KR101374696B1 - Staphylococcus pasteuri RSP-1 and its use - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식중독균 등의 유해균, 특히 항생제 내성 황색포도상구균의 생장 억제 활성이 뛰어난 신규 균주인 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P) 및 이러한 균주, 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 이용하는 것을 특징으로 하는 식중독균 등의 유해균 억제 방법에 관한 것이다.The present invention is Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P), a novel strain having excellent growth inhibitory activity against harmful bacteria such as food poisoning bacteria, particularly antibiotic resistant Staphylococcus aureus, and these strains, cultures or cultures thereof, or It relates to a method for inhibiting harmful bacteria, such as food poisoning bacteria, characterized in that using the antagonist separated from the culture or culture thereof.

Description

스타필로코코스 파스트리 RSP―1 및 이의 용도{Staphylococcus pasteuri RSP-1 and its use}Staphylococcus pastry RSP-1 and its use {Staphylococcus pasteuri RSP-1 and its use}

본 발명은 유해균의 생장 억제용 신규 균주(strain) 및 이의 용도에 관한 것이며, 특히 항생제 내성 황색포도상구균 등의 식중독균에 대한 생장 억제 활성을 가진 신규 균주 및 이러한 균주를 이용하여 농산물 등에서 식중독균의 생장을 억제하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel strain for inhibiting the growth of harmful bacteria and its use, and in particular to the growth of food poisoning bacteria in agricultural products and the like using novel strains having growth inhibitory activity against food poisoning bacteria, such as antibiotic resistant Staphylococcus aureus. It is about a method to suppress.

병원성세균 중 현재 전 세계적으로 가장 문제되고 있는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 전체 인구의 약 30%에서 검출되는 그람양성구균으로 병원 내 감염증을 유발하는 병원체로 널리 알려져 있다. 상기 유해균은 일차적으로 피부와 연부조직에 감염을 일으켜 농피증(pyoderma)의 원인이 되고, 골수염, 심내막염, 패혈증과 균혈증 등 생명을 위협하는 중한 전신 감염증을 유발할 수 있다. 페니실린, 메티실린 등 포도상구균 항균제는 그 효과가 우수하여 지난 오랫동안 감염증의 주요 치료약제로 사용되어 왔으나, 1961년 영국에서 메티실린에 내성을 보이는 균주(methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)가 처음 보고된 이후 전 세계적으로 항생제 내성 황색포도상구균이 지속적으로 증가하고 있다.Staphylococcus aureus, the world's most problematic pathogen, is a Gram-positive bacterium that is detected in about 30% of the entire population, and is widely known as a pathogen causing infection in hospitals. The harmful bacteria primarily cause skin and soft tissues to cause pyoderma, and may cause life-threatening serious systemic infections such as osteomyelitis, endocarditis, sepsis and bacteremia. Staphylococcal antibacterial agents, such as penicillin and methicillin, have been used as the main therapeutic agents for infectious diseases for a long time because of their excellent effects. Antibiotic-resistant Staphylococcus aureus continues to increase worldwide.

우리나라에서도 항생제의 무분별한 오남용으로 인한 내성 균주 출현은 특히 문제가 심각하다. 예를 들어, 메티실린 내성률은 50% 내외로 매우 높으며, 대한병원 감염관리학회가 최근 조사한 결과에 따르면 대부분의 대학병원과 종합병원에서 분리되는 MRSA 균주는 약 75%에 이른다.
In Korea, the emergence of resistant strains due to indiscriminate misuse of antibiotics is particularly problematic. For example, methicillin resistance rate is very high, around 50%, and according to a recent study by the Korean Institute for Infectious Disease Control, about 75% of MRSA strains are isolated from most university hospitals and general hospitals.

한편, 상기 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 이외에, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 등이 식중독을 일으킬 수 있다. 식중독(Food-poisoning)은 경구를 통한 병원체의 장관 내 감염에 의하여 구토, 설사와 같은 증상과 장내 균총의 변화를 나타나게 한다. 특히, 리스테리아 모노사이토제네스는 육류, 어패류, 치즈, 아이스크림, 냉동식품 등 대부분의 식품을 오염시키며 임산부, 신생아, 노약자에게 유산, 패혈증, 수막염, 식중독을 일으키는 치명적인 병원균이다. 이러한 리스테리아 모노사이토제네스는 고염분, 고당분, 건조 등 삼투압 스트레스를 받을 경우 세포 내에 삼투보호물질인 osmolyte를 축적함으로써 세포내 팽압을 유지하여 증식할 수 있으며, 또 저온(4℃)에서도 증식이 가능하며 열처리 공정에서 생존할 수 있어 식품 위생학적인 측면에서 관심이 집중되고 있다.
Meanwhile, in addition to Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Bacillus cereus may cause food poisoning. Food-poisoning causes symptoms such as vomiting and diarrhea and changes in the intestinal flora caused by oral intestinal infection of pathogens. In particular, Listeria monocytogenes pollutes most foods such as meat, shellfish, cheese, ice cream, frozen foods, and is a deadly pathogen that causes miscarriage, sepsis, meningitis, and food poisoning in pregnant women, newborns, and senior citizens. When Listeria monocytogenes is subjected to osmotic stress such as high salinity, high sugar content and dryness, the osmolyte, which is an osmolyte, accumulates in the cell, thereby maintaining intracellular swelling and proliferating at low temperature (4 ° C). As it can survive in the heat treatment process, attention has been focused on food hygiene.

한편, 식중독 미생물의 증식을 억제하는 보존제로 화학제제가 상업적으로 사용되고 있으나 근래 소비자의 건강 지향적 욕구의 증대와 안정성의 문제로 인해 합성 보존제의 기피 현상이 두드러지고 있다. 이러한 문제점에 대처하기 위해서 인체에 무해한 천연 항균활성 물질의 개발에 관심이 집중되고 있다. 특히, 항생제 내성 유해균을 효과적으로 억제할 필요성이 매우 높다.
On the other hand, chemical preservatives have been used commercially as a preservative to inhibit the growth of food poisoning microorganisms, but the recent phenomenon of avoiding synthetic preservatives has been prominent due to the increase of health-oriented needs and stability of consumers. In order to cope with these problems, attention is focused on the development of a natural antimicrobial active material harmless to the human body. In particular, there is a great need to effectively suppress antibiotic resistant harmful bacteria.

1. 한국 공개특허공보 공개번호 제10-2008-0083840호1. Korean Unexamined Patent Publication No. 10-2008-0083840 2. 한국 등록특허공보 등록번호 제10-0715730호2. Korean Registered Patent Publication No. 10-0715730

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 유해균, 특히 식중독균, 더 나아가 항생제 내성 유해균의 생장을 효과적이고 환경 친화적인 방법으로 억제할 수 있는 신규 균주 및 이러한 균주를 이용해 농산물, 식품 등에서 유해균의 생장을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
Therefore, the technical problem to be achieved by the present invention is to inhibit the growth of harmful bacteria, in particular food poisoning bacteria, and furthermore antibiotic-resistant harmful bacteria in an effective and environmentally friendly way, and using these strains to suppress the growth of harmful bacteria in agricultural products, food, etc. To provide a way.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 식중독균 등의 유해균, 특히 항생제 내성 황색포도상구균 등의 생장을 효과적으로 억제하는 신규 균주인 스타필로코코스 파스트리(Staphyloccus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P)을 제공한다.In order to achieve the above technical problem, the present invention provides a novel strain Staphyloccus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P), which effectively suppresses the growth of harmful bacteria such as food poisoning bacteria, especially antibiotic resistant Staphylococcus aureus do.

본 발명자들은 농산물에서 분리한 400여 Staphylococcus 균들 중에서 항생제 내성 황색포도상구균에 대해 길항력을 가지는 Staphylococcus pasteuri RSP-1 선발하였으며, 이러한 선발된 Staphylococcus pasteuri RSP-1에 기존에 보고된 박테리오신 생산 유전자가 없음을 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 확인하였다.The present inventors have selected Staphylococcus pasteuri RSP-1 which has an antagonistic resistance against antibiotic resistant Staphylococcus aureus among 400 Staphylococcus bacteria isolated from agricultural products, and there is no bacteriocin producing gene previously reported in the selected Staphylococcus pasteuri RSP-1. It was confirmed using a PCR (polymerase chain reaction).

또한, 선발된 Staphylococcus pasteuri RSP-1는 황색포도상구균뿐만 아니라 Listeria monocytogenes, Bacillus cereus 등 그람양성 식중독 세균에 대해서도 높은 길항력을 나타내었다. In addition, the selected Staphylococcus pasteuri RSP-1 exhibited high antagonism against Gram-positive food poisoning bacteria such as Listeria monocytogenes and Bacillus cereus as well as Staphylococcus aureus.

본 발명에 따른 Staphylococcus pasteuri RSP-1 균주는 통상적인 스타필로코코스 속 미생물의 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, NB(nutrient broth), TSB(tryptic soy broth) 액체 배지, 또는 TSA(tryptic soy agar) 고체배지 등을 사용할 수 있다. 배양은 통상의 배양 조건으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 약 37℃에서 약 10-72시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동 건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. Staphylococcus pasteuri RSP-1 strain according to the present invention can be cultured in large quantities by a conventional method for culturing Staphylococcus microorganisms. As the culture medium, a medium composed of carbon source, nitrogen source, vitamins and minerals can be used. For example, NB (nutrient broth), TSB (tryptic soy broth) liquid medium, or TSA (tryptic soy agar) solid medium can be used. Incubation can be carried out under conventional culture conditions, for example at about 37 ° C. for about 10-72 hours. Centrifugation or filtration may be performed to remove the culture medium in the culture and recover only concentrated cells, and this step may be performed according to the needs of those skilled in the art. The concentrated microbial cells can be preserved by freezing or freeze-drying according to a conventional method so as not to lose their activity.

또한, 본 발명에 따른 미생물은 당업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량될 수 있다.
In addition, the microorganism according to the present invention may be improved or improved to have equivalent activity or better activity by conventional physicochemical mutation methods and the like known in the art.

본 발명은 또한 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P)의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 제공한다.The invention also provides an antagonist isolated from the culture or culture of Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P).

본 발명의 길항물질은 단백질로서 열안정성 및 pH안전성을 가지고 이를 수백배 희석하여도 그 길항력을 유지하므로, 유해균 생장 억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.The antagonist of the present invention has a thermal stability and pH safety as a protein and maintains its antagonism even when diluted several hundred times, it can be usefully used as a composition for inhibiting harmful bacteria growth.

상기 길항물질은 당업계에 공지된 통상의 방법으로 분리할 수 있으나, 바람직하게 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P)을 배양한 후 원심분리하여 배양 상등액을 회수하는 단계; 상기 배양 상등액에 소수성 레진을 넣고 20-25 ℃에서 6-10 시간 동안 흡착시키는 단계; 흡착하지 않고 남은 배양 상등액을 제거하고 세척한 다음 0.1% TFA(trifluorothioacetate)을 함유하는 70% 2-프로판올로 희석하는 단계; 및 상기 희석액을 증류시키고 pH 6-9의 Tris-Cl 버퍼에 현탁하여 길항물질을 분리하는 단계를 포함하여 분리할 수 있다. The antagonist may be separated by a conventional method known in the art, but preferably, after culturing Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P) to recover the culture supernatant; Adding hydrophobic resin to the culture supernatant and adsorbing at 20-25 ° C. for 6-10 hours; Removing the remaining culture supernatant without adsorption, washing and diluting with 70% 2-propanol containing 0.1% trifluorothioacetate (TFA); And distilling the diluting solution and suspending it in Tris-Cl buffer at pH 6-9 to separate the antagonist.

또는, 바람직하게 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P)을 배양한 후 원심분리하여 배양 상등액을 회수하는 단계; 상기 배양 상등액에 10-40% 황산암모늄을 첨가하여 생긴 황산암모늄 침전물을 원심분리하여 제거하고, 여기에 50-70% 황산암모늄을 첨가하여 생긴 황산암모늄 침전물을 원심분리하여 제거하고, 그리고 여기에 80-90% 황산암모늄을 첨가하여 생긴 황산암모늄 침전물을 수득하는 단계; 상기 수득한 황산암모늄 침전물을 pH 6-9의 Tris-Cl 버퍼에 현탁하고 열처리한 후 생성된 침전물을 제거하는 단계; 및 상기 침전물 제거하고 남은 상등액을 50kDa 구멍 크기의 막에 투과시켜 길항물질을 분리하는 단계를 포함하여 분리할 수 있다.
Or, preferably, culturing Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P) and then centrifuging to recover the culture supernatant; The ammonium sulfate precipitate formed by adding 10-40% ammonium sulfate to the culture supernatant was removed by centrifugation, and the ammonium sulfate precipitate formed by adding 50-70% ammonium sulfate was removed by centrifugation, and 80 Adding -90% ammonium sulfate to obtain the resulting ammonium sulfate precipitate; Suspending the obtained ammonium sulphate precipitate in Tris-Cl buffer at pH 6-9 and heat treatment to remove the resulting precipitate; And separating the antagonist by removing the precipitate and permeating the remaining supernatant to a membrane having a pore size of 50 kDa.

본 발명은 또한 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 포함하는 프로바이오틱 활성을 갖는 생균제를 제공한다. The invention also provides a probiotic with probiotic activity comprising Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P), its culture or culture, or an antagonist isolated from its culture or culture do.

또한, 본 발명은 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 유해균 억제용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention Staphylococcus pasteuri ( Staphylococcus pasteuri ) RSP-1 (KACC 91660P), a culture or culture thereof, or a composition for inhibiting harmful bacteria comprising an antagonist separated from the culture or culture thereof To provide.

상기 생균제 또는 조성물은 본 발명에 따른 균주의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균, 또는 이의 배양물 또는 배양액, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 유효성분으로 함유할 수 있으며, 적합한 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양액은 본 발명에 따른 균주를 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 생균제 또는 조성물은 고체배지 배양물, 또는 상기 배양액의 건조물 또는 추출물 등의 배양물을 함유할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The probiotic or composition may contain the antagonist isolated from the crushed cell wall fraction of the strain according to the present invention, live bacteria, dead bacteria, dry bacteria, or cultures or cultures thereof, or cultures or cultures thereof, Suitable excipients or carriers may further be included. The culture medium is culture medium itself in which the strain according to the invention cultured in a suitable liquid medium, the filtrate (filtered or centrifuged supernatant) from which the strain is removed by filtration or centrifugation, the culture solution is sonicated or dissolved in the culture solution Cell lysates obtained by treating enzymes (lysozyme), but are not limited thereto. In addition, the probiotic or composition may contain a culture medium such as a solid medium culture, or a dried product or extract of the culture solution, but is not limited thereto.

본 발명의 Staphylococcus pasteuri RSP-1, 또는 이의 배양액 또는 배양물이 이용될 수 있는 유해균으로는 스타필로코코스 아우레스(Staphylococcus aureus), 스타필로코코스 자일로서스(Staphylococcus xylosus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 잔쏘모나스 알빌리네안스(Xanthomonas albilineans) 등이 있으며, 특히 본 발명의 Staphylococcus pasteuri RSP-1는 스타필로코코스 아우레스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 등의 식중독균을 억제하는데 매우 유용하다.
Staphylococcus pasteuri RSP-1 of the present invention, or harmful bacteria that can be used as a culture or culture thereof may be Staphylococcus aureus , Staphylococcus xylosus, Staphylococcus xylosus, Bacillus cereus ), Clavibacter michiganensis , Listeria monocytogenes , Xanthomonas albilineans , and the like, and in particular, Staphylococcus pasteuri RSP-1 of the present invention is Staphylococcus aurea . It is very useful for suppressing food poisoning bacteria such as Staphylococcus aureus , Bacillus cereus and Listeria monocytogenes .

본 발명에 따른 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 유해균 억제용 조성물은 식품, 사료 첨가제, 또는 세제 첨가제 등으로 이용될 수 있다.
Staphylococcus pasteuri ( Staphylococcus pasteuri ) according to the invention RSP-1 (KACC 91660P), a culture or culture thereof, or a composition for inhibiting harmful bacteria comprising an antagonist separated from the culture or culture thereof It can be used as food, feed additives, detergent additives and the like.

따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 유해균 억제용 식품을 제공한다.Accordingly, the present invention is characterized in that it comprises a Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P), a culture or culture thereof, or an antagonist isolated from the culture or culture thereof. Provide food for suppressing harmful bacteria.

상기 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 본 발명에 따른 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이로부터 분리된 길항물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품, 특히 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명에 따른 조성물을 함유하는 건강식품으로는 상기 균주, 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이로부터 분리된 길항물질을 유효성분으로 하는 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 유해균 생장 억제를 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 각각을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품은 통상의 식품와 같이 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 외의 본 발명의 식품에는 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 조성물을 함유하는 식품은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 유해균 생장 억제용 식품은 인체에 부작용이 없으면서 유해균의 생장 억제에 우수할 뿐 아니라 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
There is no particular limitation on the kind of the food. Examples of Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P), a culture or a culture thereof, or a food to which an antagonist separated therefrom are added according to the present invention, such as meat, sausage, bread, Chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products, including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, food in the ordinary sense, In particular, it includes all health food. The health food containing the composition according to the present invention is for the purpose of inhibiting the growth of harmful bacteria such as tea, jelly, juice, extract, beverages, etc., wherein the strain, its culture or culture, or the antagonist isolated therefrom as an active ingredient. Folk remedies. When the composition according to the present invention is used as a food additive, each of the above may be added as it is or used with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. The food of the present invention may contain various flavors, sweeteners or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, like conventional foods. Natural carbohydrates described above include glucose, monosaccharides such as fructose, maltose, disaccharides such as sucrose, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As the sweetening agent, natural sweetening agents such as tautin and stevia extract, synthetic sweetening agents such as saccharin, aspartame, and the like can be used. Foods of the present invention other than the above include various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, And a carbonation agent used for the carbonated beverage. In addition, the food containing the composition according to the present invention may contain flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components may be used independently or in combination. Such harmful bacterium growth inhibiting food of the present invention is excellent in suppressing the growth of harmful bacteria without adverse effects on the human body, and is easy to take and can be stored for a long time. The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (prevention, health or therapeutic treatment).

본 발명은 또한 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 유해균 억제용 사료 첨가제 또는 이를 포함하는 사료 조성물을 제공한다. The present invention also includes Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P), a culture or culture thereof, or an antagonist for inhibiting harmful bacteria, characterized in that it comprises an antagonist isolated from the culture or culture thereof. Or it provides a feed composition comprising the same.

본 발명의 사료첨가제는 식물 또는 동물 사료에 첨가할 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제는 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태일 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin),리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양 보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 사료와 별도로 투여할 경우, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 배양추출물의 투여 형태는 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 투여형은 정제,캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 사료 첨가제가 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다. 상기의 사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 사료에 첨가하여 이용될 수 있다. 본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물 (랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물 (예, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물 (예, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 애완 동물 (예, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다. 또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.
Feed additives of the present invention can be added to plant or animal feed. Feed additives of the present invention may be 20 to 90% high concentrate or in the form of powder or granules. The feed additives include organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid and malic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate and polyphosphate (polyphosphate), polyphenols, catechins (catechin) and lees extracts ( rosemary extract), vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, phytic acid and may further include any one or more of natural antioxidants. The feed additive of the present invention and the feed containing the same are supplementary ingredients such as amino acids, inorganic salts, vitamins, antibiotics, antimicrobials, antioxidants, antifungal enzymes, live microbial agents, etc. Wheat, oats, barley, corn and rice; Vegetable protein feedstuffs, for example, based on rapeseed, soybeans and sunflower; Animal protein feeds such as blood, meat, bone meal and fish meal; It is preferable to mix all of the dry ingredients comprising the sugar and the milk product such as the various powdered milk and the whey powder and the dry additive and then mix the liquid ingredient with the ingredient to be liquid after heating, In addition to the main components such as fat and vegetable fat, can be used together with materials such as nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, disease prevention agents and the like. The feed additive may be administered alone in combination with other feed additives in an edible carrier. In addition, the feed additives can be easily administered as a top dressing or directly mixed into the feed or separately from the feed, in a separate oral formulation, by injection or transdermal or in combination with other ingredients. Typically, a single daily dose or divided daily doses can be used, as is well known in the art. When the feed additive is administered separately from the feed, the dosage form of the culture extract, as is well known in the art, can be prepared in an immediate release or sustained release formulation in combination with a non-toxic pharmaceutically acceptable edible carrier. Such edible carriers may be solid or liquid, for example corn starch, lactose, sucrose, soy flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol. If a solid carrier is used, the dosage form may be a tablet, a capsule, a powder, a torokee or a sugar-containing tablet or a top dressing in an undispersible form. If a liquid carrier is used, it may be in the form of soft gelatin capsules or syrups or liquid suspensions, emulsions or solutions. In addition, the dosage form may contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution promoters and the like. In addition, the animal feed comprising the feed additive of the present invention may be any protein-containing organic wheat flour conventionally used to meet the dietary needs of the animal. Such protein-containing flours typically consist mainly of corn, soy flour, or corn / bean flour mixtures. The feed additive may be used by adding to the feed by dipping, spraying or mixing. The invention is applicable to a number of animal diets, including mammals, poultry and fish. More specifically, the diet is commercially important mammals such as pigs, cows, sheep, goats, laboratory rodents (rats, mice, hamsters and gerbils), furry animals (eg, mink and fox), and Zoo animals (eg monkeys and tailless monkeys), as well as pets (eg cats and dogs). Commercially important poultry typically include chickens, turkeys, ducks, geese, pheasants and quails. Commercially raised fish, such as trout, may also be included. Also, after the feed mixture is thoroughly mixed, lightly viscous granulation or granulation material is obtained depending on the degree of crushing of the components. It is fed as a mash or formed into the desired discrete shape for further processing and packaging. At this time, in order to prevent separation during storage, it is preferable to add water to the feed and then go through the usual pelletization, expansion, or extrusion process. Excess water can be dried off.

본 발명은 또한 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 유해균 억제용 세제 첨가제 또는 이를 포함하는 세제 조성물을 제공한다.The present invention also includes Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P), a culture medium or culture thereof, or a detergent additive for inhibiting harmful bacteria, wherein the antagonist is separated from the culture medium or culture thereof. Or it provides a detergent composition comprising the same.

본 발명에 따른 세제 조성물에는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온성, 비-이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 양이온성형태(zwitter ionic type), 또는 이것들의 혼합물일 수 있다. 음이온성 계면활성제의 대표적인 예로는 선형 알킬벤젠술폰산염(LAS), 알킬황산염(AS), 알파올레핀술폰산염(AOS), 알코올에톡시황산염(AES) 및 천연지방산의 알칼리금속염을 들 수 있다. 비-이온성 계면활성제의 예로는 알킬폴리에틸렌글리콜에테르, 노닐페놀 폴리에틸렌글리콜 에테르, 수크로스와 글루코스의 지방산에스테르, 및 폴리에톡실화 알킬글루코시드의 에스테르가 있다. 본 발명의 세제 조성물은 또한 연마제, 표백제, 표면활성제, 부식방지제, 금속봉쇄제, 얼룩-재침착 방지제, 향수, 효소 및 표백제의 안정화제, 제형 보조제, 광증백제, 거품부스터, 킬레이트화제, 충전제, 직물연화제등과 같은 당업계에서 공지된 다른 세제 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 세제 조성물은 분제, 액제 등의 임의의 편리한 형태로 제형화될 수 있다.
The detergent composition according to the invention may comprise one or more surfactants. The surfactant may be anionic, non-ionic, cationic, amphoteric or zwitter ionic type, or mixtures thereof. Representative examples of the anionic surfactants include linear alkylbenzene sulfonates (LAS), alkyl sulfates (AS), alpha olefin sulfonates (AOS), alcohol ethoxy sulfates (AES) and alkali metal salts of natural fatty acids. Examples of non-ionic surfactants include alkyl polyethylene glycol ethers, nonylphenol polyethylene glycol ethers, fatty acid esters of sucrose and glucose, and esters of polyethoxylated alkylglucosides. Detergent compositions of the present invention may also contain abrasives, bleaches, surfactants, corrosion inhibitors, metallurgical agents, stain-repositioning agents, perfumes, enzymes and bleach stabilizers, formulation aids, optical brighteners, foam boosters, chelating agents, fillers, And other detergent ingredients known in the art, such as fabric softeners and the like. Detergent compositions of the present invention may be formulated in any convenient form, such as powders, solutions.

본 발명은 또한 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질로 처리하는 것을 특징으로 하는 유해균을 억제하는 방법을 제공한다.
The invention also relates to Staphylococcus pasteuri ) RSP-1 (KACC 91660P), a culture or culture thereof, or a antagonist isolated from the culture or culture thereof provides a method for inhibiting harmful bacteria.

본 발명은 식중독균 등의 유해균, 특히 항생제 내성 황색포도상구균의 생장 억제 활성이 뛰어난 신규 균주인 Staphylococcus pasteuri RSP-1 및 이러한 균주, 이의 배양물 또는 배양액, 또는 이로부터 분리된 길항물질을 이용하는 것을 특징으로 하는 식중독균 등의 유해균 억제 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 특정 균주를 이용하여 농산물의 생산 및 유통과정의 오염으로 의한 농작물 손실을 줄일 수 있으며, 항생제 내성 미생물의 효과적인 제어가 가능하다.
The present invention is characterized by using Staphylococcus pasteuri RSP-1, a novel strain having excellent growth inhibitory activity against harmful bacteria such as food poisoning bacteria, particularly antibiotic resistant Staphylococcus aureus, and such strains, cultures or cultures thereof, or antagonists isolated therefrom. It provides a method for suppressing harmful bacteria such as food poisoning bacteria. By using a specific strain according to the present invention it is possible to reduce the loss of crops due to contamination of the production and distribution of agricultural products, it is possible to effectively control antibiotic resistant microorganisms.

도 1은 staphylococcus pasteuri RSP-1로부터 길항물질을 분리 농축하는 방법을 도시한 것이다.
도 2는 길항물질의 유해균 생장 억제 활성 평가 결과를 도시한 것이다.
도 3은 길항물질의 열안전성 시험 결과를 도시한 것이다.
1 is staphylococcus Shown is the separation and concentration of antagonists from pasteuri RSP-1.
Figure 2 shows the results of evaluation of the harmful bacteria growth inhibitory activity of the antagonist.
Figure 3 shows the results of the thermal stability test of the antagonist.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail to facilitate understanding of the present invention. However, the embodiments according to the present invention can be modified into various other forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following embodiments. Embodiments of the invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.

[실시예 1] Example 1 Staphylococcus pasteuriStaphylococcus pasteuri RSP-1 균주의 선별 Screening of RSP-1 Strains

농산물에서 분리한 400여 Staphylococcus 중에서 항생제 내성 황색포도상구균에 대해 길항력을 가지는 최적의 균주를 선별하였다.Among 400 Staphylococcus isolates from agricultural products, optimal strains with antagonistic activity against antibiotic resistant Staphylococcus were selected.

쌈채소, 새싹채소 등의 신선 농산물뿐만 아니라 식품, 동물, 사람 등에서 분리한 394개의 Staphylococci 균주 분리하였으며, 이들 중 주요 식중독 세균(예를 들어, Staphylococcus aureus) 346 균주를 대상으로 박테리오신 생성 균주 탐색하여 박테리오신을 생산하는 139개의 Staphylococci 균주를 1차 분리하였고, 다시 다양한 유해 식중독균에 대한 억제 활성을 평가하여 40개의 Staphylococci 균주를 2차 선별하였으며, 선별된 40개의 균주들 가운데서 활성이 상대적으로 가장 우수한 1 균주를 선별하였으며, 후술하는 16s rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석, 기타 생화학 분석 등을 통해 해당 균주가 Staphylococcus pasteuri임을 확인하고 이 균주를 Staphylococcus pasteuri RSP-1로 명명하였으며, 2011년 10월 4일자로 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC 91660P를 부여받았다.
Wrapping vegetables, bud vegetables, fresh produce was not only the food, separated 394 Staphylococci strains, etc. animals, people, the major food poisoning bacteria of which (for example, Staphylococcus aureus) 346 strain by the navigation bacteriocin producing strains intended for bacteriocins 139 Staphylococci strains were produced, and 40 strains of Staphylococci were selected by evaluating the inhibitory activity against various harmful food poisoning bacteria, and one of the 40 strains showed the highest activity. The strains were identified as Staphylococcus pasteuri through molecular systemic analysis and other biochemical analysis based on the 16s rDNA sequence described below. The strain was named Staphylococcus pasteuri RSP-1, and as of October 4, 2011. Korean Agricultural Culture Collection (KACC) And was assigned accession number KACC 91660P.

[실시예 2] 선별된 균주인 Example 2 Selected Strains Staphylococcus pasteuriStaphylococcus pasteuri RSP-1의 동정, 균학적 성질 및 배양조건 평가 Identification, fungal properties and culture conditions of RSP-1

형태학적 분석Morphological analysis

본 발명의 선별된 균주를 TSA 평판 배지에서 배양하고 콜로니의 형태를 현미경으로 관찰하였다. 선발한 균주의 콜로니 형태는 하기 표 1에 나타내었다.Selected strains of the invention were incubated in TSA plate medium and the morphology of the colonies was observed under a microscope. Colony forms of the selected strains are shown in Table 1 below.

Figure 112011100324826-pat00001
Figure 112011100324826-pat00001

당 이용성 분석Sugar usability analysis

본 발명에 따른 균주의 당이용성을 조사하였다. 당 발효 특성은 API StaphID 키트(Bio Merioux사)를 이용하여 공급회사의 실험방법에 따라 조사하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.The sugar availability of the strain according to the present invention was investigated. Sugar fermentation characteristics were investigated in accordance with the experimental method of the supplier using the API StaphID kit (Bio Merioux), the results are shown in Table 2 below.

Figure 112011100324826-pat00002
Figure 112011100324826-pat00002

16S 16S rDNArDNA 분석 analysis

선발된 균주를 동정하기 위해 16S rDNA 염기서열분석을 하였으며 그 결과는 서열번호 1에 나타내었다. 본 발명의 선별 균주인 RSP-1는 Staphylococcus pasteuri와 99 %의 16S rDNA 상동성을 보여 분리된 균주는 Staphylococcus pasteuri 임을 확인하였다.
16S rDNA sequencing was performed to identify the selected strains and the results are shown in SEQ ID NO: 1. The RSP-1 selected strains of this invention was identified as a strain isolated showed 16S rDNA homology with Staphylococcus pasteuri 99% Staphylococcus pasteuri.

선발된 균주의 배양특성Culture Characteristics of Selected Strains

본 발명의 선별된 균주는 TSA(tryptic soy agar)에서 약 37℃에서 약 10-72시간 동안 배양하였다.
Selected strains of the present invention were incubated at about 37 ° C. for about 10-72 hours in tryptic soy agar (TSA).

[실시예 3] [Example 3] Staphylococcus pasteuriStaphylococcus pasteuri RSP-1 균주의 식중독균 억제 효과 평가 Evaluation of food poisoning inhibitory effect of RSP-1 strain

Staphylococcus Staphylococcus 속 균주들을 대상으로 한 1차 생장 억제 활성 분석Primary Growth Inhibitory Activity of the Genus Strains

본 발명에 따른 Staphylococcus pasteuri RSP-1가 항생제 내성 포도상구균에 대한 생장 억제 활성이 있는지 여부를 조사하기 위해, 항생제 내성 Staphylococcus xylosus, Staphylococcus aureusStaphylococcus pasteuri 다른 균주들의 생장에 미치는 영향을 분석하였다. 상기 항생제 내성 Staphylococcus aureus 균주들은 항생제 내성 균주은행으로부터 분양받았으며 Staphylococcus xylosus, Staphylococcus pasteuri 균주는 본 연구실에서 직접 분리 동정하였다. In order to investigate whether Staphylococcus pasteuri RSP-1 according to the present invention has a growth inhibitory activity against antibiotic resistant Staphylococcus aureus, the effects of antibiotic resistant Staphylococcus xylosus, Staphylococcus aureus and Staphylococcus pasteuri on the growth of other strains were analyzed. The antibiotic resistant Staphylococcus aureus strains were distributed from antibiotic resistant strain banks , and Staphylococcus xylosus, and Staphylococcus pasteuri strains were isolated and identified directly in the laboratory.

구체적으로, 항균활성 측정용 지시균들을 각각 TSA 배지(Tryptic soy 액체 배지)에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 멸균하여 45℃로 식힌 소프트 아가 배지(0.8% 아가)에 각 지시균 배양액을 1% 접종하였다. 지시균이 접종된 소프트 아가 배지를 일회용 배지접시에 부어 식혀 평판배지를 제조하였다. 제조된 평판 배지 위에 종이 디스크를 올려놓고 종이 디스크에 제조한 본 발명 균주 배양액을 10ul씩 점적한 후, 각 지시균의 최적성장온도에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 각 지시균에 대한 생육억제환(Clear zone)의 지름을 측정함으로써 각 균주들의 항균활성을 측정하였다. 생육억제환의 지름을 비교함으로써 각 균종별로 항균력이 높은 균주를 선발하였다. 선발된 균주의 항균활성을 나타내는 저지환의 지름 크기에 따라 - (생장을 억제하지 못함), + (저지환의 지름이 약 8mm이하), ++ (저지환의 지름이 약 8-10mm임) 및 +++ (저지환의 지름이 약 10mm 이상)으로 평가하였다. Specifically, the indicators for measuring antimicrobial activity were inoculated in TSA medium (Tryptic soy liquid medium), respectively, and incubated overnight at 37 ° C. 1% of each indicator culture medium was inoculated into soft agar medium (0.8% agar) cooled to 45 ° C. The soft agar medium inoculated with the indicator bacteria was poured into a disposable medium dish and cooled to prepare a plate medium. A paper disk was placed on the prepared flat medium, and the strain culture solution of the present invention prepared on the paper disk was instilled by 10ul, and then incubated at an optimal growth temperature of each indicator for 24 hours. After incubation, the antimicrobial activity of each strain was measured by measuring the diameter of the growth zone (Clear zone) for each indicator. By comparing the diameters of growth inhibition rings, strains with high antimicrobial activity were selected for each strain. Depending on the diameter size of the low-ring ring showing the antimicrobial activity of the selected strains-(not inhibiting growth), + (lower ring diameter less than about 8mm), ++ (low ring diameter is about 8-10mm) and ++ It evaluated as + (lower ring diameter about 10 mm or more).

그 결과를 하기 표 3 내지 5에 나타내었다.The results are shown in Tables 3 to 5 below.

Figure 112011100324826-pat00003
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Figure 112011100324826-pat00004
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Figure 112011100324826-pat00005
Figure 112011100324826-pat00005

상기 표 3 및 5에 나타나는 바와 같이, 본 발명에 따른 새로운 균주인 Staphylococcus pasteuri RSP-1은 황색 포도상구균에 속하는 다양한 균주들에 있어 생장 억제 활성을 나타내었다. 또한 상기 표 4에 나타나는 바와 같이, 동일한 Staphylococcus pasteuri에 속하는 다른 일부 균주들에 대해서도 생장 억제 활성을 나타내었다.
As shown in Tables 3 and 5, Staphylococcus pasteuri RSP-1, a new strain according to the present invention, showed growth inhibitory activity in various strains belonging to Staphylococcus aureus. In addition, as shown in Table 4, it showed growth inhibitory activity for some other strains belonging to the same Staphylococcus pasteuri .

Staphylococcus Staphylococcus 외 다른 속 균주들을 대상으로 한 2차 생장 억제 활성 분석Analysis of Secondary Growth Inhibition Activity in Other Strains

선별된 Staphylococcus pasteuri RSP-1의 세균 생장 억제 활성을 황색포도상 구균뿐만 아니라 Listeria monocytogenes, Bacillus cereus 등 다른 항생제 내성 그람양성 식중독 세균에 대해서도 확인하였다. 상기 항생제 내성 그람양성 식중독 세균들은 모두 항생제 내성 균주은행으로부터 분양받았다. 실험방법은 상기 1차 생장 억제 활성 분석과 동일하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.Selected Staphylococcus Inhibition of bacterial growth of pasteuri RSP-1 by Listeria as well as Staphylococcus aureus monocytogenes , Bacillus Other antibiotic resistant Gram-positive food poisoning bacteria such as cereus were also identified. The antibiotic resistant Gram-positive food poisoning bacteria were all distributed from an antibiotic resistant strain bank. Experimental method was the same as the primary growth inhibitory activity assay. The results are shown in Table 6 below.

Figure 112011100324826-pat00006
Figure 112011100324826-pat00006

상기 표 6에 나타나는 바와 같이, 선별된 Staphylococcus pasteuri RSP-1은 황색포도상 구균뿐만 아니라 Listeria monocytogenes, Clavibacter michiganensis , Xanthomonas albilineans , Bacillus cereus KCTC1092 에 대해서도 생장 억제 활성을 나타내었다.
As shown in Table 6 above, selected Staphylococcus pasteuri RSP-1 is a Listeria as well as Staphylococcus aureus monocytogenes , Clavibacter michiganensis , Xanthomonas albilineans , and Bacillus cereus KCTC1092 also showed growth inhibition activity.

[[ 실시예Example 4]  4] StaphylococcusStaphylococcus pasteuripasteuri RSPRSP -1의 박테리오신 연구-1 Bacteriocin Study

먼저 선별된 Staphylococcus pasteuri RSP-1가 기존에 보고된 박테리오신 생산 유전자를 가지고 있는지 여부를 PCR을 이용하여 확인하였다. 하기 표 7은 다양한 Staphylococcus 속 균들에 존재하는 것으로 알려진 Staphylococcin 생산 유전자들의 PCR primer 서열이다.First, it was confirmed by PCR whether the selected Staphylococcus pasteuri RSP-1 has a previously reported bacteriocin producing gene. Table 7 shows various Staphylococcus PCR primer sequences of Staphylococcin-producing genes known to be present in the genus.

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Figure 112011100324826-pat00007

확인 결과 본 발명의 Staphylococcus pasteuri RSP-1는 기존에 보고된 박테리오신 생산 유전자를 가지고 있지 않았으며, nukacin 생산 유전자를 클로닝하고 서열을 분석한 결과 Staphylococcus pasteuri RSP-1의 박테리오신 생산 유전자는 기존의 nukacin 생산 유전자와는 상이한 서열을 가짐을 확인할 수 있었다.
Check result Staphylococcus of the present invention pasteuri RSP-1 did not have a previously reported bacteriocin-producing gene, and cloned and sequenced the nukacin-producing gene, Staphylococcus The bacteriocin-producing gene of pasteuri RSP-1 was confirmed to have a different sequence from the nukacin-producing gene.

[실시예 5] [Example 5] Staphylococcus pasteuriStaphylococcus pasteuri RSP-1로부터 길항물질의 분리 농축 Separation and Concentration of Antagonists from RSP-1

소수성 레진(resin)과의 상호작용을 이용한 방법Method using interaction with hydrophobic resin

상등액 400㎖ 에 XAD-16 레진 20g을 넣고 23℃에서 6시간 동안 상호작용을 유도하였다. 그 다음 상등액을 제거하고 증류수 100㎖로 세척한 다음, 다시 40% 에탄올 100㎖로 세척하였다. 그 후 0.1% TFA을 함유하는 70% 2-프로판올 400㎖로 희석시킨 다음, 40℃ 진공 상태에서 증류시키고 pH 8.0의 20mM Tris-Cl 버퍼에 현탁하여 길항물질만을 분리 농축하였다(도 1 좌측).
20 g of XAD-16 resin was added to 400 ml of the supernatant, and the interaction was induced at 23 ° C. for 6 hours. Then, the supernatant was removed, washed with 100 ml of distilled water, and then again with 100 ml of 40% ethanol. It was then diluted with 400 ml of 70% 2-propanol containing 0.1% TFA, then distilled under vacuum at 40 ° C. and suspended in 20 mM Tris-Cl buffer at pH 8.0 to isolate and concentrate only the antagonist (FIG. 1 left).

황산암모늄 침전을 이용한 방법Method using Ammonium Sulfate Precipitation

황산암모늄 30% 침전물을 원심분리로 제거하고 60%까지 침전 후, 다시 60% 침전물을 원심분리로 제거하고 상등액을 다시 80%까지 침전한 다음, 이 침전물을 pH 8.0의 20mM Tris-Cl 버퍼에 현탁하여 100℃에서 30분간 열처리하였다. 열처리를 통해 다량의 단백질이 변성하여 침전하게 되고 이러한 침전물을 원심분리로 제거하여 최종적으로 남은 상등액을 사용하여 50kDa pore size의 memebrane으로 분리 농축하였다(도 1 우측).
30% precipitate of ammonium sulfate was removed by centrifugation and precipitated up to 60%, then 60% precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was again precipitated to 80%, and the precipitate was suspended in 20 mM Tris-Cl buffer at pH 8.0. Heat-treated at 100 ° C. for 30 minutes. Through heat treatment, a large amount of protein was denatured and precipitated. The precipitate was removed by centrifugation, and finally, the remaining supernatant was separated and concentrated to 50 kDa pore size memebrane (right side of FIG. 1).

[실시예 6] [Example 6] Staphylococcus pasteuriStaphylococcus pasteuri RSP-1로부터 분리 농축된 길항물질의 유해균 생장 억제 활성 평가 Evaluation of Hazardous Bacteria Growth Inhibitory Activity of Concentrated Antagonists from RSP-1

실시예 5의 방법을 통해 얻은 길항물질을 2배, 4배, 8배, 16배, 32배, 64배, 128배 희석하여 이들의 길항력을 검사하였다. 그 결과, 2배 희석한 경우는 물론이고 128배 희석한 경우에도 길항력을 확인할 수 있었다 (도 2).
The antagonists obtained through the method of Example 5 were diluted 2 times, 4 times, 8 times, 16 times, 32 times, 64 times and 128 times to test their antagonism. As a result, the antagonist was confirmed even when diluting 128 times as well as diluting 128 times (FIG. 2).

[실시예 7] [Example 7] Staphylococcus pasteuriStaphylococcus pasteuri RSP-1로부터 분리 농축된 길항물질의 특성 평가 Characterization of Antagonists Concentrated and Separated from RSP-1

길항물질의 열안전성 확인 Thermal safety of antagonists

실시예 5의 방법을 통해 얻은 길항물질을 80, 90, 100℃에서 각각 10, 20, 30분간 열처리 한 후 활성을 검사하였다. 그 결과, 100℃에서 30분간 열처리를 하여도 매우 안전하여 길항력에 변화가 없었고, 모든 경우에 열안전성을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 3).
The antagonists obtained through the method of Example 5 were heat treated at 80, 90, and 100 ° C. for 10, 20, and 30 minutes, respectively, and then tested for activity. As a result, even after the heat treatment for 30 minutes at 100 ℃ it was very safe there was no change in the antagonism, it was confirmed that the thermal stability in all cases (Fig. 3).

길항물질의 pH 안전성 확인Confirmation of pH Safety of Antagonists

실시예 5의 방법을 통해 얻은 길항물질에 대한 pH 안전성을 확인한 결과, pH 4~10까지 비교적 폭넓은 범위에서 활성을 나타내었으며 특히 pH 7~8사이에서 높은 활성을 나타냈다.
As a result of confirming the pH safety of the antagonist obtained through the method of Example 5, it showed activity in a relatively wide range up to pH 4-10, particularly high pH between 7-8.

길항물질의 단백질 분해효소 민감성 확인Protease Sensitivity of Antagonists

실시예 5의 방법을 통해 얻은 길항물질에 다양한 단백질 분해효소를 처리한 후, 70℃에서 10분간 열처리로 상기 단백질 분해효소의 활성을 제거한 다음 길항물질의 길항력을 확인하였다. 그 결과, 단백질 분해효소의 처리 후 활성이 사라지는 현상을 통해 길항물질이 단백질성 물질임을 확인할 수 있었다. After treating the antagonist obtained by the method of Example 5 with various proteases, the activity of the protease was removed by heat treatment at 70 ° C. for 10 minutes, and then the antagonist of the antagonist was confirmed. As a result, it was confirmed that the antagonist is a proteinaceous substance through the phenomenon that the activity disappears after the treatment of the protease.

Figure 112011100324826-pat00008
Figure 112011100324826-pat00008

국립농업과학원 농업유전자원센터National Institute of Agricultural Science KACC91660PKACC91660P 2011100420111004

Claims (13)

스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P). Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P). 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물을 포함하는 프로바이오틱 활성을 갖는 생균제. Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P), a probiotic having probiotic activity, including a culture or a culture thereof. 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물을 포함하는 유해균 억제용 조성물,
상기 유해균은 스타필로코코스 아우레스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 또는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 포함하는 식중독균, 스타필로코코스 자일로서스(Staphylococcus xylosus), 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis) 및 잔쏘모나스 알빌리네안스(Xanthomonas albilineans)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 유해균인 것을 특징으로 함.
Staphylococcus pasteuri RSP-1 (KACC 91660P), a composition for inhibiting harmful bacteria comprising a culture medium or a culture thereof,
The harmful bacterium is Staphylococcus aureus , Bacillus cereus , or food poisoning bacteria, including Listeria monocytogenes , Staphylococcus xylosus , Clavibacter madga Clavibacter michiganensis and Xanthomonas albilineans ( Xanthomonas albilineans ) characterized in that at least one harmful bacteria selected from the group consisting of.
삭제delete 삭제delete 스타필로코코스 파스트리(Staphylococcus pasteuri) RSP-1 (KACC 91660P), 이의 배양액 또는 배양물로 처리하는 것을 특징으로 하는 유해균을 억제하는 방법,
상기 유해균은 스타필로코코스 아우레스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 또는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 포함하는 식중독균, 스타필로코코스 자일로서스(Staphylococcus xylosus), 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis) 및 잔쏘모나스 알빌리네안스(Xanthomonas albilineans)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 유해균인 것을 특징으로 함.
Staphylococcus pasteuri (Sphyphylococcus pasteuri ) RSP-1 (KACC 91660P), a method for inhibiting harmful bacteria, characterized in that the treatment with a culture or a culture thereof,
The harmful bacterium is Staphylococcus aureus , Bacillus cereus , or food poisoning bacteria, including Listeria monocytogenes , Staphylococcus xylosus , Clavibacter madga Clavibacter michiganensis and Xanthomonas albilineans ( Xanthomonas albilineans ) characterized in that at least one harmful bacteria selected from the group consisting of.
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