BRPI0707563A2 - tratamento do cÂncer de bexiga utilizando eo9 e propileno glicol - Google Patents

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Abstract

TRATAMENTO DO CÂNCER DE BEXIGA UTILIZANDO EO9 E PROPILENO GLICOL. São divulgados aqui vários tratamentos para o câncer da bexiga e os métodos. A presente divulgação pode tirar vantagem de concentrações de propileno glicol e/ou NAD (P) H:quinona oxirredutase-1 (NQOl), citocromo P450 oxirredutase (P45 OR) e o transportador 1 de glicose (Glut 1) e da expressão de proteínas na célula transicional humana do carcinoma de bexiga para oferecer tratamentos de câncer de bexiga individualmente direcionados.

Description

"TRATAMENTO DO CÂNCER DE BEXIGA UTILIZANDO E09 EPROPILENO GLICOL"
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDO RELACIONADO.
O presente Pedido reivindica o beneficio do PedidoProvisório de Patente Americana N°. 60/771.678, arquivado em09 de fevereiro de 2006.
CAMPO DA INVENÇÃO.
A presente invenção se refere ao tratamento docâncer de bexiga utilizando formulações de E09 e métodos. Apresente invenção pode tirar vantagem de concentrações depropileno glicol e/ou da expressão das proteinasNAD(P)Hiquinona oxirredutase-1 (NQOl), citocromo P450 oxir-redutase (P450R) e do transportador 1 de glicose (Glut-I) nacélula transicional humana do câncer da bexiga para oferecertratamentos individualmente direcionados do câncer de bexi-ga .
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO.
0 câncer de bexiga é o sétimo câncer mais comum emtodo o mundo. Em 2000, foi o quarto câncer mais comum em ho-mens no Reino Unido com 9.000 novos casos diagnosticados na-quele ano (1). Em 2002, houve aproximadamente 280.000 casosdo câncer de bexiga na Europa e mais de 60.000 novos casosforam esperados nos Estados Unidos para 2004.
O tipo mais comum do câncer de bexiga (aproximada-mente 90 %) é o carcinoma da célula transicional (TCC) quese deriva do urotélio, ou do revestimento celular do sistemauretral (ureteres, bexiga e uretra). O carcinoma da célulatransicional (TCC) pode ser classificado como ou superficial(pTa e pTl) ou músculo invasivo (> pT2). 0 tratamento do TCCsuperficial é atualmente ressecção transuretral (TURBT; istoé, a remoção cirúrgica de todas as lesões visíveis) seguidopor quimioterapia adjuvante ou imunoterapia. A validade detal tratamento é apoiada pela redução significativa da re-corrência do tumor superficial observada depois da quimiote-rapia adjuvante, quando em comparação com a TURBT sozinha
(2) Embora os reagentes, tais como a Mitomicina C (MMC) , aEpirubicina e a BCG sejam rotineiramente usados, é amplamen-te reconhecido que existe uma necessidade para desenvolverou agentes mais potentes e/ou menos tóxicos contra o TCC ouutilizar melhor a terapêutica atual em termos de um trata-mento direcionado de indivíduos (ou de subgrupos patológi-cos) que também será beneficiados.
A Mitomicina C (MMC) é um agentge anti-neoplásicoà base de quinona de ocorrência natural que pertence a umaclasse de compostos conhecidos como drogas biorredutoras
(3). Em geral, as drogas biorredutoras são pró-drogas quenecessitam da ativação metabólica para gerar os metabólitoscitotóxicos e são todos projetadas em princípio em extermi-nar células hipóxicas que residem nas regiões pobrementeperfundidas dos tumores sólidos. Estas drogas, contudo, tam-bém podem ser direcionadas para as porções aeróbicas dos tu-mores .
Os parâmetros-chave que determinam a seletividadecitotóxica das drogas biorredutoras à base de quinona (istoé, entre as células tumorais hipóxicas e aeróbicas) são apresença de determinadas redutases enzimáticas necessáriaspara reduzir a pró-droga e a capacidade do oxigênio molecu-lar para reverter o processo de ativação (4,5) (embora o pa-pel relativo das redutases e da tensão de oxigênio na deter-minação da morte celular varie dependendo do composto emquestão (4,6)). 0 fato da MMC ser rotineiramente usada notratamento do TCC sugere que esta doença não possua somentea engrenagem bioquímica adequada necessária para a ativaçãobiorredutora, mas que outros compostos nesta classe tambémpossam ser úteis no tratamento desta doença. Dois exemplosde compostos adicionais que também podem ser úteis incluem oE09 derivado da indolequinona e a aziridinil benzoquinonaRHl (7,8).
Tal com declarado, a capacidade das drogas biorre-dutoras à base de quinona em exterminar as células aeróbicasou as hipóxicas é basicamente determinada por uma relaçãocomplexa entre enzimologia do tumor incluindo a presença deredutases e a hipoxia. Várias redutases foram implicadas naativação de drogas biorredutoras (4,6) embora uma atençãoconsiderável tenha sido dada às enzimas citocromo P450 redu-tases (P450R) e NAD(Ρ)H:quinona oxirredutase-1 (NQOl). Comrelação à medição da hipoxia, foi mostrado que os marcadoresendógenos, tais como o transportador 1 de glicose (Glut 1)ou a anidrase carbônica IX (CAIX) estão em correlação com osmarcadores de hipoxia exógenos, tais como o pimonidazol(9,10). Assim, a relação entre a hipoxia do tumor e a ex-pressão de duas redutases chave nos carcinomas das célulastransicionais superficiais e invasivas (TCC) da bexiga é deuma importância primordial. Além disso, o uso de preparaçõesfarmacêuticas para o tratamento do câncer de bexiga com per-fis variados de penetração é necessário para atingir os tu-mores superficiais contra os músculo invasivos. A presenteinvenção se refere a esses aspectos dos tratamentos do cân-cer de bexiga.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO.
Diferenças significativas foram encontradas na ex-pressão da NQOl entre tumores superficiais e invasivos combaixos níveis observados nos tumores músculo invasivos. Aocontrário a P450R e o Glut 1 foram expressados em todas asetapas e graus do TCC embora a expressão aumentasse com oestágio do tumor (particularmente no caso da Glut 1) . Alémdisso, a expressão do Glut 1 foi significativamente elevadaem tumores G3 enquanto existiam baixos níveis de NQOl. Estesresultados demonstraram que existem diferenças marcantes nasexpressões da NQOl e do Glut 1 entre o TCC da bexiga super-ficial e invasivo. Além disso, foram encontradAs preparaçõesfarmacêuticas de drogas biorredutoras à base de quinona comdiferentes perfis de penetração.
Estes resultados trazem implicações terapêuticaspara as drogas biorredutoras à base de quinona de modo queaquele único agente terapêutico seria apropriado para a do-ença superficial enquanto que seria desejável para a doençamúsculo invasiva, uma terapia combinada usando quinonas paravisar as frações hipóxicas e outras modalidades para exter-minar as frações aeróbicas. Além disso, as preparações far-macêuticas com perfis de penetração mais baixos podem seradotadas para o tratamento de câncer superficiais de bexigaenquanto As preparações farmacêuticas com perfis de penetra-ção maiores podem ser adotadas para o tratamento dos cânce-res de -bexiga mais músculo invasivos. Tomado em conjunto,esses aspectos da presente invenção fornecem avanços impor-tantes no tratamento do câncer de bexiga permitindo a elabo-ração de tratamentos de câncer para determinadas caracterís-ticas do perfil da doença em um indivíduo.
Especificamente, uma modalidade de acordo com apresente invenção inclui um método para tratar o câncer debexiga compreendendo a determinação dos níveis de pelo menosuma enzima dentro de um tumor e a escolha de um tratamento àbase de pelo menos um nível de enzima em que o tratamentocompreende a administração de uma droga biorredutora à basede quinona ou sozinha ou em combinação com outro tratamento.
Em outra modalidade, a enzima é selecionada dogrupo consistindo de NAD(Ρ)H:quinona oxirredutase-1 (NQOl) eNADPH citocromo P450 redutase (P450R). Em uma modalidade emparticular, a enzima é NQOl e o tratamento compreende a ad-ministração de uma droga biorredutora à base de quinona so-zinha. Em outra modalidade em particular, a enzima é NQOl eo tratamento compreende a administração de uma droga biorre-dutora à base de quinona em combinação com outro tratamento.Em outra modalidade em particular a enzima é a P450R e otratamento compreende a administração sozinha de uma drogabiorredutora à base de quinona. Em ainda outra modalidade emparticular a enzima é P450R e o tratamento compreende a ad-ministração de uma droga biorredutora à base de quinona emcombinação com outro tratamento. Em uma nova modalidade deacordo com a presente invenção, a enzima é a NQOl e a P450Re o tratamento compreende a administração de uma droga bior-redutora à base de quinona sozinha. Em ainda outra modalida-de, a enzima é a NQOl e a P450R e o tratamento compreende aadministração de uma droga biorredutora à base de quinona emcombinação com outro tratamento.
Uma modalidade de acordo com a presente invençãocompreende também a determinação dos níveis de hipoxia den-tro de um tumor e a escolha de um tratamento à base de pelomenos um nível de enzima e nível de hipoxia. Em uma modali-dade específica, o nível de hipoxia é determinado medindotransportador 1 de glicose (Glut 1) e/ou anidrase carbônicaIX (CAIX).
Uma modalidade em particular de acordo com a pre-sente invenção inclui um método para tratar o câncer de be-xiga compreendendo escolha de um tratamento baseado em umamedição selecionada do grupo consistindo de níveis deNAD(Ρ)H:quinona oxirredutase-1 (NQOl), níveis de NADPH cito-cromo P450 redutase (P450R), e níveis do transportador 1 deglicose (Glut 1) em que o tratamento compreende a adminis-tração de uma droga biorredutora à base de quinona sozinhaou em combinação com outro tratamento. Em vários aspectosdesta modalidade em particular: a medição pode ser da NQOlou da P450R e o tratamento compreende a administração de umadroga biorredutora à base de quinona sozinha; a medição podeser da NQOl ou da P450R e o tratamento compreende a adminis-tração de uma droga biorredutora à base de quinona em combi-nação com outro tratamento; a medição pode ser da NQOl e daP450R e o tratamento compreende a administração de uma drogabiorredutora à base de quinona sozinha; a medição pode serda NQOI e da P450R e o tratamento compreende a administraçãode uma droga biorredutora à base de quinona em combinaçãocom outro tratamento; ou a medição pode ser da NQ01, daP450R e do Glut Ieo tratamento compreende a administraçãode uma droga biorredutora à base de quinona sozinha ou emcombinação com outro tratamento.
Em uma modalidade de acordo com a presente inven-ção, a invenção inclui um método para tratar o câncer inva-sivo da bexiga compreendendo a determinação dos níveis deNQOl e de Glut 1 dentro de um tumor; selecionar um tratamen-to de combinação incluindo uma droga biorredutora à base dequinona em combinação com outro tratamento em outra baseporque o dito nível de NQOl é mais baixo do que o dito nívelde Glut-I é mais alto do que seria observado se o tumor ditofosse superficial.
Em outra modalidade de acordo com a presente in-venção, a invenção inclui um método de estratificar um paci-ente para uma terapia adequada do câncer de bexiga baseado aníveis de expressão de NQOl e de Glut 1 dentro do tumor debexiga do dito paciente compreendendo: a determinação dosníveis de expressão de NQOl e de Glut 1 dentro do tumor debexiga do dito paciente; e administrar uma droga biorreduto-ra como único agente terapêutico se o dito paciente tiver ocâncer de bexiga superficial com altos níveis de NQOl ou ad-ministrar uma terapia combinada onde uma droga biorredutoraé usada em combinação com a terapia radioativa ou outro a-gente quimioterapêutico caso o dito paciente tenha câncerinvasivo da bexiga com níveis baixo de NQOl e alta de Glut1.
Em modalidades em particular de acordo com a pre-sente invenção, outro tratamento é a radioterapia e/ou a ad-ministração de pelo menos um agente quimioterapêutico.
Em várias modalidades, a droga biorredutora à basede quinona especialmente útil será selecionada do grupo con-sistindo de mitomicina C, o E09 derivado da indolequinona,aziridinil benzoquinona (RHl), e combinações dos mesmos.
A presente invenção também inclui preparações far-macêuticas. Especificamente, uma modalidade de acordo com apresente invenção inclui uma preparação farmacêutica compre-endendo E09 em uma solução com uma concentração de propilenoglicol (PG) selecionada do grupo consistindo de aproximada-mente 30 % vol/vol de PG, aproximadamente 20 % vol/vol dePG, e aproximadamente 10 % vol/vol de PG. As concentraçõesde E09 podem estar presentes em uma faixa de variação de a-proximadamente 300 μΜ a aproximadamente 400 μΜ. Em uma moda-lidade específica, a preparação compreende uma solução comuma concentração de aproximadamente 347 μΜ de E09.
As preparações farmacêuticas de acordo com a pre-sente invenção podem compreender também NaHCO3, EDTA, mani-tol e água. Em uma modalidade, a preparação compreende deaproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 120 mg/mL de NaH-CO3 em uma modalidade específica, a preparação compreendeaproximadamente 100 mg/mL ou aproximadamente 100,25 mg/mL deNaHCO3. Em outra modalidade específica a preparação compre-ende aproximadamente 50 mg/mL de NaHCO3 ou aproximadamente50,125 mg/mL de NaHCO3. Em outra modalidade, a preparaçãocompreende de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente3,0 mg/mL de manitol. Em uma modalidade especifica, a prepa-ração compreende aproximadamente 0,625 mg/mL de manitol. Emoutra modalidade especifica a preparação compreende 1,25mg/mL de manitol. Em outra modalidade especifica, a prepara-ção compreende aproximadamente 100 mg/mL de NaHCO3, aproxi-madamente 0,625 mg/mL de manitol e aproximadamente 0,1 mg/mLde E09 em uma solução compreendendo EDTA, PG e água.
Uma modalidade de acordo com a presente invençãoinclui uma preparação farmacêutica compreendendo E09, NaHCO3e manitol em uma solução compreendendo PG, EDTA e água emque o PG está presente na solução em uma faixa de variaçãopercentual selecionada do grupo consistindo de aproximada-mente 6 % a aproximadamente 14 % vol/vol; de aproximadamente16 % a aproximadamente 24 % vol/vol, e de aproximadamente 26% a aproximadamente 34 % vol/vol. Em outra modalidade, o PGestá presente na solução em um percentual selecionada dogrupo consistindo de aproximadamente 10 % vol/vol, aproxima-damente 20 % vol/vol, e aproximadamente 30 % vol/vol. Em ou-tra modalidade, a preparação compreende uma solução com a-proximadamente 347 μΜ de E09 concentração e aproximadamenteuma concentração de 10 % vol/vol de PG. Em ainda outra moda-lidade, a preparação compreende uma solução com uma concen-tração de aproximadamente 347 μΜ de E09 e uma concentraçãode aproximadamente 20 % vol/vol de PG. Em uma nova modalida-de, a preparação compreende uma solução com uma concentraçãode aproximadamente 347 μΜ E09 e uma concentração de aproxi-madamente 30 % vol/vol de PG. Estas modalidades descritas dapresente invenção podem compreender de aproximadamente 10mg/mL a aproximadamente 120 mg/mL de NaHC03 e em uma modali-dade em particular compreenderá aproximadamente 100, aproxi-madamente 100,25 ou aproximadamente 50,125 mg/mL de NaHCO3.Estas modalidades descritas da presente invenção também po-dem compreender de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximada-mente 3,0 mg/mL de manitol e em uma modalidade em particularcompreenderá aproximadamente 0,625 mg/mL ou aproximadamente1,25 mg/mL de manitol.
Uma modalidade de acordo com a presente invençãopode incluir uma preparação farmacêutica em que a preparaçãocompreende uma solução com uma concentração de aproximada-mente 347 μΜ de E09, uma concentração de aproximadamente 10% vol/vol de PG, aproximadamente 100,25 mg/mL de NaHCO3 eaproximadamente 0,625 mg/mL de manitol. Outra modalidade po-de incluir uma preparação farmacêutica em que a preparaçãocompreende uma solução com uma concentração de aproximada-mente 347 μΜ de E09, uma concentração de aproximadamente 30% vol/vol de PG, aproximadamente 100,25 mg/mL de NaHCO3 eaproximadamente 0,625 mg/mL de manitol.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS.
A Figura 1 mostra a análise imunoistoquimica daNQOl, da P450R e do Glut-I em três pacientes com carcinomada célula transicional da bexiga.
A Figura 2 mostra o equipamento usado para estudara penetração da droga através de camadas de múltiplas célu-Ias.
A Figura 3 mostra uma representação esquemática depreparações da solução de droga.
A Figura 4 mostra um cromatograma da amostra embranco semeada com WV14 como um padrão interno.
A Figura 5 mostra cromatogramas do padrão E09 nacultura de RPMl 1640.
A Figura 6 mostra cromatogramas de padrões de E09em 0,1 % de DMSO (6A); 30 % propileno glicol (PG; 6B) ; 20 %de PG (6C); e 10 % de PG (6D).
A Figura 7 mostra as curvas de calibração de E09em 0,1 % de DMSO e diversas concentrações de PG (30 %; 20 %;10 %) .
A Figura 8 mostra a penetração de E09 em váriasconcentrações PG através de camadas de múltiplas célulasDLD-I.
A Figura 9 mostra seções retas representativas a-través de camadas de múltiplas células DLD-I coradas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.
As drogas biorredutoras à base de quinona são pró-drogas que geram espécies citotóxicas após ativação enzimá-tica. A enzima NAD(P)Hrquinona oxirredutase-1 (NQOl; tambémchamada DT-diaforase (DTD)), uma enzima redutase com doiselétrons, desempenha um papel proeminente na ativação dedrogas biorredutoras à base de quinona sob condições aeróbi-cas. As drogas biorredutoras à base de quinona são tambémcitotóxicas sob condições hipóxicas incluindo células combaixa atividade NQOl. Enzimas de redução com um elétron, talcomo a Citocromo P450 redutase podem desempenhar um papelmais proeminente na ativação de drogas biorredutoras à basede quinona sob condições hipóxicas. Com base nos termos pre-cedentes, os níveis dessas redutases e as condições hipóxi-cas podem indicar que a adequação de diferentes terapias decâncer incluindo a adequação de usar diversas drogas biorre-dutoras à base de quinona. A presente invenção assim avaliouos níveis das redutases descritas e das condições hipóxicasem diferentes graus e estágios do TCC.
As melhoras no tratamento do câncer de bexiga tam-bém podem ocorrer baseadas no fornecimento de preparaçõesfarmacêuticas compreendendo drogas biorredutoras à base dequinona com perfis de penetração variados. Por exemplo, aspreparações farmacêuticas com perfis de penetração mais bai-xos seriam benéficas para usar tratando cânceres superfici-ais da bexiga porque a droga permaneceria mais próxima dasuperfície da bexiga onde o tratamento é mais necessário. Demodo inverso, preparações farmacêuticas com perfis mais al-tos de penetração seriam benéficas o tratamento de cânceresde bexiga mais músculo invasivos porque a droga penetrarianas camadas mais profundas da bexiga onde o tratamento seriamais necessário naqueles casos. Tomado em conjunto, os vá-rios aspectos da presente invenção fornecem avanços impor-tantes no tratamento do câncer de bexiga permitindo a estru-turação de tratamentos de cânceres com características espe-cíficas relativas ao perfil da doença em um indivíduo.
A apaziquona (prop. INN, USAN), também conhecidacomo E09 ou NSC-382459 (3-hidroximetil-5-aziridinil-l-metil-2-(lH-indol-4,7-diona)-propenol com a fórmula estrutural:
<formula>formula see original document page 14</formula>
é um biorredutor totalmente sintético de alquila-ção da indoloquinona. Acredita-se que o mecanismo básico daativação da E09 seja semelhante àquele de outras indoloqui-nonas, implicando na redução por enzimas celulares quetransferem um ou dois elétrons, formando a semiquinona e ahidroquinona, respectivamente. A oxidação da semiquinona sobcondições aeróbicas resulta em um ciclo redox que pode cau-sar a morte da célula pela formação de espécies reativas deoxigênio (ROS), resultando em quebras da fita de DNA. A se-miquinona / hidroquinona pode, particularmente sob condiçõeshipóxicas, alquilar e reticular o DNA e outras macromolécu-las, causando a morte da célula. A E09 é um exemplo não Ii-mitante da droga biorredutora à base de quinona que é ade-quada para uso com a presente invenção.
EXEMPLO 1.
I. Materiais e Métodos.
A. Tecidos Humanos.
Os espécimes fixados em formalina, embebidos emparafina de carcinomas de célula transicionais humanas dabexiga (n = 52) foram usados para este estudo depois de ob-ter primeiro consentimento da pesquisa local e do comitê deética (LREC) segundo as regulações do Conselho de PesquisasMédicas. Todos os detalhes dos pacientes foram ocultados pa-ra assegurar a confidencialidade e todos os experimentos fo-ram executados conforme orientações estabelecidas pelo LREC.Os tumores usados para o estudo foram representativos de to-dos os graus (11 Grau 1; 26 Grau 2; 15 Grau 3) de ambos, su-perficiais (19 pTa; 19 pTl) e músculo invasivo (14 > pT2) eestágios de TCC da bexiga humana. Todos os blocos de tumorforam usados para a construção de mirovetores de tecido(TMAs) e análise imunoistoquimica subseqüente.
B. Construção do mirovetor de tecido.
As construções de mirovetor de tecido (TMAs) foramestruturadas a partir dos blocos introduzidos de parafinapara representar vários graus (G1-G3) e vários estágios(pTa, pTl, > pT2) do TCC da bexiga humana. A construção domirovetor de tecido (TMA) foi realizada usando um contrutorde microvetor da Beecher Instruments (Silver Spring, MD,USA) pela utilização de um método modificado de Bubendorf etal/. (11) que é incorporado aqui pela referência. Resumida-mente, as seções de cada bloco de doador de parafina foramintroduzidos na utilização corada por hematoxilina e eosina(H&E) , examinado pela microscopia e uma área que contém otecido de interesse foi marcada no bloco de cera. Os núcleoscilíndricos (600 μΜ) foram pinçados para biópsia destas á-reas representativas e transferidos para um bloco recipien-te. A amostragem de tecido usou quatro núcleos de cada blocode tumor para fornecer dados representativos sobre cada blo-co de origem. Um total de 108 amostras principais que repre-sentam 26 pacientes foi incluído por bloco de TMA e doisblocos de TMA foram construídos. As seções, com espessura de5 μΜ, foram cortadas dos blocos recebedores de TMA e monta-dos sobre lâmina de vidro usando um sistema de transferênciade fita (Instrumedics, EUA). A coloração H&E para a verifi-cação de histologia e integridade de mostra foi executada naprimeira e a cada décima seção subseqüente cortada de cadabloco de mirovetor. A lâmina de TMA foi então submetida aanálises de imunoistoquimica.
C. Anticorpos.
Os anticorpos usaram incluiu anticorpo monoclonalde rato contra NQOl (fornecido pelos doutores Siegel e Ross,University of. Colorado Health Sciences Center, Denver, USA) ,um anticorpo policlonal de cabra especifico para P450R (San-ta Cruz Biotechnology, USA), anticorpo monoclonal de ratocontra Ki67 (BD Biosciences, Reino Unido) e um anticorpo po-liclonal de coelho especifico para o transportador 1 de gli-cose (GLUT-1 ; Dako, Reino Unido).
D. Imunoistoquimica.
A iminolocalização de NQ01, P450R, GLUT-I e Ki67foi avaliada por imunoistoquimica, como anteriormente des-crito (9, 10, 12, 13) e entendido por aqueles com habilidadenormal na técnica. Resumidamente, seguindo a recuperação deantigeno e o bloqueio da ligação de imunoglobulina não-especifica, TMAs foram incubados com o anticorpo primárioapropriado: incubado durante aproximadamente 60 minutos como anticorpo anti-NQOl diluído em 1:1 TBSTM (IOmM Tris-HCl,150mM NaCl, Tween 20 0,2 %, leite em pó sem gordura a 5 %);incubado durante aproximadamente 90 minutos para P450R dilu-ído a 1:100 em PBS; incubado durante aproximadamente 90 mi-nutos com o anticorpo anti-Glut-1 diluído a 1:25 em PBS; ouincubado durante a noite em 4 0C com o anticorpo anti-Ki67diluído a 1:100 em PBS. Os controles foram executados usandoIgG normal em vez do anticorpo primário, a imunolocalizaçãofoi realizada usando o anticorpo secundário biotinilado a-propriado (diluído a 1:200; Vector Labs., USA), seguido poramplificação de sinal usando um kit ABC Vectastain (VectorLabs., USA) e visualização com 3,3'-diaminobenzidina (DAB)(Vector Labs., USA). As seções foram então contracoradas comhematoxilina de Harris, desidratado, compensado e montado emmontagem DPX (Sigma, Reino Unido).
E. Análise semiquantitativa da coloração imunois-toquimica.
A imunocoloração positiva foi marcada semi-quantitativamente por três observadores independentes. TantoNQOl como P450R foram localizados citoplasmaticamente dentrodo tumor. Uma avaliação do compartimento epitelial de cadanúcleo de tumor baseado na intensidade e na distribuição damancha foi avaliada de 0 (não corado) até 4 (intensidade má-xima de coloração) . Uma intensidade de marcação média foicalculada para cada núcleo e cada tumor do TMA dos resulta-dos dos observadores independentes. Os resultados foram com-parados para qualquer relação e correlações a parâmetrosclínicos patológicos.
O nível da positividade do Glut 1 em cada núcleoTMA foi analisado e destinou uma conta de 0 a 4 representan-te da percentagem aproximada de células de tumor que demons-tram membrana se sujar (0 = não corado; 1 = 0-5 % positivos;2 = 5 - 15 % positivos; 3 = 15-30 % positivos; 4 => 30 % po-sitivos) . Uma intensidade de coloração média foi calculadapara cada núcleo e cada tumor do TMA dos resultados dos ob-servadores independentes. Os resultados foram comparados pa-ra qualquer relação e correlações a parâmetros clinicos pa-tológicos.
A percentagem de núcleos positivos Ki67 nas célu-las de tumor foi calculada usando ampliação de 40x de cadanúcleo e tumor, como informado por Santos et al. (13,14) queé incorporado aqui pela referência. Foi contado um total de200 células por núcleo e 800 células por tumor e a positivi-dade percentual foi calculada. A coloração foi realizada in-dependentemente por dois observadores. Os resultados foramcomparados para qualquer relação e correlações a parâmetrosclinicos patológicos.
F. Análise Estatística.
A expressão de NQOl e P450R foi comparada com osseguintes parâmetros clínicos patológicos: etapa de tumor,grau de tumor, hipoxia de tumor (expressão do Glut 1) e pro-liferação. A análise estatística foi empreendida usando opacote de software SPSS, versão 11.0 (SPSS Inc, Chicago, Il-linois). No estudo de imunoistoquímica, como a expressão nãoé normalmente distribuída, os valores de expressão médios decada categoria foram informados comFiguras médios com varia-ções de interquartil. As diferenças entre variáveis indepen-dentes foram determinadas pelo teste Mann-Whitney U. Os va-lores de P menores que 0,05 nas análises de dupla cauda fo-ram considerados significantes.II. Resultados.
A. Relação entre os níveis de proteína NQ01, etapae grau do tumor.
A NQOl foi localizada citoplasmaticamente nos epi-télios de tumores de bexiga de qualquer grau patológico e oestágio e expressão de NQOl foi variado entre tumores (Figu-ra 1, Tabela 1) . Em muitos casos um modelo de expressão he-terogêneo de NQOl foi observado dentro do mesmo tumor, comáreas da expressão NQOl alta e baixa dentro da mesma amostra(dados não mostrados). NQOl foi expresso em tumores de todosos estágios patológicos (pTa, pTl, > pT2) embora os níveisde expressão de NQOl variassem entre vários estágios (Tabela1). Uma diferença significante na expressão NQOl foi obser-vada entre tumores superficiais (pTa + pTl) e músculo tumo-res invasivos (> pT2), com a expressão sendo significativa-mente inferior nos tumores músculo invasivos (P = 0,02). Arelação inversa da expressão NQOl ao tumor potencial invasi-vo é também reforçada pela diferença significante na expres-são observada entre tumores não-invasivos (pTa) e invasivos(pTl + > pT2) (P = 0,03). Todos os graus patológicos do TCCexprimiram o NQOl (Tabela 1). A expressão de NQOl foi signi-ficativamente mais alta nos tumores de grau 2 em comparaçãocom o grau 1 ou em comparação com o grau 3 (Tabela 1) . Ne-nhuma diferença significante foi observada entre tumores al-tamente diferenciados (grau 1) e pobremente diferenciados(grau 3) (Tabela 1).
B. Relação entre expressão de proteína P450R e oestágio e o grau do tumor.Todos os tumores exibiram níveis citoplasmatica-mente detectáveis expressos e localizados de P450R. Em con-traste com NQ01, a expressão de P450R foi geralmente unifor-me dentro dos tumores. Immunostaining representativo é re-presentado na Figura 1. P450R foi expresso em todas as está-gios do TCC (Tabela 1). Os níveis de P450R foram significa-tivamente mais altos nos tumores músculo invasivos (^pT2) emcomparação com superficial (pTa + pTl) tumores (P <0.01). Emcontraste com NQ01, a expressão de P450R mostra uma relaçãopositiva à etapa de tumor crescente mas não se associa com opotencial invasivo do tumor, como é evidente da falta da di-ferença significante observada entre invasivo (pTl + > pT2)e tumores não-invasivos (pTa) (Tabela 1). Todos os graus pa-tológicos do TCC exprimiram o P450R (Tabela 1). Uma correla-ção positiva foi observada entre níveis P450R e grau de tu-mor crescente (Tabela 1).
C. Relação entre GIuM e etapa de tumor e grau.
A expressão da Glut 1 proteína foi heterogêneatanto dentro de espécimes de tumor individuais como entreamostras pacientes individuais. Immunostaining representati-vo e a sua relação com etapa de tumor e grau são apresenta-dos na Figura 1 e Tabela 1 respectivamente. Glut 1 proteínafoi expressa em todas as estágios e graus examinados emboraos níveis da Glut 1 fossem significativamente mais altos em>pT2 tumores (quanto a tumores pTa, P = 0.05) e Grau 3 tumo-res (tanto quanto a Grau 1 [P = 0.03] como quanto a Grau 2[P <0.01] tumores). Além disso, as diferenças por meio deestatística significantes (P = 0.02) existem entre não-invasivo (pTa) e invasivo (pTl + > pT2) tumores que sugeremque a doença invasiva se associe com Glut mais alta 1 ex-pressão de proteína e níveis conseqüentemente mais altos dahipoxia.
D. Relação entre KÍ67, etapa de tumor, grau de tu-mor e enzimologia.
Os níveis de expressão do antígeno Ki67 foram usa-dos como um indicador do tumor proliferative índice (Tabela1). Como esperado, uma correlação significante foi observadaentre grau de tumor crescente (reduzindo diferenciação) eíndice de proliferação (P <0.01). Nenhuma relação foi obser-vada entre proliferação de tumor e tumor potencial invasivo(pTa contra pTl +> pT2). Ao contrário a proliferação de tu-mor foi significativamente mais alta nos tumores músculo in-vasivos (^pT2) quanto a tumores superficiais (pTa + pTl [P<0,01]) provavelmente em conseqüência da relação entre inva-são de músculo e grau de tumor mais alto. De maneira inte-ressante, uma relação significante foi observada entre o tu-mor proliferative índice e amba a A expressão do Glut 1 (P =0.01) e expressão P450R (P <0.01), mas não expressão deNQOl.
Os resultados deste estudo demonstram que a ex-pressão de proteína de enzimas-chave implicadas na ativaçãobiorredutora de quinona baseou compostos e a presença da hi-poxia como determinado pela Glut 1 níveis de proteína modi-fica com etapa e grau do TCC da bexiga. A observação maisnotável é o fato que a expressão de proteína NQOl diminuisignificativamente com o estágio do tumor crescente (Tabela1) . Quanto ao grau de tumor, há também evidência que os tu-mores G3 têm níveis mais baixos de NQOl do que G2 (mas nãoGl) tumores. Estes achados são de acordo com estudos anteri-ormente publicados onde uma relação inversa entre NQOl mRNAexpressão e a etapa (15) de tumor crescente foi informada.De mesmo modo para a Glut 1, a expressão de proteína aumen-tada com o grau de tumor (P = 0.03 e <0.01 quando Gl e G2foram comparados com tumores G3 respectivamente) e etapa detumor (P = 0.05 quando os tumores pTa são em comparação comtumores > pT2) é compatível com relatórios prévios (16). Emcontraste com relatórios anteriormente publicados que de-monstram os níveis mais altos do P450R mRNA em superficialem comparação com TCC músculo invasivo (15), os níveis deproteína de P450R foram significativamente mais altos emmúsculo invasivo (> pT2 em comparação com pTa + pTl) doençaneste estudo (P <0.01). Além disso, a expressão de proteínade P450R mostra uma correlação positiva com o grau de tumorcrescente (reduzindo diferenciação) (Tabela 1) . De maneirainteressante, a expressão de P450R também demonstrou umacorrelação positiva forte ao índice de proliferação (P<0.01), provavelmente como conseqüência de uma relação forteentre P450R, KÍ67 e grau de tumor crescente (reduzindo dife-renciação) . No entanto, isto deve ser levado em consideraçãoavaliando biorredutora terapia que implica P450R desde quese mostrou que o alto índice proliferative se relaciona àprofecia pobre no câncer de bexiga (17,18). No sumário, aanálise da expressão de proteína por imunoistoquímica sugereque a hipoxia, como demonstrado pela A expressão do Glut 1,se relacione o estágio do tumor crescente, grau e invasão detumor. Com referência à enzimologia de tumor, este estudosugere que os níveis NQOl significativamente diminuam comouma função do estágio do tumor crescente (e potencial inva-sivo) enquanto que os níveis P450R aumentam com grau de tu-mor e potencial invasivo.
Estes achados têm implicações significantes de es-tratégias terapêuticas potenciais usando drogas biorreduto-ras à base de quinona no tratamento do TCC da bexiga. Há e-vidência extensa em modelos pré-clínicos que indicam que aresposta de células a MMC, E09 e RHl depende não só a níveisNQOl mas também ao nível da hipoxia de tumor. Quanto a MMC,o papel de NQOl na determinação de resposta celular sob con-dições aeróbicas é controvertido mas sob condições hipóxi-cas, potentiation significante da atividade é visto só emcélulas que têm baixo ou n. NQOl de atividade (19) . Em casode E09 e RHl, os resultados semelhantes foram obtidos sobcondições de hipóxicas com potentiation marcado de atividadeobservada só em células com NQOl baixo (20,21). Sob condi-ções aeróbicas contudo, há uma boa correlação entre a ativi-dade NQOl e chemosensitivity sugestão que na presença de o-xigênio, NQOl desempenhe um papel proeminente na ativação deE09 e RHl (22,23). à base mecanicista para explicar esta ob-servação não é clara (24) mas sob condições hipóxicas, umelétron redutases, tais como P450R assumem um papel mais in-fluente no processo de ativação biorredutora (25) . Baseadonestes achados, os compostos, tais como E09 e RHl visariam afração aeróbicas de tumores ricos NQOl (e assim ia MMC masaté um menor ponto) ou a fração hipóxicas de tumores defici-entes NQOl que supõem que um elétron redutases, tal comoP450R esteja presente. Em caso de tumores ricos NQ01, porisso, o uso de compostos, tais como E09 e RHl como os agen-tes únicos que visam a fração aeróbicas seriam apropriados.Para tumores deficientes NQOl com uma fração hipóxicas sig-nificante, estes reagentes devem estar usados em combinaçãocom a radioterapia ou outros agentes chemotherapeutic quevisam a fração aeróbicas. Os resultados deste estudo sugeremque esta última estratégia possa ser eficaz em caso do TCCmais promovido da bexiga (isto é, > pT2) ou doença mais a-gressiva (isto é. Grau 3 tumores) como estes tipicamente têmbaixo a expressão de proteína de NQOl (e a possivelmentemaior expressão de P450R) e contêm áreas significantes dahipoxia. Neste contexto específico, ele tem o interesse emobservar que os resultados encorajadores foram obtidos nocâncer de músculo invasivo da bexiga usando quimioradiotera-pia (Mitomicina C mais 5 Fluorouracil em combinação com aradioterapia radical) embora a análise de NQOl e marcadoresde hipoxia não fosse incorporada no desenho deste estudo(26) . No mais largo contexto, a manifestação nisto e outrosestudos que tanto superficial como músculo bexiga invasivaTCC têm regiões significantes da hipoxia sugere que estestumores sejam candidatos atraentes para avaliar outras dro-gas biorredutoras ou a hipoxia mediou a terapia.
Finalmente, os resultados deste estudo demonstra-ram que a expressão de proteína de enzimas-chave implicadasna ativação biorredutora de quinona baseou compostos e apresença de modificações de hipoxia como uma função de etapade tumor e grau em TCC da bexiga. Estes resultados sugeremque estes tumores (isto é>. o pT2 e os tumores G3) seriabons candidatos para regimes de chemo-radioterapia usandoquinonas (p. ex. MMC, E09 e RHl) para visar a fração hipóxi-cas em combinação com a radiação ou outro chemotherapeuticspara visar a fração aeróbicas de células. Baseado nestas ba-ses lógicas, e referindo-se atrás aFigura 1, caso um (pT2G3) demonstra níveis baixo NQ01, alto P450R e alto Glut 1 epor isso seria um bom candidato para quimioradioterapia u-sando quinonas. O Caso B (pTa Gl) tem alto NQ01, baixo P450Re a Glut moderada 1 e como tal devem responder bem à quimio-terapia baseada de quinona. O Caso C (pTi G2) que tem NQOlmoderado, P450R moderado e Glut moderada 1 também seria pre-dito para responder bem à quimioterapia baseada de quinona.Copiador de tumores de pacientes individuais destes marcado-res permanece importante, particularmente em vista da hete-rogeneidade interpaciente marcada (particularmente com NQOl)que existe.
Como usado neste lugar, quando usar níveis de en-zima para determinar um tratamento apropriado de um pacien-te, "alto" contra níveis "baixos" da enzima pode ser apuradocomparando os níveis da enzima do interesse do tumor rele-vante a outros tumores do mesmo paciente, a tumores de outropaciente e/ou a linhas de célula de tumor padrão ou outrareferência disponível aponta conhecido àqueles com habilida-de normal na técnica. Assim, os níveis "altos" e "baixos"podem ser determinados por um médico de trato ou outro Iabo-ratório, pesquisa ou pessoal de tratamento implicado no me-dir e/ou quantitating os níveis de enzima de tumor de um de-terminado paciente.
EXEMPLO 2.
I. Materiais e Métodos.
A. Aparelhagem e princípio geral do ensaio.
Como mostrado na Figura 2, o aparelho usado no ex-perimento descrito compreendeu uma inserção trans poços (Co-adjuvante) introduzido em um poço de uma placa de cultura de24 poços. A inserção tinha um colágeno cobriu a membrana nasua base e assim formou ambos uma barreira entre o topo ecâmara de fundo bem como uma superfície aproximadamente naqual as células puderam se fixar e crescer. A linha de célu-la usada neste estudo foi células humanas de adenocarcinomade cólon DLD-I que foram selecionadas por causa da sua capa-cidade de formar ligações estreitas entre células que pormeio disso formam 'uma barreira' contínua através da qual adroga deve atravessar. Para avaliar a penetração da droga,as drogas foram acrescentadas à câmara superior e a concen-tração da droga na câmara de fundo foi determinada durantediversos intervalos de tempo.
B. Condições de cultura de célula.
As células de DLD-I eram rotineiramente mantidasno meio de 1640 RPMI complementado com o soro fetal de be-zerro a 10 %, piruvato de sódio (1 mM) , L-glutamina (2 mM) ,penicilina/estreptomicina (50 UI/ml, 50 yg/ml) e armazenaramem tampão com o HEPES (25 mM).
As células de DLD-I (2,5 χ IO5 em 200 μΐ do meio)foram acrescentadas à câmara superior e permitidas assentare se anexarem à membrana durante aproximadamente 3 horas em37 0C em atmosfera enriquecida (a 5 %) de CO2. Uma vez ascélulas fixadas, o trans poço foi inserido em um poço de umaplaca de 24 poços e 600 μΐ do meio foram acrescentados à câ-mara de fundo. O aparelho então foi incubado a 37 0C durante4 dias com trocas de meios diárias de ambas as câmaras supe-rior e inferior. Baseado em estudos prévios, a espessura dacamada de múltiplas células depois de 4 dias da cultura éaproximadamente 50 μπι. Para cada ensaio, 3 trans poços foramretirados para exame histológico e a determinação exata deespessura e da integridade (veja abaixo para detalhes).
C. Preparação de soluções de droga.
As seguintes soluções foram preparadas como des-crito abaixo e resumidas na Figura 3.
1. Solução 1; E09 (347 μΜ) em 0,1 % de DMSQ
E09 sólido foi dissolvido em DMSO de 100 % parafazer uma solução de estoque de 347 mm 10 ml da solução deestoque foram acrescentados em 10 ml do meio RPMI completo(fenol vermelho livre). Para prevenir uma precipitação pos-sível de E09, a adição da solução de estoque E09 no meio foicom agitação contínua. A concentração final de E09 foi 347μΜ que é equivalente a 4 mg/4 0 ml.
2. Solução 2: E09 (347 μΜ) em 10 % de PG.
Duzentos miligramas do bicarbonato de sódio (NaH-CO3) foram dissolvidos em 4 ml da solução de EDTA (0,5mg/mL, que foi preparado fresco da solução de estoque de 0,5ml, Sigma). A solução então foi mista com 6 ml PG solução (2ral PG + 4 ml H2O) criação de um volume final de 10 ml quecontêm 20 % de PG. Esta solução foi acrescentada em 20 tubouniversal ml que contém E09 (2 mg) , bicarbonato de sódio (5mg) e manitol (12.5 mg). A solução foi incubada em 37°C coma sacudidela continua até que o E09 fosse completamente dis-solvido (aproximadamente 5-6 horas). Então, a solução foidiluida 1:1 com a água para produzir 10 % de PG, solução.
3. Solução 3: E09 (347 μΜ) em 20 % de PG.
Duzentos miligramas do bicarbonato de sódio (NaH-COs) foram dissolvidos em 4 ml da solução EDTA (0.5 mg/mL,que foi preparado fresco da solução de estoque de 0.5 m,Sigma). A solução então foi mista com 6 ml PG solução (4 mlPG + 2 ml H2O) criação de um volume final de 10 ml que con-têm PG de 40 %. Esta solução foi acrescentada em 20 tubo u-niversal ml que contém E09 (2 mg), bicarbonato de sódio (5mg) e manitol (12,5 mg). A solução foi incubada em 37°C coma sacudidela continua até que o E09 fosse completamente dis-solvido (aproximadamente 3-4 horas). Então, a solução foidiluida a 1:1 com água para produzir 20 % de PG, solução.
4. Solução 4: E09 (347 μΜ) em PG de 30 %.Duzentos miligramas do bicarbonato de sódio (NaH-COa) foram dissolvidos em 4 ml da solução EDTA (0,5 mg/mL,que foi preparado fresco da solução de estoque de 0,5 m,Sigma) . A solução então foi mista com 6 ml PG (6 ml PG + 0ml hbO) criação de um volume final de 10 ml que contêm PG de60 %. Esta solução foi acrescentada em 20 tubo universal mlque contém E09 (2 mg), bicarbonato de sódio (5 mg) e manitol(12,5 mg) . A solução foi incubada em 37 0C com a sacudidelacontínua até que o E09 fosse completamente dissolvido (apro-ximadamente 2 horas). Então, a solução foi diluída 1:1 com aágua para produzir PG de 30 %, solução.
D. Administração de droga.
Em todas as partes de todos os procedimentos, domeio usados foram como descritos em cima exceto que do meiogratuitos vermelhos phenol foram usados (o fenol vermelhoelui muito perto do E09 nos cromatogramas) . E09 foi acres-centado à câmara superior em t=0 em um volume de 100 μΐ e acâmara de fundo conteve 600 μΐ de meios (constantemente agi-tado) . Depois de uma incubação de 10 minutos em 37 0C, otranspoço foi retirado e colocado em um novo poço da placade 24 poços que contém 600 μΐ de meios frescos. A solução dedroga na câmara superior foi retirada e substituída com 100μΐ da solução de droga fresca (isto é, a concentração na câ-mara superior foi mantida em uma concentração constante).Este procedimento inteiro foi repetido em intervalos de 10minutos durante um período de tempo total de 1 hora.
E. Procedimentos de extração.
0 E09 foi imediatamente extraído usando cartuchosIsolute C18 SPE. Os cartuchos foram preparados com 1 ml demetanol seguido lavando-se em 1 ml água deionizada antes daadição de mostra (500 μΐ) . Depois de uma nova lavagem em 1ml água deionizada, o E09 foi eluído em 300 μΐ de metanol.As amostras foram secas sob vácuo (na temperatura ambienteem evaporador rotativo) e guardadas em -20 0C até necessáriapara análise ou reconstituídas na fase móvel (veja abaixo)para análise imediata.F. Análise de HPLC.
A análise cromatográfica de E09 foi executada comodescrito por Phillips et al. (British Journal of Câncer.65 (3) : 35 9-64, 1992) que é incorporado aqui pela referência.
Resumidamente, uma coluna RPB Hichrom (25 cm χ 4,6 mm Dl,Hichrom Ltd, Reino Unido) foi usada para a separação. Foiusado um fotodiodo detector da Waters 996 (Ai = 280nm) com osoftware Masslynx 3.4 (Micromass Ltd) para a análise espec-tral dos picos de interesse. A fase móvel compôs-se de IMtampão de fosfato (1 %), metanol (42 %) e água de grau HPLC(57 %) . A taxa de fluxo foi estabelecida em 1,2 min.ml-1 u-tilização de um Waters Alliance 2690 (Milford, MA, USA) umsistema de cromatografia por bombeamento quaternário, quetambém incorpora uma auto-amostragem. 0 limite de detecçãofoi 10 ng/ml (34.7 nM) .
G. Histologia.
Para cada experimento, 3 inserções de transpoçoforam coletadas; 1 controle e 2 no fim do experimento. Cadatranspoço foi fixado em formalina a 10 % durante uma horaantes de transferência para o etanol a 70 % e armazenamentodurante a noite. Usando um bisturi limpo, as membranas foramcuidadosamente separadas da inserção plástica e processadaspara a inserção na cera de parafina usando procedimentos pa-drão conhecidos àqueles com habilidade normal na técnica. Osespécimes foram seccionados (δμrn) pela utilização de um mi-crotom rotativo Leitz, montado sobre laminas de vidro reco-bertas deproteinas e a utilização de coloração por hemotoxi-Iina e eosina também usando procedimentos padrão conhecidosàqueles com habilidade normal na técnica. A espessura da ca-mada de múltiplas células foi medida usando uma gradiculaocular que foi calibrada usando um micrômetro de estágios.Cinco medições foram obtidas para cada seção e foram medidas3 seções por amostra.
II. Resultados.
A. Cromatogramas representativos.
A Figura 4 mostra um cromatograma de uma amostraem branco semeada com o padrão interno WV14 (tempo de reten-ção = 11,059 minutos). 0 pico em 6,870 minutos é um pico decontaminação. A Figura 5 mostra padrões E09 (1 μς/πιΐ (Figura5A) e 2Ong/ml (Figura 5B) ) no meio de cultura de 1640 RPMI.Como mostrado na Figura 5A, o E09 e picos de WV14 elute em8.029 minutos e 13.023 minutos respectivamente (o pico em7.292 minutos está o pico de contaminação descrito em cima).Deve observar-se que os tempos de retenção podem mover-sedevido a flutuações de temperatura para um laboratório masque os tempos de retenção relativos devem permanecer cons-tantes. Figura 5B indica o limite da detecção. A Figura 6mostra cromatogramas de padrões E09 em 0,1 % de DMSO (Figura6A) ; PG de 30 % (Figura 6B) ; 20 % de PG (Figura 6C) ; e 10 %de PG (Figura 6o).
B. Curvas de calibração.
As curvas de calibração foram construídas para ca-da preparação E09 e os resultados são apresentados na Figura7. As curvas de calibração foram diferenças reprodutíveis esutis na inclinação de cada curva de calibração que foramobservados como ilustrado na Figura 7. As razões das dife-renças são pouco nítidas, mas podem refletir diferenças le-ves na eficiência de extração entre as preparações diferen-tes. As eficiências de extração de E09 em 0,1 % de DMSO, 10% de PG, 20 % de PG e PG de 30 % foram 92,3 %, 81,7 %, 79,9% e 81,1 % respectivamente. Por causa desta variação, ascurvas de calibração foram geradas para cada experimentoconduzido. Nenhum produto de esgotamento óbvio foi visívelem nenhum dos cromatogramas.
C. Penetração da Droga.
Como pode ser visto na Figura 8, como a concentra-ção de aumentos de PG, a taxa de penetração de camada demúltiplas células de reduções de E09. Quanto a E09 em 0,1 %de DMSO, a cinética é linear que é como esperado quando aconcentração na câmara superior é mantida em um valor maisou menos constante. Nas duas concentrações mais altas de PGtestado, ele vale a pena observar que a cinética é não exa-tamente linear - há um aumento progressivo na taxa como au-mentos de tempo. Este efeito provavelmente reflete as modi-ficações na espessura da camada de múltiplas células induzi-da por PG (ver Figura 9). Nenhum metabólito óbvio ou os pro-dutos de esgotamento foram observados em nenhum dos pontosde tempo avaliados.
A Figura 9 mostra que os resultados da análisehistológica empreendida para examinar a penetração de E09através de camadas de múltiplas células DLD-I. A espessurade seções tratadas de não-droga foi 56,01 ± 3,63 μΜ. Depoisde uma hora do tratamento com E09 em 0,1 % de DMSO, a espes-sura da camada de múltiplas células não foi significativa-mente diferente de espécimes tratados de não-droga (58,80 ±2,50 μΜ). Seguinte tratamento com E09 em PG de 30 % contudo,a espessura da camada de múltiplas células reduziu signifi-cativamente a 29,01 ± 1,78 μΜ. Lá também foram marcados pormodificações morfológicas na aparência dentro da camada, omais óbvio do qual foi a aparência 'de intervalos1 ou 'ca-nais' na própria camada. Uma observação feita em todas aspartes de experimentos usando E09 em PG consistiu em que acâmara superior conteve mais fluido do que esperado. Por e-xemplo, depois de uma 10 incubação de minuto com E09 em PGem 30 %, 20 % e 10 %, o volume recuperou-se da câmara supe-rior foi 106 ± 3, 107 ± 3 e 105 ± 2 μΐ respectivamente (de-pois que uma exposição de hora a E09 em 0,1 % de DMSO, o vo-lume recuperado foi 98 + 2 μΐ) . Deve realçar-se que estesvolumes são só aproximações (sendo baseado no que pode serrecuperado usando uma pipeta de Gilson) mas eles realmenteindicam que o volume de meios na câmara superior se modificaquando E09 dissolvido em formulações PG (especialmente em PGde 30 %) está usado. É também notável que os quadros histo-logical mostram que as células estão no contato DTDdo com amembrana de cave em controles e E09 (0,1 % de DMSO) tratouespécimes mas para camadas imulticell tratou com E09 em PG30%, há uma fenda pequena mas distinta entre a camada demúltiplas células e a própria membrana.
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A expressão de proteína NQ01, P450R, FARTA 1 eKl67 em TCC humano da bexiga.
Os dados de NQOl, P450R e GLUT 1 são apresentadoscomo a conta mediana (+ variação interquaartil) de dois ob-servadores. Os dados do índice de proliferação são apresen-tados como avaliação média ±SE de dois observadores. Os es-pécimes foram taxados entre 0 e 4 para NQ01, P450R e GLUT 1e o índice de proliferação foi calculado como positividade %de Ki67 tal como descrito em "Materiais e Métodos".<table>table see original document page 38</column></row><table>
Os índices a, b, c e d significam os estágios tu-morais pTa; (pTl +pT2); (pTa + pTl) e pT2 respectivamente.

Claims (25)

1. Preparação farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fa-to de que compreendendo a E09 em uma solução com uma concen-tração de propileno glicol (PG) selecionada do grupo consis-tindo de aproximadamente 30 % vol/vol de PG, aproximadamente-20 % vol/vol de PG, e aproximadamente 10 % vol/vol de PG.
2. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepara-ção compreende uma solução com uma concentração de aproxima-damente 300 μΜ a aproximadamente 400 μΜ de E09.
3. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepara-ção compreende uma solução com uma concentração de aproxima-damente 347 μΜ de E09.
4. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepara-ção compreende também NaHCO3, EDTA, manitol e água.
5. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepara-ção compreende de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente-120 mg/mL de NaHCOO3.
6. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepara-ção compreende aproximadamente 100 mg/ml de NaHCO3.
7. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepara-ção compreende aproximadamente 50 mg/mL de NaHCO3.
8. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 4, CARACTERIZADA, pelo fato de que a dita prepa-ração compreende de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximada-mente 3,0 mg/mL de manitol.
9. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepara-ção compreende aproximadamente 0,625 mg/mL de manitol.
10. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepara-ção compreende aproximadamente 1,25 mg/mL de manitol.
11. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepara-ção compreende aproximadamente 100 mg/mL de NaHCO3, aproxi-madamente 0,625 mg/mL de manitol, e aproximadamente 0,1mg/mL de E09 em uma solução compreendendo EDTA, PG e água.
12. Preparação farmacêutica, CARACTERIZADA pelofato de que compreendendo E09, NaHCO3 e manitol em uma solu-ção compreendendo PG, EDTA e água em que o dito PG está pre-sente na dita solução em um faixa de variação percentual se-lecionada do grupo consistindo de aproximadamente 6 % a a-proximadamente 14 % vol/vol; de aproximadamente 16 % a apro-ximadamente 24 % vol/vol, e de aproximadamente 26 % a apro-ximadamente 34 % vol/vol.
13. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito PG estápresente na dita solução em um percentual selecionado dogrupo consistindo de aproximadamente 10 % vol/vol, de apro-ximadamente 20 % vol/vol, e de aproximadamente 30 % vol/vol.
14. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-ração compreende uma solução com uma concentração de aproximadamente 347 μΜ de E09 e uma concentração de aproximadamente 10 % vol/vol de PG.
15. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita preparação compreende uma solução com uma concentração de aproximadamente 347 μΜ de E09 e uma concentração de aproximadamente 20 % vol/vol de PG.
16. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita preparação compreende uma solução com uma concentração de aproximadamente 347 μΜ de E09 e uma concentração de aproximadamente 30 % vol/vol de PG.
17. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita preparação compreende de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 120 mg/ml de NaHCO3.
18. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita preparação compreende aproximadamente 100 mg/mL de NaHCO3.
19. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita preparação compreende aproximadamente 50 mg/mL de NaHCO3.
20. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita preparação compreende de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 3,0 mg/mL de manitol.
21. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepa-ração compreende aproximadamente 0,625 mg/mL de manitol.
22. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepa-ração compreende aproximadamente 1,25 mg/mL de manitol.
23. Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepa-ração compreende uma solução com uma concentração de aproxi-madamente 347 μΜ de E09, uma concentração de aproximadamente-10 % vol/vol de PG, aproximadamente 100,25 mg/mL de NaHCO3 eaproximadamente 0,625 mg/mL de manitol.
24.
Preparação farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita prepa-ração compreende uma solução com uma concentração de aproxi-madamente 347 μΜ de E09, uma concentração de aproximadamente-30 % vol/vol de PG, aproximadamente 100,25 mg/mL de NaHCO3 eaproximadamente 0,625 mg/mL de manitol.
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