KR101384351B1 - 장미꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환 치료용 조성물 - Google Patents
장미꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 장미꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 활성성분인 장미꽃 추출물은 중뇌동맥폐색 및 재관류에 의해 유도된 허혈성 뇌손상에서 뇌경색 영역 및 뇌부종의 크기를 감소시키고, 지질과산화 및 뇌염증 수준을 낮추며, 뇌손상 및 행동장애를 크게 개선시키는 뇌보호 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 허혈성 뇌질환의 치료제로 개발될 수 있다.
Description
본 발명은 장미꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
뇌졸중(stroke)은 암이나 심혈관질환과 함께 사망에 이르게 하는 가장 빈번한 질환중에 하나이고, 뇌졸중이 발생한 후 6시간 내에 신경보호제를 투여하게 되면 뇌졸중에 의해 유도되는 저산소증에 의한 신경세포의 사멸을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Jiang et al., 2010). 그러나, 뇌졸중 발생 직후 3시간 내에 t-PA (tissue-type plasminogen activator)를 사용하여 혈류를 회복시키는 방법 이외에, 뇌허혈을 치료하는데 임상적으로 효율적인 신경보호제가 제공되어 있지 않는 상황이다(The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group, 1995; Lee et al., 2006).
허혈성 뇌졸중은 주요 뇌동맥의 영역에 제한되는 뇌혈류의 일시적이거나 영구적인 감소에 의해 발생된다. 이 질환의 주요한 병리학적 메카니즘은 흥분성 매개인자, 과량의 Ca2 + 및 염증을 포함한다(Amantea et al., 2009; Chan, 1996, 2001; Durukan and Tatlisumak, 2007). 뇌혈관 폐색 후에 허혈-재관류 손상의 기구에 산화적 스트레스가 연관되어 있으며, 결과적으로 다량의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성시킨다는 것이 확인되었다(Chan, 2001; Margail et al., 2005). 자유라디칼은 염증성 매개인자 형성도 유도하는데, 이는 소교세포(microglia)를 활성화시켜, 내피 부착 분자의 상향조절을 통해 성상교세포증(astrogliosis) 및 백혈구 침윤(leukocyte infiltration)을 발생시킨다(Dirnagl et al., 1999). NOS (nitric oxide synthase), COX (cyclooxygenase) 및 XO (xanthine oxidase)와 같은 많은 친염증성 효소가 뇌허혈에서 산화적 손상에 관여한다(Chan, 2001). iNOS (inducible NOS)는 성상교세포(astrocyte), 소교세포 및 대식세포에서 발견되는데, 이들 세포에서 주로 iNOS로부터 ROS가 생성된다(Vaughan and Delanty, 2011). 활성화된 iNOS는 다량의 NO (nitric oxide)를 생성하며(Greco et al., 2011; Get al., 2000), 이는 수퍼옥사이드 음이온과 결합하여 강력한 산화력을 갖는 과산화아질산염 음이온(peroxynitrite anion)을 생성시킨다(Epe et al., 1996; Margail et al., 2005). 따라서, NO가 뇌허혈의 염증성 조직 손상에 주요한 원인이며 글루이타메트-매개된 신경 손상을 악화시킨다는 것이 잘 알려져 있다(Iadecola et al., 1997). iNOS-NO 경로에 추가하여, COX-2 PGs (cyclooxygenase-2 - prostaglandins) 경로도 각각 스테로이드 및 비스테로이드성 항염증제에 반응하는 또 하나의 주요한 염증경로이다(Shin et al., 2010). iNOSNO 및 COX-2PGs 경로가 염증의 많은 경우에서 완전히 분리되지 않기 때문에, COX-2의 자극에 의해 매개되는 세포독성은 iNOS에 의해 조절될 수 있다(Amantea et al., 2009).
최근에, 본 발명자들에 의해 장미꽃 추출물 및 분획물이 항산화 활성, 항알러지 활성, 항아토피 활성, 항박테리아 활성 및 항염증 활성을 가진다고 보고되었다(Park et al., 2009; Joo et al., 2010, Kwon et al., 2008; Jeon et al., 2008, 2009, Joo et al., 2010, Lee et al., 2011).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 뇌보호 활성을 갖는 물질을 천연물로부터 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 중뇌동맥폐색(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 기술을 사용한 허혈성 뇌손상 동물모델에서 장미꽃 추출물이 허혈 및 재관류에 의해 유도된 뇌손상을 보호하고 회복시킬 수 있는 활성을 가진다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 장미꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 장미(Rosa hybrida) 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 뇌보호 활성을 갖는 물질을 천연물로부터 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 중뇌동맥폐색(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 기술을 사용한 허혈성 뇌손상 동물모델에서 장미꽃 추출물이 허혈 및 재관류에 의해 유도된 뇌손상을 보호하고 회복시킬 수 있는 활성을 가진다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 장미꽃을 언급하면서 사용되는 용어 “추출물”은 장미꽃에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 장미꽃 자체를 대상자(subject)에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 장미꽃 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.
본 발명의 장미꽃 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 장미꽃 추출물을 장미꽃에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ⅱ) 알코올 (바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (ⅲ) 아세트산, (ⅳ) DMFO (dimethylformamide) 및 (v) DMSO (dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF (tetrahydrofuran)를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면, 본 발명의 장미꽃 추출물은 상기 용매 추출물에 용매를 사용하여 추가 분획하여 얻은 장미꽃 분획물을 포함한다. 추가 분획에 사용되는 용매는 상기 설명된 용매를 사용할 수 있으며, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올을 용매로 사용한 분획물이 바람직하다.
본 명세서에서 용어 “유효성분으로 포함하는” 이란 장미꽃 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명 조성물에 포함되는 활성성분인 장미꽃 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
하기 본 명세서 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 장미꽃 추출물은 중뇌동맥폐색 및 재관류에 의해 유도된 허혈성 뇌손상에서, 뇌경색 영역 및 뇌부종의 크기를 감소시키고, 지질과산화 및 뇌염증 수준을 낮추며, 뇌손상 마커인 성상교세포증의 정도를 감소시키고, 행동장애를 크게 개선하는 활성을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 장미꽃 추출물은 허혈성 뇌질환의 예방, 치료 또는 개선의 용도로 사용될 수 있다.
상기 허헐성 뇌질환은 허혈 또는 허혈 후 재관류에 의해 발생되는 뇌질환을 의미하며, 예를 들어, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 외상성 뇌손상 또는 저산소성 뇌손상을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있으며, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10,000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 장미(Rosa hybrida) 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명 식품조성물에 포함되는 장미꽃 추출물에서 “추출물”, “용매”, “추출과정” 및 “유효성분으로 포함하는”에 관한 내용은 상기 조성물에서 설명된 바와 동일하다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 장미꽃 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 장미꽃 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 장미꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 활성성분인 장미꽃 추출물은 중뇌동맥폐색 및 재관류에 의해 유도된 허혈성 뇌손상에서 뇌경색 영역 및 뇌부종의 크기를 감소시키고, 지질과산화 및 뇌염증 수준을 낮추며, 뇌손상 및 행동장애를 크게 개선시키는 뇌보호 활성을 나타낸다.
(ⅲ) 본 발명의 조성물은 허혈성 뇌질환의 치료제로 개발될 가능성이 높다.
본 발명은 장미꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 활성성분인 장미꽃 추출물은 중뇌동맥폐색 및 재관류에 의해 유도된 허혈성 뇌손상에서 뇌경색 영역 및 뇌부종의 크기를 감소시키고, 지질과산화 및 뇌염증 수준을 낮추며, 뇌손상 및 행동장애를 크게 개선시키는 뇌보호 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 허혈성 뇌질환의 치료제로 개발될 수 있다.
도 1은 중뇌동맥폐색(middle cerebral artery occlusion, MCAO)에 의해 유도된 뇌경색 및 뇌부종에 대해 백색장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)이 미치는 영향을 평가한 결과를 보여준다. 2시간의 중뇌동맥폐색에 이어서 22시간의 재관류를 행한 랫트로부터 얻은 뇌조직 절편을 TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)를 사용하여 염색하였다. 패널 A: 2％ TTC로 염색된 뇌 절편을 촬영한 사진이다. 패널 B: 모든 절편의 영역을 총합한 총 경색부위 영역을 나타낸다. 패널 C: 부종의 부피를 보여준다. a모의수술(Sham, 가짜 중뇌동맥폐색) 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄. b부형제 대조군(중뇌동맥폐색 후 부형제만 투여)과 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄.
도 2는 중뇌동맥폐색에 의해 증가된 지질과산화물인 말론디알데히드(MDA)와 질소산화물(NO)의 수준에 미치는 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 영향을 측정한 결과를 보여준다. 2시간의 중뇌동맥폐색를 행하고 22시간의 재관류를 행한 랫트로부터의 뇌균질액내에서의 말론디알데히드 수준(패널 A) 및 뇌척수액에서의 NO의 수준(패널 B)을 분석하였다. a모의수술 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타내고, b부형제 대조군과 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄.
도 3은 중뇌동맥폐색에 의해 증가한 활성화된 성상세포의 수에 대해 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 영향을 측정한 결과이다. 활성화된 성상세포(패널 A, 화살표)는 뇌실하영역(패널 B) 및 선조체(패널 C)에서 신경교섬유질산성단백질(GFAP, glial fibrillary acidic protein)에 대한 면역조직화학염색에 의해 검출하였다. a모의수술 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타내고, b부형제 대조군과 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄.
도 4는 중뇌동맥폐색(MCAO)에 의해 증가된 iNOS, COX-2 및 신경교섬유질산성단백질(GFAP)의 발현에 미치는 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 영향을 측정한 결과를 보여준다. 상기 효소들 및 신경교섬유질산성단백질들의 생성은 웨스턴 블로팅(패널 A)에 의해 분석하였고, β-액틴의 양과 비교하여 정량하였다(패널 B). a모의수술 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타내고, b부형제 대조군과 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄. 검은색 막대는 모의수술 대조군이고, 붉은색 막대는 부형제 처리군이며, 연두색 막대는 백장미꽃추출물-부탄올분획물 10 mg/kg 처리군이고, 노란색 막대는 백장미꽃추출물-부탄올분획물 32 mg/kg 처리군이다.
도 5는 중뇌동맥폐색에 의해 유도된 신경행동 기능장애에 미치는 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 영향을 측정한 결과를 보여준다. 근협조운동능력을 측정하기 위해 5분의 시간에 걸쳐 4 rpm으로부터 40 rpm까지 가속되는 회전봉(rota-rod)상에서 떨어지지 않고 머무는 시간(latency time)을 측정하였고(패널 A), 동물의 활동성을 측정하기 위해 휴식, 느린 움직임, 빠른 움직임들의 시간은 자발운동량측정기(locomotor activity system)(패널 B)에서 분석하였다. a모의수술 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타내고, b부형제 대조군과 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄. 검은색 막대는 모의수술 대조군이고, 붉은색 막대는 부형제 처리군이며, 연두색 막대는 백장미꽃추출물-부탄올분획물 10 mg/kg 처리군이고, 노란색 막대는 32 mg/kg 처리군이다.
도 2는 중뇌동맥폐색에 의해 증가된 지질과산화물인 말론디알데히드(MDA)와 질소산화물(NO)의 수준에 미치는 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 영향을 측정한 결과를 보여준다. 2시간의 중뇌동맥폐색를 행하고 22시간의 재관류를 행한 랫트로부터의 뇌균질액내에서의 말론디알데히드 수준(패널 A) 및 뇌척수액에서의 NO의 수준(패널 B)을 분석하였다. a모의수술 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타내고, b부형제 대조군과 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄.
도 3은 중뇌동맥폐색에 의해 증가한 활성화된 성상세포의 수에 대해 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 영향을 측정한 결과이다. 활성화된 성상세포(패널 A, 화살표)는 뇌실하영역(패널 B) 및 선조체(패널 C)에서 신경교섬유질산성단백질(GFAP, glial fibrillary acidic protein)에 대한 면역조직화학염색에 의해 검출하였다. a모의수술 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타내고, b부형제 대조군과 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄.
도 4는 중뇌동맥폐색(MCAO)에 의해 증가된 iNOS, COX-2 및 신경교섬유질산성단백질(GFAP)의 발현에 미치는 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 영향을 측정한 결과를 보여준다. 상기 효소들 및 신경교섬유질산성단백질들의 생성은 웨스턴 블로팅(패널 A)에 의해 분석하였고, β-액틴의 양과 비교하여 정량하였다(패널 B). a모의수술 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타내고, b부형제 대조군과 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄. 검은색 막대는 모의수술 대조군이고, 붉은색 막대는 부형제 처리군이며, 연두색 막대는 백장미꽃추출물-부탄올분획물 10 mg/kg 처리군이고, 노란색 막대는 백장미꽃추출물-부탄올분획물 32 mg/kg 처리군이다.
도 5는 중뇌동맥폐색에 의해 유도된 신경행동 기능장애에 미치는 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 영향을 측정한 결과를 보여준다. 근협조운동능력을 측정하기 위해 5분의 시간에 걸쳐 4 rpm으로부터 40 rpm까지 가속되는 회전봉(rota-rod)상에서 떨어지지 않고 머무는 시간(latency time)을 측정하였고(패널 A), 동물의 활동성을 측정하기 위해 휴식, 느린 움직임, 빠른 움직임들의 시간은 자발운동량측정기(locomotor activity system)(패널 B)에서 분석하였다. a모의수술 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타내고, b부형제 대조군과 유의성 있는 차이(P<0.05)를 나타냄. 검은색 막대는 모의수술 대조군이고, 붉은색 막대는 부형제 처리군이며, 연두색 막대는 백장미꽃추출물-부탄올분획물 10 mg/kg 처리군이고, 노란색 막대는 32 mg/kg 처리군이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법 및 재료
1. 장미꽃 추출물의 준비
2010년 5월에 신선한 백장미(Rosa hybrida Colorado)의 꽃잎을 충북 진천에서 구입한 후, 이를 햇볕에서 완전히 건조시켜 건조된 꽃잎을 수득하였다. 이어서, 건조된 꽃잎을 로터밀에서 분쇄하고, 분말화된 꽃잎에 70％ 에탄올을 분무하여 살균처리한 후, 80℃에서 24시간 동안 건조시키고 사용하기 전에 4℃에서 보관하였다. 곱게 분쇄한 꽃잎 분말에 대해 메탄올을 가하여 상온에서 24시간 동안 추출하였다. 꽃잎 분말과 용매의 비율은 1:20 (w/v)으로 하였다. 생성된 슬러리를 Whatman No. 1 여과지를 통해 여과시켰다. 상기의 공정을 잔여물에 대해 2회 반복하였고, 여과물을 모았다. 여과물을 모두 회수하여 50℃의 진공하에서 농축시켜 동결건조시켰다. 이어서, 동결건조된 메탄올 추출물(1 g)을 부탄올(1,5 ml)에 다시 녹이고, 20 ml의 물을 가하였다(메탄올-물, 1.5 : 20, v/v). 분리된 부탄올층을 회수한 후, 진공 하에서 증발 및 건조시켜 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)을 얻었다. 수득한 분획물을 뇌보호 효과 측정 실험에 사용하였다.
2. 실험동물
180 - 220g의 체중을 갖는 6주령의 수컷 Sprague-Dawley 랫트를 구입하였다(Daehan Biolink, 충북 음성). 상기 구입한 동물을 일정한 온도(23±3℃), 상대습도(50±10%) 및 12-시간 명/암 사이클의 조건하에서 사육하였다. 동물에게 표준 설치류 먹이 및 정제수를 자유롭게 급여하였다.
3. 실험처리
1주일간 실험실 환경에 적응하도록 둔 후에, 랫트를 4개의 그룹으로 나누었다: 모의수술 대조군(Sham operation), 부형제-처리(vehicle-treated) MCAO군, 10 mg/kg WRPE-BF-처리 MCAO군, 및 32 mg/kg WRPE-BF-처리 MCAO군 (n=15/군). 실험동물에 10 또는 32 mg/kg/day 용량의 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF) 또는 부형제(정제한 물)를 2주간 경구투여하고, 마지막 투여후 30분 시점에서 랫트를 중뇌동맥폐색(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 수술을 하였다.
4. 중뇌동맥폐색 수술
선행문헌(Schmid-Elsaesser et al. 1998)에 기재된 방법에 따라 실리콘으로 코팅된 실을 제작하였다. 간략하게 설명하면, 내부 지름이 0.38 mm을 갖는 폴리에틸렌 튜빙(Intramedic, Batavia, IL, USA)에 실리콘(Koreseal, Busan, Korea)을 채워 넣었다. 3/0 모노필라멘트 나일론실(Ailee, Busan, Korea)을 폴리에틸렌 튜빙의 한쪽 말단 안으로 5 mm 삽입하였다(Choi et al., 2011a). 실리콘 내부에 버블이 생성되지 않도록 주의를 기울였다. 24시간 후에, 튜빙 및 채워진 실리콘을 말단으로부터 5 mm 지점에서 면도날을 사용하여 절단하였다. 수술직전에 구조물을 튜빙으로부터 제거하여 말단 5 mm에 실리콘의 균일한 코팅이 남도록 하였다. 뇌허혈의 유도는 공지된 방법에 약간의 변화를 가하여 행하였다(Longa et al., 1989; Choi et al., 2011a; Park et al., 2011a). 간략히 설명하면, 먼저 25％ O2/75％ N2 내의 5％ 이소플루레인을 사용하여 랫트를 마취시킨 후 1.5 - 2％의 이소플루레인으로 유지시켰다. 목의 복부쪽 부분을 절개하여 왼쪽 총경동맥을 노출시키고, 동맥을 둘러싸는 조직을 제거하였다. 외경동맥을 묶고 절제하였다. 실리콘 코팅된 실을 외경동맥을 통해 삽입한 후 내경동맥을 통해 18 mm 더 밀어 넣어 중뇌동맥(middle cerebral artery)의 기시부까지 삽입시켰다. 폐색을 행한 이후에, 실리콘 코팅된 실을 결찰하여 제자리에 고정시키고 절개부위를 봉합하였다. 모의수술 대조군(Sham-operated group)에서는, 실리콘 코팅된 실만을 외경동맥안으로 삽입한 후에 더 이상 밀어 넣지 않았다. 수술동안에 실험동물은 코덮개(nose cone)을 통해 이소플루레인으로 마취시키고, 온도조절되는 히팅 패드를 사용하여 직장체온을 37℃로 유지시켰다. 실리콘 실은 2시간 폐색시킨 후에 재관류를 위해서 제거하였다.
5. TTC (2,3,5-트리페닐테트라졸륨) 염색
중뇌동맥폐색(MACO)를 시행한 후 24시간 시점에서, 랫트의 뇌를 조심스럽게 절개하고 미리 차갑게 냉각시킨 스테인레스 매트릭스내에서 2 mm의 관상단면을 잘라내었다. 잘라낸 각각의 개별 절편을 24-웰 플레이트내에 두고 식염수내의 2％ TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 염색액에 37℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 가볍게 교반하여 뇌절편이 염색액에 고르게 노출되도록 하였다. 이어서, 남은 TTC를 빼내고, 절편을 10％ 중성 완충 포르말린내에서 고정시켰다(Bederson et al., 1986; Chou et al., 2006; Choi et al., 2011a; Park et al., 2011a). 각 절편에서의 경색 부위는 컴퓨터 이미지 분석 시스템(Saram Soft, Anyang, Korea)을 사용하여 결정하였다. 총 병변의 부피는 각 절편에서 경색 부위를 합하고 단편의 두께를 곱하여 산출하였다.
6. 지질과산화물 측정
지질과산화는 뇌에서 TBARS (thiobarbituric acid-reactive substance)의 존재에 기초하여 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)의 형성을 측정하여 결정하였다(Ohkawa et al. 1979; Callaway et al. 1998). 간략하게 설명하면, 차가운 식염수를 심장내로 관류시킨 직후에 랫트의 뇌를 절개하였다. 뇌조직을 10배 부피의 차가운 PBS (phosphate-buffered saline)를 넣어 균질화시키고, 4,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 뇌 균질액(500μl)안으로, 소디엄도데실 설페이트(SDS; 500μl of 8.1% w/v solution)와 1 mL의 20％ 아세트산(pH 3.5으로 조정)을 가하고 원심분리하였다. 맑은 상등액으로부터 일정액(500μl)을 취하여 같은 부피의 치오바비투르산(thiobarbituric acid)용액(0.8％ w/v)과 혼합하고, 알루미늄 캡으로 밀봉한 유리튜브에 넣어 95℃에서 30분간 가열하였다. 샘플을 얼음상에서 냉각시키고 각 샘플로부터 100μl를 취하여 96-웰 플레이트에 옮기고 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
7. 뇌척수액에서의
NO
의 측정
에테르 마취에 의해 랫트를 희생시킨 후, 경부수조막(cervical cisterna membrane)에 구멍을 뚫어 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF)을 혈액이 섞이지 않도록 하면서 조심스럽게 수득하였다(Kim et al., 1999; Park et al., 2011b). 뇌척수액에서, NO 생성의 최종산물로서 아질산염(nitrite)을 Griess 시약 키트(설파닐아미드, N-1-나프틸에틸렌디아민 디히드로클로라이드 및 인산으로 구성된)를 사용하여 제조자(Promega, Madison, WI, USA)의 지시에 따라 540 nm에서 측정하였다.
8.
신경교섬유질산성단백질에
대한 면역조직화학염색
뇌 손상 마커로써 활성화된 성상세포를 조사하기 위해, 성상세포의 세포골격 단백질인 신경교섬유질산성단백질(GFAP)을 염색하는 면역조직화학염색을 수행하였다. 포르말린에 고정된 파라핀 포매한 뇌 절편(두께 4 μm)을 PBS으로 세정하고, 3％ 과산화수소로 15분간 처리하여 내인성 퍼옥시다아제 활성을 차단하였다. PBS로 세정한 후 3％ BSA로 10분간 블로킹하고, 절편을 4℃에서 GFAP 특이적 1차항체(1:1,000; Dako, Glostrup, Denmark)와 함께 하룻밤 인큐베이션하고, 이어서, 비오틴이 부착된 2차항체 IgG (ABC Elite kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 함께 상온에서 1시간 인큐베이션하고, 아비딘이 부착된 퍼옥시다아제 복합체(ABC Elite kit)와 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 퍼옥시다아제 반응은 발색체로써 3,3′-디아미노벤지딘(0.02％)을 사용하여 발색시키고, 헤마톡실린으로 4분간 대비염색하였다. 절편을 세정하고, 폴리라이신-코팅된 슬라이드상에 올리고, 탈수시킨 뒤, 커버슬립은 덮어 광학현미경으로 분석한 뒤 사진을 찍었다.
9.
웨스턴
블로팅
분석
실험동물 랫트의 심장을 통해 차가운 식염수로 관류한 후, 뇌조직을 10배 부피의 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)내에서 균질화시켰다. 균질화된 뇌조직을 4℃에서 13,500 rpm으로 6분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 단백질은 5X 단백질-로딩 완충액(Fermentas, Hanover, MD, USA)내에서 95℃에서 5분간 끓여 변성시켰다. 얻어진 샘플을 5％ SDS-폴리아크릴아미드젤 상에 로딩하고 7.5％ SDS-폴리아크릴아미드젤 상에서 전기영동에 의해 분리하였다. 전기영동을 완료한 젤을 20％ 메탄올, 1％ SDS 및 192 mM 글리신을 포함하는 25 mM Tris 완충용액내의 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막상에 옮겼다. Tween-20 (TBS-T; 20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1％ Tween-20, pH7.6)와 함께 Tris-완충된 식염수내 5％ 탈지유를 사용하여 2시간 동안 블로킹한 후, 막을 1％ BSA내에서 COX-2에 대한 항체(1:500; goat polyclonal), GFAP에 대한 항체(1:500; mouse monoclonal) 또는 iNOS에 대한 항체(1:500 in 1% BSA; rabbit polyclonal)(Santa Cruz Biotechnology, Delaware, CA, USA)를 사용하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. TBS-T로 세정한 후, 막을 양고추냉이 퍼옥시다아제를 갖는 2차 항체(1:2,000 in 2％ skim milk; Santa Cruz Biotechnology)와 함께 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 막은 ECL (electrochemiluminesence) 용액(Thermo, Rockford, IL, USA)을 사용하여 전개시켰다.
10. 신경행동기능의 측정
실험동물 랫트의 근협조운동(motor coordination)은 회전봉운동시험법(rota-rod test)으로 평가하였다. 로타로드 시스템(rota-rod system; TSE, Bad Homburg, Germany)은 실험동물이 탈출하는 것을 방지하기 위해 두 개의 커다란 둥근 플레이트(지름 150 mm)에 의해 양측면이 각각 막혀 있고, 작은 입자가 박힌 플라스틱 롤러(지름 60 mm, 길이 75 mm)로 구성되어 있다. 상기 롤러는 5분 동안에 4 rpm 내지 40 rpm 까지 가속시킬 수 있는 모터에 의해 구동된다. 랫트를 회전봉의 중앙에 두고 롤러를 회전시켜 롤러의 회전을 따라잡기 위해 앞쪽 방향으로 걷도록 강제시키고, 실험동물이 롤러상에 남아있는 시간을 측정하였다. 하나의 기간 동안에, 실험동물을 3회 테스트하였다. Photoactometer 이동성 시스템(Samsung, Changwon, Korea)을 사용한 자발운동량검사(locomotor activity test)를 이용하여, 실험동물의 휴식, 느린 움직임 및 빠른 움직임의 시간을 측정하였다. 각 실험동물을 사각형의 활성 챔버(50 X 50 X 30 cm)안에 두고 2분간 관찰하였다. 장치는 어둡고 조용한 테스트 방에 두었다.
11. 통계 분석
데이터는 평균±SEM으로 표시하였다. 행동데이터에 대한 그룹간 비교에 대한 통계적 유의성은 일원변량분석(one-way analysis of variance) (ANOVA, SPSS 12.0 version; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 및 Tukey’s 테스트로 결정하였다. P<0.05의 결과를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험결과
1. 경색 및 부종 부피 측정
뇌 손상은 2시간 혈관을 폐색시킨 후에 22시간 재관류한 랫트 뇌 조직내에서 뇌경색 총 영역을 정량하여 평가하였다. 랫트 뇌 조직의 전형적인 TTC 염색 패턴은 도 1의 패널 A에 나타내었다. 부형제 처리한 MCAO 실험동물의 경우는 뇌 경색 영역이 현저히 증가하여 전체 뇌 영역의 47.5％까지 증가하였다(도 1의 패널 B 참조). 또한, 중뇌동맥폐색(MCAO) 뇌의 경우는 부종의 부피가 8.05％까지 현저히 증가하였다(도 1의 패널 C). 그러나, 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)를 미리 투여한 경우에는 용량 의존적으로 뇌경색 부피를 현저하게 감소시켰다(10 mg/kg 및 32 mg/kg의 투여의 경우 뇌경색 부피가 각각 26.6％ 및 7.3％으로 감소) (도 1의 패널 B 참조). 또한, 백장미꽃추출물-부탄올분획물은 뇌의 부종도 32 mg/kg의 농도에서 거의 정상수준까지 감소시켰다(도 1의 패널 C 참조).
2. 지질과산화물(MDA) 및 산화질소(NO) 생성
중뇌동맥폐색(MCAO)를 행한 뇌에서, 인지질의 과산화 대사물인 말론디알데히드(MDA)의 수준이 모의수술 대조군의 수치(46.7 nmol/g)과 비교하여 유의성있게 증가하였다(81.0 nmol/g) (도 2의 패널 A 참조). 그러나, 지질과산화 수준은 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF) 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되었다(10 mg/kg 및 32 mg/kg에서 각각 61.4 nmol/g 및 50.6 nmol/g). 반응성 라디칼이 염증과정에서 관련되어 있기 때문에, 부형제 처리된 중뇌동맥폐색(MCAO) 랫트의 뇌척수액내에서의 NO 농도가 56.7 μmol/L으로 모의수술 대조군 30.4 μmol/L의 2배 수준으로 증가하였다(도 2의 패널 B 참조). 증가된 NO의 수준은 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)을 10 mg/kg 및 32 mg/kg으로 전처리한 경우, 각각 41.5 μmol/L 및 32.5 μmol/L으로 감소하였으며, 32 mg/kg의 장미꽃 추출물을 처리한 경우에는 NO의 수준을 거의 완전히 억제하였다.
3. 성상교세포 활성화
뇌 손상의 지표인 성상교세포증(astrogoliosis)의 수준인 활성화된 성상세포의 수는 중뇌동맥폐색 랫트의 뇌실하영역(subventricular zone)과 선조체(striatum)에서 크게 증가하였으며, 반응은 선조체에서보다 뇌실하영역에서 더 크게 나타났다(도 3). 그러나, 흥미롭게도 성상교세포 활성화는 뇌실하영역 및 선조체 모두에서 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF, 32 mg/kg)을 전처리한 경우 정상수준까지 현저하게 억제되었다(도 3의 패널 C).
4. 염증매개인자의 발현
라디칼 반응에 수반되는 염증성 반응에 의해 매개되는 뇌 손상의 메커니즘을 규명하기 위해, 랫트 뇌에서의 iNOS, COX-2 및 GFAP 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 분석하였다. 염증매개인자 NO 및 PGs를 생산하는 효소인 iNOS 및 COX-2의 발현은 MCAO 랫트 뇌에서 정상 뇌의 수준에 비해 각각 4배 이상 크게 증가하였다(도 4 참조). 흥미롭게도, GFAP 발현도 iNOS 및 COX-2와 유사한 수준으로 증가하였다. GFAP 발현이 저용량(10 mg/kg)에서 더욱 반응성이 좋았지만, 증가된 효소 및 GFAP의 모든 발현은 용량 의존적 방식으로 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 전처리에 의해 현저히 감소되었다.
5. 신경행동기능 측정 결과
중뇌동맥폐색 처리한 랫트의 운동협응력(motor coordination)은 크게 손상되어 회전봉 위에서 떨어지지 않고 머무는 시간(latency time)이 정상(모의수술) 동물에서의 118초로부터 23초로 감소하였다(도 5의 패널 A). 그러나, 중뇌동맥폐색 처리 랫트에서의 이러한 감소된 머무름 시간은 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 전처리에 의해 용량 의존적으로 현저하게 회복되었다. 실험동물의 전체적인 활동성을 평가하기 위해, 휴식, 느린 움직임 및 빠른 움직임의 시간을 자발운동량측정기(locomotor activity system)로 분석하였다. 모의수술 대조군에서의 장시간의 움직임 시간에 반하여, 중뇌동맥폐색 처리한 동물의 휴식의 시간은 65％까지 증가한 반면, 느린 움직임 및 신속한 움직임 시간은 각각 30％ 및 6％까지 감소하였다(도 5의 패널 B). 놀랍게도, 중뇌동맥폐색 처리 랫트의 신체적 활동성의 감소는 백장미꽃추출물-부탄올분획물(WRPE-BF)의 전처리에 의해 용량 의존적 방식으로 회복되어, 휴식 시간은 감소되고 움직임 시간은 증가하였다.
고찰
본 발명자들은 백장미꽃 추출물이 신경행동기능을 회복시킴으로써 중뇌동맥폐색(MCAO) 모델 동물의 허혈-재관류 뇌 손상에 대해 보호활성을 갖는다는 것을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 백장미꽃 추출물이 성상교세포 활성화와 지질과산화반응을 유도하는 염증성 매개인자의 생산을 담당하는 효소의 발현을 억제하였음을 확인하였다. 신체 기능결손(functional deficit)은 뇌손상을 가진 환자 및 뇌 허혈 동물 모델에 있어서 일반적으로 발생되는 신경학적인 후속 결과이다. 행동 파라미터는 실험적인 국소 뇌 허혈에 수반하는 기능적 손상과, 손상의 위중도의 중요한 지시자로서의 감각운동성 기능손상의 정도를 측정하는 유용한 측정수단이다(Rogers and Hunter, 1997). 본 발명자들의 종전 연구결과에 의하면, 신경행동손상은 중뇌동맥폐색(MCAO) 랫트의 뇌 경색 부피와 관련이 있으며, 재관류는 허혈에 의해 시작된 뇌손상을 촉진시킨다는 사실을 입증하였다(Choi et al., 2011a; Park et al., 2011a).
본 발명의 결과에서는, 신체적 활동성과 운동기능이 MCAO를 시행한 실험동물에서 심각하게 손상되었음을 확인하였다. 또한, 실험동물에서 TTC 염색으로 확인되는 바와 같이 경색부위가 현저히 나타났으며, 현저히 변화된 행동양식과 더불어 부종을 확인하였다. 놀랍게도, 백색장미꽃 추출물 처리에 의해 경색부위의 크기 및 부종이 감소하였을 뿐만 아니라, 행동손상이 개선되었는데, 이는 신경보호작용과 기능의 회복이 잘 연관되어 있다는 것을 보여준다. 허혈성 뇌손상의 생화학적 메카니즘은 매우 광범위하게 연구되어 있다. 최근의 연구결과는 ROS에 의한 간접적인 신호전달경로가 뇌 허혈 및 재관류에서 세포손상 및 세포사를 일으킬 수 있다는 증거를 제시하고 있다(Chan, 2001; Clark et al., 2001; Margaill et al., 2004). 재관류동안 생성되어 방출되는 과량의 ROS가 인지질, 단백질 및 DNA에 산화적 손상을 가하고 종국적으로 신경기능손상 및 사멸에 이르게 함으로써 뇌손상에서 주요한 역할을 수행한다(Chan, 1996; Park et al., 2011a). 허혈성 뇌졸중에서 자유라디칼 생성이 증대되어 뇌졸중 환자에게 손상을 일으키는 TBARS (MDA) 및 지질과산화물(lipid peroxide, LOOH)과 같은 지질과산화 생성물의 혈장, 혈액 및 뇌조직에서의 수준을 증가시킨다(Pan et al., 2009; Thaakur and Sravanthi, 2010). 본 발명의 실험결과에서, MCAO 처리한 랫트의 뇌에서 MDA는 75％ 증가하여 심각한 조직 손상이 발생되었음을 나타내었다. 흥미롭게도, 백장미꽃 추출물이 MDA의 수준을 현저히 감소시켰다. 성상교세포는 뇌에서 가장 풍부하게 존재하는 세포 중 하나이고 뇌염증 과정에서 염증성 매개인자의 중요한 원천이 된다(Mojsilovic-Petrovic et al., 2007). MCAO 랫트의 뇌척수액에서의 NO 농도가 크게 증가하였으며, 이는 iNOS 단백질의 발현이 증가하였기 때문인 것으로 추정될 수 있다. 흥미롭게도, iNOS-NO 경로의 활성화는 활성화된 성상교세포 수의 증가와 일치하였으며, 이는 GFAP 생성의 상향조절을 확인함으로써 추가 입증되었다. 그러나, 성상세포의 활성화와 iNOS의 증가 모두는 백장미꽃 추출물에 의해 억제되었다.
COX-2는 흥분성 뉴런에서 항상적으로 발현된다(Nogawa et al., 1997). 뇌 허혈에 수반하여, COX-2 mRNA와 단백질은 상향 조절되어 허혈후 12-24 시간에 최고 수준에 이른다(Nogawa et al., 1997). 허혈성 뇌에서 iNOS에 의해 생성된 NO가 COX-2의 활성을 증대시키는 뇌 허혈의 작용 메카니즘에서 COX-2가 해로운 작용을 수행한다는 것과 iNOS-양성 세포가 COX-2-양성 뉴런에 근접하게 위치한다는 것이 제안되었다(Nogawa et al., 1998). 활성화된 성상교세포는 iNOS 뿐만 아니라 염증성 COX-2의 중요한 원천이다(Mojsilovic-Petrovic et al., 2007). 본 발명의 실험결과에 의하면 iNOS 및 COX-2의 발현의 동시적 증가가 백장미꽃 추출물에 의해 유사한 용량 의존적 방식으로 하향조절되었다. 성상교세포증(astrogliosis)이라고 불리우는 성상교세포의 활성화는 뇌 손상의 결과라는 것이 잘 알려져 있으며, 활성화된 성상교세포가 조직의 손상을 더욱 악화시킨다. 따라서, 성상세포의 세포골격단백질인 GFAP의 발현증가는 신경조직손상의 정량 마커로 사용된다(Park et al., 2011c). 예상한 바와 같이, 백장미꽃 추출물은 신경보호효과를 나타내는 GFAP 발현 및 경색영역의 감소와 일치하게, 뇌실하영역 및 선조체에서 활성화된 성상교세포의 수를 감소시켰다. 본 발명의 실험결과를 종합하면, 백장미꽃 추출물은 성상교세포의 활성화, iNOS 및 COX-2의 발현 및 이어서 발생되는 NO 생성 및 지질과산화반응을 억제함으로써 뇌졸중의 중뇌동맥폐색(MCAO) 동물모델에서 신경보호효과를 발휘한다는 것이 입증된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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- 장미의 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물로서, 상기 장미의 종은 Rosa hybrida 이고, 상기 추출물은 장미의 꽃의 메탄올 추출물의 부탄올 분획물이며, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 또는 저산소성 뇌손상인 것을 특징으로 하는 조성물.
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- 장미의 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 개선용 식품 조성물로서, 상기 장미의 종은 Rosa hybrida 이고, 상기 추출물은 장미의 꽃의 메탄올 추출물의 부탄올 분획물이며, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 또는 저산소성 뇌손상인 것을 특징으로 하는 조성물.
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