KR101374263B1

KR101374263B1 - 항 황산염 및 항 항산화 프로테오글리칸 항체 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR101374263B1
Application number: KR1020117024741A
Authority: KR
Inventors: 크리스티나 마테오 데 아코스타 델 리오; 안나 마리아 바스케스 로페즈; 알레한드로 로페즈 레케나; 유니 페르난데즈 머레로; 요스돌 소토 로페즈; 빅토리 브리토 네버로
Original assignee: 센트로 데 인뮤놀러지아 모레큘러
Priority date: 2009-05-04
Filing date: 2010-05-03
Publication date: 2014-03-13
Also published as: HK1168362A1; AR076495A1; PE20100808A1; CA2758994C; EP2428521A1; RU2011149252A; AU2010244859A1; RU2502744C2; SG175849A1; ES2656849T3; BRPI1013991B1; JP5354823B2; US8470322B2; MX2011011665A; AU2010244859B2; CL2010000413A1; MY158954A; KR20120016055A; CN102414222B; US20120121605A1

Abstract

본 발명은 생물 공학에 대한 것이고 그리고 특히는 인간 건강에 사용하기 위한 신제품에 대한 것이다.
본 발명은 술파티드 및 황산화 프로테오글리칸과 높은 친화도로 결함하는 새로운 특징적인 모노크로날 항체를 제공한다.
본 발명에 개시되고 성세한 설명에서 기술된 항 술파티드 및 항 황산화 프로테오글리칸 항체는 동맥경화증 플라그의 발현과 연계된 병인의 진행에 작용하는 중요한 진단적인 그리고 치료적인 도구를 제공한다.
따라서, 본 발명은 심혈관 질환과 연계된 치료적인 그리고 진단적인 용도를 위해 본 발명의 MAbs 또는 이들의 분획들을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 이 병인의 치료 또는 진단에 사용되어 질 수 있는 술파티드 및 황산화 프로테오글리칸을 인식하는 MAbs로부터 유래된 분획에 대한 것이다.

Description

항 황산염 및 항 항산화 프로테오글리칸 항체 및 이들의 용도{ANTI SULFATIDES AND ANTI SULFATED PROTEOGLYCANS ANTIBODIES AND THEIR USE}

본 발명은 술파티드 및 황산화 프로테오글리칸과 높은 친화도를 가지고 그리고 명확하게 인식하는 새로운 모노크로날 항체 (MAb)에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 모노크로날 항체 또는 이들 항체로부터 유래된 분획을 포함하는 약학적 조성물에 대한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 본 발명의 Abs 또는 이들의 분획을 포함하는, 심혈관 질환의 진단에 유용한 시약의 키트에 대한 것이다.

뮤어라인 MAb를 수득하기 위한 하이브리도마 기술(Koehler y Milstein Nature, 256: 495-497, (1975)의 개발 30년 이상 후, 이들 기술은 질병의 진단과 기초 연구에서는 아주 유용한 것으로 입증되어 졌지만, 그러나 단지 20 Abs만이 인간 치료를 위해 등록되어 져 있다(Pharma Vitae, Monoclonal Abs Update, 6-363, 2008). 이것은 주로 이들이 환자에게 주입되어 질 때 이들 Abs의 뮤어라인 유래에 기인한 인간 면역 시스템에 의해 그리고 또한 면역 반응에 의해 뮤어라인 이펙터 기능의 열악한 인식 및 혈액에서 이들의 짧은 반감기에 기인한다(HAMA 반응, 인간 항-마우스 Abs의 두문자). 몇몇 연구는 외래 항체의 투여 후, 환자에 있어서 생성된 면역 반응은 상당하게 강력할 수 있고 그리고 초기 치료 후 항체의 치료적 유용성을 실질적으로 제거할 수 있다는 것을 보여 준다. 더욱이, 뮤어라인 MAb를 환자에게 제공한 후, 비관련 마우스 Abs로 연속적인 처리는 "Khazaeli, M.B. y col. Journal of Immunotherapy 15: 42-52 (1994)"의 보고에 따르면 유효하지 않을 수 있거나 또는 더욱이 교차-반응성 HAMA 반응에 기인하여 위험할 수 있다.

상기의 정보로부터, 인간에게 거의 면역원성이 아닌, 용이하게 그리고 경제적으로 얻어지고 그리고 치료적 제형 및 다른 용도의 제조를 위해 적절한 치료적 Abs의 형태를 얻는 것이 필요로 된다. Morrison S.L. y col. Adv Immunol., 44: 65-92 (1989).

몇몇 방법들이 마우스 또는 랫트로부터 Abs를 인간화하고, 따라서 인간에 주입되어 질 때 이들 외래 단백질에 대한 이종 발생성 반응을 감소하기 위해 개발되어 져 왔다. 면역원성을 감소하기 위한 제일의 시도의 하나는 뮤어라인 단백질의 가변 영역이 감소된 면역원성뿐 아니라 면역 이펙터 작용의 활성화를 수반하는 인간 분자의 일정한 영역에 부착되는, "키메라" Abs의 생성이었다. Morrison S.L. y col. PNAS USA, 81: 6851-6855 (1984). 이들 키메라 분자는 항원과 관련하여 원래 항체의 특성을 유지하고 반면 그의 일정한 영역은 면역원성이 아니다.

아테롬성 동맥 경화증 및 그 결과는 세계의 인구에 있어서 큰 충격이고 그리고 수년 전부터 개발국(Melian, A. y col. Am. J. Pathol., 155:775, 1999) 및 쿠바(OMS, 2004, Anuario Estadistico, MINSAP, 2007)에 있어서 병적 상태와 죽음의 수위 원인이다.

아테롬성 동맥 경화증은 심근 경색과 뇌의 병인, 괴저, 그리고 사지 기능의 손실에 크게 기여하는 다원적인 특성의 만성적인 면역성 질병이다. Greaves, D. R. y col. Trends Immunol 22: 180-181 (2001); Ross, R. y col. Am Heart J 138(5 Pt 2): S419-20 (1999).

아테롬성 동맥 경화증의 수위 원인의 하나는 고콜레스테롤증이다. 동맥의 벽을 통하여 통과한 저분자량의 지질단백질(LDL)은 동맥 내막의 세포질 외 매트릭스에 프로테오글리칸과의 상호작용에 의해 포획되어 지고, 그리고 산화적 수사를 당한다.

동맥의 내막의 프로테오글리칸에 결합된 지질단백질은, 이들의 아테롬을 발생시키는 잠재성을 증가하는 산화 및 효소적 가수분해와 같은 지질 및 단백질 부분 양자에서 변화에 보다 민감하다. ApoB-100은 이것이 공통적으로 복합적인 염기성 아미노산의 존재를 가지는 프로테오글리칸의 글리코스아미노글리칸 사슬에 결합할 수 있는 몇몇 영역을 포함한다. Camejo, G., E. y col. Atherosclerosis 139: 205-22, (1998); Chang, T. Y. y col. Curr Opin Lipidol 12: 289-96 (2001); Camejo, G., U. y col. Atheroscler Suppl 3: 3-9 (2002).

글리코스아미노글리칸 상의 음 전하의 밀도는, 황산화의 정도가 프로테오글리칸을 갖는 LDL의 상호 작용에 영향을 미치는 LDL과의 상호작용에 영향을 미친다.Sambandam T. y col. Arterioascler Thromb, 11: 561-568 (1991).

더욱이, 산화된 LDL은 연속적인 기포 세포 형성으로 세포질 내의 콜레스테롤 축적을 이끄는, 이들 세포의 표면 상에 스카벤져 리셉터를 통해 매크로파아지에 의해 내재화되어 질 수 있다. 이들 사건은 모노사이트/매크로파아지, 비만 세포, 수지 세포, T 세포 및 NKT의 함유로 염증성 반응을 시작하는 주요 단계를 나타낸다. Camejo, G. y col. Atherosclerosis 139(2): 205-22 (1998); Hurt-Camejo, E. y col. Invest Clin 42 Suppl 1: 43-73 (2001); Skalen, K., M. y col. Nature 417:750-754 (2002).

최종적으로 거품 세포 형성을 야기하는, 이들 세포에 산화된 LDL의 결합에서 그리고 이들 입자의 내재화 또는 합체에서 매크로파아지의 표면 상에 존재하는 프로테오글리칸의 합입을 입증하는 실험적 증거가 있다. Halvorsen B. y col. Biochem J. 331:743-752 (1998).

항-혈전 및 지질-감소 제제의 용도와 연계한 보다 건강한 라이프스타일의 적용은 심혈관 질환 전개의 위험을 감소하는데 강한 영향력을 가지지만 이들 치료책은 이들 위험을 완전히 제거하기에는 여전히 불충분하다는 것은 확실하다.

상기에 언급된 바와 같이, 아테롬성 동맥 경화증은 복수의 항원이 이들의 전개에 있어서 중요하고 그래서 다른 전략이 이 질환에 대해 보다 나은 치료적인 강력한 작용을 달성할 목적으로 활성적이고 그리고 수동적인 면역치료법을 활성화를 위해 개발되어져 왔던 다원적인 염증성 질환이다.

이들 전략의 하나는 HDL-콜레스테롤 및 심혈관 질환 사이의 역상 관계에 기인하여 HDL를 증가하는 치료법이다. CETP는 HDL의 대사작용에 있어서 핵심 효소이고 그리고 이의 활성의 증가는 HDL 준위를 증가하기 때문에 치료를 위한 잠재적인 표적으로 고려되어 진다. CETP에 결합하여 그 작용을 저해할 수 있는 Abs를 유도하는 백신을 사용하는 전략이 WO 1997/041227 및 WO 2006/133196에 기술되어 있다. 그러나, CETP 저해제 토세트라피브를 사용하는 페이스 III 임상적 시도의 실패를 보여준 최근의 연구가 이 전략을 회의적으로 하였다. Nicholls S. J. y col. Circulation. 9; 118:2506-14 (2008); Hermann M. y col. Curr Hypertens Rep, 11:76-80 (2009).

몇몇 저자들은 동맥경화증의 형성을 저해하기 위한 면역원으로서 산화된 LDL을 사용한 백신을 기술하였다. Palinski W. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:821-25 (1995); Ameli S y col. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:1074-79 (1996); Freigang S. y col. Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 18:1972-82 9 (1998); Zhou X. y col. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21:108-14 (2001); George J. y col. Atherosclerosis 138:147-52 (1998); Fredrikson G.N. y col. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:879-84 (2003); US 2008/0070265A1.

다른 전략은 동맥경화증 손상의 형성을 방지하거나 또는 감소할 수 있는 면역 반응을 유도할 목적으로 산화된 아포리포프로테인 C-III의 특정 분획에 기초된 예방적인 그리고 치료적인 백신의 개발이다(WO 2001/064008, WO 2003/020765, WO 2004/080375 및 WO 2004/081045).

기술된 또 다른 백신 어프로치는 동맥경화증 손상의 형성을 방지하는, T 세포의 알파/베타 수용체와 상호작용하는 Abs를 유도하기 위해 MDA 또는 4-HNE와 같은 알데하이드에 컨쥬게이트된 펩티드에 기초되어 진다(WO2001/068119).

몇몇 작가들은 동맥경화증 플라그의 전개를 방지하기 위해 아테롬성 동맥 경화증에서의 병인에 대한 백신의 중요성에 대해 주창되었다(WO1998/033510, US 006291437 B1, US 6471965 B1, US006808713 B1).

규정식의 콜레스테롤의 섭취에 의해 야기된 동맥경화증의 심각성을 지연하거나 또는 감소하기 위해 또 다른 제안된 치료책은 스테롤에 대한 백신의 사용이다(US 2002/0018808 A1).

치료적인 도구로서 양자 면역 요법이 동맥경화증에서 중요한 역할을 또한 할 수 있다. Apo B100의 산화된 또는 수사된 분획에 대한 인간 Abs를 사용함에 의해 아테롬성 동맥 경화증을 치료하거나 또는 예방하기 위한 양자 면역화가 기술되어 있다(US 005196324A, US 2007/0098725 A1, US 2008/0075716 A1).

부가적으로, 포스포릴콜린에 대한 특정한 Abs로 양자 면역화가 아테롬성 동맥 경화증의 치료 또는 방지를 위한 치료적인 조합으로서 제안되었다 (US 2007/0286868 A1, US 2007/0122419 A1).

기술된 또 다른 전략은 인간 M-CSF에 특이적으로 결합하는 Abs 또는 항원 결합 분획의 상용이다(US 2007326414 B2).

혈관 내피에 모노사이트의 접합을 방지하고 그리고 따라서 이들 세포에 의한 내피 및 주변 조직에 침입을 방지하는 MAb의 사용이 이 질환의 또 다른 치료적인 어프로치이다(US 005541296 A).

글리코프로테인 IIb / IIIa 리셉터의 저해자로서 그리고 따라서 혈소판 응집의 저해자로 모노크로날 Abs의 사용이 기술되어져 있다(WO 1999/052551, US 005976532 A).

부가하여, 인간 모노크로날 Abs는 양자 면역 치료에서 사용을 위한 CIII 아포리포프로테인의 보호적인 펩티드 에피토프에 대해 얻어진다(WO 2004/081046).

또한, 정맥 내의 이뮤노글로불린(IVIG)이 동맥경화적 효과를 가질 수 있다. Udi N y y col. Autoimmunity reviews 7:445-452 (2008).

술파티드 및 황산화 글리코스아미노글리칸과 반응하거나 또는, 낮은 복용량으로 투여되어 질 때 동맥경화증 손상의 형성을 저해하고 그리고 이들 황산화된 분자에 대해 항체 반응을 유도하는 능력으로, 매크로파지 및 동맥경화증 손상을 인식하는 키메라 MAbs는 기술되어 지지 않았다.

본 발명은 술파티드 및 황산화 프로테오글리칸이나 이들로부터 유래된 분획을 인식을 특징으로 하는 모노크로날 Abs에 대한 것이다.

본 발명의 항-설파티드 및 항-황산화 프로테오글리칸 Abs는 바람직하기로는 모노크로날이다. 본 발명의 범주 내에는 또한 본 명세서에서 제공된 항-설파티드 및 항-황산화 프로테오글리칸 Abs의 Fab 분획, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2와 같은 Ab 분획들이 포함되어 진다. 이들 Ab 분획은 효소적 단리와 같은 전통적인 수단에 의해 만들어질 수 있고 또는 재조합 기술에 의해 생산되어 질 수 있다. 이들 Ab 분획들은 키메라이거나 또는 인간화될 수 있다. 이들 분획은 본 상세한 설명에서 제시된 진단적인 그리고 치료적인 목적에 유용하다. 본 발명은 또한 실질적으로 순수한 Abs 및 분획의 실시형태를 포함한다.

특정한 실시형태에 있어서, 본 발명의 Ab는 다음의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역의 시퀀스에 의해 특징되어 진다:

중사슬:

HCDR1 RYSVH

HCDR2 MIWGGGSTDYNSALKS

HCDR3 SGVRRGRAQAWFAY

HFR1 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS

HFR2 WVRQPPGKGLEWLG

HFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR

HFR4 WGQGTLVTVSA

경사슬:

LCDR1 KASQDVSTAVA

LCDR2 SASYRYT

LCDR3 QQHYSTPWT

LFR1 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC

LFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC

LFR4 FGGGTKLELK

부가적으로, 본 발명의 항체는 중사슬에 대해 인간 IgG1 불변 영역 및 경사슬에 대해 인간 Cκ를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 항-술파티드 및 항-황산화 프로테오글리칸 항체 또는 이들로부터 유래된 분획을 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 포괄한다. 본 명세서에 사용된 것으로서, 조성물은 술파티드 및 황산화 프로테오글리칸에 결합하는 하나 또는 그 이상의 Abs를 포함한다.

이들 조성물은 이 기술 분야의 통상인에게 잘 알려진 완충액이나 어쥬번트를 포함하는 약학적으로 허용될 수 있는 부형제와 같은 적절한 담체를 더 포함할 수 있다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 그의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 시퀀스가 아래에 나타난 바와 같은 MAb를 포함하는 약학적 조성물에 대한 것이다.

중사슬 :

HCDR1 RYSVH

HCDR2 MIWGGGSTDYNSALKS

HCDR3 SGVRRGRAQAWFAY

HFR1 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS

HFR2 WVRQPPGKGLEWLG

HFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR

HFR4 WGQGTLVTVSA

경사슬:

LCDR1 KASQDVSTAVA

LCDR2 SASYRYT

LCDR3 QQHYSTPWT

LFR1 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC

LFR2 WYQQKPGQSPKLLIY

LFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC

LFR4 FGGGTKLELK

제삼 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 Abs 또는 이들로부터 유래된 분획을 포함하는, 동맥경화증 손상의 진단에 유용한 시약의 키트에 대한 것이다. 그리고 더욱 특별하게는, 시약의 세트는 위에서 기술된 중사슬 및 경사슬의 가변 영역의 시퀀스를 갖는 MAb를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환의 치료, 특히는 동맥경화증 손상의 징후를 보이는 것의 치료를 위한 본 발명의 Abs의 사용에 대한 것이다.

용어 항체는 일반적으로 MAb에 대한 것이고 그리고 더욱 특별하게는 뮤어라인 MAb 또는 키메라 Ab에 대한 것이다.

항체의 수득:

일반적으로, 본 발명의 항-설파티드 및 항-황산화 프로테오글리칸-MAbs는 먼저 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 기술된, 천연 또는 합성 원으로부터 얻어진 글리코리피딕 추출물로 면역된 마우스로부터 하이브리도마 방법에 의해 얻어질 수 있다. 면역된 마우스로부터 비장 세포가 기술된 바와 같은 선택적인 배지에서 배양된 미에로마 세포 P3.X63Ag8 6.5.3과 용융되어 지고 그리고 생성된 클론은 ELISA에 의해 배양 상등액에서 이뮤노글로불린의 검출에 의해 선택되어 진다.

원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 Abs를 생성하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, Ab 생성 클론은 제한된 희석 과정에 의해 서브클론될 수 있고, 그리고 세포 배지 성장의 표준 방법(Goding, Monoclonal Abs: Principles and Practice, pags. 59-103 (Academic Press, 1986))에 의해 성장되어 질 수 있다. 이 목적에 적절한 배양 배지는 예를 들어 배지 D-MEM 또는 RPMI-1640을 포함한다. 더욱이, 하이브리도마 세포는 복수 종양의 형성이 있는 동물에서 생체 내에서 성장되어 질 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 MAbs는, 예를 들어 프로테인 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그라피, 겔 일렉트로포르시스, 투석 또는 어피니티 크로마토그라피와 같은 이뮤노글로불린의 정제를 위한 통상적인 과정에 의해 배양 배지, 복수 액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리되어 진다.

본 발명의 Abs는 또한 뮤어라인 이뮤노글로불린 유전자를 적절하게 조작하는 유전 공학적 기술에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 Abs는 증폭, 클로닝, 유전자 시퀀싱 및 단리와 같은 유전자 조작에 대한 통상적인 기술에 의해 뮤어라인 모노크로날 Abs를 생산하는 세포로부터 정제된 RNA로부터 얻어질 수 있고, 상기 기술의 상태는 예를 들어 다음의 문헌에 기술되어 진다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Current Protocols in molecular biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie Methods in Enzimology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A practical approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ABS, A laboratory manual, y Animal cell culture (R. I.Freshney, ed. (1987)).

Ab 가변 영역의 cDNA 합성 및 PCR(Polymerase Chain Reaction의 두문자) 증폭은 뮤어라인 Ab를 코드하는 RNA로부터 수행되어 질 수 있고, cDNA가 합성되어 지고, VK 및 VH 가변 영역은 PCR에 의해 증폭되어 지고, 이러한 것은 그 목적상 이 기술 상태를 기술한 통상적인 기술에 따라 수행되어 질 수 있다.

중사슬 및 경사슬 각각에 대한 PCR의 생산은 각각 유전자 시퀀싱을 위해 사용된 벡터 내에서 클론되어 진다. 얻어진 클론은 이 목적을 위해 기술된 방법의 어느 하나, 예를 들어 제작자의 상세한 설명서에 따른 T7 DNA 폴리머라제를 사용하는 디데옥시뉴클레오티드 방법을 사용하여 스퀀스되어 진다.

중사슬 VH 및 경사슬 VK의 가변 영역 유전자는 중간체 컨스트럭션의 효소적 제한에 의해 얻어지고 그리고 키메라 유전자의 컨스트럭션을 위한 통상적인 기술에 따라 각각의 발현 벡터 내에서 클론되어 진다. 이 목적을 위해서는 재조합 단백질, 특히는 MAbs의 효율적인 발현을 위해 기술된 어떤 벡터가 유용하다.

키메라 Ab의 발현을 위해서 Ab 유전자를 포함하는 각 발현 벡터에 DNA 컨스트럭트와 전기영동되는 NS0 세포가 사용되어 질 수 있다. 이들 세포는 선택적 배지에서 성장한다. 이뮤노글로불린-생성 클론의 검출은 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)를 사용하여 배지의 상등액에서 측정에 의해 수행되어 졌다.

원하는 특이성 및 기능을 갖는 Abs 의 셀렉션 :

어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 Abs는 이 목적을 위해 기술된 다양한 기술, 예를 들어 ELISA에 의해 검출되어 질 수 있다.

본 발명의 어떤 실시형태에 있어서, 생산된 Abs의 생물학적 활성이 분석되어 졌다. 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 Abs는 이들의 항원 결합 활성에 대해 시험되어 졌다.

전문가에게 알려져 있고 그리고 본 명세서에서 사용될 수 있는 항원 결합 분석은 웨스턴 블럿, 라디오이뮤노어세이, ELISA, 이중 항체 면역분석(sandwich), 면역 침전 분석법, 형광 면역 분석법 및 프로테인 A 면역 분석법과 같은 기술을 사용하여 직접 또는 비교 결합 분석을 포함한다. 항원 결합에 대한 설명적인 분석법은 이후의 실시예의 부분에 포함되어 진다.

부가적으로, 본 발명에서 인간의 대동맥 조직 부분에서 동맥경화증 혈전을 인식할 수 있는 Abs를 생산하는 클론들이 동정되어 질 수 있고, 이것은 이 기술 분야에서 기술된 통상적인 면역 조직학적 기술을 사용하여 수행되어 질 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 Abs에 의한 마우스에서의 항-헤파린 반응을 유도하는 능력이 측정되어 질 수 있다. 이를 위하여, 다른 군의 동물들이 본 발명의 Abs로 면역되어 지고 그리고 이들 동물의 혈청 샘플이 항-헤파린 Abs의 존재에 대해 시험되어 졌다.

부가적인 측면에 있어서, 본 발명의 Abs의 항-동맥경화증 효과가 측정되어 질 수 있고 그리고 이를 위하여, 리포펀딘(Lipofundin)으로 래빗에서 동맥경화증 손상의 유도 모델이 사용되어 질 수 있다(Takacs E, Harsing J, Fuzesi S, Jellinek H. 1986 Arteriosclerosis developing in rabbits after lipofundin administration. Morphol Igazsagugyi Orv Sz. 26:99-105; Noa M & Mas R (1992). Ateromixol y lesion aterosclerotica en conejos inducida por lipofundin. Progresos en Ciencias Medicas, 6: 14-19).

약학적 조성물:

일 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 Abs를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 실시형태에 있어서, 항체를 포함하는 조성물은 더욱이 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함한다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 Abs를 포함하는 시약의 키트를 제공하고 그리고 부가적으로 완충용액을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 완충 용액은 약학적으로 허용될 수 있는 것이다. 일 실시형태에 있어서, Ab를 포함하는 조성물은 또한 몇몇 실시형태에 있어서 약학적으로 허용될 수 있는 담체 분자를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 시약 키트는 또한 조성(예를 들어 대상물에 대해 Ab)물의 투여 또는 사용을 위한 지시서를 포함한다.

본 발명의 Ab를 포함하는 약학적 조성물은 이들의 보전을 위해 생리학적으로 허용될 수 있는 담체 분자, 선택적인 부형제 또는 안정화제와 원하는 정도의 순도를 갖는 Abs를 혼합함에 의해, 수성 용액의 형태로, 동결건조된 또는 달리 동결건조된 제형의 형태로 제조되어 진다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)). 허용될 수 있는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 모든 복용량 및 농도에서 사용자에게 비독성이다.

본 발명의 MAbs는 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합한 약학적 조성물에 존재되어 진다.

생체 내 투여를 위한 제형은 반드시 멸균되어 진다. 이것은 멸균 여과 멤브레인을 통해 여과에 의해 달성되어 진다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 심혈관 질환과 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적인 치료를 위한 약물의 제조에 본 발명의 Ab를 어떻게 사용하는가 하는 것을 보여준다.

본 발명의 Abs는 동맥경화증 손상의 발현을 치료하고, 저해하고, 진행을 지연하고, 예방하고/지연하기 위해 사용되어 질 수 있고, 하나 또는 그 이상의 항원성 분자의 발현 및/또는 활성과 연계된 질병, 질환 또는 과정을 개선하거나 또는 예방하기 위해 사용되어 질 수 있다.

본 발명에 따르면, 이들 Abs의 치료적인 복용량은 일 복용 당 10 마이크로그램 내지 10 mg 사이, 바람직하기로는 일 복용 당 100 마이크로그램 내지 1 mg 사이의 범위로 될 것이다.

본 발명의 MAb(s)는 장관 외, 피하, 복강 내, 폐 내, 그리고 코 안의 경로를 포함하는 적절한 수단에 의해 투여되어 지고, 그리고 만일 국부적인 치료를 원한다면, 손상부 경로로 투여되어 진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환과 같은 질환을 진단하기 위한 시약의 키트를 제공한다.

도 1. 항- SO3 - 키메라 MAb 에 의한 술파티드의 인식.
다양한 농도의 항-SO3- 키메라 MAb 및 이소타입 대조 키메라 MAbs가 메탄올 내에 4㎍/mL의 농도로 술파티드로 도포된 ELISA 플레이트에 부가되어 졌다. 반응성은 알카린 포스파타제에 컨쥬게이트된 고트 항-인간 감마 사슬 항혈청으로 검출되어 진다. 제품의 405 nm에서의 흡광도가 ELISA 판독기로 정량되어 졌다(*p<0.05, Mann-Whitney U test).
도 2. 항- SO3 - 키메라 MAb 에 의한 헤파린 인식.
다양한 농도의 항-SO3- 키메라 MAb 및 이소타입 대조 키메라 MAbs가 HBSS 내에 10㎍/mL의 농도로 헤파린으로 도포된 ELISA 플레이트에 부가되어 졌다. 반응성은 알카린 포스파타제에 컨쥬게이트된 고트 항-인간 감마 사슬 항혈청으로 검출되어 진다. 제품의 405 nm에서의 흡광도가 ELISA 판독기로 정량되어 졌다(*p<0.05, Mann-Whitney U test).
도 3. 항- SO3 - 키메라 MAb 에 의한 J774 세포 라인의 인식.
세포는 바이오티닐화된 Abs의 10㎍/mL로 배양되어 졌다. 반응은 FITC에 컨쥬게이트된 고트 항-인간 IgG 항혈청으로 밝혀 졌고 그리고 유동 세포 분석법으로 분석되어 졌다.
도 4. 항- SO3 - 키메라 MAb 에 의한 인간 동맥경화증 플라크 인식.
포르말린에 고정되고 그리고 파리핀에 삽입된 인간 대동맥의 분획이 바이오티닐화된 항-SO3- 키메라 Ab 및 이소타입 대조 키메라 Ab로 배양되어 졌다. 반응은 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체로 밝혀졌다. 항-SO3- MAb에 의해 인식된 에피토프는 강렬한 브라운 색상에 의해 나타내어 졌고 그리고 세포의 핵들은 헤마톡실린으로 반대 염색되어 졌다(400 X).
도 5: 항- SO3 - 키메라 MAb 로 면역화에 의해 유도된 헤파린에 대한 Abs 반응.
항-SO3- 키메라 MAb로 면역화 계획의 0일 및 49일에 BALB/c 마우스로부터 얻어진 혈청 샘플이 ELISA에 의하여 분석되어 졌다. 각 심벌은 마우스의 혈청으로부터 얻어진 값이다. pI 및 hI: 각각 면역 전 그리고 고면역임(*p <0.05, Mann-Whitney U test).
도 6: 래빗에서 리포펀딘 모델에서 동맥경화증 손상의 전개에서 항- SO3 - 키 메라 MAb 로 치료의 효과.
연구의 다른 군을 대표하는 래빗의 흉부 대동맥의 조직학적 단면. (A) 군 1, 변형이 없는 동맥의 정상 구조를 나타내는 비처리된 동물. (B) 군 2, 리포펀딘으로 처리된 동물로, 여기서 근육, 엘라스틴 및 콜라겐 섬유 사이의 세포질 외 물질의 증착과 조직 구조의 변형으로 동맥의 내막의 농후화가 관찰되었음. (C 및 D) 군 3, 항-SO3- 키메라 MAb로 면역되어 지고 그리고 그 후 리포펀딘이 투여된 동물; 명확한 조직 손상이나 내막의 농후화가 관찰되지 않았다. 헤마톡실린-에오신 염색 180X.

다음의 실시예는 그의 범주를 제한함이 없이 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것이다.

다음의 실시예에 있어서, 사용된 모든 레스트릭션 또는 모디피케이션 엔자임뿐 아니라 시약 및 재료는 달리 특정하지 않는다면 시중의 것으로부터 얻어진다.

실시예 1. 소의 뇌 술파티드의 키메라 MAb 항- SO3 에 의한 인식.

ELISA를 사용하여, PolySorp 플레이트, Nunc가 메탄올 내에서 4㎍/mL의 농도로 소의 뇌 술파티드의 용액 50㎕/well로 도포되어 지고, 그리고 용매는 37℃에서 90분 동안 배양함에 의해 증류되어 졌다. 그런 다음 실온에서 한 시간 동안 1% 소 혈청 알부민(SAB)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) 200㎕/well으로 차단되어 졌다. 그 후, PBS 내 키메라 항체 항-SO3의 다른 농도의 50㎕/well이 부가되어 지고 37℃에서 한 시간 동안 배양되어 졌다. 그런 다음 플레이트는 PBS로 수세되어 지고 그리고 50㎕/well의 알카린 포스파타제에 컨쥬게이트된 고트 항혈청 항-인간 감마 사슬(Sigma)이 부가되어 졌다. 37℃에서 1시간 동안 플레이트를 배양한 후, 이들은 다시 수세되어 지고 그리고 pH 9.8의 디에탄올아민 버퍼에 1mg/mL p-니트로페닐포스페이트로 구성된 100㎕/well의 기질 용액이 부가되어 졌다. 반응 산물의 흡광도는 실온에서 배양 30분 후에 405 nm에서 ELISA 리더에서 측정되어 졌다.

음성 대조군으로서는 키메라 모노크로날 항-SO3-의 위치 98에서 중사슬의 가변 영역에서 S에 의해 R의 대체로 수사된 키메라 MAb가 사용되었다. 도 1은 다른 키메라 MAbs의 술파티드의 반응성을 나타낸다. 이 그래프는 키메라 모노크로날 항-SO3-은 0.01 mg/ml과 같은 낮은 농도에서 조차도 술파티드를 인식하는 것을 보여준다. 반면에, 위치 98에서 수사된 키메라 MAb는 어떠한 반응성도 나타내지 않았다.

실시예 2. 헤파린 인식 시험.

연속적으로 키메라 모노크로날 항-SO3-이 술파티드외에 보다 복잡한 황산화 분자를 인식하는지에 대해 분석되어 졌다. 이 연구를 위해 황산화 글리코스아미노글리칸의 모델로서 사용된 고도로 황산화된 분자인 헤파린에 선정되어 졌다.

항-헤파린 반응성에 대한 분석은 Skalen, K. M. y cols (Nature 417: 750-754 , 2002)에 의해 개발된 비글리칸에 대한 ELISA 기술에 기초하여 약간의 변형을 가하여 수행되어 졌다. 맥시솔프 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp microtiter plates(Nunc))가 Hepes 완충 식염수(HBSS) (20mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4)에서 10㎍/mL (100㎕/well)로 헤파린(Sigma)으로 도포되어 지고 그리고 4℃에서 밤 세워 배양되어 졌다. 플레이트는 HBSS로 삼 회 수세되어 졌고 그리고 나서 실온에서 한 시간 동안 1%의 SAB(HBSS-BSA)를 함유하는 HBSS로 차단되어 졌다. 플레이트는 HBSS-트윈 20 0.02% (HBSS-T)로 삼 회 수세되어 졌고 그리고 실온에서 한 시간 동안 결합 버퍼(10 mM Hepes , 20mM NaCl, 2mM CaCl₂, 2mM MgCl₂, pH 7.4)에서 40㎍/mL의 초기 농도로부터 키메라 모노크로날 항-SO3-의 일련의 희석물이 부가되어 졌다. 음성 대조군으로서는 키메라 모노크로날 항-SO3-의 위치 98에서 중사슬의 가변 영역에서 S에 의해 R의 대체로 수사된 키메라 MAb가 사용되었다. 플레이트는 HBSS-T로 두 번 수세되고 그리고 나서 0.1% SAB를 함유하는 HBSS-T 내에서 알카린 포스파타제에 컨쥬게이트된 고트 항혈청 항-인간 감마 사슬(Sigma-Aldrich, USA)로 실온에서 한 시간 동안 배양되어 졌다. 필요한 수세가 수행되어 지고 그리고 반응은 pH 9.8의 디에탄올아민 버퍼에 용해된 기질 p-니트로페닐포스페이트를 사용하여 전개되어 졌다. 산물의 405 nm에서 흡광도는 ELISA 리더(Organon Teknica, Austria)에서 정량되어 졌다.

도 2에 나타난 바와 같이, 키메라 모노크로날 항-SO3-은 헤파린에 대해 높은 반응성을 가진다. 반면에, 이소타입 대조군으로 사용된 수사 키메라 Ab는 연구된 농도의 어느 것에서도 반응성도 나타내지 않았다.

실시예 3: 유동 세포분석법에 의한 J774 세포 라인의 인식.

모노사이트 및 매크로파아지는 아테롬성 동맥 경화증과 같은 염증의 진행에 중요하다(Osterud B Bjorklid E. Physiol Rev 83:1069-1112, 2003). 이들 세포는 프로테오글리칸을 합성하고 그리고 거품 세포의 형성에서 매크로파아지에 의한 산화된 LDL을 합체하기 위한 몇몇의 방법은 세포 멤브레인 프로테오글리칸을 포함한다는 것이 밝혀졌다(Halvorsen B, et al. Biochem J. 331:743 -- 752, 1998).

항SO3- 키메라 Ab가 매크로파아지를 인식하는지를 판정하기 위해, 8% 비활성화 송아지 태반 혈청(SFT; Gibco), 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM-F12 (Gibco BRL, Paisley, Scotland)에서 배양된 뮤어라인 매크로파아지 세포 라인 J774를 사용하여 유동 세포분석법 실험을 수행하였다.

세포(튜브 당 0.5 x 10⁶)는 Fc-감마 수용체를 차단하기 위해 37℃에서 10분 동안 비활성화된 래빗 혈청 20㎕/tube으로 배양되었다. 연속적으로 항-SO3-키메라 MAb 및 이소타입-대조군 수사 키메르 Ab가 얼음 조에서 30분 동안 1% 소 혈청 알부민(Sigma, St. Louis, MO) 및 0.01% 소디움 아지드를 포함하는 pH 7.4의 PBS 안에 10㎍/mL로 부가되고 양자는 바이오티날화된다. 세포를 수세한 후, 이들은 얼음 조에서 30분 동안 1/200 희석에서 스트렙트아비딘-플루오르세인 이소티오시아네이트 복합체(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)로 배양되어 진다. 세포는 수세되어 지고 1% 소디움 아지드를 함유하는 PBS에 재현탁되어 지고 그리고 유동 세포분석법상에서 분석되어 진다(Becton-Dickinson, San Jose, CA).

도 3에 도시된 바와 같이, 이소타입 대조군으로 사용된 키메라 Ab는 세포 라인 J774를 인식하지 않는다. 반대로, 항-SO3- 키메라 Ab는 세포의 93.7%를 인식하였다.

실시예 4: 인간 대동맥에서 동맥경화증 플라그의 인식.

키메라 Ab 항-SO3-인식의 면역조직학적 결정이 포르말린에 고정되고 그리고 파리핀에 끼워진 인간 대동맥의 분획 상에서 수행되어 진다. 실란화된 슬라이드 상에 장착되어 지고 그리고 12시간 동안 68℃에서 배양되어 진 4㎕의 조직 단면이 사용되어 졌다. 조직 단면은 크실롤에서 탈파라핀화되어 지고 그리고 감소하는 농도에서의 에탄올에서 탈수되어 진다. 그런 다음 이들은 증류수에서 5분 동안 수세되어 지고 그리고 PBS에서 수세된다. 항원 비마스킹은 100℃의 온도에서 항온조 세트를 사용하여 수행되어 진다. pH 6.0의 시트레이트 완충액에 침지된 플레이트는 30분 동안 배쓰에 유지되고 그리고 나서 마이크로파 오븐을 사용하여 10분 동안 pH 6.8의 시트레이트 완충액에서 가열되어 진다. 슬라이스는 20분 동안 냉각되어 지고 그리고 나서 증류수 및 PBS로 수세되어 진다. 내재성 퍼옥시다제는 실온에서 10분 동안 H₂O₂ 3%의 용액으로 저해되어 지고, PBS로 수세되고, 그리고 바이오티날화된 키메라 Ab 항-SO3- 및 이소타입 대조군 Ab가 실온에서 30분 동안 50㎍/mL의 농도로 부가되어 진다. 그 후, 슬라이드는 PBS로 수세되고 그리고 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 복합체(Anacrom Diagnostics)가 동일한 시간 및 온도에서 부가되어 진다. 마지막으로, 조직 단면은 3 내지 5분 동안 1mL의 기질 완충액 내 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)의 신선한 혼합물 용액으로 배양되어 진다. 대조는 메이어의 헤마톡실린으로 수행되어 지고, 샘플은 증가하는 알코올 농도에서 탈수되어 지고, 크실롤에서 분류되고 그리고 마지막으로 영구한 배지 플레이트 Eukitt(Kinder GmbH & Co.)에서 장착되어 진다. 평가는 백색광 현미경(Leica)을 사용하여 수행되어 졌다.

도 4는 항-SO3- 키메라 Ab가 대동맥에 존재하는 동맥경화증 손상의 샘플과 어떻게 강력하게 반응되는지를 보여준다. 이것은 지질-담지 매크로파아지 또는 거품 세포와 그리고 손상 지질 코어와의 반응성이 관찰되었다(반응성은 짙은 브라운 색상으로 도시됨). 이 도면은 이소타입 대조군으로사 사용된 Ab가 어떻게 인간 대동맥 부분을 인식하지 않는가 하는 것을 나타낸다.

실시예 5: 항- SO3 키메라 Ab 에 의해 마우스 내에서 항-헤파린 반응을 유도하는 능력.

열 마리의 BALB/c 암컷 마우스가 사용되어 졌다; 이들은 200㎕ 내의 50㎍의 항-SO3- 키메라 Ab가 피하로 투여되어 진다. 면역 반응은 매 14일 마다 수행되어 져 전체 4번의 복용으로 완료된다. 항-SO3- 키메라 Ab는 어쥬번트 또는 담체 단백질 없이 투여되어 진다. 혈청 샘플은 0일 및 49일(제사 차 투여 7일 후)에 취해진다.

면역화된 동물의 혈청에서 항-헤파린 Abs의 존재는 헤파린으로 도포(10㎍/mL, 100㎕/well)된 Maxisorp 플레이트를 사용하여, 실시예 2에 기술된 ELISA 기술을 사용하여 측정되어 졌다. 마우스의 혈청은 100㎕/well로 결합 완충액에서 1/100 희석으로 시험되어 졌다. 제이의 항체로서, 알카린 포스파타제에 컨쥬게이트된 고트 항-마우스 IgG 및 IgM 항혈청(Jackson)이 사용되어 졌다.

도 5는 0 및 49일에 취해진 마우스의 혈청으로 분석의 결과를 나타낸다. 동물의 면역 전(0일) 혈청에서 항-헤파린 Abs의 존재가 검출되지 않았다. 반면에, 마우스가 항-SO3- 키메라 Ab로 면역되어 진 후 이들 혈청의 Abs의 존재가 검출되었다. 이 결과는 항-SO3- 키메라 Ab가 헤파린을 강력하게 인식할 뿐 아니라 이 분자에 대해 반응을 유도하는 놀라운 능력을 가진다는 것을 나타낸다(백신 효과).

실시예 6: 항- SO3 - 키메라 Ab 의 항-동맥경화증 효과.

항-SO3- 키메라 Ab가 생체 내에서 생물학적 효과를 생성할 수 있는지를 평가하기 위해, 이미 기술된, 리포펀딘으로 래빗에서 동맥경화증 손상의 유도의 모델이 사용되었다(Takacs E and cols.Morphol Igazsagugyi Orv Sz. 26:99 -105, 1998, Noa M & R. More Progress in Medical Sciences, 6: 14-19, 1992).

열다섯 마리의 뉴질랜드 산 래빗이 다섯 마리의 래빗씩 세 군으로 분할되어 사용되었다. 1군은 아무런 처리도 수용하지 않았다(음성 대조군). 2군은 매일 8일 동안 kg당 2mL의 리포펀딘 20% (Braun)가 정맥 내로 투여되어 졌다. 3군에 대해서는 7일의 간격으로 피하로 PBS 내 100㎍의 항-SO3- 키메라 Ab의 삼 회 복용량으로 투여되어 지고 그리고 마지막 면역화의 날에는 2군의 동물에서 사용된 것과 같이 리포펀딘의 매일 투여가 시작되었다. 모든 래빗은 마지막 복용량의 리포펀딘의 투여 일일 후 마취하에서 희생되어 지고 그리고 1군의 음성 대조 동물이 동일한 날에 희생되어 졌다. 동물로부터 대동맥이 얻어지고 그리고 거시적 및 미시적인 동맥경화증 손상의 존재를 판정하기 위한 병리학적 연구가 수행되었다.

아무런 처리를 하지 않은 1군으로부터 래빗의 대동맥은 총손상이 나타나지 않았다. 8일 동안 kg당 2mL의 리포펀딘을 투여한 2군에서의 래빗으로부터의 모든 대동맥에서는 총손상이 관찰되었다. 미리 삼회 복용량의 항-SO3- 키메라 Ab가 투여되고 그런 다음 리포펀딘으로 투여된 래빗의 대동맥에서는 거시적인 손상이 없었다.

미시적인 손상의 연구를 위해, 대동맥의 분획이 포르말린에 고정되어 지고 그리고 파라핀에 삽입되어 진다. 4㎛의 조직 단면이 사용되어 져, 실란화된 슬라이드 상에 장착되고 그리고 헤마톡실린-에오신으로 염색되었다. 평가는 백색광 현미경(Leica)을 사용하여 수행되어 졌다.

아무 처리를 수용하지 않은 래빗의 대동맥의 조직 단면이 평가되어 질 때, 도 6에 나타난 바와 같이, 전체는 비변경이 없이 동맥의 정상 구조를 보였다. 리포펀딘을 수용한 군의 모든 래빗으로부터 대동맥 단면에 있어서, 특징적 손상이 관찰되어 졌다: 근육, 엘라스틴 및 콜라겐 섬유 사이의 세포질 외의 물질의 증착으로 내막 농후화의 존재 및 조직 구조의 변형. 이에 반해, 삼회 복용량의 항-SO3- 키메라 Ab가 투여되고 그런 다음 리포펀딘으로 투여된 세 래빗으로부터의 샘플은 미시적인 손상이 관찰되지 않았다. 잔여 두 마리 래빗으로부터의 샘플에 있어서는 섬유들 사이의 세포질 외의 물질의 증착으로 동맥의 벽의 약간의 영역에서 어느정도 뚜렷한 농후하로 구성되는 조직 변형이 관찰되었다. 내막의 농후화는 없었다.

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Claims

술파티드 및 황산화 프로테오글리칸에 특이적으로 결합하는 모노크로날 항체로서,
상기 모노크로날 항체의 경사슬 및 중사슬 가변 영역의 상보성 결정부위(complementarity determining regions; CDRs)의 시퀀스는 아래에 나타난 것과 같고,
중사슬:
HCDR1 RYSVH
HCDR2 MIWGGGSTDYNSALKS
HCDR3 SGVRRGRAQAWFAY
경사슬:
LCDR1 KASQDVSTAVA
LCDR2 SASYRYT
LCDR3 QQHYSTPWT
상기 모노크로날 항체의 경사슬 및 중사슬 가변 영역 내의 프레임워크 영역의 시퀀스는 아래에 나타난 것과 같으며,
중사슬:
HFR1 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
HFR2 WVRQPPGKGLEWLG
HFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
HFR4 WGQGTLVTVSA
경사슬:
LFR1 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
LFR2 WYQQKPGQSPKLLIY
LFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
LFR4 FGGGTKLELK
상기 모노크로날 항체의 불변 영역의 시퀀스는 중사슬에 대해 인간 IgG1 및 경사슬에 대해 Cκ인 모노크로날 항체.
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제1항의 모노크로날 항체를 포함하는 동맥경화증 질환의 치료를 위한 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 더 포함하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 어쥬번트를 더 포함하는 약학적 조성물.
제1항의 모노크로날 항체를 포함하는 동맥경화증 손상의 진단에 유용한 시약 키트.
삭제
동맥경화증의 치료에 유용한 치료제의 조제를 위한 제1항에 따른 모노크로날 항체.