KR101350053B1 - 간 건강 개선을 위한 식물성 제형물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간을 알코올 및 화학적 손상으로부터 보호하고/하거나 단계 II 효소를 유도함으로써 간 건강을 개선하기 위한 식물성 제형물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제형물은 고추냉이 뿌리 섬유 분말, 아티초크 잎 추출물, 아스파라거스 탈수물, 칡 뿌리 추출물, 오레가노 추출물, 쉬산드라 베리 추출물, 전칠삼 (파낙스 노토진셍 뿌리의 에탄올 추출물), 산치 (파낙스 노토진셍 뿌리의 수 추출물), 게겐 뿌리 추출물 (푸에라리아 오마이엔시스), 시금치 탈수물, 또는 이의 조합물을 포함한다.
식물성 제형물, 고추냉이, 아티초크, 아스파라거스, 칡, 오레가노, 쉬산드라 베리, 전칠삼, 산치, 게겐, 시금치

Description

간 건강 개선을 위한 식물성 제형물 {PLANT-BASED FORMULATIONS FOR IMPROVING LIVER HEALTH}
본 발명은 상승적으로 작용하여 간의 양호한 건강을 보조하는 식물성 추출물의 독특한 제형물에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 알코올 및 화학적으로 유발되는 손상으로부터 간을 보호하는 데 도움이 되는 식물성 추출물의 독특한 제형물에 관한 것이다.
간은 인체에서 가장 맹렬히 작동하는 기관 중 하나이다. 우수한 간 기능은 균형잡힌 호르몬 수치, 체중의 조절 및 유지, 콜레스테롤 수치, 피부 건강 및 전반적 건강을 위해 중요하다. 간은 인체를 청소하는 장소로 기능하고 알코올 등의 여러 물질의 대사를 담당하며, 인체 내 독소의 해독에 중요한 역할을 한다. 단계 II 효소는 이 해독 과정의 일부로서 인체로부터 잠재적 발암 물질의 제거를 보조한다. 간은 인체 내에서 그 기능의 결과, 환경 독소, 불순물, 알코올, 처방약 및 일반의약품으로부터의 일상적인 공격에 노출되어 있고 손상 받기 쉽다. 사염화탄소, 니트로사민, 및 다환식 방향족 탄화수소 등 많은 간독성 물질이 간 효소에 의해 대사적으로 활성화되어 인간의 간 손상을 유발하는 반응성 독성 대사산물을 형성한다. 따라서 알코올 및 사염화탄소 손상으로부터 간을 보호하는 데 도움이 되는 식물성 추출물의 제형물이 유용할 것이다. 나아가, 간의 해독을 담당하는 단계 II 효소를 유도하는 식물성 제형물도 유용할 것이다.
발명의 개요
본 발명은 사염화탄소 및 알코올 손상으로부터 간을 보호하는 작용을 함으로써 간 건강을 개선시키는 독특한 제형물에 관한 것이다. 본 발명의 제형물은 테트라졸륨염인 3-(4,5-디메틸티아졸릴-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 ("MTT"), 및 락타제 탈수소효소 ("LDH") 등의 지표로 측정하였을 때 인간 간세포에 대해 강력한 보호 능력을 나타낸다. 또한 이들 추출물 및 그 조합물은 강력한 단계 II 효소 유도 능력을 나타낸다. 단계 II 효소 유도 측정법은 해독 작용의 지표인 퀴논 환원효소 (단계 II 효소)를 유도하는 시료의 능력을 측정한다.
따라서 일 구현예에서, 본 발명은 고추냉이 뿌리 섬유 분말, 아티초크 잎 추출물, 아스파라거스 추출물, 칡 뿌리 추출물, 오레가노 추출물, 쉬산드라 베리 (schisandra berry) 추출물, 전칠삼 (파낙스 노토진셍 (Panax notoginseng) 뿌리의 에탄올 추출물), 산치(sanchi) (파낙스 노토진셍 뿌리의 수 추출물), 게겐 (Gegen) (푸에라리아 오마이엔시스 (Pueraria omeiensis)), 시금치 탈수물, 또는 이의 조합물을 포함하는 간 건강 개선을 위한 제형물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 고추냉이 뿌리 섬유 분말, 아티초크 잎 추출물, 아스파라거스 추출물, 칡 뿌리 추출물, 오레가노 추출물, 쉬산드라 베리 추출물, 전칠삼 (파낙스 노토진셍 뿌리의 에탄올 추출물), 산치 (파낙스 노토진셍 뿌리의 수 추출물), 게겐 (푸에라리아 오마이엔시스), 시금치 탈수물, 또는 이의 조합물을 제공함으로써 사염화탄소 ("CCl4") 손상으로부터 간을 보호하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 고추냉이 뿌리 섬유 분말, 아티초크 잎 추출물, 아스파라거스 추출물, 칡 뿌리 추출물, 오레가노 추출물, 쉬산드라 베리 추출물, 전칠삼 (파낙스 노토진셍 뿌리의 에탄올 추출물), 산치 (파낙스 노토진셍 뿌리의 수 추출물), 게겐 (푸에라리아 오마이엔시스), 시금치 탈수물, 또는 이의 조합물을 제공함으로써 알코올 손상으로부터 간을 보호하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 고추냉이 뿌리 섬유 분말, 아티초크 잎 추출물, 아스파라거스 추출물, 칡 뿌리 추출물, 오레가노 추출물, 쉬산드라 베리 추출물, 전칠삼 (파낙스 노토진셍 뿌리의 에탄올 추출물), 산치 (파낙스 노토진셍 뿌리의 수 추출물), 게겐 (푸에라리아 오마이엔시스), 시금치 탈수물, 또는 이의 조합물을 제공함에 의한 단계 II 효소의 유도 방법을 제공한다 .
도 1은 MTT로 측정한, 에탄올 손상으로부터 간을 보호함에 있어서 각종 제형물의 효과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 LDH로 측정한, 에탄올 손상으로부터 간을 보호함에 있어서 각종 제형물의 효과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 3은 MTT로 측정한, CCl4 손상으로부터 간을 보호함에 있어서 각종 제형물의 효과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 LDH로 측정한, CCl4 손상으로부터 간을 보호함에 있어서 각종 제형물 의 효과를 보여주는 막대 그래프이다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 방법론 또는 프로토콜에 한정되지 않는 것으로 이해해야 한다. 또한 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 지닌다. 나아가, 본원에서 사용되는 용어는 오로지 특정 구현예를 기술하기 위함이며, 본 발명의 범위를 한정하고자 함이 아니고, 이는 오로지 청구의 범위에 의하여 한정되는 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 제형물에 사용되는 성분
본 발명은 표 1에 더 상세히 설명된 하기 성분들의 독특한 조합물이 간 건강을 개선한다는 놀라운 발견을 토대로 하고 있다: 고추냉이 뿌리 섬유 분말, 아티초크 잎 추출물, 아스파라거스 추출물, 칡 뿌리 추출물, 오레가노 추출물, 쉬산드라 베리 추출물, 전칠삼 (파낙스 노토진셍 뿌리의 에탄올 추출물), 산치 (파낙스 노토진셍 뿌리의 수 추출물), 게겐 (푸에라리아 오마이엔시스), 및 시금치 탈수물.
더 구체적으로, 본 발명의 제형물은 알코올 및 사염화탄소 손상으로부터 간을 보호함으로써 간 건강을 개선한다. 나아가 상기 제형물은 단계 II 효소를 유도함으로써 간 건강을 개선한다. 단계 II 효소는 인체로부터 잠재적 발암 물질의 제거를 보조함으로써 이들의 제거를 담당한다.
"알코올 손상으로부터 간을 보호함" 및 "사염화탄소 손상으로부터 간을 보호함"이란, 본원에 기재된 제형물의 기존의 간 기능의 유지 또는 개선 능력을 의미한다.
Figure 112008034208199-pct00001
본 발명의 제형물
표 2는 보조제에 포함될 수 있는 성분들의 대표적 1일 함량을 예시한다.
Figure 112008034208199-pct00002
하기는 본 발명에 따라 정제로 만들어진 제형물의 예이며 이는 본 발명의 범위를 한정하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1
Figure 112008034208199-pct00003
실시예 2
Figure 112008034208199-pct00004
실시예 3
Figure 112008034208199-pct00005
실시예 4
Figure 112008034208199-pct00006
실시예 5
Figure 112008034208199-pct00007
실시예 6
Figure 112008034208199-pct00008
실시예 7
Figure 112008034208199-pct00009
실시예 8
Figure 112008034208199-pct00010
실시예 9
Figure 112008034208199-pct00011
상기 타정된 제형물 예는 당업계에 공지된 전형적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 고추냉이 뿌리 섬유 분말, 아티초크 잎 추출물, 쉬잔드라 베리 추출물, 전칠삼 및 시금치 탈수물을 20 메쉬 스크린을 갖춘 SWECO 분리기를 통과시켜 100 3제곱 피트 PK 혼합기로 보낸다. 미세결정질 셀룰로스를 PK 혼합기 내 혼 합물에 첨가한다. 상기 성분들을 10 분간 혼합한다. 셀룰로스 검 및 이산화규소를 20 메쉬 스크린을 갖춘 SWECO 분리기를 통과시켜 바로 100 3제곱 피트 PK 혼합기로 보낸다. 상기 성분들을 10 분간 혼합한다. 다음으로 스테아르산을 20 메쉬 스크린을 갖춘 SWECO 분리기를 통과시켜 바로 100 3제곱 피트 PK 혼합기로 보낸다. 상기 혼합물을 추가로 5 분간 혼합한다. 생성된 혼합물을 토트(tote) 또는 수퍼색(supersack)으로 방출시키고 정제로 압축하다.
투여 방법
본 발명의 제형물을 허용가능한 담체 내에 제형화하고 제조, 포장하여 건강 증진, 간 기능, 간에 대한 알코올 및/또는 화학적 손상으로부터 보호, 및/또는 건강한 간 기능 촉진을 위한 단계 II 효소의 유도를 표시할 수 있다. 본 발명의 제형물 및 이의 허용가능한 담체를 알약, 정제, 사용 전에 물 또는 기타 적당한 비히클로 재구성하는 건조 또는 분말 제품, 바, 식품, 용액, 시럽, 현탁물, 음료, 로젠즈 등의 형태의 경구 투여물로 제형화할 수 있다. 또한 본 발명의 제형물을 비경구 투여하거나 또는 흡입 또는 취입 (입 또는 코를 통해)에 의해 투여할 수도 있다.
액체 제제는 현탁제 (예, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제 (예, 레시틴 또는 아카시아); 비(非)-수성 비히클 (예, 아몬드유, 유성 에스테르, 또는 분별 식물성 오일); 및 방부제 (예, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산) 등의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 이용하여 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 음료 형태로 투여할 경우, 본 발명의 제형물 은 물-기재, 우유-기재, 차-기재, 과일 주스-기재, 또는 이의 몇 가지 조합일 수 있다.
또한 본 발명의 제형물을, 결합제 (예, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스; 충전제 (예, 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예, 스테아르산마그네슘, 탈크 또는 실리카); 붕해제 (예, 셀룰로스 검, 감자 전분 또는 전분글리콜산소듐); 또는 습윤제 (예, 소듐 라우릴 설페이트) 등의 약학적으로 허용가능한 부형제를 이용하여 통상의 방법으로 제조되는 고형물 형태로 경구 투여할 수도 있다.
경구 투여되는 본 발명의 제형물은 잔탄검, 카르복시메틸-셀룰로스, 카르복시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 메틸셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 전분, 덱스트린, 발효 유장, 두부, 말토덱스트린, 당 알코올 (예, 소르비톨 및 만니톨)을 포함한 폴리올, 탄수화물 (예, 락토스), 프로필렌 글리콜 알기네이트, 젤란검, 구아, 펙틴, 트라가칸쓰검, 아카시아검, 로커스트콩검, 아라비아검, 젤라틴을 포함한 증점제, 및 이들 증점제의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 경구 투여 제형물은 탄수화물 감미료 및 천연 및/또는 인공 무/저 칼로리 감미료를 포함하여 하나 이상의 감미료의 유효량을 함유할 수 있다. 본 발명의 제형물에 사용되는 감미료의 양은 가변적이나, 통상적으로는 사용하는 감미료의 종류 및 원하는 당도에 좌우된다.
전술한 제형물 이외에도, 상기 화합물을 서방성 및/또는 지효성 (timed release) 제형물로 제형화할 수 있다. 상기 제형물은 효과적이기 위하여 어떤 최 소 치료량보다 높게 유지되어야 한다. 통상적인 지효성 및/또는 제어 방출형 전달 시스템으로는, 전분, 삼투압 펌프, 또는 젤라틴 미세캡슐이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
제형물을 필요에 따라서는 본 발명의 제형물을 포함한 하나 이상의 단위 투여 형태롤 포함할 수 있는 디스펜서 장치 또는 팩으로 제공할 수 있다. 상기 팩은 예컨대 블리스터 팩과 같이 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여 안내서가 첨부될 수 있다.
다른 유용한 투여 형태를 당업자에게 자명한 방법 및 기술에 의해 제조할 수 있으며, 정제, 캡슐, 또는 액체 투여 형태를 제조함에 있어서 추가적인 성분의 사용을 포함할 수 있다. 투여량, 및 투여 빈도는 개별 소비자 또는 환자의 나이, 체중, 상태 및 반응, 및 사용되는 본 발명의 특정 제형물에 따라 가변적이다.
전술한 설명을 한정적인 것이 아니라 예시적인 것으로 보고자 한다. 하기 실험 연구 및 실시예로써 본 발명을 더욱 설명하나 이를 한정적으로 해석해서는 안된다.
개별 성분에 대한 생물측정 연구
알코올 및 화학적으로 유발된 간 손상에 대한 몇 가지 물질의 보호 능력을 예측하기 위하여 이들을 생물측정법으로 시험하였다. 이를 평가하기 위하여, 인간 간세포를 상기 물질 및 손상 인자로 처리하고, 세포 생육성을 두 가지 상이한 측정법으로 측정하였다. 알코올 손상은 2.5% 에탄올을 손상 인자로 사용하여 모의하였 다. 화학적 손상의 경우 0.2% CCl4를 사용하였다. 이들 농도는 예비 실험에서 20% 세포사를 유발한 농도이고 따라서 세포가 불가역적인 세포사멸/손상에 이르게끔 하지 않을 농도였기 때문에 선택되었다.
물질들을 세 가지 농도 (1, 10 및 100 μg/㎖)에서 시험하고 EC-50 추정치를 결정하였다 (자세한 것은 하기 실험 부분 참조). 세포 생육성 측정법 외에도, 단계 II 효소 유도 시험을 수행하여 물질의 해독 특성 보유 여부를 확인하였다. 단계 II 효소 유도 측정법은 해독 작용의 지표인 퀴논 환원효소 (단계 II 효소)를 유도하는 시료의 능력을 측정한다. 단계 II 효소는 인체로부터 잠재적 발암 물질의 제거를 보조함으로써 이들의 제거를 담당한다. 브로콜리는 그 설포라판 함량으로 인하여 우수한 단계 II 효소 유도 물질로 알려져 있다. 순수한 설포라판은 106 U/g의 활성을 갖는 반면, 브로콜리는 4000 - 74,000 U/g (품종, 형태, 및/또는 추출 조건에 따라)의 활성이 보고되었다. 30,000 U/g 초과 활성이면 탁월한 것으로 본다. 5000 U/g 미만의 활성을 최소로 본다. 우수한 단계 II 효소 유도 물질로 여겨지는 대부분의 물질은 15,000-30,000 U/g의 활성을 가진다.
표 3 및 4는 모든 시험 대상 물질의 EC-50 값을 요약한 것이다. 표 3은 구체적으로 에탄올 보호, 및 표 4는 사염화탄소 보호의 결과를 나타낸다. 표 5는 단계 II 효소 유도 측정법의 결과를 보여준다.
Figure 112008034208199-pct00012
Figure 112008034208199-pct00013
Figure 112011089565830-pct00026
실험예
에탄올 보호 및 CCl4 평가를 위해, 시료 모액을 DMSO 중에서 만든 다음, 시험을 위해 세포 배양 배지에 희석한다. 100 ㎕ 시료를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 세 개 웰 각각에 가함으로써 HepG2 세포 (인간 간세포주)의 처리를 행한다. 4 시간 항온배양 후, 손상 인자를 가하고 (2.5% 에탄올 또는 0.2% 사염화탄소) 추가적으로 밤새 항온배양을 수행한다. 다음날 두 가지 상이한 측정법으로 세포 생육성을 측정한다. 우선, CytoTox-ONE 균질막 완전성 측정법 (Homogenous Membrane Integrity Assay, Promega)을 이용하여, 생육 불능 세포의 수를 LDH의 배지 내 방출량을 측정함으로써 추정한다. LDH는 세포막이 훼손된 경우에 세포 밖으로 새어나온다. 두 번째 측정법은 MTT 측정법으로, 이는 생육성 세포의 미토콘드리아에 의한 황색 테트라졸림염의 불용성 자색 포르마젠 산물로의 환원을 측정하는 것이다. MTT 용액과 항온배양한 후, 이소프로판올을 첨가하여 착색된 결정을 가용화한다. 발색량은 생육성 세포의 수에 정비례한다.
단계 II 효소 유도 측정법의 경우, 시료 모액을 아세토니트릴 중에 만든 다음, 시험을 위해 세포 배양 배지에 희석한다. 150 ㎕ 시료를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 세 개 웰 각각에 가함으로써 Hepalclc7 세포 (쥐과 간종양 세포주)의 처리를 행한다. 48 시간 항온배양 후, MTT의 NADPH-의존적, 메나디올-매개 환원을 측정함으로써 퀴논 환원효소의 유도 활성을 확인한다. 활성은 물질의 생중량 1 그램 당 유도 물질 단위로 보고되는데, 여기서 1 유도 물질 활성 단위는 Hepalclc7 세포의 퀴논 환원효소 특이적 활성을 두 배로 하는데 필요한 유도 물질의 양으로 정의된다.
성분 조합에 대한 생물측정 연구
간 해독 성분의 몇 가지 혼합물을 생물측정법으로 시험하여 알코올 및 화학적으로 유발된 간 손상에 대한 이의 보호 능력을 예측하였다. 이들 혼합물을 간 건강을 위해 이미 시판되고 있는 두 제품 - NUTRILITE® Milk Thistle and Dandelion(밀크 티슬 앤드 단델리온) 및 China's King Drink(차이나'스 킹 드링크)와 함께 시험하였다. 이를 평가하기 위해 인간 간세포를 상기 시료 및 손상 인자로 처리하고, 두 가지 상이한 측정법을 이용하여 세포 생육성을 측정하였다. 알코올 손상은 2.5% 에탄올을 손상 인자로 사용하여 모의하였다. 화학적 손상의 경우 0.2% CCl4를 사용하였다. 이들 농도는 예비 실험에서 20% 세포사를 유발한 농도이고 따라서 세포가 불가역적인 세포사멸/손상에 이르게끔 하지 않을 농도였기 때문에 선택되었다. 시료를 세 가지 농도 (1, 10 및 100 μg/㎖)에서 측정하고 EC-50 추정치를 결정하였다 (자세한 것은 하기 실험 부분 참조). 5 ℓ 혈액 (평균 인간 체적) 내로의 물질의 흡수율을 10%라 가정할 때, EC-50 값이 10 μg/㎖ 이하인 물질은 가장 효과적임을 나타낸다.
CCl4 간세포 손상에 대해 가장 큰 효능을 나타낸 혼합물은 8523-25-CI (실시예 1), 8523-27-CI (실시예 8), 8523-28-CI (실시예 2), 및 8523-30-CI (실시예 3)이었다. 우수한 결과를 보여준 (≤10 μg/㎖에서 40% 보호율을 나타냄) 다른 혼합물은 8523-20-CI, 8523-22-CI, 8523-24-CI, 8523-26-CI 및 8523-31-CI 이었다. 어떠한 혼합물도 에탄올 간세포 손상에 대하여 ≤10 μg/㎖에서 효능을 나타내지 않았다. 대조군 제품 (NUTRILITE milk thistle 및 King Drink) 역시 ≤10 μg/㎖의 EC-50 값을 달성하지 못했다. >100 μg/㎖의 EC-50 값을 갖는 혼합물은 8523-28-CI (실시예 2), 8523-30-CI (실시예 3), 8523-31-CI (실시예 4) 및 8523-32-CI (실시예 5)이었다. 표 6-9는 시험한 모든 시료의 결과를 요약한 것이다. 이들 결과는 도 1-4에도 나타내었다.
Figure 112008034208199-pct00015
Figure 112008034208199-pct00016
Figure 112008034208199-pct00017
Figure 112008034208199-pct00018
세포 생육성 측정법 외에도, 단계 II 효소 유도 시험을 수행하여 물질의 해독 특성 보유 여부를 확인하였다. 단계 II 효소 유도 측정법은 해독 작용의 지표인 퀴논 환원효소 (단계 II 효소)를 유도하는 시료의 능력을 측정한다. 브로콜리는 그 설포라판 함량으로 인하여 우수한 단계 II 효소 유도 물질로 알려져 있다. 순수한 설포라판은 106 U/g의 활성을 갖는 반면, 브로콜리는 4000 - 74,000 U/g (품종, 형태, 및/또는 추출 조건에 따라)의 활성이 보고되었다. 30,000 U/g 초과 활성이면 탁월한 것으로 본다. 5000 U/g 미만의 활성을 최소로 본다. 우수한 단계 II 효소 유도 물질로 여겨지는 대부분의 물질은 15,000-30,000 U/g의 활성을 가진다.
시험한 모든 혼합물은 우수에서 탁월한 단계 II 효소 유도 활성을 가졌다. 가장 활성이 큰 것은 8523-27 (실시예 8)이었고 가장 낮은 것은 8523-31 (실시예 4)이었다. 8523-22 (실시예 7), 8523-23, 8523-30 (실시예 3), 8523-32 (실시예 5) 및 8523-33 또한 탁월한 활성을 보였다. 표 10은 시험한 모든 시료에 대한 단계 II 효소 유도 측정의 결과를 나타낸다.
Figure 112008034208199-pct00019
실험예
시료 모액을 DMSO 중에서 만든 다음, 시험을 위해 세포 배양 배지에 희석한다. 100 ㎕ 시료를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 세 개 웰 각각에 가함으로써 HepG2 세포 (인간 간세포주)의 처리를 행한다. 4 시간 항온배양 후, 손상 인자를 가하고 (2.5% 에탄올 또는 0.2% 사염화탄소) 추가적으로 밤새 항온배양을 수행한다. 다음날 두 가지 상이한 측정법으로 세포 생육성을 측정한다. 우선, CYTOTOX-ONE™ 균질막 완전성 측정법 (Promega)을 이용하여, 생육 불능 세포의 수를 LDH의 배지 내 방출량을 측정함으로써 추정한다. LDH는 세포막이 훼손된 경우에 세포 밖으로 새어나온다. 두 번째 측정법은 MTT 측정법으로, 이는 생육성 세포의 미토콘드리아에 의한 황색 테트라졸림염의 불용성 자색 포르마젠 산물로의 환원을 측정하는 것이다. MTT 용액과 항온배양한 후, 이소프로판올을 첨가하여 착색된 결정을 가용화한다. 발색량은 생육성 세포의 수에 정비례한다.
세 반복군을 평균한 후 각 웰의 독성 백분율을 우선 계산함으로써 보호율을 결정한다 (1-실험군/음성 대조군). 이어서 하기에 의해 보호 백분율을 계산한다: (%독성 양성 대조군 - %독성 시료군)/%독성 양성 대조군, 여기서 양성 대조군은 2.5% 에탄올 또는 0.2% 사염화탄소임. 그 후 50% 보호율 (EC-50)을 나타내는 농도를 평가할 수 있다. 이 실험의 목적상, 이를 <1, 1, 1-10, 10, 10-100, 100 또는 >100 μg/㎖로 분류하였다.
단계 II 효소 유도 측정법의 경우, 시료 모액을 아세토니트릴 중에 만든 다음, 시험을 위해 세포 배양 배지에 희석한다. 150 ㎕ 시료를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 세 개 웰 각각에 가함으로써 Hepalclc7 세포 (쥐과 간종양 세포주)의 처리를 행한다. 48 시간 항온배양 후, MTT의 NADPH-의존적, 메나디올-매개 환원을 측정함으로써 퀴논 환원효소의 유도 활성을 확인한다. 활성은 물질의 생중량 1 그램 당 유도 물질 단위로 보고되는데, 여기서 1 유도 물질 활성 단위는 Hepalclc7 세포의 퀴논 환원효소 특이적 활성을 두 배로 하는데 필요한 유도 물질의 양으로 정의된다.
포유류 연구
간 건강에 대한 상기 제형물의 효능을 확인하기 위해 임상 시험을 실시할 수 있다. 상기 제형물은 화학적 및 알코올 손상으로부터 간을 보호함으로써 간 건강을 개선할 것으로 기대된다. 이러한 시험을 위한 프로토콜은 다음과 같다.
프로토콜 1 : CCl4 간 손상 모델
1.1 원리.
간의 마이크로솜 효소에 의해 CCl4가 활성화될 경우, 트리클로로메탄 자유 라디칼 (CCl3ㆍ)이 생성된다. 이 자유 라디칼이 단백질과 공유 결합하면 단백질 합성의 손상 및 지질 이화 작용의 장애를 초래하여 간세포에 트리글리세라이드 (TG)를 축적시킨다. CCl3ㆍ은 또한 O2와 빠르게 결합하여 트리클로로메탄 과산화물 자유 라디칼 (CCl3O2ㆍ)을 생성함으로써 지질의 과산화를 초래할 수 있는데 이는 세포막의 퇴행성 손상, 효소의 누출 및 세포의 다양한 종류의 병리학적 변화 및 심지어 괴사의 원인이 된다.
1.2 실험 동물.
단일 성의 성체 래트 또는 마우스. 각 군은 8-12 마리 래트 (180-22O g) 또는 10- 15 마우스 (18-22 g)로 이루어진다.
1.3 실험 방법 및 절차.
1.3.1 시험 시료의 투여량 군 및 투여 기간.
세 투여량 군, 하나의 블랭크(blank) 대조군 및 하나의 모델 대조군을 설정한다. 투여량 군 중 하나의 투여량은 인간의 권장 투여량의 10 배 (마우스) 또는 5 배 (래트)이다. CCl4 (분석학적으로 순수한 것)를 사용하여 간 손상 모델을 생성한다. 모델 생성 방법은 위내 투여 혹은 복막내 주사법을 이용할 수 있다. 마우스의 위내 투여를 위한 CCl4의 농도는 1%이다. CCl4를 식용 식물성 오일로 희석하고 위내 투여를 위한 투여량은 5 ㎖/kg BW 이다 (CCl4로 환산한 투여량은 80 mg/kg BW). 래트의 위내 투여를 위한 CCl4의 농도는 2%-3%이고 그 투여량은 5 ㎖/kg BW 이다 (CCl4로 환산한 투여량은 160-240 mg/kg BW). 필요에 따라 양성 대조군 및 용매 대조군을 설정할 수 있다. 시험 시료의 투여 기간은 30 일이고 필요한 경우 45 일까지 연장할 수 있다.
1.3.2 시험 시료의 투여 경로.
시험 시료는 위내로 투여한다. 이것이 불가능할 경우, 시험 시료를 사료 또는 마시는 물에 섞어 넣을 수 있고 사료 섭취량 또는 마시는 물의 양을 기록한다.
1.3.3 실험 절차.
실험군 동물에 매일 시험 시료를 위내로 투여하는 한편, 블랭크 대조군 및 모델 대조군 동물에는 증류수를 투여한다. 매주 두 번 동물의 체중을 측정하여 시험 시료의 투여량을 조절한다. 실험 30 일째의 전날에, 여러 군의 동물들을 16 시간 절식시킨다. 모델군 및 여러 시험 시료군의 동물들에 CCl4 단일 투여분을 위내로 투여하는 한편, 블랭크 대조군 동물에는 식물성 오일을 투여한다. 실험군 동물은 실험 끝까지 시험 시료를 계속 투여받는다 (시험 시료와 CCl4 간의 투여 간격은 4 시간이 넘음). CCl4를 투여한 다음, 실제 상황에 따라 24 시간 또는 48 시간 후에 동물들을 죽인다. ALT 및 AST 측정을 위해 혈액을 채취하고 혈청을 분리한다. 조직병리학적 검사를 위해 간을 채취한다.
1.3.4 측정 지표.
혈청 글루타메이트-피루베이트 트랜스아미나제 (ALT), 글루타믹-옥살로아세틱 트랜스아미나제 (AST), 간의 조직병리학적 검사
1.4 ALT 및 AST의 측정.
1.4.1 측정 방법.
전자동 생물화학적 분석기 또는 Reitman-Frankel 방법 (시약 키트)을 선택할 수 있다.
1.4.1 자료 처리 및 결과 평가.
분산 분석을 이용하나, 분산 분석의 절차에 따라 우선 등분산성 검정을 수행해야한다. 분산이 동질적인 경우, F 값을 계산한다. F 값이 < F0.05인 경우, 결론은 상이한 군의 평균 간의 차이가 유의하지 않다는 것이다. F 값이 ≥ F0.05 및 P가 ≤ 0.05인 경우, 몇 가지 실험군 및 하나의 대조군 간의 평균에 대한 쌍체 비교분석법을 통계 분석에 이용한다. 비정상 분포 또는 비동질 분산을 갖는 자료의 경우, 변수의 적절한 전환을 수행하고 정상 또는 분산 동질성 요건이 충족된 후에 전환된 자료를 통계 분석에 이용한다. 변수의 전환 후에도 정상 또는 분산 동질성 목적이 여전히 달성되지 않는다면, 순위 검정을 통계 분석에 이용한다.
시험 시료군의 ALT 및 AST가 모델 대조군의 것과 유의하게 상이할 경우, ALT 및 AST 결과를 각각 긍정적인 것으로 평가할 수 있다.
1.5 간의 조직병리학적 변화, 진단 기준 및 결과 평가.
1.5.1 실험 재료.
래트 간의 좌엽을 10% 포르말린으로 고정시킨다. 일상적인 병리학적 절편의 제작을 위해 간 좌엽의 중앙부의 단면으로부터 간 조직을 채취한다 (파라핀 포매, H.E. 염색).
1.5.2 현미경 관찰.
40-배 대물렌즈를 이용하여 전체 조직 절편을 연속적으로 관찰하여, 간의 한쪽 말단의 시야로부터 시작해서 세포의 병리학적 변화를 기록한다. 상기 간엽의 중심부 간세포의 퇴행성 변화 및 일부 세포의 괴사를 볼 수 있다. 주요한 병리학적 변화 유형은 풍선 변성, 지방 변성, 세포질 응축, 수포 변성 및 간세포 괴사 등이다.
1.5.3 평가 기준.
각 시야 내에서 시야 영역의 일부를 차지하는 각 병리학적 변화를 각각 기록하고 관찰한 시야 내 병리학적 변화의 총 점수를 합한다.
간세포의 풍선 변성: (세포의 팽창, 약간의 세포질이 남음)
대체로 정상 0 점
풍선 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야의 1/4을 차지함 1 점
풍선 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야의 1/2을 차지함 2 점
풍선 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야의 3/4을 차지함 3 점
풍선 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야를 차지함 4 점
간세포의 지방 변성: (뚜렷이 구분되는 지방 방울 공포가 간세포의 세포질에 나타남)
대체로 정상 0 점
지방 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야의 1/4을 차지함 1 점
지방 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야의 1/2을 차지함 2 점
지방 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야의 3/4을 차지함 3 점
지방 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야를 차지함 4 점
세포질 응축: (호산구 염색이 증가됨 )
대체로 정상 0 점
세포질 응축을 나타내는 간세포가 전체 시야의 1/4을 차지함 1 점
세포질 응축을 나타내는 간세포가 전체 시야의 2/4을 차지함 2 점
세포질 응축을 나타내는 간세포가 전체 시야의 3/4을 차지함 3 점
세포질 응축을 나타내는 간세포가 전체 시야를 차지함 4 점
수포 변성:
수포 변화를 나타내는 간세포 없음 0 점
수포 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야의 1/4을 차지함 1 점
수포 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야의 2/4을 차지함 2 점
수포 변성을 나타내는 간세포가 전체 시야의 3/4을 차지함 3 점
수포 변성을 나타내는 미만성 간세포가 전체 시야를 차지함 4 점
간세포 괴사: (세포질의 호산성 변화, 응고 괴사)
괴사 세포 보이지 않음 0 점
산발성 괴사 세포가 전체 시야의 1/4을 차지함 1 점
괴사 세포가 전체 시야의 2/4을 차지함 2 점
괴사 세포가 전체 시야의 3/4을 차지함 3 점
미만성 괴사 세포가 전체 시야를 차지함 4 점
1.5.4 자료 처리 및 결과 평가.
분산 분석을 이용하나, 분산 분석의 절차에 따라 우선 등분산성 검정을 수행해야 한다. 분산이 동질적인 경우, F 값을 계산한다. F 값이 < F0.05인 경우, 결론은 상이한 군의 평균 간의 차이가 유의하지 않다는 것이다. F 값이 ≥ F0.05 및 P가 ≤ 0.05인 경우, 몇 가지 실험군 및 하나의 대조군 간의 평균에 대한 쌍체 비교분석법을 통계 분석에 이용한다. 비정상 분포 또는 비동질 분산을 갖는 자료의 경우, 변수의 적절한 전환을 수행하고 정상 또는 분산 동질성 요건이 충족된 후에 전환된 자료를 통계 분석에 이용한다. 변수의 전환 후에도 정상 또는 분산 동질성 목적이 여전히 달성되지 않는다면, 순위 검정을 통계 분석에 이용한다.
풍선 변성, 지방 변성, 세포질 응축, 수포 변성 및 간세포 괴사를 포함한 간세포의 병리학적 변화 가운데, 시험 시료의 임의의 투여량 군에서 간세포 괴사가 모델 대조군에서와 비교하여 유의한 차이로 완화되고 다른 유형의 병리학적 변화가 모델 대조군에서와 비교하여 유의하게 완화되거나 혹은 유의한 차이가 없을 경우, 상기 동물 병리학 실험 결과는 긍정적인 것으로 평가할 수 있다.
간세포의 4 가지 유형의 병리학적 변화, 즉 풍선 변성, 지방 변성, 세포질 응축 및 수포 변성의 악화 및 완화가 유의한 차이로 동시에 존재하고 시험 시료의 임의의 하나의 투여량 군에서 간세포 괴사가 모델 대조군과 비교하여 유의한 차이로 완화된 경우, 다양한 병리학적 변화의 점수 및 괴사 점수의 2배를 합한다. 상기 총 점수를 통계 분석에 사용한다. 총 점수가 유의한 차이를 보이는 경우, 동물 병리학 실험의 결과를 긍정적인 것으로 평가할 수 있다.
1.6 결과의 평가.
두 가지 혈중 생물화학적 지표, 즉 ALT 및 AST 중 어느 하나, 및 병리학적 검사 결과는 긍정적일 것으로 예상되며, 시험 시료는 화학적 손상으로부터 간을 보호하는 데 도움이 된다고 평가될 것으로 기대된다.
프로토콜 2: 간의 알코올 손상 모델
2.1 원리.
다량의 에틸 알코올을 섭취한 후에, 에탄올 탈수소효소에 의해 촉매된 대량 탈수산기화가 트리카르복시산 사이클의 장애 및 지방산 산화의 약화를 가져옴으로써, 지방 대사 및 간세포 내 지방의 침전에 영향을 미친다. 동시에, 에틸 알코올은 산소 분자를 활성화시켜 산소 자유 라디칼의 생성을 유발함으로써 간세포막 지질의 과산화 및 체내 환원된 글루타티온의 고갈을 일으킨다.
2.2 실험 동물.
단일 성의 성체 마우스 또는 래트. 각 군은 8-12 마리 래트 (180-22O g) 또는 10- 15 마우스 (18-22 g)로 이루어진다.
2.3 실험 방법 및 절차.
2.3.1 시험 시료의 투여량 군 및 투여 기간.
세 투여량 군, 하나의 블랭크 대조군 및 하나의 모델 대조군을 설정한다. 투여량 군 중 하나의 투여량은 인간의 권장 투여량의 10 배 (마우스) 또는 5 배 (래트)이다. 필요에 따라 양성 대조군을 설정할 수 있다. 무수 에틸 알코올 (분석학적으로 순수한 것)을 사용하여 간 손상 모델을 생성한다. 무수 에틸 알코올의 농도는 50% (증류수로 희석함)이고 마우스에의 위내 투여를 위한 용량은 12-14 ㎖/kg BW (에틸 알코올 6000-7000 mg/kg BW과 동량)이다. 시험 시료의 투여 기간은 30 일이고 필요한 경우 45 일까지 연장할 수 있다.
2.3.2 시험 시료의 투여 경로.
시험 시료는 위내로 투여한다. 위내 투여가 불가능할 경우, 시험 시료를 사료 또는 마시는 물에 혼합할 수 있고, 각 동물의 사료 섭취량 및 마신 물의 양을 기록한다.
2.3.3 실험 절차.
시험 시료군 동물에는 매일 시험 시료를 위내로 투여하고, 블랭크 대조군 및 모델 대조군 동물에는 증류수를 투여한다. 매주 두 번 동물의 체중을 측정하여 시험 시료의 투여량을 체중에 따라 조절한다. 시험 시료의 투여 완료시에, 50% 에틸 알코올 12 ㎖/kg BW 단일 투여분을 모델 대조군 및 세 투여량 군의 동물에 투여하는 한편, 블랭크 대조군 동물에는 증류수를 투여한다. 16 시간 절식시킨 후, 동물을 죽여서 각종 지표 검사 및 조직병리학적 검사를 실시한다.
2.3.4 검사 지표.
간의 말론디알데하이드 (MDA), 환원 글루타티온 (GSH), 트리글리세라이드 (TG) 함량.
2.4 간 균질화물 (liver homogenate) 내 지질 과산화물 말론디알데하이드 (MDA)의 분해 산물의 측정 방법.
2.4.1 원리.
MDA는 세포막 지질의 과산화의 최종 산물 중 하나이다. MDA 함량을 측정함으로써 지질의 과산화 정도를 간접적으로 추정할 수 있다. MDA 및 티오바르비탈을 산성 조건에서 함께 가열할 경우, 분홍색 복합체가 생성되고 그 흡광도 피크는 535nm 이며, 그로부터 MDA 함량을 측정할 수 있다.
2.4.2 기구 및 시약.
기구: 721 분광광도계, 시료 마이크로-어클리케이터, 항온 수조, 일반 원심분리기, 혼합 회전기, 마개 달린 원심분리관, 조직 균질화기.
시약: 0.2M 아세테이트 완충 용액, pH 3.5:
0.2M 아세트산 용액 185 ㎖
0.2M 소듐 아세테이트 용액 15 ㎖
1 mmol/ℓ 테트라에톡실 프로판 (모액, 4℃ 에서 3 개월간 유지함), 사용 직전에 물을 이용해 40 nmol/㎖로 희석함:
8.1% 소듐 도데실 설페이트 SDS
0.8% 티오바르비탈 TBA
0.2 M 인산염 완충 용액, pH 7.4
0.2 M 인산수소이소듐 192O ㎖
0.2 M 인산이수소포타슘 48O ㎖
2.4.3 실험 절차.
2.4.3.1 시료 제작.
조직 균질화물 시료: 필요한 장기의 일정량을 생리식염수로 세척하고 닦아서 건조하고 무게를 측정하여 잘게 썬 다음 균질화기에 넣는다. 0.2 M 인산염 완충 용액을 가하고 혼합물을 2000r/분으로 10 초간 균질화한다. 원심분리를 30 초 간격으로 3회 반복하여 5% 조직 균질화물 (W/V)을 생성한다. 상기 균질화물을 3000r/분으로 5-10 분간 원심분리한 다음 측정을 위해 상청액을 취한다.
2.4.3.2 시료의 측정.
시약 블랭크 튜브 시료 튜브 표준 튜브
5% 조직 균질화물 O.1㎖
40nmol/㎖ 테트라에톡실 프로판 O.1㎖
8.1% SDS 0.2㎖ 0.2㎖ 0.2㎖
0.2 M 아세테이트 완충 용액 1.5㎖ 1.5㎖ 1.5㎖
0.8% TBA 1.5㎖ 1.5㎖ 1.5㎖
H2O 0.8㎖ 0.7㎖ 0.7㎖
혼합하여 균질화하고 60분간 수조에서 끓이고 빛을 차단하고 흐르는 물로 냉각함, 532nm 에서 비색분석
2.4.3.3 계산.
Figure 112008034208199-pct00020
지질 과산화물 함량 (nmol/100 mg 단백질) =
Figure 112008034208199-pct00021
A: 블랭크 튜브의 흡광도
B: 시료 튜브의 흡광도
F: 테트라에톡실 프로판의 흡광도
C: 테트라에톡실 프로판의 농도 (40 nmol/㎖)
K: 희석 배수
2.4.3.4 자료 처리 및 결과 평가.
분산 분석을 이용하여 자료를 분석하나, 분산 분석의 절차에 따라 우선 등분산성 검정을 수행해야한다. 분산이 동질적인 경우, F 값을 계산한다. F 값이 < F0.05인 경우, 결론은 상이한 군의 평균 간의 차이가 유의하지 않다는 것이다. F 값이 ≥ F0.05 및 P가 ≤ 0.05인 경우, 몇 가지 실험군 및 하나의 대조군 간의 평균에 대한 쌍체 비교분석법을 통계 분석에 이용한다. 비정상 분포 또는 비동질 분산을 갖는 자료의 경우, 변수의 적절한 전환을 수행하고 정상 또는 분산 동질성 요건이 충족된 후에 전환된 자료를 통계 분석에 이용한다. 변수의 전환 후에도 정상 또는 분산 동질성 목적이 여전히 달성되지 않는다면, 순위 검정을 통계 분석에 이용한다.
결과의 평가
시험 시료군의 MDA 함량은 모델 대조군의 것과 유의하게 상이하고, 따라서 상기 지표 결과는 긍정적인 것으로 평가될 것으로 예상된다.
2.5 간 균질화물 내 환원 글루타티온 (GSH)의 측정 방법.
2.5.1 원리.
GSH-Px 에 의해 촉매되는 GSH와 5,5'-디티오니트로포름산 (DTNB) 간의 반응은 황색의 5-티오-2-니트로-포름산 음이온을 생성하고 이는 423nm 파장에서 최대 흡광도 피크를 갖는다. 이 이온의 농도를 측정함으로써 GSH 함량을 계산할 수 있다.
2.5.2 시약.
0.9% 생리식염수
4% 설포살리실산 용액
0.1 mol/ℓ PBS 용액 (pH = 8.0)
Na2HPO4 13.452 g
KH2PO4 0.722 g
증류수 100O ㎖ 이하.
0.004% DTNB 용액: DTNB 40 mg을 0.1 mol/ℓ PBS 용액 100O ㎖ 에 용해함 (pH = 8.0).
소듐 아지드 완충 용액.
NaN3 16.25 mg
EDTA-Na2 7.44 mg
Na2HPO4 1.732 g
NaH2PO4 1.076 g
증류수 100O ㎖ 이하. 소량의 HCl 및 NaOH을 사용하여 pH 7.0로 조절함.
상기 용액을 4℃로 유지함.
표준 용액: 환원 GSH 15.4 mg을 칭량하고 소듐 아지드 완충 용액을 첨가하여 5O ㎖로 만들고 최종 농도를 1 mmol/ℓ로 함. 상기 용액은 사용 직전에 제조함.
2.5.3 방법.
2.5.3.1 시료의 측정.
생리식염수 5 ㎖를 간 0.5 g 에 가한다. 혼합물을 잘 갈아서 고운 되직한 액체 (10% 간 균질화물)를 생성한다. 균질화 후에 4% 설포살리실산 0.5 ㎖를 균질화물 0.5 ㎖ 에 첨가한다. 혼합 후, 혼합물을 실온에서 3000 rpm 으로 10 분간 원심분리하면 그 상청액이 시료가 된다.
시약 측정용 튜브 블랭크 튜브
시료 0.5 ㎖ -
4% 설포살리실산 - 0.5 ㎖
DTNB 4.5 ㎖ 4.5 ㎖
혼합물을 혼합하고 실온에서 10 분간 놔둔 다음 412nm 에서 그 흡광도를 측정한다.
2.5.3.2 표준 곡선.
시약 1 2 3 4 5 6
1 mmol/ℓ GSH (㎖) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
생리식염수 (㎖) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.20 0.25
DTNB (㎖) 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50
GSH 함량 (μmol/ℓ) 0 100 200 300 400 500
2.5.3.3 계산.
시료 GSH 함량 (μmol/ℓ 간 조직) = 대응하는 곡선 농도값 (μmol/ℓ)÷50 g/ℓ
2.5.4 자료 처리 및 결과 평가.
분산 분석을 이용하여 자료를 분석하나, 분산 분석의 절차에 따라 우선 등분산성 검정을 수행한다. 분산이 동질적인 경우, F 값을 계산한다. F 값이 < F0.05인 경우, 결론은 상이한 군의 평균 간의 차이가 유의하지 않다는 것이다. F 값이 ≥ F0.05 및 P가 ≤ 0.05인 경우, 몇 가지 실험군 및 하나의 대조군 간의 평균에 대한 쌍체 비교분석법을 통계 분석에 이용한다. 비정상 분포 또는 비동질 분산을 갖는 자료의 경우, 변수의 적절한 전환을 수행하고 정상 또는 분산 동질성 요건이 충족된 후에 전환된 자료를 통계 분석에 이용한다. 변수의 전환 후에도 정상 또는 분산 동질성 목적이 여전히 달성되지 않는다면, 순위 검정을 이용한다.
결과의 평가
시험 시료군의 환원 GSH 함량은 모델 대조군의 것과 유의하게 상이할 것으로 예상되고, 따라서 상기 지표 결과는 긍정적인 것으로 평가된다.
2.6 간 균질화물 내 트리글리세라이드 (TG)의 측정 방법.
2.6.1 측정 방법.
트리글리세라이드 측정 시약 키트 (글리세로포스포산 산화효소 과산화효소 방법)를 이용하여 10% 간 균질화물 내의 트리글리세라이드 함량을 측정한다. 혈청 트리글리세라이드의 측정 방법과 동일하나, 혈청 대신에 동량의 10% 간 균질화물을 사용하고 작동 설명에 따라 측정을 수행한다. 측정 결과는 mmol/g 간 중량으로 표시한다.
2.6.2 자료 처리 및 결과 평가.
분산 분석을 이용하여 자료를 처리하나, 분산 분석의 절차에 따라 우선 등분산성 검정을 수행한다. 분산이 동질적인 경우, F 값을 계산한다. F 값이 < F0.05인 경우, 결론은 상이한 군의 평균 간의 차이가 유의하지 않다는 것이다. F 값이 ≥ F0.05 및 P가 ≤ 0.05인 경우, 몇 가지 실험군 및 하나의 대조군 간의 평균에 대한 쌍체 비교분석법을 통계 분석에 이용한다. 비정상 분포 또는 비동질 분산을 갖는 자료의 경우, 변수의 적절한 전환을 수행하고 정상 또는 분산 동질성 요건이 충족된 후에 전환된 자료를 통계 분석에 이용한다. 변수의 전환 후에도 정상 또는 분산 동질성 목적이 여전히 달성되지 않는다면, 순위 검정을 통계 분석에 이용한다.
결과의 평가
시험 시료군의 TG는 모델 대조군의 것과 유의하게 상이하고, 따라서 상기 지표 결과는 긍정적인 것으로 평가될 것으로 예상된다.
2.7 간의 조직병리학적 변화, 진단 기준 및 결과 평가.
2.7.1 실험 재료.
간 좌엽의 중앙부의 단면을 잘라서 실험 재료로 취한다. 냉동 절편을 만들고 수단 III 염색으로 염색한다.
2.7.2 현미경 관찰.
간의 한쪽 말단의 시야로부터 시작하여 세포의 병리학적 변화를 기록한다. 40-배 대물렌즈를 이용하여 전체 조직 절편을 연속 관찰한다. 주된 관찰 대상은 간 내 지방 방울의 분포, 범위 및 영역이다.
2.7.3 평가 기준.
간세포 내 지방 방울이 드물고 산발적임 0 점
지방 방울을 함유한 간세포가 1/4을 넘지 않음 1 점
지방 방울을 함유한 간세포가 1/2을 넘지 않음 2 점
지방 방울을 함유한 간세포가 3/4을 넘지 않음 3 점
간 조직이 대부분 지방 방울로 대체됨 4 점
2.7.4 자료 처리 및 결과 평가.
분산 분석을 이용하나, 분산 분석의 절차에 따라 우선 등분산성 검정을 수행해야한다. 분산이 동질적인 경우, F 값을 계산한다. F 값이 < F0.05인 경우, 결론은 상이한 군의 평균 간의 차이가 유의하지 않다는 것이다. F 값이 ≥ F0.05 및 P가 ≤ 0.05인 경우, 몇 가지 실험군 및 하나의 대조군 간의 평균에 대한 쌍체 비교분석법을 통계 분석에 이용한다. 비정상 분포 또는 비동질 분산을 갖는 자료의 경우, 변수의 적절한 전환을 수행하고 정상 또는 분산 동질성 요건이 충족된 후에 전환된 자료를 통계 분석에 이용한다. 변수의 전환 후에도 정상 또는 분산 동질성 목적이 여전히 달성되지 않는다면, 순위 검정을 통계 분석에 이용한다.
시험 시료의 임의의 투여량 군에서 지방 변성이 모델 대조군에 비하여 통계적으로 차이있게 완화되고, 따라서 그 결과는 긍정적인 것으로 평가될 것으로 예상된다.
2.8 결과의 평가.
하기 조건이 충족되고, 따라서 시험 시료가 간을 알코올성 손상으로부터 보호하는 데 도움이 된다고 평가될 것으로 기대된다.
(a) 3 가지 지표, 즉 간 MDA, 환원 GSH 및 TG의 검사 결과는 긍정적이다.
(b) 3 가지 지표, 즉 간 MDA, 환원 GSH 및 TG 중 임의의 두 가지가 긍정적이고 조직병리학적 검사 결과가 긍정적이다.

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  2. 150 mg - 500 mg의 고추냉이 뿌리 섬유 분말, 200 mg - 1000 mg의 아티초크 잎 추출물, 100 mg - 500 mg의 전칠삼 추출물, 150 mg - 1000 mg의 오미자 열매 추출물 및 20 mg - 500 mg의 시금치 탈수물을 포함하며 단계 II 효소 유도 활성을 갖는, 간 건강 개선을 위한 조성물.
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  4. 150 mg - 500 mg의 고추냉이 뿌리 섬유 분말, 200 mg - 1000 mg의 아티초크 잎 추출물, 100 mg - 500 mg의 전칠삼 추출물, 150 mg - 1000 mg의 칡 뿌리 및 20 mg - 500 mg의 시금치 탈수물을 포함하며 단계 II 효소 유도 활성을 갖는, 간 건강 개선을 위한 조성물.
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