KR101364322B1 - Ｅ09 및 프로필렌 글리콜을 사용하는 방광암 치료 - Google Patents

Ｅ09 및 프로필렌 글리콜을 사용하는 방광암 치료 Download PDF

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Abstract

본원은 다양한 방광암 치료 방법을 공개하고 있다. 본 발명의 공개내용은 방광의 인간 이행 세포 암종에서 프로필렌 글리콜 농축물 및/또는 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소-1(NQO1), 시토크롬 P450 산화환원효소(P450R) 및 포도당 수송체 1(Glut-1) 단백질 발현을 이용하여 개인별로 표적화된 방광암 치료를 제공한다.

Description

Ｅ09 및 프로필렌 글리콜을 사용하는 방광암 치료{BLADDER CANCER TREATMENT BY USING E09 AND PROPYLENE GLYCOL}
관련 출원에 대한 상호 참증
본원은 2006년 2월 9일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제60/771,678호의 이익을 청구한다.
발명의 분야
본 발명은 EO9 제제 및 방법을 이용하는 방광암의 치료에 관한 것이다. 본 발명은 방광의 인간 이행 세포 암종에서 프로필렌 글리콜 농축물 및/또는 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소-1(NQO1), 시토크롬 P450 산화환원효소(P450R) 및 포도당 수송체 1(Glut-1) 단백질 발현을 이용하여 개인별로 표적화된 방광암 치료를 제공할 수 있다.
방광암은 세계적으로 7번째로 가장 흔한 암이다. 2000년에, 영국 남성에서 그 해 새로 9,000건이 진단되어 4번째로 가장 흔한 암이 되었다(1). 2002년에, 유럽에서 280,000건의 방광암이 추정되었고, 2004년에 미국에서 새로 60,000건 이상이 예상되었었다.
방광암의 가장 흔한 형태(약 90%)는 요로계(요관, 방광 및 요도)의 세포 상피인, 요로상피로부터 유래하는 이행 세포 암종(TCC; transitional cell carcinoma)이다. 이행 세포 암종(TCC)은 표재성(pTa 및 pT1) 또는 근침윤성(≥pT2)으로 분류할 수 있다. 표재성 TCC의 치료는 현재 경요도절제술(TURBT; 즉 눈에 보이는 모든 병소를 수술로 제거하는 것)을 실시한 이후, 보조 화학요법 또는 면역요법을 실시하는 것이다. 이러한 치료의 타당성은, TURBT 단독과 비교할 때, 보조 화학요법을 실시한 후 관찰되는 표재성 종양 재발에서의 유의적인 감소로 입증된다(2). 미토마이신 C(MMC), 에피루비신 및 BCG와 같은 제제가 일상적으로 사용되지만, TCC에 대해 더 강력하고/하거나 덜 독성인 제제를 개발하거나 또는 이익을 얻기 쉬운 개인(또는 병리학적 하위군)에 대한 치료 표적화의 관점에서 현재의 치료제를 더 잘 이용하기 위한 필요성이 있는 것으로 널리 인정되고 있다.
미토마이신 C(MMC)는 생체환원 약물로서 공지된 화합물의 부류에 속하는 천연 퀴논계 항신생물제이다(3). 일반적으로, 생체환원 약물은 세포독성 대사산물을 생성시키는 대사 활성화를 필요로 하고, 모두가 고형 종양의 불량하게 관류된 영역에 잔류하는 저산소 세포를 전멸시키도록 주로 설계된 프로드러그이다. 그러나, 이들 약물은 종양의 호기성 부분을 표적화할 수도 있다.
퀴논계 생체환원 약물의 세포독성 선택도(즉, 저산소 세포와 호기성 종양 세포 사이의 세포독성 선택도)를 결정하는 중요한 매개변수는 (세포사의 결정시 환원효소 및 산소 분압의 상대적 역할이 당해 화합물에 의존하여 변하더라도(4,6)) 프로 드러그를 환원시키는데 필요한 특정한 효소적 환원효소의 존재 및 분자 산소의 활성화 공정을 가역화시키는 능력이다(4,5). MMC가 TCC의 치료시 일상적으로 사용된다는 사실은 이러한 질환이 생체환원 활성화에 필요한 적절한 생화학 기계를 가진다는 것뿐만 아니라, 이러한 부류의 다른 화합물이 이러한 질환의 치료시 유용할 수도 있다는 것을 제시한다. 유용할 수도 있는 추가 화합물의 2가지 예로는 인돌퀴논 유도체 EO9 및 아지리디닐 벤조퀴논 RH1을 포함한다(7,8).
기술한 바대로, 퀴논계 생체환원 약물이 호기성 또는 저산소 세포를 전멸시키는 능력은 환원효소의 존재를 비롯한 종양 효소학과 저산소증 사이의 복잡한 관계에 의해 주로 결정된다. 몇몇 환원효소는, 효소 시토크롬 P450 환원효소(P450R) 및 효소 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소-1(NQO1)에 상당한 관심을 기울이더라도, 생체환원 약물의 활성화에 관련되어 있다(4,6). 저산소증의 측정과 관련하여, 포도당 수송체 1(Glut-1) 또는 탄산탈수효소 IX(CAIX)와 같은 내인성 표지자는 피모니다졸과 같은 외인성 저산소증 표지자와 상관되는 것으로 나타나고 있다(9,10). 따라서, 방광의 표재성 및 침윤성 이행 세포 암종(TCC)에서 2개의 중요한 환원효소의 발현과 종양 저산소증 사이의 관계는 매우 중요하다. 추가로, 다양한 침투 프로파일을 지닌 방광암 치료 약학 제제의 사용은 표재성 종양이나 근침윤성 종양을 표적화하기 위해 필요하다. 본 발명은 이러한 양태의 방광암 치료를 다루기 위한 것이다.
발명의 개요
NQO1 발현에서의 유의적인 차이가 표재성 종양과 침윤성 종양 사이에서 관찰되었고 근침윤성 종양에서 관찰되는 낮은 수준으로 관찰되었다. 대조적으로, 발현이 (특히 Glut-1의 경우에) 종양 병기에 따라 증가하더라도, P450R 및 Glut-1은 TCC의 모든 병기 및 등급에서 발현되었다. 또한, Glut-1 발현은 G3 종양에서 유의적으로 상승하지만, 낮은 수준의 NQO1이 존재하게 된다. 이러한 결과는 표재성 방광 TCC와 침윤성 방광 TCC 사이에 NQO1 및 Glut-1의 발현에서의 현저한 차이가 존재한다는 것을 증명한다. 또한, 상이한 침투 프로파일을 지닌 퀴논계 생체환원 약물의 약학 제제가 발견되었다.
이러한 결과들은 단일 제제 치료법이 표재성 질환의 경우 적합하지만, 근침윤성 질환의 경우, 저산소성 분획을 표적화하기 위해 퀴논을 사용하는 병용요법 및 호기성 분획을 전멸시키는 다른 요법이 바람직하다는 점에서 퀴논계 생체환원 약물에 대해 치료적 암시를 갖는다. 추가로, 더 낮은 침투 프로파일을 갖는 약학 제제는 표재성 방광암을 치료할 때 채택될 수 있는 반면, 더 높은 침투 프로파일을 갖는 약학 제제는 더 근침윤성인 방광암을 치료할 때 채택할 수 있다. 함께 고려되어, 본 발명의 이들 양태는 암 치료를 개인의 질환 프로파일의 개인별 특성에 조정하는 것을 허용함으로써 방광암의 치료시 중요한 진보를 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따르는 하나의 양태는 종양 내의 하나 이상의 효소의 수준을 측정하는 단계 및 하나 이상의 효소 수준을 기준으로 하여 치료를 선택하는 단계를 포함하는 방광암의 치료 방법을 포함하고, 여기서 치료는 퀴논계 생체환원 약물 단독 투여 또는 또 다른 치료와의 병용 투여를 포함한다.
또 다른 양태에서, 효소는 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소-1(NQO1) 및 NADPH 시토크롬 P450 환원효소(P450R)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 양태에서, 효소는 NQO1이고, 치료는 퀴논계 생체환원 약물의 단독 투여를 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 효소는 NQO1이고, 치료는 또 다른 치료와 병용되는 퀴논계 생체환원 약물의 투여를 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 효소는 P450R이고, 치료는 퀴논계 생체환원 약물 단독의 치료를 포함한다. 훨씬 또 다른 특정 양태에서, 효소는 P450R이고, 치료는 또 다른 치료와 병용되는 퀴논계 생체환원 약물의 투여를 포함한다. 본 발명에 따르는 추가 양태에서, 효소는 NQO1 및 P450R이고, 치료는 퀴논계 생체환원 약물의 단독 투여를 포함한다. 훨씬 또 다른 양태에서, 효소는 NQO1 및 P450R이고, 치료는 또 다른 치료와 병용되는 퀴논계 생체환원 약물의 투여를 포함한다.
본 발명에 따르는 하나의 양태는 종양 내의 저산소증의 수준을 측정하는 단계 및 하나 이상의 효소 수준 및 저산소증 수준을 기준으로 하여 치료를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 저산소증 수준은 포도당 수송체 1(Glut-1) 및/또는 탄산탈수효소 IX(CAIX)를 측정함으로서 결정한다.
본 발명에 따르는 특정 양태는 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소-1(NQO1)의 수준, NADPH 시토크롬 P450 환원효소(P450R)의 수준, 및 포도당 수송체-1(Glut-1)의 수준으로 이루어진 군으로부터 선택된 측정을 기준으로 하여 치료를 선택하는 단계를 포함하는 방광암의 치료 방법을 포함하고, 여기서 치료는 퀴논계 생체환원 약물 단독 또는 또 다른 치료와의 병용 투여를 포함한다. 이러한 특정 양태의 다양한 구체예에서, 측정은 NQO1 또는 P450R일 수 있고, 치료는 퀴논계 생체환원 약물의 단독 투여를 포함하고; 측정은 NQO1 또는 P450R일 수 있고, 치료는 또 다른 치료와 병용되는 퀴논계 생체환원 약물의 투여를 포함하고; 측정은 NQO1 및 P450R일 수 있고, 치료는 퀴논계 생체환원 약물의 단독 투여를 포함하고; 측정은 NQO1 및 P450R일 수 있고, 치료는 또 다른 치료와 병용되는 퀴논계 생체환원 약물의 투여를 포함하고; 또는, 측정은 NQO1, P450R 및 Glut-1일 수 있고, 측정은 퀴논계 생체환원 약물 단독 또는 또 다른 치료와의 병용 투여를 포함한다.
본 발명에 따르는 하나의 양태에서, 본 발명은 종양 내의 NQO1 및 Glut-1의 수준을 측정하는 단계; 상기 종양이 표재성인 경우 관찰되는 것보다 상기 NQO1 수준은 더 낮고 상기 Glut-1 수준은 더 높으므로, 또 다른 치료와 병용되는 퀴논계 생체환원 약물을 포함하는 병용 치료를 선택하는 단계를 포함하는 침윤성 방광암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따르는 또 다른 양태에서, 본 발명은 환자의 방광 종양 내의 NQ01 및 Glut-1의 발현 수준을 기준으로 하여 방광암에 대한 적절한 치료법을 위해 환자를 계층화시키는 방법으로서, 상기 환자의 방광 종양 내에 NQ01 및 Glut-1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 환자가 높은 수준의 NQ01을 갖는 표재성 방광암을 갖는 경우 단일 치료제로서 생체환원 약물을 투여하거나, 또는 상기 환자가 낮은 NQ01 및 높은 Glut-1 수준을 갖는 침윤성 방광암을 갖는 경우 생체환원 약물이 방사선 치료법 또는 또 다른 화학요법제와 병용되어 사용되는 병용 치료를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르는 특정 양태에서, 또 다른 치료는 방사선치료법 및/또는 하나 이상의 화학요법제의 투여이다.
다양한 양태에서, 특히 유용한 퀴논계 생체환원 약물은 미토마이신 C, 인돌퀴논 유도체 EO9, 아지리디닐 벤조퀴논(RH1), 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 약학 제제를 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 따르는 하나의 양태는 약 30% vol/vol PG, 약 20% vol/vol PG, 및 약 10% vol/vol PG로 이루어진 군으로부터 선택된 프로필렌 글리콜(PG) 농도를 갖는 용액 중에 EO9를 포함하는 약학 제제를 포함한다. EO9 농도는 약 300 μM 내지 약 400 μM의 범위로 존재할 수 있다. 특정 양태에서, 제제는 약 347 μM EO9 농도를 갖는 용액을 포함한다.
본 발명에 따르는 약학 제제는 NaHCO3, EDTA, 만니톨 및 물을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 제제는 약 10 mg/mL 내지 약 120 mg/mL NaHCO3를 포함한다. 특정 양태에서, 제제는 약 100 mg/mL 또는 약 100.25 mg/mL NaHCO3를 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 제제는 약 50 mg/mL NaHCO3 또는 약 50.125 mg/mL NaHCO3를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제제는 약 0.5 mg/mL 내지 약 3.0 mg/mL 만니톨을 포함한다. 특정 양태에서, 제제는 약 0.625 mg/mL 만니톨을 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 제제는 1.25 mg/mL 만니톨을 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 제제는 EDTA, PG 및 물을 포함하는 용액 중에 약 100 mg/mL NaHCO3, 약 0.625 mg/mL 만니톨 및 약 0.1 mg/mL EO9를 포함한다.
본 발명에 따르는 하나의 양태는 PG, EDTA 및 물을 포함하는 용액 중에 EO9, NaHCO3 및 만니톨을 포함하는 약학 제제를 포함하고, 여기서 PG는 약 6% 내지 약 14% vol/vol; 약 16% 내지 약 24% vol/vol, 및 약 26% 내지 약 34% vol/vol로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율 범위로 용액 중에 존재한다. 또 다른 양태에서, PG는 약 10% vol/vol, 약 20% vol/vol, 및 약 30% vol/vol로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율로 용액 중에 존재한다. 또 다른 양태에서, 제제는 약 347 μM EO9 농도 및 약 10% vol/vol PG 농도를 갖는 용액을 포함한다. 훨씬 또 다른 양태에서, 제제는 약 347 μM EO9 농도 및 약 20% vol/vol PG 농도를 갖는 용액을 포함한다. 추가 양태에서, 제제는 약 347 μM EO9 농도 및 약 30% vol/vol PG 농도를 갖는 용액을 포함한다. 이들 기재된 본 발명의 양태는 약 10 mg/mL 내지 약 120 mg/mL NaHCO3를 포함할 수 있고, 하나의 특정 양태에서 약 100 mg/mL, 약 100.25 mg/mL 또는 약 50.125 mg/mL NaHCO3를 포함할 수 있다. 이들 기재된 본 발명의 양태는 약 0.5 mg/mL 내지 약 3.0 mg/mL 만니톨을 포함할 수 있고, 하나의 특정 양태에서 약 0.625 mg/mL 또는 약 1.25 mg/mL 만니톨을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 약 347 μM EO9 농도, 약 10% vol/vol PG 농도, 약 100.25 mg/mL NaHCO3 및 약 0.625 mg/mL 만니톨을 갖는 용액을 포함하는 약학 제제를 포함할 수 있다. 또 다른 양태는 약 347 μM EO9 농도, 약 30% vol/vol PG 농도, 약 100.25 mg/mL NaHCO3 및 약 0.625 mg/mL 만니톨을 갖는 용액을 포함하는 약학 제제를 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 방광의 이행 세포 암종을 갖는 3명의 환자에서 NQO1, P450R 및 Glut-1의 면역조직화학적 분석을 보여주는 것이다.
도 2는 다세포층을 통한 약물 침투를 연구하기 위해 사용된 기구를 보여주는 것이다.
도 3은 약물 용액 제제의 개략적 대표도를 보여주는 것이다.
도 4는 내부 기준물질로서 WV14가 소량 첨가된(spiked) 바탕시료의 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 5는 RPMI 1640 배양액 중의 EO9 기준물질의 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 6은 0.1% DMSO(6A); 30% 프로필렌 글리콜(PG; 6B); 20% PG(6C); 및 10% PG(6D) 중의 EO9 기준물질의 크로마토그램을 보여주는 것이다.
도 7은 0.1% DMSO 및 다양한 PG(30%; 20%; 10%) 농도 중의 EO9에 대한 보정 곡선을 보여주는 것이다.
도 8은 DLD-1 다세포층을 통한 다양한 PG 농도에서 EO9의 침투를 보여주는 것이다.
도 9는 염색된 DLD-1 다세포층을 통한 대표적인 단면도를 보여주는 것이다.
발명의 상세한 설명
퀴논계 생체환원 약물은 효소 활성화 후 세포독성 종을 생성시키는 프로드러그이다. 효소 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소-1(NQO1; DT-디아포라제(DTD)로도 호칭됨), 2개의 전자 환원효소 효소는 호기성 상태하에 퀴논계 생체환원 약물의 활성화에 중요한 역할을 한다. 퀴논계 생체환원 약물은 또한 낮은 NQO1 활성을 갖는 세포를 비롯한 저산소 상태하에 세포독성이다. 시토크롬 P450 환원효소와 같은 하나의 전자 환원 효소는 저산소 상태하에 퀴닌계 생체환원 약물의 활성화에 더 두드러진 역할을 할 수 있다. 상술한 내용을 기본으로 하여, 이들 환원효소의 수준 및 저산소 상태는 다양한 퀴논계 생체환원 약물 사용의 적합성을 비롯하여 상이한 암 치료법의 적합성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 등급 및 병기의 TCC에서 기술된 환원효소의 수준 및 저산소 상태를 평가한다.
방광암의 치료에서의 개선은 다양한 침투 프로파일을 지닌 퀴논계 생체환원 약물을 포함하는 약학 제제를 제공함에 의거하여 발생할 수도 있다. 예를 들면, 침투 프로파일이 더 낮은 약학 제제는, 약물이 치료가 가장 필요한 방광의 표면에 더 가까이 잔류하므로, 표재성 방광암의 치료시 때 사용하는 것이 유리하다. 반대로, 침투 프로파일이 더 높은 약학 제제는, 약물이 이러한 경우에 치료가 가장 필요한 방광의 더 깊은 층으로 침투하므로, 더 근침윤성인 방광암의 치료시 유리하다. 함께 고려되어, 본 발명의 이들 양태는 암 치료를 개인의 질환 프로파일의 개인별 특성에 조정하는 것을 허용함으로써 방광암의 치료시 중요한 진보를 제공한다.
EO9 또는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 NSC-382459(3-하이드록시메틸-5-아지리디닐-1-메틸-2-(1H-인돌-4,7-디온)-프로페놀로서도 공지되어 있는 아파지퀀(prop. INN, USAN)은 완전 합성 생체환원 알킬화 인돌로퀴논이다.
Figure 112008058984208-pct00001
EO9의 활성화의 기본적인 메카니즘은 각각 세미퀴논 및 하이드로퀴논을 형성하는 하나 또는 두개의 전자를 이송시키는 세포 효소에 의한 환원을 비롯하여, 다른 인돌로퀴논의 메카니즘과 유사한 것으로 생각되고 있다. 호기성 상태하에 세미퀴논의 산화는 반응성 산소 종(ROS)을 형성하여 DNA 스트랜드 절단을 유발함으로써 세포사를 발생시킬 수 있는 산화환원주기를 결과로 발생시킨다. 세미퀴논/하이드로퀴논은 특히 저산소 상태하에 DNA 및 다른 마크로분자를 알킬화시키고 가교결합시켜 세포사를 유발할 수 있다. EO9는 본 발명에서 사용하기에 적절한 퀴논계 생체환원 약물의 하나의 비제한적인 예이다.
실시예 1.
I. 재료 및 방법
A. 인간 조직
인간 방광 이행 세포 암종의 포르말린 고정 파라핀 포매 시편(n = 52)을 우 선 의학연구협회(Medical Research Council) 규정에 따라 자국 내의 연구윤리위원회(LREC; local research and ethics committee)로터 허가를 얻은 후 본 연구를 위해 사용하였다. 모든 환자의 세부사항은 비밀을 보장하기 위해 익명화시키고 모든 실험은 LREC에 의해 규정된 가이드라인에 따라 수행하였다. 연구에 사용된 종양은 인간 방광 TCC의 표재성 병기(19 pTa; 19 pT1) 및 근침윤성(14 ≥pT2) 병기 둘 다의 모든 등급(등급 1, 11개; 등급 2, 26개; 등급 3, 15개)을 대표하였다. 모든 종양 블록은 조직미세배열법(TMA; tissue microarray)의 구조물 및 후속적인 면역조직화학적 분석을 위해 사용하였다.
B. 조직미세배열법 구조물
조직미세배열법(TMA) 구조물은 파라핀 포매 블록으로부터 구조화하였고, 인간 방광 TCC의 다양한 등급(G1-G3) 및 다양한 병기(pTa, pT1, ≥pT2)를 대표하였다. 조직미세배열법(TMA) 구조물은 본원에 참조문헌으로 인용된 문헌(Bubendorf et al.)(11)의 변형 방법을 사용하여 비이체르 인스트루먼츠(Beecher Instruments) 마이크로어레이(미국 미들랜드주 실버 스프링 소재)를 사용하여 성취하였다. 간단하게, 각각의 파라핀 포매 공여자 블록의 절편은 헤마톡실린 및 에오신(H&E)을 사용하여 염색하고, 현미경으로 검사하고 중요한 조직을 포함하는 영역을 왁스 블록 상에 표시하였다. 원기둥 코어(600 μM)는 이들 대표적인 구역으로부터 펀치 생검하고 수여자 블록으로 이동시켰다. 조직 채취는 각각의 종양 블록으로부터 4개의 코어를 사용하여 각각의 모 블록 상에 대표적인 데이타를 제공하였다. TMA 블록마다 26명 의 환자를 대표하는 총 108개의 코어 시료를 포함하고 2개의 TMA 블록을 구조화하였다. 두께 5 μM의 절편을 수여자 TMA 블록으로부터 절단하고 테이프 이송 시스템(tape transfer system)(Instrumedics, 미국 소재)을 사용하여 유리 슬라이드 상에 장전하였다. 조직학 및 시료 통합성의 검증을 위한 H&E 오염은 각각의 마이크로어레이 블록으로부터 절단된 첫번째 절편 및 매번 뒤이은 10번째 절편에서 수행하였다. 이어서, TMA 슬라이드는 면역조직화학적 분석 처리하였다.
C. 항체
사용된 항체는 NQO1에 대해 [미국 덴버 소재의 University of Colorado Health Sciences Center, Drs. Siegel and Ross에 의해 제공되는] 마우스 단클론성 항체, P450R에 특이적인 염소 다클론성 항체[Santa Cruz Biotechnology, 미국 소재], Ki67에 대해 마우스 단클론성 항체[BD Biosciences, 영국 소재] 및 포도당 수송체-1에 특이적인 래빗 다클론성 항체[GLUT-1; Dako, 영국 소재]를 포함하였다.
D. 면역조직화학법
NQO1, P450R, GLUT-1 및 Ki67의 면역위치결정법(immunolocalisation)은, 상기 기재되어 있고(9,10,12,13) 당해 분야의 숙련된 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 면역조직화학법에 의해 평가하였다. 간단하게, 항원 회복 및 비특이적 면역글로불린 결합의 차단 후에, TMA는 적절한 제1 항체로 배양하거나: 1:1 TBSTM(1O mM Tris-HCl, 15O mM NaCl, 0.2% Tween 20, 5% 탈지분유) 중에 희석된 항-NQO1 항체로 약 60 분 동안 배양하거나; PBS 중에 1:100 희석된 P450R에 대해 약 90 분 동안 배 양하거나; PBS 중에 1:25 희석된 항-Glut-1 항체로 약 90 분 동안 배양하거나; 또는 PBS 중에 1:100 희석된 항-Ki67 항체로 4℃에서 밤새 배양하였다. 대조군은 제1 항체 대신에 일반 IgG를 사용하여 수행하였다. 면역위치결정법은 적절한 바이오티닐레이트화 제2 항체[1:200 희석됨; Vector Labs., 미국 소재]를 사용하여 성취한 후, 벡타스타인(Vectastain) ABC 키트[Vector Labs., 미국 소재]를 사용하여 시그널을 증폭시키고 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)[Vector Labs., 미국 소재]으로 가시화시켰다. 이어서, 절편을 해리스(Harris) 헤마톡실린으로 대조염색하고, 탈수시키고, 깨끗이 하고, DPX 마운탄트[Sigma, 영국 소재] 상에 장전하였다.
E. 면역조직화학적 염색의 반정량적 분석
양성 면역염색을 3명의 독립적 관찰자에 의해 반정량적으로 점수를 매겼다. NQO1 및 P450R 둘 다 종양 내에 세포질로 편재되었다. 염색의 강도 및 분포를 기준으로 하여 각각의 종양 코어의 상피 구역에 대한 점수를 0(염색되지 않음)으로부터 4(최대 염색 강도)로 배정하였다. 평균 득점량은 독립적 관찰자의 결과로부터 TMA의 각각의 코어 및 각각의 종양에 대해 계산하였다. 결과는 임상병리학적 매개변수에 대한 임의의 관계 및 상관관계에 대해 비교하였다.
각각의 TMA 코어에서 Glut-1 염색성(positivity)의 수준을 분석하고 막 염색을 나타내는 종양 세포의 대략적 백분율을 대표하여 0으로부터 4로 점수(0 = 염색되지 않음; 1 = 0-5% 양성; 2 = 5-15% 양성; 3 = 15-30% 양성; 4 = >30% 양성)를 배정하였다. 평균 득점량은 독립적 관찰자의 결과로부터 TMA의 각각의 코어 및 각각의 종양에 대해 계산하였다. 결과는 임상병리학적 매개변수에 대한 임의의 관계 및 상관관계에 대해 비교하였다.
종양 세포에서 Ki67 양성 핵의 백분율은, 본원에 참조문헌으로 인용된 문헌(Santos et al.)(13,14)에 보고된 바와 같이, 각각의 코어 및 종양에 대해 4O배 확대를 사용하여 계산하였다. 코어당 총 200개의 세포 및 종양당 총 계수하고 염색성의 백분율을 계산하였다. 점수 매김은 2명의 관찰자에 의해 독립적으로 수행하였다. 결과는 임상병리학적 매개변수에 대한 임의의 관계 및 상관관계에 대해 비교하였다.
F. 통계 분석
NQO1 및 P450R의 발현은 하기 임상병리학적 매개변수로 비교하였다: 종양 병기, 종양 등급, 종양 저산소증(Glut-1 발현) 및 증식. 통계 분석은 SPSS 소프트웨어 팩키지, 버젼 11.0(SPSS Inc., 일리노이주 시카고 소재)을 사용하여 수행하였다. 면역조직화학적 연구에서, 발현은 일반적으로 분포되지 않으므로, 각각의 카테고리에 대한 평균 발현 값은 사분위 범위에 의해 중앙값으로서 기록하였다. 독립 변수들 사이의 차이는 만-휘트니 U 검증(Mann-Whitney U test)으로 측정하였다. 양측(two-tailed) 분석에서 0.05 미만의 P 값은 유의적인 것으로 고려되었다.
II . 결과
A. NQO1 단백질 수준, 종양 병기 및 등급 사이의 관계
NQO1은 모든 병리학적 등급 및 병기의 방광 종양의 상피에서 세포질로 편재되었고 NQO1의 발현은 종양들 사이에서 변하였다(도 1, 표 1). 많은 경우에, 동일 한 시료 내에 높은 NQO1 발현 영역 및 낮은 NQO1 발현 영역을 가지면서, NQO1의 불균일한 발현 패턴이 동일한 종양 내에 관찰되었다(데이타는 기재되지 않음). NQO1은 모든 병리학적 병기(pTa, pT1, ≥pT2)의 종양에서 발현되었지만, NQO1의 발현 수준은 다양한 병기들 사이에서 변하였다(표 1). NQO1 발현에서의 유의적인 차이가 표재성 종양(pTa + pT1)과 근침윤성 종양(≥pT2) 사이에 관찰되었고, 근침윤성 종양(P = 0.02)에서의 발현은 유의적으로 더 낮았다. 종양 침윤 가능성에 대한 NQO1 발현의 역관계는 비침윤성(pTa) 종양과 침윤성(pT1 + ≥pT2) 종양 사이에 관찰된 발현(P = 0.03)에서의 유의적인 차이에 의해 추가로 강화된다. TCC의 모든 병리학적 등급은 NQO1을 발현하였다(표 1). NQO1의 발현은 등급 1 또는 등급 3과 비교하여 등급 2 종양에서 유의적으로 더 높았다(표 1). 상당히 분화된 종양(등급 1)과 불량하게 분화된 종양(등급 3) 사이에 유의적인 차이는 관찰되지 않았다(표 1).
B. P450R 단백질 발현 및 종양 병기 및 등급 사이의 관계
검사된 모든 종양은 세포질로 편재된 P450R의 검출 가능한 수준을 발현하였다. NQO1과 대조적으로, P450R 발현은 일반적으로 종양 내에서 균일하였다. 대표적인 면역염색은 도 1에 도시되어 있다. P450R은 TCC의 모든 병기에서 발현되었다(표 1). P450R의 수준은 표재성(pTa + pT1) 종양(P < 0.01)과 비교하여 근침윤성 종양(≥pT2)에서 유의적으로 더 높았다. NQO1과 대조적으로, P450R의 발현은 종양 병기의 증가에 따라 정적 관계를 나타내지만, 침윤성 종양(pT1 + ≥pT2)과 비침윤성(pTa) 종양 사이에 관찰되는 유의적인 차이의 부족으로 증명되는 바와 같이(표 1), 종양의 침윤 가능성과 관련되지 않았다. TCC의 모든 병리학적 등급은 P450R을 발현하였다(표 1). 정적 상관관계는 P450R 수준과 종양 등급의 증가 사이에 관찰되었다(표 1).
C. Glut-1 및 종양 병기 및 등급 사이의 관계
Glut-1 단백질의 발현은 각각의 종양 시편 내에서 및 각각의 환자 시료들 사이에서 둘 다 불균일하였다. 대표적인 면역염색 및 이의 종양 병기 및 등급과의 관계는 도 1 및 표 1에 각각 제시되어 있다. Glut-1 단백질은 검사된 모든 병기 및 등급에서 발현되었지만, Glut-1의 수준은 (pTa 종양[P = 0.05]에 대해) ≥pT2 종양 및 (등급 1 종양[P = 0.03] 및 등급 2 종양[P < 0.01] 둘 다에 대해) 등급 3 종양에서 유의적으로 더 높았다. 또한, 통계적으로 유의적인 차이(P = 0.02)가 비침윤성 종양(pTa)과 침윤성(pT1 + ≥pT2) 종양 사이에 존재하고, 침윤성 질환이 더 높은 Glut-1 단백질 발현과 관련되고 결과적으로 더 높은 수준의 저산소증과 관련된다는 것을 제시하였다.
D. Ki67 , 종양 병기, 종양 등급 및 효소학 사이의 관계
Ki67 항원의 발현 수준은 종양 증식 지수의 지시자로서 사용하였다(표 1). 예상된 바와 같이, 유의적인 상관관계가 종양 등급의 증가(분화의 감소)와 증식 지수(P < 0.01) 사이에 관찰되었다. 종양 증식과 종양 침윤 가능성(pTa 대 pT1 + ≥pT2) 사이의 관계는 관찰되지 않았다. 반대로, 종양 증식은, 대게 근침윤과 더 높은 종양 등급 사의의 관계의 결과로서, 표재성 종양(pTa + pT1[P < 0.01])에 비해 근침윤성 종양(≥pT2)에서 유의적으로 더 높았다. 흥미롭게도, 종양 증식 지수와, NQO1 발현이 아니라, Glut-1 발현(P = 0.01) 및 P450R 발현(P < 0.01) 둘 다 사이 에 유의적인 관계가 관찰되었다.
본 연구의 결과는 중요한 효소의 단백질 발현은, 방광 TCC의 병기 및 등급에 따르는 Glut-1 단백질 수준 변화에 의해 측정된 바대로, 퀴논계 화합물의 생체환원 활성화 및 저산소증의 존재와 관련된다는 것을 증명하였다. 가장 인상적인 관찰은 NQO1 단백질 발현은 종양 병기가 증가하면서 유의적으로 감소한다는 사실이었다(표 1). 종양 등급과 관련하여, G3 종양은 (G1 종양이 아닌) G2 종양보다 낮은 수준의 NQO1을 갖는다는 증거가 또한 존재한다. 이러한 발견은 NQO1 mRNA 발현과 종양 병기의 증가 사이의 역관계(15)가 보고되었던 이전의 공개된 연구와 일치한다. Glut-1의 경우와 유사하게, 종양 등급(G1 및 G2가 G3 종양과 각각 비교될 때, P = 0.03 및 < 0.01) 및 종양 병기(pTa 종양이 ≥pT2 종양과 비교될 때, P = 0.05)에 따른 단백질 발현의 증가는 이전의 보고서와 일치하였다(16). 근침윤성 TCC와 비교하여 표재성 TCC에서 더 높은 수준의 P450R mRNA를 증명하는 이전의 공개된 보고서(15)와 대조적으로, P450R 단백질 수준은 본 연구(P < 0.01)에서 근침윤성(pTa + pT1과 비교하여 ≥pT2) 질환에서 유의적으로 더 높았다. 또한, P450R 단백질 발현은 종양 등급의 증가(분화의 감소)와 정적 상관관계를 보여주었다(표 1). 흥미롭게도, P450R 발현은, 대게 P450R, Ki67과 종양 등급의 증가(분화의 감소) 사이의 밀접한 관계의 결과로서, 증식 지수(P < 0.01)에 대해 강한 정적 상관관계를 또한 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 높은 증식 지수는 방광암에서 불량한 예후와 관련되는 것으로 나 타나고 있으므로(17,18), P450R을 포함하는 생체환원 치료법을 평가시 이를 숙지하고 있어야 한다. 요약하자면, 면역조직화학법에 의한 단백질 발현의 분석은, Glut-1 발현에 의해 증명되는 바와 같이, 저산소증은 종양 병기, 등급 및 종양 침윤의 증가와 관련된다는 것을 제시하였다. 종양 효소학과 관련하여, 본 연구는 NQO1 수준이 종양 병기(및 침윤 가능성)의 증가의 함수로서 유의적으로 감소하지만, P450R 수준은 종양 등급 및 침윤 가능성에 따라 증가한다는 것을 제시하였다.
이러한 발견은 방광 TCC의 치료시 퀴논계 생체환원 약물을 사용하는 잠재적 치료 전략에 대해 상당한 함축을 갖는다. MMC, EO9 및 RH1에 대한 세포의 반응은 NQO1 수준에 의존할 뿐만 아니라, 종양 저산소증의 수준에 의존한다는 것을 나타내는 사전임상 모델에서 광범위한 증거가 존재한다. MMC와 관련하여, 호기성 상태하에 세포 반응을 결정하는 NQO1의 역할은 저산소 상태하에서를 제외하고는 논쟁의 여지가 있고, 활성의 유의적인 강화는 적은 NQO1 활성을 갖거나 또는 NQO1 활성을 갖지 않는 세포에서만 관찰되었다(19). EO9 및 RH1의 경우에, 유사한 결과가 저산소 상태하에 수득되었고, 활성의 현저한 강화가 낮은 NQO1을 갖는 세포에서만 관찰되었다(20,21). 그러나, 호기성 상태하에서, NQO1 활성과 항암제감수성 사이에 우수한 상관관계가 존재하고, 산소의 존재하에 NQO1은 EO9 및 RH1을 활성화하는데 주요한 역할을 한다(22,23)는 것을 제시하였다. 이러한 관찰을 설명하는 메카니즘 원리는 저산소 상태하에서를 제외하고는 명확하지 않고(24), 하나의 전자 환원효소, 예를 들 면, P450R은 생체환원 활성화 공정에서 더 우세한 역할을 하는 것으로 추정되었다(25). 이러한 발견을 기본으로 하여, EO9 및 RH1과 같은 화합물은, 하나의 전자 환원효소, 예를 들면, P450R이 존재하는 것으로 가정하면서, NQO1 풍부 종양의 호기성 분획을 표적으로 하거나(MMC도 그렇지만 보다 낮은 정도로 그러하다) 또는 NQO1 결핍 종양의 저산소 분획을 표적으로 한다. 따라서, NQO1 풍부 종양의 경우에, 호기성 분획을 표적으로 하는 단일제로서 EO9 및 RH1과 같은 화합물의 사용이 적절하다. 상당한 저산소 분획을 갖는 NQO1 결핍 종양의 경우에, 이러한 제제는 호기성 분획을 표적으로 하는 방사선치료법 또는 다른 화학요법제와 병용하여 사용해야 한다. 본 연구의 결과는, 방광의 더 전진된 TCC(즉, ≥pT2) 또는 더 공격적인 질환(즉, 등급 3 종양)의 경우에, 이들이 일반적으로 낮은 NQO1 단백질 발현(및 가능하게는 더 높은 P450R 발현)을 갖고 저산소증의 상당한 영역을 포함하므로, 상기한 후자의 전략은 효과적일 수 있다는 것을 제시하였다. 이러한 구체적인 상황에서, NQO1 및 저산소증 표지자의 분석이 본 연구의 설계에 편입되지 않았더라도(26), 장려되는 결과가 화학방사선치료법(라디칼 방사선치료와 병용되는 미토마이신 C + 5 플루오로우라실)을 사용하여 근침윤성 방광암에서 수득된다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 폭넓은 상황에서, 표재성 및 근침윤성 방광 TCC 둘 다는 저산소증의 상당한 구역을 갖는다는 본 연구 및 다른 연구에서의 설명은, 이들 종양은 다른 생체환원 약물 또는 저산소증 매개된 치료법을 평가하기 위한 매력적인 후보자라는 것을 제시하였다.
결론적으로, 본 연구의 결과는 퀴논계 화합물의 생체환원 활성화 및 저산소증의 존재와 관련되는 중요한 효소의 단백질 발현은 방광의 TCC에서 종양 병기 및 등급의 함수로서 변한다는 것을 증명하였다. 이러한 결과는 이러한 종양(즉, ≥pT2 및 G3 종양)은 방사선과 병용되어 저산소 분획을 표적화하기 위해 퀴논(예: MMC, EO9 및 RH1)을 사용하는 화학방사선치료 요법 또는 세포의 호기성 분획을 표적화하기 위한 다른 화학요법에 대한 우수한 후보자라는 것을 제시하였다. 이러한 논리를 기준으로 하여, 다시 도 1을 참조하면, 증례 A(pT2 G3)는 낮은 NQO1, 높은 P450R 및 높은 Glut-1 수준을 나타내고, 따라서 퀴논을 사용하는 화학방사선치료법에 대한 우수한 후보자이었다. 증례 B(pTa G1)는 높은 NQ01, 낮은 P450R 및 적절한 Glut-1을 갖고, 그대로 퀴논계 화학요법에 훌륭히 반응해야 한다. 적절한 NQO1, 적절한 P450R 및 적절한 Glut-1을 갖는 증례 C(pT1 G2)는 또한 퀴논계 화학요법에 훌륭히 반응할 것으로 예상되었다. 특히 발생하는 (특히 NQO1에 의한) 현저한 이식환자 이질성의 관점에서, 이들 표지자에 대한 각각의 환자 종양의 프로파일링은 여전히 중요하다.
본원에 사용된 바대로, 환자에 대한 적절한 치료를 결정하기 위한 효소 수준을 사용할 때, 효소의 "높은" 수준 대 "낮은" 수준은 관련 종양으로부터 동일한 환자로부터의 다른 종양으로, 또 다른 환자로부터의 종양으로 및/또는 표준 종양 세포주로의 중요한 효소의 수준 또는 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지된 다른 이용가능한 표준점을 비교함으로써 확인할 수 있다. 따라서, "높은" 수준 및 "낮은" 수준은 특정한 환자의 종양 효소 수준을 측정하고/하거나 정량하는데 관련되는 치료 주치의 또는 다른 실험실, 연구소 또는 치료 직원에 의해 측정할 수 있다.
실시예 2.
I. 재료 및 방법
A. 기구 및 일반적인 검정 원리
도 2에 도시된 바대로, 기재된 실험에 사용된 기구는 24웰 배양 평판 하나의 웰로 삽입된 트랜스웰 인서트(Costar)를 포함하였다. 그 인서트는 이의 기부에 콜라겐 코팅된 막을 갖고, 따라서 상부 챔버와 하부 챔버 사이의 장벽뿐만 아니라, 세포가 부착하고 성장할 수 있는 표면 둘 다를 형성하였다. 본 연구에서 사용된 세포주는 세포들 사이에 밀착 연접을 형성함으로써 약물이 통과해야하는 연속 '장벽'을 형성하는 이의 능력으로 인해 선택된 DLD-1 인간 대장 샘암종 세포이었다. 약물 침투를 평가하기 위해, 약물은 상부 챔버에 첨가하고 하부 챔버에서의 약물의 농도는 시간 간격의 범위에 걸쳐 측정하였다.
B. 세포 배양 조건
DLD-1 세포는 10% 태아소혈청, 피루브산나트륨(1 mM), L-글루타민(2 mM), 페니실린/스트렙토마이신(50 IU/ml, 50 ㎍/ml)로 보충되고 HEPE(25 mM)로 완충된 RPMI 1640 매질 중에 일상적으로 유지시켰다. DLD-1 세포(매질 200 ㎕ 중의 2.5 × 105)를 상부 챔버에 첨가하고 침강되게 하고 CO2 풍부 대기(5%)에서 37℃에서 대략 3 시간 동안 막에 부착시켰다. 일단 세포가 부착되면, 트랜스웰을 24웰 평판의 하 나의 웰에 삽입하고 600 ㎕ 매질을 하부 챔버에 첨가하였다. 이어서, 기구를 상부 챔버 및 하부 챔버 둘 다에 일상적으로 매질 변화시키면서 37℃에서 4 일 동안 배양하였다. 이전 연구를 기본으로 하여, 배양 4 일 후 다세포층의 두께는 대략 50 ㎛ 이었다. 각각의 검정의 경우, 3개의 트랜스웰을 조직학 검사, 및 두께 및 통합성의 정확한 측정(자세한 사항은 하기 참조)을 위해 제거하였다.
C. 약물 용액의 제제
하기 용액을 하기 기재된 바대로 제조하였고 도 3에 요약되어 있다.
1. 용액 1: 0.1% DMSO 중의 EO9 (347 μM)
고체 EO9를 100% DMSO 중에 용해시켜 347 mM 스톡 용액을 제조하였다. 스톡 용액 10 ㎕를 완전한 RPMI 매질(페놀 레드 비함유) 10 ml 중에 첨가하였다. EO9의 가능한 침전을 막기 위해, EO9 스톡 용액을 연속적으로 진탕시키면서 매질로 첨가하였다. EO9의 최종 농도는 4 mg/40 ml에 동등한 347 μM이었다.
2. 용액 2: 10% PG 중의 EO9 (347 μM)
중탄산나트륨(NaHCO3) 200 mg을 EDTA 용액(0.5 mg/mL, 이는 0.5 M 스톡 용액으로부터 새로 제조하였다, Sigma) 4 ml 중에 용해시켰다. 이어서, 그 용액을 PG 용액 6 ml(PG 2 ml + H2O 4 ml)와 혼합하여 20% PG를 포함하는 10 ml의 최종 부피를 만들었다. 그 용액을 EO9(2 mg), 중탄산나트륨(5 mg) 및 만니톨(12.5 mg)을 포함하는 20 ml 다용도 튜브에 첨가하였다. 그 용액을 EO9가 완전히 용해될 때까지(약 5-6 시간) 연속적으로 진탕시키면서 37℃에서 배양하였다. 이어서, 그 용액을 물로 1:1로 희석하여 10% PG 용액을 생성시켰다.
3. 용액 3: 20% PG 중의 EO9 (347 μM)
중탄산나트륨(NaHCO3) 200 mg을 EDTA 용액(0.5 mg/mL, 이는 0.5 M 스톡 용액으로부터 새로 제조하였다, Sigma) 4 ml 중에 용해시켰다. 이어서, 그 용액을 PG 용액 6 ml(PG 4 ml + H2O 2 ml)와 혼합하여 40% PG를 포함하는 10 ml의 최종 부피를 만들었다. 그 용액을 EO9(2 mg), 중탄산나트륨(5 mg) 및 만니톨(12.5 mg)을 포함하는 20 ml 다용도 튜브에 첨가하였다. 용액을 EO9가 완전히 용해될 때까지(약 3-4 시간) 연속적으로 진탕시키면서 37℃에서 배양하였다. 이어서, 그 용액을 물로 1:1로 희석하여 20% PG 용액을 생성시켰다.
4. 용액 4: 30% PG 중의 EO9 (347 μM)
중탄산나트륨(NaHCO3) 200 mg을 EDTA 용액(0.5 mg/mL, 이는 0.5 M 스톡 용액으로부터 새로 제조하였다, Sigma) 4 ml 중에 용해시켰다. 이어서, 그 용액을 PG 용액 6 ml(PG 6 ml + H2O 0 ml)와 혼합하여 60% PG를 포함하는 10 ml의 최종 부피를 만들었다. 그 용액을 EO9(2 mg), 중탄산나트륨(5 mg) 및 만니톨(12.5 mg)을 포함하는 20 ml 다용도 튜브에 첨가하였다. 용액을 EO9가 완전히 용해될 때까지(약 2 시간) 연속적으로 진탕시키면서 37℃에서 배양하였다. 이어서, 그 용액을 물로 1:1로 희석하여 30% PG 용액을 생성시켰다.
D. 약물 투여
모든 절차에 걸쳐, 사용된 매질은 페놀 레드 비함유 매질이 사용되었다(페놀 레드는 크로마토그램 상에서 EO9에 매우 가깝게 용리된다)는 점을 제외하고는 상기 기재된 바와 같았다. EO9를 100㎕의 부피로 t=0에서 상부 챔버에 첨가하고 하부 챔버는 (계속해서 교반되는) 매질 600 ㎕를 함유하였다. 37℃에서 10 분 배양 이후, 트랜스웰을 제거하고 새로운 매질 600㎕를 함유하는 24웰 평판의 새로운 웰에 배치시켰다. 상부 챔버에서의 약물 용액을 제거하고 새로운 약물 용액 100㎕로 대체하였다(즉, 상부 챔버에서의 농도를 일정 농도에서 유지시켰다). 이러한 전체 절차를 1 시간의 총 시간 간격에 걸쳐 10 분 간격에서 반복하였다.
E. 추출 절차
EO9를 아이솔루트(lsolute) C18 SPE 카트리지를 사용하여 즉시 추출하였다. 카트리지를 메탄올 1 ml로 프라이머시킨 후, 시료 첨가(500 ㎕) 전에 탈염수 1 ml 중에 세척하였다. EO9를 탈염수 1 ml로 추가로 세척한 이후, EO9를 메탄올 300 ㎕ 중에 용리시켰다. 시료를 (회전 증발기 중에 실온에서) 진공하에 건조시키고, 분석을 위해 필요할 때까지 -20℃에서 저장하거나 또는 즉각적인 분석을 위해 이동상(하기 참조) 중에 재조합하였다.
F. HPLC 분석
EO9의 크로마토그래피 분석을 본원에 참조문헌으로 인용된 문헌[참조: Phillips et al. (British Journal of Cancer. 65(3):359-64, 1992)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단하게, Hichrom RPB 컬럼(25 cm × 4.6 mm id, Hichrom Ltd, 영국 소재)을 분리를 위해 사용하였다. Masslynx 3.4 소프트웨어(Micromass Ltd)가 구비된 Waters 996 Photodiode Array Detector(λ1 = 280nm)를 중요한 피크의 스펙트럼 분석을 위해 사용하였다. 이동상은 1M 포스페이트 완충액(1%), 메탄올(42%) 및 HPLC 등급 물(57%)로 이루어졌다. 유속은 자동시료주입기가 또한 합체되어 있는 Waters Alliance 2690(미국 매사추세츠주 밀포드 소재) 쿼터너리 펌프 크로마토그래피 시스템을 사용하여 1.2 ml min-1에서 설정하였다. 검출 한계는 10 ng/ml(34.7 nM)이었다.
G. 조직학
각각의 실험을 위해, 3개의 트랜스웰 인서트를 수집하였다; 대조군 1개 및 실험의 종료시 2개. 각각의 트랜스웰을 70% 에탄올로 이동시키고 밤새 저장하기 전에 1 시간 동안 10% 포르말린 중에 고정하였다. 깨끗한 스캘플을 사용하여, 막을 조심스럽게 플라스틱 인서트로부터 박리시키고 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지된 표준 절차를 사용하여 파라핀 왁스 중에 포매시키기 위해 처리하였다. 시편을 레이츠(Leitz) 회전 마이크로톤을 사용하여 (5 ㎛로) 절단하고, 단백질 코팅된 유리 슬라이드 상에 장착하고, 또한 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지된 표준 절차를 사용하여 헤마톡실린 및 에오신을 사용하여 염색시켰다. 다세포층의 두께는 대물 마이크로미터를 사용하여 보정된 접안 그래티클을 사용하여 측정하였다. 각각의 절편에 대해 5개의 측정치를 수집하고 시료당 3개의 절편을 측정하였다.
II. 결과
A. 대표적인 크로마토그램
도 4는 WV14 내부 기준물질이 소량 첨가된 바탕시료의 크로마토그램(체류 시간 = 11.059 분)을 보여주는 것이다. 6.870 분에서의 피크는 염색 피크이다. 도 5는 RPMI 1640 배양 매질 중의 EO9 기준물질(1 ㎍/ml(도 5a) 및 20 ng/ml(도 5b))을 보여주는 것이다. 도 5a에 도시된 바대로, EO9 및 WV14 피크는 8.029 분 및 13.023 분에서 각각 용리되었다(7.292 분에서의 피크는 상기 기재된 바대로 염색 피크이다). 체류 시간은 실험실에서의 온도 변동으로 인해 움직일 수 있지만, 그 체류 시간은 일정하게 유지되어야 한다는 것을 유념해야 한다. 도 5b는 검출 한계를 나타낸다. 도 6은 0.1% DMSO(도 6a); 30% PG(도 6b); 20% PG(도 6c); 및 10% PG(도 6d) 중의 EO9의 기준물질의 크로마토그램을 보여주는 것이다.
B. 보정 곡선
보정 곡선을 각각의 EO9 제제에 대해 작도하고 그 결과는 도 7에 제시되어 있다. 보정 곡선은 재현가능하고 각각의 보정 곡선의 기울기에서의 미세한 차이가 도 7에 도시된 바대로 관찰되었다. 차이에 대한 이유는 불명확하지만, 상이한 제제들 사이의 추출 효율에서의 약간의 차이를 반영할 수 있다. 0.1% DMSO, 10% PG, 20% PG 및 30% PG 중의 EO9에 대한 추출 효율은 각각 92.3%, 81.7%, 79.9% 및 81.1%이었다. 이러한 변동으로 인해, 보정 곡선을 수행된 각각의 실험에 대해 생성시켰다. 명확한 분해 생성물은 어느 크로마토그램에서도 볼 수 없었다.
C. 약물 침투
도 8에서 확인할 수 있는 바대로, PG의 농도가 증가하면서, EO9의 다세포층 침투 속도는 감소하였다. 0.1% DMSO 중의 EO9와 관련하여, 동역학은 상부 챔버에서 의 농도가 다소 일정한 값에서 유지될 때 예상되는 바대로 직선이다. 시험된 PG의 2개의 가장 높은 농도에서, 동역학은 완전히 직선이 아니라는 것 - 시간이 증가하면서 속도가 점진적으로 상승한다 - 은 말할 필요도 없다. 이러한 효과는 대게 PG에 의해 유도된 다세포층의 두께에서의 변화를 반영한다(참조 도 9). 명확한 대사산물 또는 분해 생성물은 어느 평가 시점에서도 관찰되지 않았다.
도 9는 DLD-1 다세포층을 통한 EO9의 침투를 조사하기 위해 수행된 조직학 분석의 결과를 보여주는 것이다. 비약물 처리된 절편의 두께는 56.01 ± 3.63 ㎛이었다. 0.1% DMSO 중의 EO9로의 1 시간 처리 후, 다세포층의 두께는 비약물 처리된 시편(58.80 ± 2.50 ㎛)과 유의적으로 상이하지 않았다. 그러나, 30% PG 중의 EO9로의 처리 이후, 다세포층의 두께는 29.01 ± 1.78 ㎛로 유의적으로 감소하였다. 층 내 외관에서의 형태학적 변화가 또한 현저하였고, 이들 외관 중 가장 명확한 것은 층 그 자체에서의 '단절' 또는 '통로'의 외관이었다. PG 중의 EO9를 사용한 실험에 걸쳐 이루어진 관찰은, 상부 챔버는 예상된 것보다 더 많은 유체를 포함한다는 것이었다. 예를 들면, 30%, 20% 및 10%에서 PG 중의 EO9로의 10 분 배양 후, 상부 챔버로부터 회수된 부피는 각각 106 ± 3, 107 ± 3 및 105 ± 2 ㎕이었다(0.1% DMSO 중의 EO9로의 1 시간 노출 후, 회수된 부피는 98 ± 2 ㎕이었다). 이들 부피는 (길슨(Gilson) 피펫을 사용하여 회수될 수 있는 것을 기준으로 하는) 오직 근삿값이라는 것은 강조되어야 한지만, 이는 상부 챔버에서의 매질의 부피는 (특히 30% PG에서) PG 제제 중에 용해된 EO9가 사용될 때 변한다는 것을 나타내었다. 조직학 사진은 세포가, 30% PG 중의 EO9로 처리된 다세포층의 경우를 제외하고, 대조군 및 EO9(0.1% DMSO) 처리된 시편에서 기저막과 밀접하게 접촉하고, 다세포층과 막 그 자체 사이에 작지만 뚜렷한 간극이 존재한다는 것을 보여준다는 것은 또한 주목할만하다.
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방광의 인간 TCC 에서 NQO1 , P450R , GLUT -1 및 Ki67 의 단백질 발현. NQO1, P450R 및 GLUT-1에 대한 데이타는 2명의 관찰자의 중앙값 점수(± 사분위 범위)로서 제시되어 있다. 증식 지수에 대한 데이타는 2명의 관찰자의 평균 점수 ± S.E.로서 제시되어 있다. 시편은 NQO1, P450R 및 GLUT-1에 대해 0과 4 사이로 점수 매기고, 증식 지수는 "재료 및 방법"에 기재된 바대로 양으로 Ki67 염색성 %로서 계산하였다.
시료수 중앙 NQO1 발현
(± 사분위)		 중앙 P450 발현
(± 사분위)		 중앙 GLUT-1 발현
(± 사분위)		 증식 %
(Ki67 양성)
(±S.E.)
pTa 19 2.50
(1.14-3.20)		 3.20
(2.58-3.83)		 2.00
(1.30-3.80)		 16.75 ± 2.8
pT1 19 1.88
(0.33-3.00)		 2.96
(2.33-3.67)		 3.38
(2.75-3.88)		 13.88 ± 2.2
pT2 14 0.17
(0.00-1.67)		 3.89
(3.75-3.92)		 3.88
(2.67-4.00)		 24.59 + 4.43
G1 11 1.00
(0.00-1.10)		 2.79
(2.17-2.92)		 2.38
(2.00-3.25)		 9.72 + 2.64
G2 26 2.72
(1.83-3.20)		 3.35
(2.75-3.83)		 2.83
(1.75-3.75)		 14.59 + 1.72
G3 15 0.33
(0.00-1.85)		 3.83
(3.31-3.92)		 4.0O
(3.63-4.00)		 30.47 ± 3.71
비침윤성 a 19 2.50
(1.14-3.20)		 3.20
(2.58-3.83)		 2.00
(1.31-3.67)		 17.51 ± 2.83
침윤성 b 33 1.67
(0.0-2.52)		 3.67
(2.92-3.89)		 3.50
(2.71-4.00)		 19.41 ± 2.86
표재성c 38 2.00
(1.08-3.17)		 3.10
(2.33-3.78)		 2.83
(1.83-3.83)		 15.69 ± 1.79
근침윤성d 14 0.17
(0.00-1.67)		 3.89
(3.75-3.92)		 3.88
(2.67-4.00)		 24.59 ± 4.43
첨자 a, b, c 및 d는 각각 pTa;(pT1 + pT2);(pTa + pT1) 및 pT2 종양 병기를 나타낸다.

Claims (24)

  1. 프로필렌글리콜(PG), EDTA 및 물을 포함하는 용액 중에 하기 화학식의 EO9(INN 아파지퀀), NaHCO3 및 0.5 mg/mL 내지 3.0 mg/mL 만니톨을 포함하는 약학 제제로서, 상기 PG는 상기 용액 중에 30% vol/vol, 20% vol/vol, 및 10% vol/vol 로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율 범위로 존재하는 것인 약학 제제.
    Figure 112013067384264-pct00015
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 300 μM 내지 400 μM EO9 농도를 갖는 용액을 포함하는 것인 약학 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제제는 347 μM EO9 농도를 갖는 용액을 포함하는 것인 약학 제제.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 제제는 10 mg/mL 내지 120 mg/mL NaHCO3를 포함하는 것인 약학 제제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제제는 100 mg/mL NaHCO3를 포함하는 것인 약학 제제.
  7. 제5항에 있어서, 상기 제제는 50 mg/mL NaHCO3를 포함하는 것인 약학 제제.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 제제는 0.625 mg/mL 만니톨을 포함하는 것인 약학 제제.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제제는 1.25 mg/mL 만니톨을 포함하는 것인 약학 제제.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제제는 EDTA, PG 및 물을 포함하는 용액 중에 100 mg/mL NaHCO3, 0.625 mg/mL 만니톨, 및 0.1 mg/mL EO9를 포함하는 것인 약학 제제.
  12. PG, EDTA 및 물을 포함하는 용액 중에 하기 화학식의 EO9(INN 아파지퀀), NaHCO3 및 0.5 mg/mL 내지 3.0 mg/mL 만니톨을 포함하는 약학 제제로서, 상기 PG는 상기 용액 중에 6% vol/vol 내지 14% vol/vol, 16% vol/vol 내지 24% vol/vol, 및 26% vol/vol 내지 34% vol/vol로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율 범위로 존재하는 것인 약학 제제.
    Figure 112013067384264-pct00016
  13. 제12항에 있어서, 상기 PG는 상기 용액 중에 10% vol/vol, 20% vol/vol, 및 30% vol/vol로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율로 존재하는 것인 약학 제제.
  14. 제12항에 있어서, 상기 제제는 347 μM EO9 농도 및 10% vol/vol PG 농도를 갖는 용액을 포함하는 것인 약학 제제.
  15. 제12항에 있어서, 상기 제제는 347 μM EO9 농도 및 20% vol/vol PG 농도를 갖는 용액을 포함하는 것인 약학 제제.
  16. 제12항에 있어서, 상기 제제는 347 μM EO9 농도 및 30% vol/vol PG 농도를 갖는 용액을 포함하는 것인 약학 제제.
  17. 제12항에 있어서, 상기 제제는 10 mg/mL 내지 120 mg/mL NaHCO3를 포함하는 것인 약학 제제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제제는 100 mg/mL NaHCO3를 포함하는 것인 약학 제제.
  19. 제17항에 있어서, 상기 제제는 50 mg/mL NaHCO3를 포함하는 것인 약학 제제.
  20. 삭제
  21. 제12항에 있어서, 상기 제제는 0.625 mg/mL 만니톨을 포함하는 것인 약학 제제.
  22. 제12항에 있어서, 상기 제제는 1.25 mg/mL 만니톨을 포함하는 것인 약학 제제.
  23. 제12항에 있어서, 상기 제제는 347 μM EO9 농도, 10% vol/vol PG 농도, 및 100.25 mg/mL NaHCO3 및 0.625 mg/mL 만니톨을 갖는 용액을 포함하는 것인 약학 제제.
  24. 제12항에 있어서, 상기 제제는 347 μM EO9 농도, 30% vol/vol PG 농도, 100.25 mg/mL NaHCO3 및 0.625 mg/mL 만니톨을 갖는 용액을 포함하는 것인 약학 제제.
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