KR101400674B1 - 방사선 이용 생체분자 도입용 미생물 셀룰로오스 나노섬유 및 제조방법 - Google Patents

방사선 이용 생체분자 도입용 미생물 셀룰로오스 나노섬유 및 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사선 조사기술을 이용한 미생물 셀룰로오스 나노섬유 및 그 제조방법에 관한 것으로 감귤박의 미생물 대사에 의한 셀룰로오스 겔을 동결건조하여 준비하는 단계; 상기 동결건조된 셀룰로오스 겔에 방사선을 조사하여 (메타)아크릴산을 그라프트 하는 그라프트 셀룰로오스 섬유 제조단계; 상기 그라프트 셀룰로오스 섬유에 세포외 기질 단백질을 중합하는 생체분자 나노섬유의 제조단계; 및 상기 생체분자 나노섬유를 동결건조하는 단계를 포함하며 본 발명에 따른 미생물 셀룰로오스 나노섬유는 폐부산물의 재생자원으로의 활용과 조직공학용 생체모방 지지체 개발에 막대한 경제적 효과를 기대할 수 있어 기술적 가치가 매우 크다.

Description

방사선 이용 생체분자 도입용 미생물 셀룰로오스 나노섬유 및 제조방법{Radiation biomolecules bacterial cellulose nanofibers and method of manufacture}
본 발명은 방사선 조사기술을 이용한 미생물 셀룰로오스 나노섬유 및 그 제조방법에 관한 것이다.
조직공학이란 오늘날 외부 레져 활동의 증가에 따른 사고와 고령화 시대로의 진입으로 인한 조직 및 장기의 손상 및 기능 상실을 효과적으로 치료할 수 있는 치료법에 부응하여 기존의 의약품과 의료기술로는 해결될 수 없는 손상된 장기 및 조직을 다양한 공학적인 방법을 기반으로 하여 재생시키는 방법으로 통칭한다.
인체 시스템은 세포를 기반으로 한 매우 복잡한 체제로 구성되어 있으며 세포는 단백질과 당류 및 그 복합체를 구성성분으로 하는 세포외 기질이라고 하는 3차원적인 미세 구조와의 상호작용으로 생명현상을 유지하고 있다. 세포는 세포외 기질과의 특이적 결합을 통하여 3차원적인 공간 안에 정착하고 세포 고유의 형태를 유지하며, 세포 고유의 형질을 발현하게 된다.
셀룰로오스(Cellulose)는 자연계에 널리 존재하는 고등식물의 세포벽의 주성분으로서 β-1,4-glucose로 구성된 다당류이다. 식물 셀룰로오스는 펙틴(pectin), 헤미셀룰로오스(hemicelluloses), 리그닌(lignin) 등의 다른 다당류와 혼합하여 헤테로폴리-사카라이드(heteropoly-saccharide)로 이루어져 있어 결정화도가 낮고 기계적 강도와 흡착성이 떨어진다. 반면 세균이 생산하는 셀룰로오스는 식물성 셀룰로오스와 달리 펙틴(pectin), 헤미셀룰로오스(hemicelluloses), 리그닌(lignin) 등의 다당류를 함유하지 않은 순수한 셀룰로오스 집합체이며, 약 0.1 μm의 두께를 지닌 마이크로피브릴(microfibril)이 수소결합으로 3차원적 망상구조를 이루고 있다. 따라서 결정화도가 높고 기계적강도와 흡착성, 보수성, 현탁 안정성, 결착성 등의 물리적인 성질이 우수하여 식품, 화장품 및 의약품 산업의 신소재로써 널리 사용되고 있다.
감귤은 제주도에서 연간 50~60만 톤이 생산되는 국내 최대 생산 과일 품목으로 대부분 생과로 이용되고 있으나, 일부 감귤주스를 가공하기 위한 전 단계에서 감귤농축액 상태로 저장되고 있을 뿐 가공품 개발에 의한 소비가 적고 대부분 한정된 계절에 생산되어 보존 가공에 많은 애로점이 있다. 또한 감귤박 및 부산물의 처리에도 막대한 비용이 소비되고 있어 감귤박을 이용한 신소재 개발의 필요성이 대두되고 있다. 감귤박의 재활용을 목적으로 대한민국 공개특허 10-2004-0069587(특허문헌 1)은 감귤박을 재활용하여 식이섬유, 플라보노이드 및 사료 등을 생산하는 기술에 대하여 개시된바 있다.
이러한 감귤박의 활용방법 중 하나로 감귤박으로부터 미생물 셀룰로오스 등을 생산하여 생체재료에 활용하려는 연구가 시도되고 있다. 그러나 상기 미생물 셀룰로오스에는 조직을 효과적으로 재생하는데 필요한 세포부착 리간드가 없어 세포의 접착성 및 증식 효율이 낮은 단점을 가지고 있다.
대한민국 공개특허 10-2004-0069587
상기 문제를 해결하기 위한 본 발명의 목적은 감귤박으로부터 제조되는 미생물 셀룰로오스를 생체재료에 활용하기 위한 개질방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로 미생물 셀룰로오스를 방사선 조사기술을 이용하여 개질하여 세포외 기질과의 합성이 가능하도록 하고 이를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공하고자 하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
감귤박의 미생물 대사에 의한 셀룰로오스 겔을 동결건조하여 준비하는 단계;
상기 동결건조된 셀룰로오스 겔에 방사선을 조사하여 (메타)아크릴산을 그라프트 하는 그라프트 셀룰로오스 섬유 제조단계;
상기 그라프트 셀룰로오스 섬유에 세포외 기질 단백질을 중합하는 생체분자 나노섬유의 제조단계; 및
상기 생체분자 나노섬유를 동결건조하는 단계;
를 포함하는 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 미생물 셀룰로오스 나노섬유를 제공한다.
본 발명에 따른 미생물 셀룰로오스 나노섬유는 감귤박으로부터 미생물 셀룰로오스, 구체적으로 미생물 발효 셀룰로오스 겔을 생산하여 생체재료로 활용할 수 있으므로, 폐부산물인 감귤박의 재활용 문제를 해결하고, 게다가 친환경적이고 경제적인 효과를 기대할 수 있다.
이는 기존의 조직공학용 지지체들의 제조에 필수적으로 필요한 화학물질 등을 사용하지 않고 방사선 기술을 이용하여 생체친화성이 우수한 물질을 도입함으로써, 인체와 자연에 무해함은 물론 사용된 폐부산물의 재생자원으로의 활용과 조직공학용 생체모방 지지체 개발에 막대한 경제적 효과를 기대할 수 있어 기술적 가치가 매우 크다.
또한 본 발명은 방사선 조사기술을 이용하여 천연재료인 상기 미생물 발효 셀룰로오스 겔의 표면 개질을 하여 세포외 기질과의 합성이 가능하도록 함으로써 기존의 조직공학용 소재보다 조직 및 세포 친화성이 더욱 향상된 조직공학용 지지체를 제공할 수 있다.
이러한 기술은 기존의 생체재료에 비하여 생체적합성이 우수하고, 구체적으로는 본 발명에 따른 조직공학용 지지체는 세포 흡착이나 증식, 세포의 흡착 형태에서 뛰어난 능력을 보여주기 때문에 지지체의 세포 친화성을 높일 수 있는 기술로서 유용하게 쓰일 것으로 전망된다.
도 1은 본 발명에 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 각 단계별 결합구조를 도식화 한 것이다.
도 2는 (a)실시예 2 및 (b)실시예 3의 주사전자현미경 사진이다.
도 3은 (a)실시예 1(BC) 및 실시예 2(AAc-BC)의 톨루이딘블루오(TBO) 염색후의 UV-VIS spectrometer 측정결과이며 (b)는 염색된 TBO량을 정량한 결과이다.
도 4는 (a)실시예 1(BC), (b)실시예 2(AAc-BC) 및 (c)실시예 3(Gelatin -AAc-BC)이 중합된 생체분자 나노섬유(Gelatin-AAc-BC) 각각의 플로오레사민 염색결과를 형광현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5는 도 5는 a)실시예 1(BC), (b)실시예 2(AAc-BC) 및 (c)실시예 3(Gelatin -AAc-BC)의 각각의 표면특성을 분석한 ATR-FTIR의 그래프이다.
본 발명은 감귤박의 미생물 대사에 의한 셀룰로오스 겔을 동결건조하여 준비하는 단계;상기 동결건조된 셀룰로오스 겔에 방사선을 조사하여 (메타)아크릴산을 그라프트 하는 그라프트 셀룰로오스 섬유 제조단계;상기 그라프트 셀룰로오스 섬유에 세포외 기질 단백질을 중합하는 생체분자 나노섬유의 제조단계; 및 상기 생체분자 나노섬유를 동결건조하는 단계; 를 포함하는 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외 기질 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 라미닌, 피브로넥틴 및 엘라스틴에서 선택된 하나 또는 둘 이상으로 이루어진 3차원 나노구조를 포함할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 세포외 기질 단백질은 폴리펩타이드를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 동결건조는 -80 ~ -50 ℃ 에서 3 ~ 5 일간 수행할 수 있다.
상기 생체분자 나노섬유의 제조단계는 1-에틸-3-(3-이메틸마이노프로필)카보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드를 포함하여 중합하는 단계를 포함한다.
상기 그라프트는 (메타)아크릴산 용액에 침지한 후 감마선을 5~100 kGy 조사하여 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 그라프트 셀룰로오스 섬유에 존재하는 미반응된(메타)아크릴산을 제거하는 단계;를 더 포함하는 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법을 제공할 수 있다
이렇기 상기 방법들로 제조된 미생물 셀룰로오스 나노섬유는 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 상기 미생물 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 조직공학용 지지체는 본 발명의 범위에 포함된다.
이하 본 발명에 관하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
조직공학에 있어서 생분해성은 상당히 큰 비중을 차지하고 있으며 만일 비분해성 고분자를 사용할 경우 병변의 완전한 재생 후에 조직에 남아 있는 지지체가 외부 물질로 인식되어 염증반응이 지속적으로 발생할 가능성이 있기 때문에 반드시 제거하는 과정을 동반해야 한다. 또한 생분해가 일어나지 않으면 새로 형성된 조직이 지지체 안쪽으로 재생되기 어려우며 주변 조직과의 효가적인 융합이 될 수 없다. 생분해성 고분자는 인체 내에서 가수분해나 분해 효소 등에 의해 분해되는 고분자를 칭하며, 고분자를 얻는 방법에 따라 크게 천연 고분자와 합성 고분자로 나눌 수 있다. 천연 고분자로는 젤라틴, 콜라젠, 피브린 및 엘라스틴 등의 단백질과 알긴산 및 하이알루론산 등의 다당류 계열을 포함하며, 합성고분자로는 폴리에스터의 중합체 또는 공중합체등을 포함한다.
본 발명자는 생분해성 고분자로서 종래에 사용되는 천연고분자 및 합성고분자 대신, 감귤박의 미생물 대사에 의한 셀룰로오스 겔을 적용함으로 인하여 획기적인 생체분자 나노섬유를 제공할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서는 방사선 기술을 이용하여 미생물 셀룰로오스 나노섬유에 아크릴산을 그라프트 중합시킨 후 세포친화성이 우수한 단백질이나 펩타이드를 결합시켜 미생물 셀룰로오스 나노섬유를 제공할 수 있으며 이를 도 1에 도식화 하였다.
본 발명은 감귤박의 미생물 대사에 의한 셀룰로오스 겔의 제조단계; 상기 셀룰로오스 겔에 방사선을 조사하여 (메타)아크릴산을 그라프트 하는 그라프트 셀룰로오스 섬유의 제조 단계; 및 상기 그라프트 셀룰로오스 섬유에 세포외 기질 단백질을 중합하는 생체분자 나노섬유의 제조단계; 를 포함하는 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
먼저 감귤박의 미생물 대사에 의한 셀룰로오스 겔을 동결건조하여 준비하는 단계에 대하여 상술하기로 한다.
상기 셀룰로오스 겔의 제조단계는 감귤박 발효액 및 종균의 혼합물은 정치발효하는 단계를 거쳐 수득할 수 있다.
본 발명에서 감귤박은 감귤로부터 얻어지는 것으로 "감귤"은 실시예에서 사용되는 온주 밀감뿐만 아니라 유럽 남부 등지에서 재배되는 시트론(citron), 미국 캘리포니아 등지에서 재배되는 문단의 돌연변이종인 그레이프 프루트(grape fruit), 인도, 이탈리아 등지에서 재배되는 광귤(sour orange), 인도 등 세계 각지에서 재배되는 당귤, 중국이나 우리나라에서 재배되는 금귤이나 유자, 우리나라 제주도 등에서 재배되는 한라봉, 진지향, 진귤, 산귤, 청귤, 동정귤, 당유자, 홍귤, 편귤, 사두감, 주감, 탱귤 등을 모두 의미하며 이의 외피, 또는 감귤의 착즙후 생성되는 박을 모두"감귤박"이라고 지칭한다.
감귤박 발효액은 Pectines 100L, Viscozyme L, AMG 300L, Celluclast 1.5L 등의 당분해효소를 접종한 뒤 3~12시간, 약 40~70℃ 정도에서 제조하는 것이 바람직하다. 이때 당도는 크게 제한되지는 않으나 1~30 brix 범위내에 있는것이 바람직하다. 당분해효소의 접종량은 크게 제한적이지는 않으나 효율성을 고려하였을 때 감귤박의 0.01 ~ 1%(w/w)의 농도로 접종하는 것이 바람직하다.
상기 종균은 셀룰로오스 겔이 제조되는 범위내에서 다양한 균주를 적용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 글루콘아세토박터 한세니 TL-2C를 사용할 수 있다.
이때 상기 발효액 10%(v/v)에 상기 종균을 접종하며, 접종량은 1ⅹ103~1ⅹ107cell/ml의 범위 내에서 접종하나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
정치발효는 호기성 조건에서 시행하며, 20℃~40℃에서 7일 ~ 30일이 소요되며 이에 제한되는 것은 아니다.
이렇게 제조된 셀룰로오스 겔은 제주 농촌진흥청에서 제공받아 사용할 수도 있다.
상기 셀룰로오스겔은 동결건조하여 준비하며 동결건조는 -80 ~ -50 ℃ 에서 3 ~ 5 일간 수행되는 것을 특징으로 한다. 습윤된 셀룰론오스 겔을 상온건조를 하게 되면 겔에서 물이 날아가면서 셀룰로오스 겔의 두께와 공극이 감소된다. 따라서 동결건조법을 사용하게 되면 저온에서 셀룰로오스 겔 안의 물이 얼음으로 결정화 되고 동시에 압력을 낮추어 지면 물이 승화 되어 원래의 셀룰로오스의 두께가 유지되면서 일정한 형태를 가진 공극를 제작 할 수 있다는 장점이 있다. 이 방법 중에서는 초기 습윤 셀룰로오스겔 을 동결 온도에 따라 물의 결정 크기를 조절 할 수 있기 때문에 다양한 공극 크기를 가진 겔을 제작 할 수 있다. 예를 들어, -20 ℃ 에서 천천히 냉각 했을 경우에는 얼음 결정이 증가되고 - 80 ℃에서는 물이 급격이 얼어 결정이 작아진다. 따라서, 물의 냉각 온도에 따른 결정화 속도를 조절을 하게 되면 겔의 공극률을 조절 할 수 있게 된다.
다음으로는 상기 셀룰로오스 겔에 방사선을 조사하여 (메타)아크릴산을 그라프트 하는 그라프트 셀룰로오스 섬유의 제조 단계에 대하여 상술하기로 한다.
본 발명에 따른 셀룰로오스 겔은 조직을 효과적으로 재생하는데 필요한 세포부착 리간드가 존재하지 않아 세포의 접착성 및 증식 효율이 낮다. 본 발명은 이러한 문제점을 해결하고자 방사선 기술을 도입하였다. 방사선을 이용한 기술의 원리는 방사선 조사에 의해 단량체에 라디칼이 생성되어 중합되어 폴리머가 되거나, 고분자 사슬의 라디칼에 의해 고분자 사슬간에 가교 또는 단량체의 그라프트가 일어난다. 이러한 방사선 기술은 화학적 방법에 비해 인체에 유해한 가교제나 개시제를 사용하지 않기 때문에 반응후 별도의 정제과정이 필요 없으며 의료분야에 이용될 경우 필수단계인 멸균과정 또한 방사선 조사로 대체될 수 있다.
상기 셀룰로오스 겔은 직경 3~10mm의 크기로 잘라서 사용하는 것이 바람직하다.
방사선 조사는 감마선을 의미하며 구체적으로 60Co 선원의 감마선(ACEL type C-1882, Korea Atomic Energy Instiute)를 5~100 kGy 조사할 수 있다.
이때, 상기 (메타)아크릴산은 구체적으로 아크릴산 용액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.1M 모아염의 5wt% 아크릴산 용액을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일예로 1~10 wt%의 아크릴산 용액을 사용할 수 있다.
또한 상기 아크릴산 용액에 상기 셀룰로오스 겔을 침지하여 방사선을 조사하는 것이 바람직하다. 따라서 아크릴산 용액 및 셀룰로오스 겔의 함량비는 셀룰로오스 겔이 침지될 수 있는 범위인 것이 적절하며, 구체적으로는 아크릴산 용액 50~99 중량%, 셀룰로오스 겔 1~50중량%인 것이 바람직하다.
이렇게 (메타)아크릴산이 그라프트된 그라프트 셀룰로오스 섬유는 미반응된 (메타)아크릴산을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로는 3차 증류수를 이용하여 50시간 내지 100시간 동안 워싱을 실시하여 (메타)아크릴산을 제거할 수 있다.
다음으로는 상기 그라프트 셀룰로오스 섬유에 세포외 기질 단백질을 중합하는 생체분자 나노섬유의 제조단계에 대하여 상술하기로 한다.
상기 그라프트 셀룰로오스 섬유는 EDC/NHS 반응을 이용하여 세포외 기질 단백질을 중합할 수 있다. 구체적으로 1-에틸-3-(3-이메틸마이노프로필)카보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 포함하여 중합하는 단계이며, 보다 구체적으로는 z-(N-모르폴리노)에틸술폰산(MES) 완충용액에 EDC 와 NHS를 녹인 혼합액에 상기 그라프트 셀룰로오스 섬유를 침지시킨 후 꺼내어 세포외 기질단백질이 용해되어있는 용해액에 넣고 교반하여 제조할 수 있다. 이때 EDC와 NHS 혼합액의 혼합비는 1:9 ~ 9:1 에서 선택될 수 있다.
상기 세포외 기질 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 라미닌, 피브로넥틴 및 엘라스틴에서 선택된 하나 또는 둘 이상으로 이루어진 3차원 나노구조를 포함한다.
또한 폴리펩타이드를 세포외 기질 단백질로 사용할 수도 있다.
이렇게 세포외 기질 단백질이 중합된 생체분자 나노섬유는 미반응된 세포외 기질 단백질을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로는 z-(N-모르폴리노)에틸술폰산 및 인산완충식염수를 이용하여 20시간 내지 30시간 동안 워싱을 실시하여 제거할 수 있다.
마지막으로 상기 나노섬유를 동결건조하는 단계에 대하여 상술하기로 한다.
본 발명에서 상기 셀룰로오스 나노섬유를 동결건조하였을 때 셀룰로오스 겔 섬유의 조직의 가교도를 높여주어 인장강도 및 탄성력 및 복원력이 높아지는 것을 발견하였으며 이를 통해 우수한 조직공학용 지지체를 제공할 수 있게 되었다.
이러한 동결건조의 조건은 -80 ~ -50 ℃ 에서 3 ~ 5 일간 수행되는 것이 바람직하다.
다음으로는 본 발명의 바람직한 실시예를 제시하고자 하며 하기 실시예에는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 감귤박의 미생물 대사에 의한 셀룰로오스 겔의 동결건조
감귤박을 원료로 하고 글루코아세토박터 한세니 TL-2C에 의해 30℃, 14일간 정치발효하여 제조된 셀룰로오스 겔(제주농촌진흥청)을 -78℃에서 24시간, -50℃에서 48시간 동결건조기로 동결건조하여 준비하였다.
<실시예 2> 그라프트 셀룰로오스 섬유의 제조
상기 동결건조된 셀룰로오스 겔을 8mm의 크기로 절단하고 상기 셀룰로오스겔과 0.01M 모아염의 5중량% 아크릴산 용액을 1:1의 중량비로 하여 침지하였다.
침지된 셀룰로오스 겔에 60Co 선원의 감마선(ACEL type C-1882, Korea Atomic Energy Institute)을 선량률 10kGy/hr로 25kGy 조사하였다. 조사 후에 미 반응된 아크릴산을 제거하기 위해 3차 증류수를 이용하여 72시간 워싱을 실시하여 그라프트 셀룰로오스 섬유를 제조하였다.
<실시예 3> 생체분자 나노섬유의 제조
상기 그라프트 셀룰로오스 섬유를 0.1M z-(N-모르폴리노)에틸술폰산(MES) 완충용액(pH 5.07, 5mg/mL)에 EDC와 NHS를 1:1의 부피비로 녹인용액에 1시간 동안 침지한 후 꺼내고 젤라틴용액(2mg/mL)에 넣어 12시간 동안 교반하였다. 미반응 젤라틴을 제거하기 위해 z-(N-모르폴리노)에틸술폰산 및 인산완충식염수의 1: 1 혼합액에 24시간 동안 워싱하여 생체분자 나노섬유를 제조하였다.
<실시예 4> 생체분자 나노섬유의 동결건조
상기 워싱된 생체분자 나노섬유를 동결건조기를 이용하여 -78℃에서 72시간 동안 동결건조하였다.
이렇게 제조된 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 각 단계별 제조된 물질을 여러가지 방법으로 분석하여 그 특성을 평가하였다.
1. 주사전자현미경(SEM) 측정
상기 생체분자 나노섬유에서 셀룰로오스 겔의 표면에 결합된 아크릴산과 젤라틴이 미치는 영향을 알아보기 위해 전자현미경(SEM, JSM-6400, JEOL, Japan)을 이용하여 10kv, 10~12 mm distance 조건에서 확인하였다. 샘플은 스푸터코터(Sputter coater)를 이용하여 70초동안 골드코팅하여 측정하였다.
상기 실시예 2의 그라프트 셀룰로오스 섬유의 SEM사진을 도 2의 (a)에 첨부하였으며 실시예 3의 젤라틴이 중합된 생체분자 나노섬유의 SEM사진은 도 2의 (b)에 첨부하였다.
2. 톨루이딘블루오(TBO, Toluidine blue O) 염색과 정량
또한 셀룰로오스 겔에 아크릴산의 카복실그룹이 잘 형성되었는지 확인하기 위하여 TBO를 사용하여 염색과 정량을 하였다. 측정방법은 다음과 같다.
24 월 플레이트(well plate)에 TBO 솔루션(0.01M HCl. 60mg NaCl, 12mg TBO) 500㎕와 그라프트 셀룰로오스 섬유를 넣고 6시간 교반후 증류수를 이용하여 TBO가 더 이상 녹아 나오지 않을때까지 워싱을 하였다. 그후 0.1M NaOH와 에탄올을 1:4(v/v)혼합한 용액에 녹인후 UV-VIS spectrometer(PowerWave XS, Biotek, USA)를 이용하여 630nm에서 측정하였다. 이를 도 3에 나타내었으며, 도 3-(a)를 보면 실시예 1의 셀룰로오스 겔(BC)는 염색되지 않은 반면, 실시예 2의 아크릴산이 그라프트된 그라프트 나노섬유(AAc-BC)는 푸른색으로 염색이 되었음을 확인하였다. 또한 도 3-(b)는 그라프트 나노섬유에 염색된 TBO량을 정량한 결과이며 BC는 0.0195±0.1384, AAc-BC는 6.3827±0.7710(ug/mg)으로 측정되었다. 이로써 카복실기가 결합되어 TBO 반응이 일어난 것을 확인할 수 있었다.
3. 플루오레사민 염색
젤라틴이 잘 중합되었는지 확인하기 위해 플루오레사민(fluorescamine)을 이용하여 다음과 같이 측정하였다.
셀룰로오스 겔(BC), 그라프트 나노섬유(AAc-BC) 및 젤라틴이 중합된 생체분자 나노섬유(Gelatin-AAc-BC) 각각에 0.2M 보레이트 완충(pH 9) 350㎕와 플루오레사민 용액(1mg/mL 아세톤) 150㎕를 함께 넣고 볼텍스(voltex)를 이용하여 고속으로 1분간 교반후, 형광현미경으로 염색여부를 관찰하였다. 도 4와 같이 BC와 AAc-BC에서는 녹색형광이 관찰되지 않으나 Gelatin -AAc-BC에서는 녹색형광이 나타나기 때 문에 젤라틴이 결합되었음을 확인할 수 있었다.
4. ATR-FTIR 측정
셀룰로오스 겔(BC), 그라프트 나노섬유(AAc-BC) 및 젤라틴이 중합된 생체분자 나노섬유(G-AAc-BC)의 표면의 화학특성을 확인하기 위하여 attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy(ATR-FTIR)(Bruker TEMSOR 37, Bruker AXS. Inc., Germany)를 사용하여 분석하였다. 스펙트라는 500~4000 cm-1의 범위를 4 cm- 1해상도와 64 scans 조건에서 측정하였다.
도 5는 (a)BC, (b)AAc-BC 및 (c) Gelatin -AAc-BC의 각각의 표면특성을 분석한 ATR-FTIR의 그래프이다. AAc-BC 의 카르복실 그룹의 피크는 1720 cm-1에서 발견되었다. 젤라틴을 결합시킨 G-AAc-BC 는 1650 cm-1, 1550cm-1에서 새로운 피크가 발견되었다. 이 피크는 젤라틴에 있는 아미드(Ⅰ),(Ⅱ) 로 AAc-BC 에 젤라틴이 결합되었다는 것을 확인할 수 있다.

Claims (9)

  1. 감귤박의 미생물 대사에 의한 셀룰로오스 겔을 동결건조하여 준비하는 단계;
    상기 동결건조된 셀룰로오스 겔에 방사선을 조사하여 (메타)아크릴산을 그라프트 하는 그라프트 셀룰로오스 섬유 제조단계;
    상기 그라프트 셀룰로오스 섬유에 세포외 기질 단백질을 중합하는 생체분자 나노섬유의 제조단계; 및
    상기 생체분자 나노섬유를 동결건조하는 단계;
    를 포함하는 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서
    상기 세포외 기질 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 라미닌, 피브로넥틴 및 엘라스틴에서 선택된 하나 또는 둘 이상으로 이루어진 3차원 나노구조를 포함하는 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서
    상기 세포외 기질 단백질은 폴리펩타이드를 더 포함하는 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 동결건조는 -80 ~ -50 ℃ 에서 3 ~ 5 일간 수행되는 것을 특징으로 하는 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서
    상기 생체분자 나노섬유의 제조단계는 1-에틸-3-(3-이메틸마이노프로필)카보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드를 포함하여 중합하는 단계인 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 그라프트는 (메타)아크릴산 용액에 침지한 후 감마선을 5~100 kGy 조사하는 것인 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서
    상기 그라프트 셀룰로오스 섬유에 존재하는 미반응된(메타)아크릴산을 제거하는 단계;를 더 포함하는 미생물 셀룰로오스 나노섬유의 제조방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항에서 선택된 어느 한 항의 방법으로 제조된 미생물 셀룰로오스 나노섬유.
  9. 제 8항의 미생물 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 조직공학용 지지체.
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