KR20120118570A - Lactococcus lactis et45 and use thereof - Google Patents

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KR20120118570A
KR20120118570A KR1020110036012A KR20110036012A KR20120118570A KR 20120118570 A KR20120118570 A KR 20120118570A KR 1020110036012 A KR1020110036012 A KR 1020110036012A KR 20110036012 A KR20110036012 A KR 20110036012A KR 20120118570 A KR20120118570 A KR 20120118570A
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lactococcus lactis
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김민수
윤병대
김중수
김차영
박찬선
양희종
전효곤
정성엽
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한국생명공학연구원
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Abstract

PURPOSE: A Lactococcus lactis ET 45 and an anti-microbial composition containing the same are provided to produce bacteriocin which shows wide range pH stability and thermal stability. CONSTITUTION: A Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) has a rearing control activity for food disease-causing germs. The Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) has antibacterial activity for Bacillus cereus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus dextrinicus, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus confuses, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc mesenteroides or Enterococcus faecium disease-causing germs. The Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) produces bacteriocin. The antimicrobial composition comprises Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), culture, or bacteriocin produced by the strain.

Description

락토코커스 락티스 (Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ) ＥＴ45 및 이의 용도 {Lactococcus lactis ET45 and Use Thereof}Lactococcus lactis ET45 and Use Thereof} Lactococcus lactis ET45 and its use

본 발명은 신규한 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) ET45에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 다양한 식품 병원성균에 대한 생육억제 활성을 갖는 김치 유래의 신규한 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) ET45, 이로부터 생산되는 박테리오신 및 그 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Lactococcus lactis ET45, and more particularly to a novel Lactococcus lactis ET45 derived from kimchi having growth inhibitory activity against various food pathogenic bacteria The bacteriocin produced and its use.

식품에 있어 오염지표 세균은 식품의 위생상태를 나타내며 이러한 세균들은 식품의 부패 및 변질을 일으켜 식품의 유통기간을 결정하는데 중요한 지표로 이용된다. 식중독은 식품이나 물을 매개로 하여 발생하는 급성 위장염 및 신경장애 등의 중독증상의 총칭으로 우리나라의 경우 식중독 발생의 대부분은 세균성 식중독에 기인하며, 세균성 식중독은 살모넬라, 장염 비브리오, 대장균 O157:H7, 캄프로박터, 여시니아 등을 포함하는 감염형, 황색 포도상 구균, 보툴리누스균을 포함하는 독소형, 클로스트리디움, 세레우스균을 포함하는 감염 독소형, 세균성 이질, 리스테리아, 연쇄상 구균, 슈도모나스 등을 포함하는 기타로 구분된다. 우리나라의 경우 식중독 세균은 감염형인 살모넬라, 장염 비브리오와 독소형인 황색 포도상 구균이 대표적이다 특히, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균은 자연계에 널리 분포하고 있어 원료단계에서 많은 오염이 이루어지기 때문에 현실적으로 차단이 쉽지 않은 식품유해미생물로 보고되어 있다.Contaminant indicators in food represent the hygiene of the food, and these bacteria are used as important indicators in determining the shelf life of food by causing food decay and deterioration. Food poisoning is a general term for poisoning symptoms such as acute gastroenteritis and neurological disorders caused by food or water. In Korea, most food poisoning is caused by bacterial food poisoning, and bacterial food poisoning is caused by Salmonella, enteritis vibrio, Escherichia coli O157: H7, Kam Infectious type including Probacter, Yexinia, etc., Staphylococcus aureus, Toxin type including Botulinus, Clostridium, Infectious toxin type including Cereus, Bacterial dysentery, Listeria, Streptococcus, Pseudomonas, etc. It is divided into other. In Korea, food poisoning bacteria include infectious Salmonella, enteritis Vibrio and toxin Staphylococcus aureus. In particular, Bacillus cereus is widely distributed in the natural world, so it is practically blocked because it is polluted at the raw material stage. It is reported as a food harmful microorganism.

현재 식품산업에서는 식품의 장기간 보존과 위생적 제조를 위한 천연보존제의 개발이 주요 문제로 제시되고 있다. 수년 전까지만 해도 저온저장을 통한 식품저장 및 유통이 최선책인 것으로 알려져 있었다. 그러나, 저온성 병원균인 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 등의 발견으로 인하여, 저온저장이 식품저장을 위한 완전한 수단이 아닌 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, 식품의 위생학적 안전성을 보장하기 위한 수단으로서, 저온저장 이외에도 식중독균 및 식품오염 미생물에 대해 항균효과가 큰 식품보존제의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 식품보존제는 주로 화학적 합성 보존제가 널리 사용되고 있으며, 현재 한국에서도 나프톨 유도체 등을 포함한 14 종의 화합물들이 식품에 사용할 수 있는 것으로 허용되고 있다. 그밖에도, 테트라사이클린(tetracycline)과 같은 일부 항생물질들을 식품에 사용하는 것이 검토되고 있으나, 이들 화학 식품보존제나 독성이 큰 항생물질의 사용은 소비자가 원하지 않고 있다. 따라서, 인체에 무해하고 식품과 함께 섭취 시 소화효소에 의해 쉽게 분해되는 항균성 펩타이드 계열의 천연보존제에 대한 관심이 증대되고 있다. 예를 들면, 니신(nisin)과 같은 항균성 펩타이드는 현재 47 개국에서 식품에 사용 가능한 것으로 허용되고 있다. In the current food industry, the development of natural preservatives for long-term preservation and hygienic manufacturing of food has been suggested as a major problem. Until a few years ago, food storage and distribution through cold storage were known to be the best option. However, due to the discovery of the low-temperature pathogen Listeria monocytogenes and the like, it has been found that cold storage is not a complete means for food storage. Accordingly, as a means for ensuring the hygienic safety of food, in addition to low temperature storage, the development of food preservatives having a large antibacterial effect against food poisoning bacteria and food contaminating microorganisms has been actively made. Food preservatives are mainly widely used in chemical synthetic preservatives, and currently 14 kinds of compounds including naphthol derivatives are allowed in Korea. In addition, some antibiotics such as tetracycline have been considered for use in foods, but consumers do not want to use these chemical food preservatives or highly toxic antibiotics. Therefore, there is a growing interest in antimicrobial peptide-based natural preservatives that are harmless to the human body and easily degraded by digestive enzymes when ingested with food. For example, antimicrobial peptides such as nisin are currently accepted for use in foods in 47 countries.

발효 미생물의 항균효과는 발효시 미생물이 성장하면서 생성하는 대사물질에 의한 것으로서, 항생제, 박테리오신(bacteriocin), 디아세틸, 아세트산, 젖산 등이 주요물질이다. 항균성 펩타이드 생산 균주로는 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 엔테로코커스(Enterococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium) 및 할로박테리움 (Halobacterium) 등이 있다. 이들이 생산하는 항균성 펩타이드들은 항균물질 생산균주 자신과 계통 분류학적으로 근접한 균종으로 제한되거나 광범위한 항균 스펙트럼을 나타낸다. 현재 이들은 일부 제품화되어 상용되고 있으며, 우유제품, 육제품, 사료제품, 곡류 등 여러 가지 식품 및 사료의 저장성 향상 및 위생화제 제조과정에도 사용될 수 있다.The antimicrobial effect of fermented microorganisms is due to the metabolites produced by the growth of microorganisms during fermentation, and antibiotics, bacteriocin, diacetyl, acetic acid and lactic acid are the main substances. Antimicrobial peptide producing strains include Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Corynebacterium and Halobacterium ( Halobacterium). The antimicrobial peptides they produce are limited to strains that are systematically close to the antimicrobial producing strain itself or exhibit a broad antimicrobial spectrum. Currently, these products are commercialized in part, and can be used for improving the shelf life of various foods and feeds such as milk products, meat products, feed products, grains, and sanitizing agents.

박테리오신은 미생물 유래 천연 단백질 또는 펩타이드계 항균물질로서 단백질로 구성되어 있기 때문에 일반적으로 인체에 무독성이고 잔류성이 없을 뿐만 아니라, 인체에 섭취시 소화효소에 의하여 분해되므로, 새로운 생물학적 보존제 또는 발효식품의 생물제어제로서 중요한 가치를 가지고 있다.Bacteriocin is a microbial-derived natural protein or peptide-based antimicrobial substance, and because it is composed of proteins, it is generally non-toxic and non-residual to humans, and is degraded by digestive enzymes when ingested in humans. Yesterday has significant value.

유산균(Lactic acid bacteria)은 젖산, 아세트산 등의 유기산, 박테리오신 등 여러 가지 항균물질을 생산한다고 알려지고 있으며 이들은 식품이나 사료의 중요한 생물학적 보존제가 될 수 있다고 알려지고 있다. 또한 각종의 생리활성물질, 항균물질, 항암물질을 생산함으로써 식물체의 자기방어능력을 향상시키며, 가축의 경우 장내 미생물의 안정화, 사료 효율증가, 내병성의 증가 효과를 나타낸다. 또한, 유산균이 특별한 관심을 끄는 이유는 동서양을 막론하고 식품에서 널리 이용되어 섭취되어왔으므로 일반적으로 안전하다고 인식하는 'GRAS'(generally regarded as safe) 미생물이기 때문이다. 그러나, 유산균을 산업적으로 올바르게 사용하기 위해서는 일반적으로 긍정적인 효과의 나열에 의한 판단보다는 사용용도가 무엇이며 용도에 적합한 특성이 무엇인지를 과학적인 입장에서 명확하게 이해하고 평가하는 절차를 반드시 거쳐야 한다. 이와 같은 절차를 통해서만이 제품의 균일성과 효과의 재현성을 보장할 수 있기 때문이다.Lactic acid bacteria are known to produce various antibacterial substances such as lactic acid, organic acids such as acetic acid, and bacteriocin, which are known to be important biological preservatives in food and feed. It also improves the self-defense ability of plants by producing various bioactive substances, antibacterial substances and anticancer substances, and in the case of livestock, it shows the effect of stabilizing intestinal microorganisms, increasing feed efficiency and increasing disease resistance. In addition, lactic acid bacteria attract special attention because they are widely regarded as 'GRAS' (generally regarded as safe) microorganisms that have been widely used and consumed in foods in both East and West. However, in order to industrially use lactic acid bacteria correctly, it is generally necessary to go through a procedure to clearly understand and evaluate from a scientific standpoint what the use is and what characteristics are suitable for use, rather than judging by a list of positive effects. Only with such a procedure can you ensure the uniformity of the product and the reproducibility of the effects.

이에 본 발명자들은 전통 발효식품 중 김치로부터 식품유해미생물 중 특히 바실러스 세레우스에 대한 우수한 항균활성을 나타내는 유산균을 분리하기 위해 예의 노력한 결과 유산균인 락토코커스 락티스 ET45를 선별하였고, 상기 균주 및 상기 균주의 배양액에 의해 바실러스 세레우스 등을 포함하는 식품 병원성균의 성장이 저해됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have selected lactic acid bacteria Lactococcus lactis ET45 as a result of intensive efforts to isolate the lactic acid bacteria showing excellent antimicrobial activity against food harmful microorganisms, especially Bacillus cereus, from kimchi in traditional fermented foods, the strain and the strain The present invention was completed by confirming that the culture medium inhibited the growth of food pathogenic bacteria including Bacillus cereus and the like.

본 발명은 식품 병원성균에 대한 생육억제 활성을 갖는 신규한 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) ET45 미생물을 제공하고자 한다.The present invention is to provide a novel Lactococcus lactis ET45 microorganism having growth inhibitory activity against food pathogenic bacteria.

또한 본 발명은 식품 병원성균에 대한 생육억제 활성을 갖는 락토코커스 락티스 ET45, 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 항균 조성물, 사료 조성물 및 식품 조성물을 제공하고자 한다.It is another object of the present invention to provide an antimicrobial composition, a feed composition, and a food composition comprising Lactococcus lactis ET45 having a growth inhibitory activity against a food pathogenic bacterium, a culture thereof, or a bacteriocin produced by the strain.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 식품 병원성균에 대한 생육억제 활성을 갖는 신규한 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) ET45 (KCTC 11767BP) 균주를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a novel Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) strain having a growth inhibitory activity against food pathogenic bacteria.

또한 본 발명은 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP)로부터 생산되고, 하기 (a) 내지 (e)의 특징을 갖는 박테리오신을 제공한다: (a) 4.5 kDa의 분자량; (b) 온도 40 내지 121℃에서 안정; (c) pH 3.0 내지 11.0에서 안정; (d) 클로로폼, 이소프로판올, 헥산, 에탄올, 아세톤 및 아세토니트릴 유기용매에 안정; 및 (e) 펩신, α-아밀라제 및 프로테아제 효소에 안정.The present invention also provides bacteriocins produced from Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) and having the following characteristics (a) to (e): (a) a molecular weight of 4.5 kDa; (b) stable at temperatures between 40 and 121 ° C .; (c) stable at pH 3.0 to 11.0; (d) stable to chloroform, isopropanol, hexane, ethanol, acetone and acetonitrile organic solvents; And (e) stable to pepsin, α-amylase and protease enzymes.

또한 본 발명은 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 항균 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), its culture or the bacteriocin produced by the strain.

또한 본 발명은 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a feed composition comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), its culture or the bacteriocin produced by the strain.

또한 본 발명은 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.The present invention also provides a food composition comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), its culture or the bacteriocin produced by the strain.

또한 본 발명은 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), its culture or the bacteriocin produced by the strain.

본 발명에 따른 식품 병원성균에 대한 생육억제 활성을 갖는 신규한 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) ET45 (KCTC 11767BP) 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신은 김치로부터 분리된 것이기 때문에 생균을 섭취하더라도 안정성이 보장되며, 식품 병원성균의 생장을 저해하는 효과가 있어, 친환경적 미생물 제제로서 식품 병원성균에 의한 식품의 부패 및 질병 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.The novel Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) or the bacteriocin produced by the strain having growth inhibitory activity against food pathogenic bacteria according to the present invention is isolated from kimchi, so stability is ensured even when the live bacteria are ingested. In addition, there is an effect of inhibiting the growth of food pathogenic bacteria, it can be very useful for preventing food spoilage and disease caused by food pathogenic bacteria as an environmentally friendly microbial agent.

도 1은 Tricine-SDS-PAGE를 통해 락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신의 분자량을 확인한 것이다(1번 레인: 니신(Sigma #N5764), 2번 레인: 박테리오신).
도 2는 락토코커스 락티스 ET45의 균주 동정결과를 나타낸 것이다.
도 3은 락토코커스 락티스 ET45 균주의 16S rDNA 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신의 다양한 식품 병원성균에 대한 항균효과를 나타낸 것이다.
도 5는 락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신의 pH, 열, 유기용매, 각종 가수분해 효소에 대한 안정성 및 내성을 나타낸 것이다.
도 6은 락토코커스 락티스 ET45의 배양온도에 따른 박테리오신의 활성을 나타낸 것이다(-■- 균체 성장도, -◆- 박테리오신 활성(AU/ml), -●- 배양 상등액의 pH).
도 7은 락토코커스 락티스 ET45의 초기 배양 pH에 따른 박테리오신의 활성을 나타낸 것이다(-■- 박테리오신 활성(AU/ml), -◆- 바실러스 세레우스에 대한 생육저해활성(㎝), -●- 균체 성장도).Figure 1 shows the molecular weight of the bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45 through Tricine-SDS-PAGE (lane number 1: nisin (Sigma # N5764), lane 2: bacteriocin).
Figure 2 shows the results of strain identification of Lactococcus lactis ET45.
Figure 3 shows the results of 16S rDNA sequence analysis of Lactococcus lactis ET45 strain.
Figure 4 shows the antimicrobial effect of the bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45 against various food pathogenic bacteria.
Figure 5 shows the stability and resistance to pH, heat, organic solvents, various hydrolytic enzymes of bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45.
Figure 6 shows the activity of bacteriocin according to the culture temperature of Lactococcus lactis ET45 (-■-cell growth,-◆-bacteriocin activity (AU / ml),-●-pH of the culture supernatant).
Figure 7 shows the activity of bacteriocin according to the initial culture pH of Lactococcus lactis ET45 (-■-bacteriocin activity (AU / ml),-◆-growth inhibitory activity against Bacillus cereus (cm),-●- Cell growth).

본 발명은 일 관점에서, 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) ET45 (KCTC 11767BP)에 관한 것이다. The present invention, in one aspect, relates to Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP).

또한 본 발명은 다른 관점에서, 상기 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP)로부터 생산되고, 하기 (a) 내지 (e)의 특징을 갖는 박테리오신에 관한 것이다: (a) 4.5 kDa의 분자량; (b) 온도 40 내지 121℃에서 안정; (c) pH 3.0 내지 11.0에서 안정; (d) 클로로폼, 이소프로판올, 헥산, 에탄올, 아세톤 및 아세토니트릴 유기용매에 안정; 및 (e) 펩신, α-아밀라제 및 프로테아제 효소에 안정.In another aspect, the present invention also relates to bacteriocin produced from the Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) and having the following characteristics (a) to (e): (a) a molecular weight of 4.5 kDa; (b) stable at temperatures between 40 and 121 ° C .; (c) stable at pH 3.0 to 11.0; (d) stable to chloroform, isopropanol, hexane, ethanol, acetone and acetonitrile organic solvents; And (e) stable to pepsin, α-amylase and protease enzymes.

락토코커스 락티스는 락토코커스(Lactococcus) 속에 속하는 그람 양성균으로서 일반적으로 김치, 젖갈, 피클, 올리브 절임 및 식물 발효 식품이나 일부 치즈에서 발견되는 유산균으로, 본 발명에 따른 락토코커스 락티스 ET45은 김치로부터 분리 동정된 신규한 유산균이다.Lactococcus lactis is a gram-positive bacterium belonging to the genus Lactococcus and is a lactic acid bacterium commonly found in kimchi, lactose, pickles, pickled olives and plant fermented foods or some cheeses. The lactococcus lactis ET45 according to the present invention It is a novel lactic acid bacteria isolated.

본 발명에 따른 락토코커스 락티스 ET45는 김치로부터 분리 동정된 유산균으로서, 유산균은 통상적으로 병원성이 없는 균으로 알려져 있기 때문에, 상기 유산균 또는 이로부터 생산되는 박테리오신을 생균으로 섭취하더라도 인체에 무해하다는 사실은 당업자에게 자명하다. The lactococcus lactis ET45 according to the present invention is a lactic acid bacterium that has been isolated and identified from kimchi. Since the lactic acid bacteria are generally known to be non-pathogenic bacteria, the fact that they are harmless to the human body even when the lactic acid bacteria or bacteriocin produced therefrom are taken as live bacteria. It is obvious to those skilled in the art.

본 발명에 따른 락토코커스 락티스 ET45 또는 이로부터 생산되는 박테리오신은 식품 병원성균에 대해 항균 및 생장 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 항균 및 생장 저해 활성은 비교적 열에 안정한 특성을 보인다.Lactococcus lactis ET45 or bacteriocin produced therefrom according to the present invention is characterized by having antibacterial and growth inhibitory activity against food pathogenic bacteria. Antibacterial and growth inhibitory activity according to the present invention shows a relatively thermally stable properties.

본 발명의 구체예에 따르면, 상기 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP)는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 페디오콕쿠스 펜토사케우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오콕쿠스 데크키트리니쿠스(Pediococcus dextrinicus), 락토바실루스 비리데스켄스(Lactobacillus viridescens), 락토바실루스 파라부치네리(Lactobacillus parabuchneri), 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 레우코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 레우코노스톡 카노슘(Leuconostoc carnosum), 레우코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 엔테로코쿠스 페슘(Enterococcus faecium)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식품 병원성균에 대한 항균 및 생장 저해 활성을 가질 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) is Bacillus cereus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus dextrinicus, Pediococcus dextrinicus, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus confusus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus plantarum, Leuconostox lactose lactis It may have antimicrobial and growth inhibitory activity against one or more food pathogenic bacteria selected from the group consisting of Leuconostoc carnosum, Leuconostoc mesenteroides and Enterococcus faecium. .

본 발명의 항균 활성은 락토코커스 락티스 ET45 균주 뿐만 아니라 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신에서도 동일하게 나타난다.The antimicrobial activity of the present invention is the same in Lactococcus lactis ET45 strain as well as in the culture of the strain or the bacteriocin produced by the strain.

본 명세서에서 사용된 용어 '배양물'은 균체를 포함한 배양원액일 수 있으며, 균체를 제거한 배양 상등액일 수 있고, 또한 상기 배양원액 또는 배양 상등액의 희석액일 수 있다. As used herein, the term 'culture' may be a culture supernatant including the cells, the culture supernatant from which the cells are removed, and may also be a dilution of the culture stock solution or the culture supernatant.

상기 배양물의 조성은 통상의 유산균 배양에 필요한 성분뿐만 아니라, 유산균 생장에 상승적으로 작용을 하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다. The composition of the culture may further include not only components necessary for normal lactic acid bacteria culture, but also components that synergistically act on the growth of lactic acid bacteria, and thus the composition may be easily selected by those skilled in the art. Can be.

본 발명은 또 다른 관점에서, 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to an antimicrobial composition comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), a culture thereof, or a bacteriocin produced by the strain.

상기 락토코커스 락티스 ET45, 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 항균 조성물은 식품 병원성균에 대해 항균 및 생장 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는데, 구체적인 특성은 앞서 설명한 바와 같다. The antimicrobial composition comprising the lactococcus lactis ET45, its culture or the bacteriocin produced by the strain is characterized by having antimicrobial and growth inhibitory activity against food pathogenic bacteria, specific characteristics are as described above.

상기 항균 조성물은 균체가 제거된 배양물 만을 포함할 수도 있으며, 균체가 혼합되거나 균체만을 함유하도록 제조할 수 있다. 본 발명의 항균 조성물을 제조하기 위해서 본 발명의 락토코커스 락티스 ET45은 통상의 액상 또는 고상의 배양기술을 통하여 대량으로 배양할 수 있다. 본 발명의 항균 조성물은 락토코커스 락티스 ET45 균주의 영양세포 또는 포자, 또는 영양 세포와 포자의 혼합 상태로 구성될 수 있고, 제제화하기 위하여 감압동결건조(Lyophillized), 동결건조, 수화의 상태로 균체를 제거할 수 있다.The antimicrobial composition may include only a culture in which the cells are removed, and may be prepared so that the cells are mixed or contain only cells. In order to prepare the antimicrobial composition of the present invention, Lactococcus lactis ET45 of the present invention can be cultured in large quantities through conventional liquid or solid culture techniques. The antimicrobial composition of the present invention may be composed of feeder cells or spores of the Lactococcus lactis ET45 strain, or a mixture of feeder cells and spores, and in order to formulate the microorganisms in the state of reduced pressure freeze-dried (Lyophillized), lyophilized, hydrated Can be removed.

본 발명은 또 다른 관점에서, 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 식품 병원성균에 대한 생육억제 활성을 갖는 식품(또는 건강기능성식품) 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a food (or health functional food) composition having growth inhibitory activity against a food pathogenic bacterium comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), a culture thereof, or a bacteriocin produced by the strain. It is about.

상기 락토코커스 락티스 ET45, 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 식품 조성물은 식품 병원성균에 대해 항균 및 생장 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는데, 구체적인 특성은 앞서 설명한 바와 같다.The food composition comprising Lactococcus lactis ET45, its culture or the bacteriocin produced by the strain is characterized by having antibacterial and growth inhibitory activity against food pathogenic bacteria, specific characteristics are as described above.

상기 식품 조성물은 균체가 제거된 배양물 만을 포함할 수도 있으며, 균체가 혼합되거나 균체만을 함유하도록 제조할 수 있다.The food composition may include only a culture in which the cells are removed, and may be prepared so that the cells are mixed or contain only cells.

본 발명에 따른 락토코커스 락티스 ET45와 같은 유산균은 젖산 발효를 함으로써 식품의 부패를 방지하고, 항균 물질을 분비하여 식중독 균을 억제하는 등 인체에 유익한 균으로 활동한다. 유산균 발효를 이용하여 제조되는 식품으로는 치즈, 버터밀크, 요구르트, 유청(whey) 등이 있으며, 최근에는 유산균 발효에 의한 기능성 요구르트도 널리 시판되고 있다. 또한 유산균 발효 식품들은 정장제로서의 정제, 과립제제 등으로 제조되어 식품 조성물, 의약품 등으로 시판되고 있다. Lactobacillus, such as Lactococcus lactis ET45 according to the present invention acts as a beneficial bacterium for the human body, such as to prevent the decay of food by secreting the lactic acid, to suppress the food poisoning bacteria by secreting antibacterial substances. Food produced using lactic acid bacteria fermentation include cheese, buttermilk, yogurt, whey (whey), etc. Recently, functional yogurt by lactic acid bacteria fermentation is also widely marketed. In addition, lactic acid bacteria fermented foods are manufactured as tablets, granules, and the like as commercial preparations and are commercially available as food compositions and pharmaceuticals.

따라서, 상기 식품에는 냉장, 냉동 또는 장기보관이 가능한 유제품, 예를 들면, 우유, 분유, 요커트, 캐피어(kefir), 아이스크림, 밀크쉐이크, 치즈, 크림, 커드, 발효유 및 우유가 첨가된 발효식품뿐만 아니라 두유, 발효된 곡류 제품, 환자식이 및 유아식이 등이 포함될 수 있으며, 본 발명의 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP)를 배양하여 식품으로 제조하거나 식품에 첨가하기 위해서는 우유 또는 곡류와 같이 녹말을 포함한 기질이 균주 배양에 바람직하다. Therefore, the food is refrigerated, frozen or long-term storage of dairy products, for example, milk, milk powder, yogurt, kefir, ice cream, milkshakes, cheese, cream, curd, fermented milk and fermented milk Soymilk, fermented grain products, patient diets and infant diets, as well as foods may be included, and to produce or add food to the Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) of the present invention, such as milk or cereals Substrates containing starch are preferred for strain culture.

상기 식품에 포함되는 락토코커스 락티스 ET45의 양은 약 105 cfu/g 내지 약 1011 cfu/g일 수 있으며, 약 106 cfu/g 내지 약 1010 cfu/g, 또는 약 107 cfu/g 내지 약 109 cfu/g일 수 있다. 상기 식품에 포함되는 박테리오신의 양은 식품 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 99.9 중량부, 0.01 내지 90 중량부, 0.01 내지 80 중량부, 0.01 내지 70 중량부, 0.01 내지 60 중량부, 0.01 내지 50 중량부, 0.1 내지 50 중량부 또는 1 내지 50 중량부로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The amount of Lactococcus lactis ET45 included in the food may be about 10 5 cfu / g to about 10 11 cfu / g, about 10 6 cfu / g to about 10 10 cfu / g, or about 10 7 cfu / g To about 10 9 cfu / g. The amount of bacteriocin included in the food is 0.01 to 99.9 parts by weight, 0.01 to 90 parts by weight, 0.01 to 80 parts by weight, 0.01 to 70 parts by weight, 0.01 to 60 parts by weight, 0.01 to 50 parts by weight based on 100 parts by weight of the food composition. It may be included, but is not limited to 0.1 to 50 parts by weight or 1 to 50 parts by weight.

균주를 투여할 경우에는 생균 상태로 투여하는 것이 바람직하며, 섭취 전에 사멸시키거나, 감쇄(attenuation)상태로 투여할 수 있다. 또한 배양물을 사용하여 제조할 경우에는 열처리 과정을 통한 멸균화 과정을 추가적으로 거칠 수 있다. 최소의 효능을 가지는데 필요한 균주량 및 일일 섭취 정도는 섭취자의 신체 또는 건강상태에 따라 달라질 수 있으나 일반적으로 106 내지 1012 cfu/day일 수 있고, 또는 107 내지 1010 cfu/day일 수 있다. 배양 상등액은 당업계에서 통상적으로 사용되는 기술을 사용하여 항균 효능의 정도를 판단할 수 있으며, 이에 따라 투여량이 결정될 수 있다.In the case of administering the strain, it is preferable to administer in a viable state, it may be killed before ingestion, or may be administered in an attenuation state. In addition, when the culture is prepared using a sterilization process may be additionally subjected to a heat treatment process. The amount of strain and daily intake required to have minimal efficacy may vary depending on the body or health of the ingestor but may generally be 10 6 to 10 12 cfu / day, or 10 7 to 10 10 cfu / day have. The culture supernatant can be used to determine the degree of antimicrobial efficacy using techniques commonly used in the art, and thus the dosage can be determined.

본 발명은 또 다른 관점에서, 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 식품 병원성균에 대한 항균활성을 갖는 사료 조성물에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a feed composition having an antimicrobial activity against a food pathogenic bacterium comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), a culture thereof, or a bacteriocin produced by the strain.

상기 락토코커스 락티스 ET45, 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 사료 조성물은 식품 병원성균에 대해 항균 및 생장 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는데, 구체적인 특성은 앞서 설명한 바와 같다.The lactococcus lactis ET45, its culture or feed composition comprising the bacteriocin produced by the strain is characterized by having antimicrobial and growth inhibitory activity against food pathogenic bacteria, specific characteristics are as described above.

상기 사료 조성물은 균체가 제거된 배양물 만을 포함할 수도 있으며, 균체가 혼합되거나 균체만을 함유하도록 제조할 수 있다.The feed composition may include only the culture in which the cells are removed, and the cells may be prepared to mix or contain only the cells.

본 발명의 사료 조성물은 기존의 항생제를 대체하고 유해한 식품 병원성균의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. Feed composition of the present invention replaces the existing antibiotics and inhibit the growth of harmful food pathogenic bacteria to improve the health of the animal body, improve the weight gain and meat quality of the livestock, and has the effect of increasing the milk yield and immunity. Feed composition of the present invention can be prepared in the form of fermented feed, compound feed, pellet form and silage and the like.

상기 사료에 첨가되는 락토코커스 락티스 ET45의 유효량은 약 105 cfu/g 내지 약 1011 cfu/g일 수 있으며, 약 106 cfu/g 내지 약 1010 cfu/g, 또는 약 107 cfu/g 내지 약 109 cfu/g일 수 있다. 상기 사료에 포함되는 박테리오신의 양은 사료 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 99.9 중량부, 0.01 내지 90 중량부, 0.01 내지 80 중량부, 0.01 내지 70 중량부, 0.01 내지 60 중량부, 0.01 내지 50 중량부, 0.1 내지 50 중량부 또는 1 내지 50 중량부로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The effective amount of Lactococcus lactis ET45 added to the feed may be about 10 5 cfu / g to about 10 11 cfu / g, about 10 6 cfu / g to about 10 10 cfu / g, or about 10 7 cfu / g to about 10 9 cfu / g. The amount of bacteriocin included in the feed is 0.01 to 99.9 parts by weight, 0.01 to 90 parts by weight, 0.01 to 80 parts by weight, 0.01 to 70 parts by weight, 0.01 to 60 parts by weight, 0.01 to 50 parts by weight based on 100 parts by weight of the feed composition. It may be included, but is not limited to 0.1 to 50 parts by weight or 1 to 50 parts by weight.

발효사료는 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 미생물을 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70% 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식발효사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.Fermented feed can be prepared by fermenting an organic material by adding various microorganisms or enzymes, compounded feed can be prepared by mixing a variety of general feed and microorganism of the present invention. Pellet-type feed may be prepared by applying heat and pressure to the blended feed and the like in a pellet machine, silage can be prepared by fermenting the green feed to the microorganism according to the present invention. Wet fermented feed collects and transports organic materials such as food waste, mixes excipients for sterilization process and moisture control at a certain ratio, and then ferments at a temperature suitable for fermentation for 24 hours or more to control about 70% water content. Can be prepared. Fermented dry irrigated feed may be prepared by adjusting the wet fermented feed to contain about 30% to 40% of water by further drying.

본 발명은 또 다른 관점에서, 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 페디오콕쿠스 펜토사케우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오콕쿠스 데크키트리니쿠스(Pediococcus dextrinicus), 락토바실루스 비리데스켄스(Lactobacillus viridescens), 락토바실루스 파라부치네리(Lactobacillus parabuchneri), 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 레우코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 레우코노스톡 카노슘(Leuconostoc carnosum), 레우코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 엔테로코쿠스 페슘(Enterococcus faecium)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 병원성균에 의한 감염증의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention, Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), the culture or Bacillus cereus (Bacillus cereus) containing the bacteriocin produced by the strain, Pediococcus pentosaceus (Pediococcus pentosaceus), Pediococcus dextrinicus, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus confusus (Lactobacillus confuactus) lantobacilli At least one pathogenic bacterium selected from the group consisting of Leuconostoc lactis, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc mesenteroides and Enterococcus faecium. It relates to a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of infection by.

본 발명에 따른 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신은 하기 실시예를 통하여 알 수 있듯이, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 페디오콕쿠스 펜토사케우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오콕쿠스 데크키트리니쿠스(Pediococcus dextrinicus), 락토바실루스 비리데스켄스(Lactobacillus viridescens), 락토바실루스 파라부치네리(Lactobacillus parabuchneri), 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 레우코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 레우코노스톡 카노슘(Leuconostoc carnosum), 레우코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 엔테로코쿠스 페슘(Enterococcus faecium)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식품 병원성균에 대한 항균 및 생장 억제 효과를 갖는다. 따라서 본 발명은 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신의 식품 병원성균에 의한 감염증의 치료 또는 예방 용도 및 치료상 유효량의 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 식품 병원성균에 의한 감염증의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) according to the present invention, the culture or the bacteriocin produced by the strain can be seen through the following examples, Bacillus cereus, Pediococcus pentosakeus (Pediococcus) pentosaceus, Pediococcus dextrinicus, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus confuscus (Lactobacillus contacillus fulacus) Lactobacillus plantarum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc mesenteroides and Enterococcus faecium It has antimicrobial and growth inhibitory effects on the above food pathogenic bacteria. Therefore, the present invention is intended for the treatment or prophylaxis of infection by Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), a culture thereof, or a food pathogenic bacterium of bacteriocin produced by the strain, and a therapeutically effective amount of Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP). It provides a method for the treatment or prevention of infection by food pathogenic bacteria, comprising administering to the subject a bacteriocin produced by the culture or the strain.

상기 식품 병원성균에 의한 감염증은 상기 식품 병원성균의 감염으로 인한 모든 질병을 포함하며, 예를 들면 식중독일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Infectious diseases caused by the food pathogenic bacteria include all diseases caused by the infection of the food pathogenic bacteria, for example, may be food in Germany, but is not limited thereto.

상기 약학적 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어 상기 약학적 조성물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 파우더, 젤, 연고, 크림 등의 외용제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical compositions can be prepared and administered in various formulations and methods. For example, the pharmaceutical composition may be, but is not limited to, oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, powders, gels, ointments, creams, etc. according to conventional methods. It can be formulated in the form of external preparations or sterile injectable solutions.

상기 약학적 조성물은, 예를 들어 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 항생제, 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.　The pharmaceutical composition may further comprise, for example, suitable antibiotics, carriers, excipients or diluents commonly used in the manufacture of a medicament.

구체적으로 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피를리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 로필히드록시벤조에티트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있다.　제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.Specifically, the carrier, excipient or diluent may be lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, undetermined. Vaginal cellulose, polyvinyl pyridone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, lofihydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil can be used. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants can be prepared.

본 발명에 따른 약학 조성물을 약제로 사용할 때, 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP) 은 일반적으로 106 내지 1012 cfu/day, 또는 107 내지 1010 cfu/day로 투여할 수 있다. 박테리오신의 경우 1 내지 1000 mg/day, 1 내지 800 mg/day, 1 내지 600 mg/day 또는 1 내지 400 mg/day로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. When the pharmaceutical composition according to the present invention is used as a medicament, the preferred dosage may vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration and may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) of the present invention may be administered at 10 6 to 10 12 cfu / day, or 10 7 to 10 10 cfu / day in general. In the case of bacteriocin, it may be administered at 1 to 1000 mg / day, 1 to 800 mg / day, 1 to 600 mg / day or 1 to 400 mg / day. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.

본 발명에 있어서, '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.In the present invention, the 'subject' may be a mammal including a human, but is not limited thereto, and may be administered by various routes. All modes of administration can be expected, for example by oral, intravenous, intramuscular or subcutaneous injection.

본 발명의 항균 조성물, 식품 조성물, 사료 조성물 및 약학 조성물은 약제학적으로 필요한 구성물 또는 식품으로 적합한 구성물 외에도 인체에 이로운(probiotic) 균주를 추가적으로 포함할 수 있다.
The antimicrobial composition, food composition, feed composition and pharmaceutical composition of the present invention may further include a beneficial strain to the human body in addition to the pharmaceutically necessary composition or a composition suitable for food.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.

실시예Example 1: 김치로부터 박테리오신 생산 유산균의 탐색 및 분리 1: Screening and Isolation of Bacteriocin-producing Lactic Acid Bacteria from Kimchi

단계 1: 유산균의 분리 및 보존Step 1: Isolation and Preservation of Lactic Acid Bacteria

각종 김치로부터 유산균을 분리하기 위하여 각종 김치를 무균적으로 잘게 다진 다음, 이 중 1 g을 취하여 멸균 생리식염수(0.85% NaCl) 9 ㎖에 현탁하고 단계적으로 희석하여 MRS 고체배지에 각각 도말하였다. 30℃에서 48시간 배양한 다음 집락의 형태가 서로 다른 균주들을 선택하여 순수 분리하였다. 이어 상기 김치로부터 순수 분리한 유산균을 MRS 고체배지에 도말하여 30℃에서 배양하였으며, 이때 형성된 집락을 20% 글리세롤 용액에 현탁시킨 후 -70℃ 냉동고에 보관하면서 하기 박테리오신 생산 유산균의 탐색에 사용하였다.In order to separate lactic acid bacteria from various kimchi, various kimchi were chopped aseptically, 1 g of which was suspended in 9 ml of sterile saline solution (0.85% NaCl), diluted in stages, and plated in MRS solid medium, respectively. After incubation at 30 ° C. for 48 hours, the colonies were separated by purely selecting different strains. Subsequently, the lactic acid bacteria purely isolated from the kimchi were plated on an MRS solid medium and incubated at 30 ° C., and the colonies formed were suspended in 20% glycerol solution and then stored at −70 ° C. freezer, and used to search for the following bacteriocin-producing lactic acid bacteria.

단계 2: 박테리오신 생산 유산균의 탐색 및 선발 Stage 2: Screening and Selection of Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria

식중독을 일으키는 식품 병원성균을 생물자원센터(KCTC)로부터 분양 받아 사용하였다. 김치로부터 분리한 100여종의 유산균의 배양 상등액의 항균 활성을 확인하기 위하여 플레이트 위에 NB(nutrient broth) 연한천배지(0.8% agar, Bacillus cereus 1%(v/v)) 25ml를 굳히고 살균된 팁으로 배지 상에 웰을 만들었다. 준비해 놓은 배지의 웰에 상기 유산균의 배양 상등액을 100㎛씩 분주하여 지시균주(Bacillus cereus)의 최적 배양 온도에서 배양하여 NB 플레이트 상에 억제환 생성 여부를 관찰함으로써 항균활성을 갖는 균주를 선별하였고, 그 중 항균활성이 강한 균주 1 주를 선별하였다. 한편, 상기 억제환이 항균성 단백질 혹은 펩타이드인 박테리오신에 의한 것임을 확인하기 위하여 단백질분해효소인 프로테이나아제 K [proteinase K (20 ㎎/㎖)]를 처리하여 단백질성 또는 펩타이드성 여부를 확인하였다. 박테리오신 역가는 activity unit(AU)으로 표시하였고 상등액을 순차적으로 2배씩 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역수를 취하고, 이 값에 1 ㎖에 대한 환산계수를 곱하여 AU/㎖로 나타내었다.Food pathogenic bacteria causing food poisoning were distributed from KCTC and used. In order to confirm the antimicrobial activity of the culture supernatant of 100 kinds of lactic acid bacteria isolated from kimchi, 25 ml of NB (nutrient broth) light agar medium (0.8% agar, Bacillus cereus 1% (v / v)) was hardened on a plate and used as a sterilized tip. Wells were made on the medium. Strains having antimicrobial activity were selected by dispensing the culture supernatant of the lactic acid bacteria into the wells of the prepared medium and culturing at an optimum culture temperature of the indicator strain (Bacillus cereus) and observing the inhibition ring generation on the NB plate. Among them, strain 1 strain with strong antimicrobial activity was selected. Meanwhile, in order to confirm that the inhibitory ring is caused by bacteriocin, which is an antimicrobial protein or peptide, protease protein [proteinase K (20 mg / ml)] was treated to determine whether proteinaceous or peptide. The bacteriocin titer was expressed as activity unit (AU) and the reciprocal of the maximum dilution factor to form an inhibitory ring by diluting the supernatant sequentially by 2 folds, multiplied by the conversion factor for 1 ml and expressed as AU / ml.

단계 3: 박테리오신 부분 정제Step 3: Bacteriocin Partial Purification

우선 멸균한 1L의 MRS 액체배지 에 전 배양한 락토코커스 락티스 ET45 균주 10㎖를 접종하고 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 배양액을 원심분리(12000rpm, 4℃, 15분)하여 배양 상등액을 얻었다. 이어, 상기 배양 상등액을 0.2 ㎛ 여과막를 이용하여 제균 하였다. 제균한 상등액과 차가운 아세톤 용매를 1:3의 비율로 혼합하여 -80℃에서 10분간 방치한 후 상기 용액을 원심분리(6000rpm, 4℃, 20분)하여 단백질을 회수하였다. 회수한 단백질을 DW에 용해 한 후 분자량 1000이상을 거르는 투석 튜브(spctra-por사)에 넣어 4℃에서 완충용액(0.1M Citrate buffer, pH 3.0) 5ℓ에서 3시간 투석 후 다시 완충용액 5ℓ에서 하룻밤 투석 및 원심분리(12000rpm, 4℃, 15분)하여 감압 농축하였다. 농축된 시료를 동결 건조하여 -70℃에서 보관하면서 필요 시 3차 증류수에 용해하여 전기영동 샘플로 사용하였다.First, 10 ml of pre-cultured Lactococcus lactis ET45 strain was inoculated into sterilized 1 L MRS liquid medium and incubated at 30 ° C. for 18 hours, followed by centrifugation (12000 rpm, 4 ° C., 15 minutes) to obtain a culture supernatant. . The culture supernatant was then sterilized using a 0.2 μm filtration membrane. The sterilized supernatant and the cold acetone solvent were mixed at a ratio of 1: 3 and left at −80 ° C. for 10 minutes, and the solution was centrifuged (6000 rpm, 4 ° C., 20 minutes) to recover the protein. After dissolving the recovered protein in DW, it was placed in a dialysis tube (spctra-por) with a molecular weight of 1000 or more, and dialyzed for 3 hours in 5 L of a buffer solution (0.1M Citrate buffer, pH 3.0) at 4 ° C, and then again in 5 L of buffer solution overnight. Dialysis and centrifugation (12000 rpm, 4 ° C., 15 minutes) were concentrated under reduced pressure. The concentrated sample was lyophilized, stored at -70 ° C, dissolved in tertiary distilled water if necessary, and used as an electrophoretic sample.

단계 4: 박테리오신의 분자량 확인Step 4: Determine Molecular Weight of Bacteriocin

락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신의 분자량을 tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) 방법을 통하여 확인하였다. 전기 영동 겔 농도는 5% stacking gel과 16.5% separating gel을 사용하였고, 표준분자량 물질로 BIO-RAD사의 precision plus protein dual xtra standards marker를 사용하였다. 부분 정제한 박테리오신 용액을 tricine-SDS-PAGE sample buffer와 1:1의 비율로 혼합하여 끓는 물에서 3분간 가열하여 전기영동 하였다. 전기영동 완충용액으로 anode buffer (0.2M Tris, pH 8.9)와 cathode buffer (0.1 M Tris, 0.1 M tricine, 0.1% SDS, pH 8.25)를 사용하였다. 전기영동 이 끝난 겔은 coomassie brilliant blue R-250으로 염색을 하였고, 다른 겔은 50% 메탄올과 10% 아세트산에서 30분간 고정시키고, 멸균수로 4시간 동안 세척한 다음 이 겔을 플레이트위에 무균적으로 건조시키고 그 후 지시균주(B. cereus, 1.0×106 CFU/㎖) 가 포함된 NB soft agar (0.8%) 10ml을 중층한 다음 30℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 지시균에 대해 억제환이 형성되는 밴드와 염색한 겔 상에서의 밴드를 상호비교 하였다. The molecular weight of bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45 was determined by tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Electrophoretic gel concentration was 5% stacking gel and 16.5% separating gel, and BIO-RAD's precision plus protein dual xtra standards marker was used as standard molecular weight material. The partially purified bacteriocin solution was mixed with tricine-SDS-PAGE sample buffer at a ratio of 1: 1 and heated by boiling water for 3 minutes, followed by electrophoresis. As electrophoresis buffer, anode buffer (0.2M Tris, pH 8.9) and cathode buffer (0.1M Tris, 0.1M tricine, 0.1% SDS, pH 8.25) were used. The electrophoresis gel was stained with coomassie brilliant blue R-250, and the other gel was fixed in 50% methanol and 10% acetic acid for 30 minutes, washed with sterile water for 4 hours, and then the gel was aseptically plated. After drying, 10 ml of NB soft agar (0.8%) containing the indicator strain (B. cereus, 1.0 × 10 6 CFU / mL) was layered and incubated at 30 ° C. overnight, and then a ring of inhibition was formed against the indicator. The bands and the bands on the stained gels were compared.

도 1의 (A)에서 보는 바와 같이 부분 정제된 물질을 분자량 표준시료와 비교한 결과, 약 4.5 kDa의 분자량을 갖는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 전기영동한 겔을 증류수로 30분간 4회 세척 한 후 지시균주를 중층하여 박테리오신의 활성을 조사한 결과, 도 1의 (B)에서 보는 바와 같이 상기 염색한 겔의 밴드와 일치하는 곳에 강한 억제환을 확인함으로써 상기 부분 정제된 물질이 박테리오신임을 확인할 수 있었다.
As shown in FIG. 1A, when the partially purified material was compared with the molecular weight standard sample, it was confirmed that the molecular weight was about 4.5 kDa. In addition, the electrophoresis gel was washed four times for 30 minutes with distilled water, and then the indicator strain was stratified to examine the activity of bacteriocin. As shown in FIG. By confirming that the partially purified material was confirmed to be bacteriocin.

실시예Example 2: 김치로부터 분리한 박테리오신 생산 유산균의 분류학적 성질 및 유전학적 동정 2: Taxonomic and Genetic Identification of Bacteriocin Producing Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi

선별된 균주의 동정은 Bergey's Manual of Determinative bacteriology의 방법에 따라 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였으며, 최적 생육온도, 그람염색, 운동성, catalase test, CO2 생성 유무 및 유전학적 동정을 위해서 16S rRNA의 염기서열을 분석하였다. Identification of the selected strains was irradiated with morphological and biochemical properties according to the process of the Bergey's Manual of Determinative bacteriology, for optimal growth temperature, Gram stain, motile, catalase test, CO 2 generated presence and genetic identification of 16S rRNA The sequence was analyzed.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의해 분리된 균주는 만니톨과 라피노오즈 이용 여부 및 arginine hydrolysis를 제외하고는 대부분 표준균주와 동일한 특성을 나타냄을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 2, it was confirmed that the strain isolated by the present invention exhibits the same characteristics as most standard strains except for the use of mannitol and raffinose and arginine hydrolysis.

최종적으로, NCBI의 BLAST program을 이용하여 ET45의 16S rRNA 염기서열에 대한 상동성을 분석한 결과, 99%의 신뢰도로 Lactococcus lactis subsp.lactis로 동정되었다(도 3). 상기 락토코커스 락티스 ET45는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2010.09.29 자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC 11767BP).
Finally, the homology to the 16S rRNA sequence of ET45 was analyzed using the BLAST program of NCBI. Lactococcus with 99% confidence. lactis subsp. It was identified as lactis (FIG. 3). The Lactococcus lactis ET45 was deposited with the Korea Biotechnology Research Institute Bioresource Center on September 29, 2010 (accession number KCTC 11767BP).

실시예Example 3:  3: 락토코커스Lactococcus 락티스Lactis ET45ET45 의 식품 병원성균에 대한 항균활성Antimicrobial Activity against Food Pathogenic Bacteria

실시예 1의 방법과 동일하게 락토코커스 락티스 ET45 배양 상등액을 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus, 한국생명공학연구원 생물자원센터, KCTC 1928)과 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, 한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC 3624) 등 도 4에 개시된 식품병원성 균주가 접종된 고체배지에 분주하고, 각 지시균주의 최적 생육 온도에서 24시간 이상 배양하여 억제환의 생성 여부를 확인하였다. 박테리오신 역가는 배양 상등액을 순차적으로 2배씩 희석하여 억제환을 형성하는 최대 희석배수의 역수를 취하고, 이 값에 1㎖에 대해서 환산해주는 환산계수를 곱하여 bacteriocin activity unit (AU/㎖)으로 나타내었다.Lactococcus lactis ET45 culture supernatant was treated with Staphylococcus aureus, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KCTC 1928 and Bacillus cereus, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. Biological Resource Center KCTC 3624), etc. were dispensed in solid medium inoculated with the food pathogenic strains disclosed in FIG. 4, and cultured for 24 hours or more at the optimum growth temperature of each indicator strain to confirm the production of inhibitory rings. The bacteriocin titer was expressed as bacteriocin activity unit (AU / mL) by taking the reciprocal of the maximum dilution factor to form the inhibitory ring by diluting the culture supernatant two times sequentially, and multiplying this value by the conversion factor for 1 ml.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 페디오콕쿠스 펜토사케우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오콕쿠스 데크키트리니쿠스(Pediococcus dextrinicus), 락토바실루스 비리데스켄스(Lactobacillus viridescens), 락토바실루스 파라부치네리(Lactobacillus parabuchneri), 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 레우코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 레우코노스톡 카노슘(Leuconostoc carnosum), 레우코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 엔테로코쿠스 페슘(Enterococcus faecium)에 대하여 성장저해효과가 있음을 확인하였다.
As a result, as shown in Figure 4, Bacillus cereus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus dextrinicus, Lactobacillus viridescens Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus confusus, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc lactis, Leuconostoccanosium (Leuconostoc carnosum) It was confirmed that the growth inhibitory effect on Conosstock mesenteroides (Leuconostoc mesenteroides) and Enterococcus faecium.

실시예Example 4:  4: 락토코커스Lactococcus 락티스Lactis ET45ET45 가 생산하는 박테리오신의 특성Of bacteriocins produced by

락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신의 특성을 확인하기 위하여 pH, 열, 유기용매, 가수 분해효소 처리 조건 하에서 안정성을 확인하였다. In order to confirm the characteristics of the bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45, stability was confirmed under pH, heat, organic solvent, and hydrolase treatment conditions.

1. pH 안전성1. pH safety

락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신의 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여 pH 3.0 (0.1 M citrate buffer), pH 5.0 (0.1 M acetate buffer), pH 7.0 (0.1 M phosphate buffer), pH 9.0 (0.1 M borate buffer) 및 pH 11.0 (0.1 M carbonate buffer)의 완충용액과 아세톤 침전법으로 부분 정제한 박테리오신 용액을 1:1의 비율로 혼합하여 24시간 상온(25℃)에서 반응시킨 후 식품 병원성균인 바실러스 세레우스를 접종한 고체배지에 락토코커스 락티스 ET45의 배양 상등액을 pH별로 처리한 샘플을 분주하여 상기 병원성 균에 대해 항균활성이 관찰되는지를 확인하였다. 대조군으로 pH 처리를 하지 않은 정제한 박테리오신 용액을 사용하였다. 항균활성의 역가는 activity unit(AU)/mL로 표기하였고 상등액을 순차적으로 2배씩 희석하여 억제환을 형성하는 최대 희석배수의 역수를 취하고, 이 값에 1ml에 대해서 환산해주는 환산계수를 곱하여 나타내었다.To investigate the stability of the bacteriocins produced by Lactococcus lactis ET45, pH 3.0 (0.1 M citrate buffer), pH 5.0 (0.1 M acetate buffer), pH 7.0 (0.1 M phosphate buffer), pH 9.0 (0.1 M) borate buffer) and a buffer solution of pH 11.0 (0.1 M carbonate buffer) and a bacteriocin solution partially purified by acetone precipitation were mixed at a ratio of 1: 1 and reacted at room temperature (25 ° C) for 24 hours, and then Bacillus sere, a food pathogenic bacterium. A sample in which the culture supernatant of Lactococcus lactis ET45 was treated by pH in a solid medium inoculated with UW was dispensed to confirm whether antimicrobial activity was observed against the pathogenic bacteria. As a control, purified bacteriocin solution without pH treatment was used. The titer of the antimicrobial activity was expressed as activity unit (AU) / mL and the supernatant was serially diluted twice, taking the inverse of the maximum dilution factor that forms the inhibitory ring, and multiplied by the conversion factor converted to 1 ml. .

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 모든 샘플에서 항균활성이 관찰되었다. 이러한 결과를 통해 락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신은 넓은 범위의 pH에 걸쳐 높은 안정성을 나타냄을 알 수 있다. As a result, as shown in Figure 5, the antimicrobial activity was observed in all samples. These results show that bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45 shows high stability over a wide range of pH.

2. 열 안정성2. thermal stability

락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신의 열에 대한 안정성의 조사는 부분 정제한 박테리오신 용액을 20℃, 40℃, 60℃, 80℃, 100℃ 및 121℃에서 각각 30분 또는 60분간 열처리 한 후 식품 병원성균인 바실러스 세레우스를 접종한 고체배지에 락토코커스 락티스 ET45이 생산하는 부분정제한 박테리오신 용액을온도별로 열처리한 것을 분주하여 상기 병원성 균에 대해 항균활성이 관찰되는지를 확인함으로써 수행하였다. 대조군으로 열처리를 하지 않은 부분정제한 박테리오신 용액을 사용하였다. 항균활성의 역가는 activity unit(AU)/mL로 표기하였고 부분정제한 박테리오신 용액을 순차적으로 2배씩 희석하여 억제환을 형성하는 최대 희석배수의 역수를 취하고, 이 값에 1ml에 대해서 환산해주는 환산계수를 곱하여 나타내었다. Investigation of the heat stability of the bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45 was carried out by heating the partially purified bacteriocin solution at 20 ° C, 40 ° C, 60 ° C, 80 ° C, 100 ° C and 121 ° C for 30 or 60 minutes respectively. The heat treatment of the partially purified bacteriocin solution produced by Lactococcus lactis ET45 on a solid medium inoculated with the pathogenic bacterium Bacillus cereus was performed by checking the antibacterial activity against the pathogenic bacteria. As a control, a partially purified bacteriocin solution without heat treatment was used. The titer of the antimicrobial activity was expressed as activity unit (AU) / mL, and the conversion factor was converted to about 1 ml by taking the reciprocal of the maximum dilution factor that forms the inhibitory ring by diluting the partially purified bacteriocin solution sequentially two times. Multiplied by

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이 모든 샘플에서 항균활성이 관찰되었다. 본 발명의 락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신은 120℃에서도 항균활성이 일정하게 나타나는 바, 열 안정성이 높다는 것을 알 수 있다.As a result, the antimicrobial activity was observed in all samples as shown in FIG. The bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45 of the present invention shows a constant antibacterial activity even at 120 ° C., indicating high thermal stability.

3. 유기용매 안정성3. Organic Solvent Stability

락토바실러스 플란타룸 SY99가 생산하는 박테리오신의 유기용매에 대한 내성 실험은 chloroform, isopropanol, hexane, ethanol, acetone 및 acetonitrile 등을 부분정제한 박테리오신 용액과 같은 부피 비율로 혼합(1:1)하여 상온(25℃)에서 1시간 배양한 후, 병원성균인 바실러스 세레우스를 접종한 고체배지에 락토바실러스 플라타룸 SY99의 부분정제한 박테리오신 용액을 유기용매별로 처리한 샘플을 분주하여 상기 병원성균에 대해 항균활성이 관찰되는지를 확인함으로써 수행하였다, 대조군으로 유기용매 처리를 하지 않은 부분정제한 박테리오신 용액을 사용하였다. 항균활성의 역가는 activity unit(AU)/mL로 표기하였고 부분정제한 박테리오신 용액을 순차적으로 2배씩 희석하여 억제환을 형성하는 최대 희석배수의 역수를 취하고, 이 값에 1ml에 대해서 환산해주는 환산계수를 곱하여 나타내었다. To test the resistance of the bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum SY99 to organic solvents, chloroform, isopropanol, hexane, ethanol, acetone, and acetonitrile were mixed (1: 1) in the same volume ratio as the partially purified bacteriocin solution. 25 ° C.) was incubated for 1 hour, and then a sample in which the bacteriocin solution of Lactobacillus platarum SY99 was partially purified by organic solvent was dispensed into a solid medium inoculated with the bacterium Bacillus cereus, thereby preventing the antibacterial activity against the pathogenic bacteria. This was done by confirming whether or not it was observed. A partially purified bacteriocin solution without organic solvent treatment was used as a control. The titer of the antimicrobial activity was expressed as activity unit (AU) / mL, and the conversion factor was converted to about 1 ml by taking the reciprocal of the maximum dilution factor that forms the inhibitory ring by diluting the partially purified bacteriocin solution sequentially two times. Multiplied by

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이 모든 샘플에서 항균활성이 관찰되었다. 이러한 결과를 통해 락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신은 각종 유기용매에 대해서 항균활성을 나타내어 유기용매에도 안정함을 알 수 있다.As a result, the antimicrobial activity was observed in all samples as shown in FIG. These results show that bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45 shows antimicrobial activity against various organic solvents and is therefore stable in organic solvents.

4. 가수분해효소 안정성4. Hydrolase Stability

락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신의 각종 가수분해효소에 대한 영향을 알아보기 위하여 단백질, 탄수화물 등의 가수분해효소를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 제조사의 지침에 따라 사용하였다. Trypsin (13,500 U/㎎), protease (1.0 U/㎎)는 50 mM tris-HCl 완충액 (pH 7.5), α-chymotrypsin (83.9 U/㎎)은 50 mM tris-HCl 완충액 (pH 8.0), pepsin (800~2500 U/㎎)은 10 mM citrate 완충액 (pH 6.0), α-amylase (519 U/㎎)는 0.1 M sodium phosphate 완충액 (pH 7.0), subtilisin A (12 U/㎎)와 proteinase K (30 U/㎎) 는 0.01 M tris-HCl 완충액 (pH 7.9), 0.005M EDTA 및 0.5% SDS 완충액으로 20 ㎎/㎖이 되도록 준비하였다. 배양 상등액에 준비된 각종 효소를 2 ㎎/㎖의 농도로 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. proteinase K는 45℃에서 12시간 반응시켰다. 남아있는 박테리오신 활성은 바실러스 세레우스 KCTC 3624에 대한 억제환의 생성 유무로 확인하였다. 또한 동일한 조건에서 효소액만을 처리하지 않은 것을 음성 대조구로 사용하였다. To investigate the effects of various hydrolases of bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45, hydrolysates such as proteins and carbohydrates were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) and followed by the manufacturer's instructions. Used. Trypsin (13,500 U / mg), protease (1.0 U / mg) for 50 mM tris-HCl buffer (pH 7.5), α-chymotrypsin (83.9 U / mg) for 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.0), pepsin ( 800 to 2500 U / mg) for 10 mM citrate buffer (pH 6.0), α-amylase (519 U / mg) for 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), subtilisin A (12 U / mg) and proteinase K (30 U / mg) was prepared to be 20 mg / ml with 0.01 M tris-HCl buffer (pH 7.9), 0.005 M EDTA and 0.5% SDS buffer. Various enzymes prepared in the culture supernatant were added at a concentration of 2 mg / ml and reacted at 37 ° C for 3 hours. Proteinase K was reacted at 45 ° C. for 12 hours. The remaining bacteriocin activity was confirmed by the presence of inhibitory ring against Bacillus cereus KCTC 3624. In addition, those not treated with enzyme solution under the same conditions were used as negative controls.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이 락토코커스 락티스 ET45가 생산하는 박테리오신은 proteinase K, trypsin, chymotrypsin, 및 subtilisin A에 의해서는 항균활성이 소실되었으며, pepsin, protease, a-amylase에 의해서는 항균활성이 소실되지 않았다. 대부분의 박테리오신은 단백질이거나 단백질성이기 때문에 단백질 분해효소에 의해 분해되는데 ET45가 생산하는 박테리오신은 pepsin, protease에 대해서 안정한 성질을 나타내어 기존에 알려진 단백질성 박테리오신과는 차이가 있음을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 5, bacteriocin produced by Lactococcus lactis ET45 was lost by proteinase K, trypsin, chymotrypsin, and subtilisin A, and antibacterial activity by pepsin, protease and a-amylase. It was not lost. Since most bacteriocins are protein or proteinaceous, they are degraded by proteolytic enzymes. The bacteriocins produced by ET45 show stable properties against pepsin and protease, which are different from the known proteinogenic bacteriocins.

실시예Example 5: 배양온도 및 초기 배양  5: incubation temperature and initial culture pHpH 가 end 락토코커스Lactococcus 락티스Lactis ET45ET45 가 생산하는 박테리오신에 미치는 영향Effect on the production of bacteriocin

1. 배양 온도의 영향1. Influence of incubation temperature

배양온도가 락토코커스 락티스 ET45의 생육(growth)과 박테리오신의 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해 전 배양된 락토코커스 락티스 ET45를 MRS 액체배지에 1.0%(v/v) 접종하고 25℃, 30℃, 및 37의 진탕배양기에서 48시간 동안 배양하면서 일정한 시간 간격으로 배양 상등액을 회수하여 박테리오신 활성과 흡광도(OD 600)를 측정하여 균의 생육 곡선과 최대 항균활성을 나타내는 배양 온도를 결정하였다. To investigate the effect of incubation temperature on the growth and production of bacteriocin of Lactococcus lactis ET45, 1.0% (v / v) of pre-cultured Lactococcus lactis ET45 was inoculated in MRS liquid medium and 25 ° C, 30 The culture supernatant was recovered at regular time intervals while incubating for 48 hours at 37 ° C. and shaking incubator to determine bacteriocin activity and absorbance (OD 600) to determine the growth curve and the culture temperature showing the maximum antimicrobial activity.

도 6에서 보는 바와 같이 25℃, 30℃에서 배양하였을 때에는 18시간부터 항균활성이 나타나기 시작하여 48시간 때까지 일정한 활성을 유지하였다. 37℃에서는 12시간부터 항균활성이 나타나기 시작하여 48시간 때까지 일정한 활성을 유지하였지만, 25℃, 30℃에서의 박테리오신 최대역가의 약 50%수준을 나타내었다. As shown in FIG. 6, when cultured at 25 ° C. and 30 ° C., the antimicrobial activity began to appear from 18 hours and maintained constant until 48 hours. At 37 ° C, antimicrobial activity began to appear from 12 hours and maintained constant until 48 hours, but it was about 50% of the maximum titer of bacteriocin at 25 ° C and 30 ° C.

2. 초기 배양 pH의 영향 2. Effect of Initial Culture pH

배지의 초기 pH가 락토코커스 락티스 ET45의 생육과 박테리오신 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해 1 N HCl와 1 M NaOH로 pH 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5 및 pH 9.5으로 맞춘 MRS 액체배지에 전 배양한 분리균주를 1.0%(v/v) 접종하고 30℃ 에서 24시간 배양한 후 배양액으로부터 상등액을 회수하여 박테리오신 활성과 흡광도(OD 600)를 측정하여 균의 생육곡선과 최대 항균활성을 나타내는 배지의 pH를 결정하였다. MRS liquid medium adjusted to pH 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5 and pH 9.5 with 1 N HCl and 1 M NaOH to determine the effect of the initial pH of the medium on the growth and bacteriocin production of Lactococcus lactis ET45 Inoculated with 1.0% (v / v) of the pre-cultured isolates and incubated at 30 ° C for 24 hours, the supernatant was recovered from the culture, and the bacteriocin activity and absorbance (OD 600) were measured to determine the growth curve and maximum antimicrobial activity of the bacteria. The pH of the medium indicated was determined.

도 7에서 보는 바와 같이 균체의 증식은 pH 9.5에서 가장 높았으며, 다음으로 pH 8.5, 7.5순으로 나타났다. 박테리오신의 활성은 pH 7.5에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 결과적으로, 락토코커스 락티스 ET45의 박테리오신의 최대 활성은 MRS 액체배지 초기 pH 7.5으로 조정하여 30℃에서 18-24시간 배양하는 동안 나타나는 것으로 확인하였다.
As shown in FIG. 7, the growth of the cells was the highest at pH 9.5, followed by pH 8.5 and 7.5. The activity of bacteriocin showed the highest activity at pH 7.5. As a result, it was confirmed that the maximum activity of the bacteriocin of Lactococcus lactis ET45 was adjusted to MRS liquid medium initial pH 7.5 and appeared during 18-24 hours incubation at 30 ° C.

이상의 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described specific parts of the present invention in detail, it will be apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. will be. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC11767BPKCTC11767BP 2010092920100929

Claims (7)

락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) ET45 (KCTC 11767BP).Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP). 제1항에 있어서,
상기 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP)는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 페디오콕쿠스 펜토사케우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오콕쿠스 데크키트리니쿠스(Pediococcus dextrinicus), 락토바실루스 비리데스켄스(Lactobacillus viridescens), 락토바실루스 파라부치네리(Lactobacillus parabuchneri), 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 레우코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 레우코노스톡 카노슘(Leuconostoc carnosum), 레우코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 엔테로코쿠스 페슘(Enterococcus faecium)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 병원성균에 대한 항균활성을 갖는 것인 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP).The method of claim 1,
The Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) is Bacillus cereus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus dextrinicus, Lactobacillus viridecensus viridescusideus ), Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus confusus, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc lactis, Leuconostock cannosium carnosum , Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) having antimicrobial activity against at least one pathogenic bacterium selected from the group consisting of Leuconostoc mesenteroides and Enterococcus faecium. 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) ET45 (KCTC 11767BP))로부터 생산되고, 하기 (a) 내지 (e)의 특징을 갖는 박테리오신:
(a) 4.5 kDa 분자량;
(b) 온도 40 내지 121℃에서 안정;
(c) pH 3.0 내지 11.0에서 안정;
(d) 클로로폼, 이소프로판올, 헥산, 에탄올, 아세톤 및 아세토니트릴 유기용매에 안정; 및
(e) 펩신, α-아밀라제 및 프로테아제 효소에 안정.Bacteriocin produced from Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) and characterized by the following (a) to (e):
(a) 4.5 kDa molecular weight;
(b) stable at temperatures between 40 and 121 ° C .;
(c) stable at pH 3.0 to 11.0;
(d) stable to chloroform, isopropanol, hexane, ethanol, acetone and acetonitrile organic solvents; And
(e) stable to pepsin, α-amylase and protease enzymes. 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 항균 조성물.Antimicrobial composition comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), its culture or the bacteriocin produced by the strain. 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP)), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 사료 조성물.A feed composition comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), a culture thereof, or a bacteriocin produced by the strain. 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP), 그 배양물 또는 상기 균주가 생산하는 박테리오신을 포함하는 식품 조성물.A food composition comprising Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP), its culture or the bacteriocin produced by the strain. 락토코커스 락티스 ET45 (KCTC 11767BP) 또는 그 배양액을 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 페디오콕쿠스 펜토사케우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오콕쿠스 데크키트리니쿠스(Pediococcus dextrinicus), 락토바실루스 비리데스켄스(Lactobacillus viridescens), 락토바실루스 파라부치네리(Lactobacillus parabuchneri), 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 레우코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 레우코노스톡 카노슘(Leuconostoc carnosum), 레우코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 엔테로코쿠스 페슘(Enterococcus faecium)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 병원성균에 의한 감염증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.Bacillus cereus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus dectrinicus, Lactobacillus vides containing Lactococcus lactis ET45 (KCTC 11767BP) or its culture Lactobacillus viridescens, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus confusus, Lactobacillus plantarum, Leuconostok lactis, Leuconostoc lactinos lactose Pharmaceutical composition for the treatment or prophylaxis of infection by at least one pathogen selected from the group consisting of (Leuconostoc carnosum), Leuconostoc mesenteroides and Enterococcus faecium.
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