KR101332829B1 - 보중익기탕을 포함하는 폐암 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보중익기탕을 이용하여 항암제의 효과를 증대시키는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항암제를 개체에 투여하고, 30분 이내에 상기 개체에 보중익기탕을 투여하여 폐암을 치료하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, 항암제가 단독 투여될 때의 부작용을 보중익기탕의 병용투여로 현저히 완화시켰고, 세포독성이 낮으며, 항암제가 단독으로 투여됐을 경우보다 높은 항암 활성을 가지는 장점이 있다.

Description

보중익기탕을 포함하는 폐암 치료용 조성물 {Compostion comprising Bojungikkitang for treatment of Lung cancer}
본 발명은 보중익기탕을 포함하는 폐암 치료용 조성물을 제공한다.
게피티닙(Gefitinib)은 유방암과 폐암을 포함한 다양한 악성 종양의 치료제로 빈번히 사용되고 있는 대표적인 EGFR inhibitor 경구용 항암제이며, 주로 EGFR tyrosine kinase domain을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 표적 지향적 항암제로 기존의 세포 독성 항암제에 비해 독성이 매우 낮은 것으로 알려져 있다.
하지만, 피부발진, 설사, 오심, 구토, 식욕부진, 위염, 탈수, 손톱 주위염, 간 독성, 무력감, 결막염, 안검염, 간질성 폐질환, 각막 미란 및 속눈썹 탈락 등 의도하지 않은 다양한 부작용 및 gefitinib 자체 또는 조성 성분에 대한 과민반응의 문제점이 초래되고 있고, 간에서 형성된 대사체에 의한 지질 과산화의 증가와 이에 따른 항산화 방어 시스템의 손상에 의한 간 독성의 문제도 있으며, 근래에 들어서는 EGFR의 돌연변이에 의한 내성 악성 종양 세포의 출현으로 인한 내성문제도 초래되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 최근 천연물과 다양한 항산화제를 포함한 약물의 병용 투여로 게피티닙의 독성 및 내성 문제를 해결하기 위한 노력들이 시도되어 왔다(Festuccia et al., 2005; Shen et al., 2010; Lee et al., 2011; Han et al., 2012; Sylvester, 2012).
한편 보중익기탕은 한의학에서 피로회복 등에 빈번히 사용되고 있는 대표적인 보익제로, 황기(黃耆), 백출(蒼朮), 인삼(人參(白參)), 당귀(當歸), 시호(柴胡), 대추나무(大棗), 진피(陳皮), 감초(甘草), 승마(升麻) 및 생강(乾薑)의 총 10종의 천연물로 구성된 복합처방이며, 현재 면역조절, 항 알러지 및 항산화 효과가 비교적 잘 알려져 있고, 특히 최근 보중익기탕의 암환자에서 피로 회복 효과가 보고된바 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 보중익기탕을 이용하여 항암치료 효과가 증대되고, 부작용이 경감된 폐암 치료용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 항암제 및 보중익기탕을 포함하는 폐암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 항암제는 게피티닙(gefitinib)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 보중익기탕은 황기, 백출, 인삼, 당귀, 시호, 대추나무, 진피, 감초, 승마, 및 생강을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 항암제 및 보중익기탕은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로, 상기 항암제 및 보중익기탕은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로, 상기 보중익기탕의 투여기간은 상기 자극인자 투여 후 30분 이내에 시작되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제공하는 보중익기탕을 포함하는 폐암 치료용 조성물은, 항암제와 병용 투여되어, 항암 효과를 증진시키는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 조성물은, 항암제를 단독투여하여 항암치료할 경우, 빈혈, 간질환, 악액질 등의 부작용을 가지고 있었던 종래 기술상의 문제를 해결할 수 있는 새로운 대체 수단으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 게피티닙의 구조식을 나타낸 도면이다.
도 2는 보중익기탕을 5분 이내 단회 경구 병용투여하는 경우 혈중 gefitinib 농도의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 보중익기탕을 6일 동안 반복하여 투여해준 후, 나머지 9일동안 게피티닙 투여 후 5분 이내에 보중익기탕을 병용투여하는 경우 혈중 gefitinib 농도의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 14가지의 혈액학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 20가지의 혈액생화학적 검사를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 마우스를 부검하여 비장 및 악하 임파절의 모습을 촬영한 사진(상)이고, 상기 사진 상의 기준을 토대로 각 군의 변화를 관찰한 결과(하)를 나타낸 도면이다.
도 7은 비장 적색 수질의 조직병리학적 관찰 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 악하 임파절의 조직병리학적 관찰 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 임파구 증생, 간의 국소 괴사, 염증세포 침윤을 관찰하여 그 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 폐의 충혈정도를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 상기 도 5 내지 도 8의 결과를 종합한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 간 지질 과산화 정도와 항산화 물질의 함량 또는 함량의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 보중익기탕의 NCI-H520 세포에 대한 세포 생존율(A) 및 게피티닙의 NCI-520 세포에 대한 세포 생존율(B)을 나타낸 도면이다.
도 14는 실시예 2에서 각 군마다 변화하는 체중 및 증체량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 각 군별 종양의 volume(mm3) 크기 변화를 육안으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 각 군별 종양의 volume(mm3) 크기 변화를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 종양 중량의 변화를 관찰한 결과(A: 절대 중량, B: 상대중량)를 나타낸 도면이다.
도 18은 혈중 IL-6 및 IFN-γ 함량의 변화를 확인한 결과(A) 및 비장 및 복강 NK cell의 활성을 확인한 결과(B)를 나타낸 도면이다.
도 19는 비장 cytokine 함량을 살펴본 결과로, TNF-α, IL-1β 및 IL-10 함량을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 각 군에 따른 종괴 세포를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 종괴의 volume의 크기 및 apoptotic 세포 수적 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 22는 caspase-3의 면역반응세포의 수적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 23은 PARP 면역반응세포 수적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 24는 COX-2 면역반응 세포의 수적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 25는 iNOS 면역반응 세포의 수적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 26은 NF-α 면역반응세포의 수적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 27은 비장의 조직 병리학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 28은 비장의 조직병리학적 변화를 관찰하여 두께, 백색수질 직경, 및 수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 29는 악하 임파절의 조직병리학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 30은 악하 임파절의 조직병리학적 변화를 관찰하여, 두께, 피질 두께 및 피질 내 follicle 수의 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 31은 난소 주위 축적 지방을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 32는 난소 주위 축적 지방의 두께 및 백색 지방세포 평균 직경을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 폐암 치료를 위해 게피티닙을 투여할 경우 나타나는 여러가지 부작용들을 완화시킬 수 있으면서도, 항암 치료의 효과를 보다 증가시킬 수 있는 조성물을 개발하고자, 한약재에 주목하게 되었고, 상기 한약재 중 보중익기탕에 뛰어난 줄기세포 증식 및 분화 촉진 효과가 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 항암제(antitumor agent) 및 보중익기탕을 포함하는 폐암 치료용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 항암제는 종양성 질환에 사용되는 것이라면 제한이 없으나, 특히 폐암 치료에 이용되는 항암제로, 게피티닙(gefitinib)이 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 보중익기탕은 황기, 백출, 인삼, 당귀, 시호, 대추나무, 진피, 감초, 승마, 생강을 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예로, 상기 항암제 및 보중익기탕은 사전에 혼합되어 제형화 되거나, 별도로 제형화 될 수 있다.
상기 보중익기탕의 투여 기간은 상기 항암제의 투여 후 30분 이내에 수행될 수 있고, 바람직하게는 15분 이내에 수행되어야 하며, 가장 바람직하게는 5분 이내에 수행되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암제 및 보중익기탕은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 상기 보중익기탕은 경구 투여되는 것이 바람직하나, 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 및 기간 등에 따라, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에서 ‘개체’ 란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유동물을 의미한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 300 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 200 mg/체중kg으로 투여한다.
본 발명의 치료용 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 항암제 및 보중익기탕을 포함하는 폐암 치료용 조성물은 항암 치료 효과를 증대시킬 수 있는 동시에, 기존에 항암제를 단독 투여하였을 경우에 야기되었던 여러 가지 부작용들을 완화시킬 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 재료준비
본 발명의 실시예에서 사용하는 게피티닙은 Hangzhou Tacon Co., Ltd(Hangzhou, China)로부터 구입하여 사용하였으며, 그 구조를 도 1에 나타내었다.
보중익기탕은 한풍제약(Seoul, Korea)으로부터 구매하여 사용하였고, 그 성분과 양은 하기 표 1과 같다.
Herbs Scientific Names/ Produce Region Amounts (g)
Astragali Radix Astragalus membranaceus Bunge (황기) 1.33
Atractylodis Rhizoma Atractylodes lancea D.C (백출) 1.33
Ginseng Radix Alba Panax ginseng C.A. Meyer. (인삼) 1.33
Angelicae Gigantis Radix Angelica gigas N. (당귀) 1.00
Bupleuri Radix Bupleurum falcatum L. (시호) 0.67
Zizyphi Fructus Zizyphus jujuba var . inermis (Bunge) Rehder (대추나무) 0.67
Citri Unshii Pericarpium Citrus unshiu S.Marcov. (진피) 0.67
Glycyrrhizae Rhizoma Glycyrrhiza uralensis Fisch (감초) 0.50
Cimicifugae Rhizoma Cimicifuga heracleifolia Kom. (승마) 0.33
Zingiberis Rhizoma Siccus Zingiber officinale Roscoe (생강) 0.17
Total 10 types 8.00
실시예 2. Gefitinib 의 약물동력 ( pharmacokinetics )에 미치는 보중익기탕의 영향 평가 : 5분 이내 단회 경구 병용투여
2-1. 실험동물 준비
본 실시예에서는 실험 동물로 Male SD 랫트 (SLC, Japan) 를 선택하여 사용하였다. 10마리의 마우스를 총 2군으로 군 당 5마리로 하기 표 2와 같이 실험에 사용하였다.
Group Sex Dose (mg/kg/day) Animal No.
Gefitinib + BJIKT, within 5min
Active Male Gefitinib (50mg/kg; orally administration)) A01~A05
Active Male Gefitinib + BJIKT (50 + 100mg/kg; orally co-administration) B01~B05
2-2. 투여방법
50mg/kg의 gefitinib (Hangzhou Tacon Co., Ltd, Hangzhou, China)을 멸균 증류수에 용해 시켜, 5ml/kg의 용량으로 단회 경구 투여하였으며, gefitinib 투여 5분 이내에 보중익기탕 100mg/kg을 멸균 증류수에 용해시켜, 동일한 용량으로 단회 경구 투여하였다. 한편 gefitinib 단독 투여군에서는 보중익기탕 대신 동일한 용량의 멸균 증류수만 단회 경구투여하였다
약물 투여전 30분, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간에 안와 정맥총으로부터 약 0.5ml의 전혈을 50IU의 heparin (Sigma, MO, USA)이 처리된 tube를 이용하여 채취하였고, 채취 직후 13,000rpm에 10분간 원심분리하여, 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장은 -70℃ 에 LC-MS/MS 분석 전까지 보관하였다.
2-3. 실험 방법 및 결과
본 실시예에서는 투여전 30분, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간 후의 혈중 gefitinib 농도 (ng/ml) 변화를 관찰하였고, 약물동력학적 지표인 Cmax, Tmax, AUC, t1/2 및 MRT (noncompartmental pharmacokinetics data analyzer program; PK solutions 2.0; Summit, CO, USA)를 분석하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
혈중 gefitinib 농도는 분리한 plasma에서 Carbamazepine (Sigma, MO, USA)을 internal standard로 사용하여, gefitinib의 농도를 LC-MS/MS 방법으로 각각 측정하였다. Chromatographic 분석은 Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, CA, USA)를 이용하였으며, column effluent는 API 2000 triple-quadruple mass-spectometric detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
HPLC 조건은 하기와 같다:
Column: Waters Xterra MS C18 (2.1×50mm, 3.5μm) (Waters Corp., MA, USA)
Column Oven: 30 ℃
Mobile phase: Linear gradient from 2% acetonitrile/98% distilled water (0.1% formic acid) to 98% acetonitrile/2% distilled water (0.1% formic acid)
Flow rate: 0.35 ml/min
Injection Volume: 5.0 μl
LC-MS/MS 조건은 하기와 같다:
Ion source: Turbo Ion Spray (400℃)
Polarity: Positive
The multiple reaction monitoring (MRM): Carbamazepine (IS) = m/z 237>194 (Retention time: 2.4 min), gefitinib = 447>128 (Retention time: 2.3 min)
Standard Curve: Analyst 1.4.2, Quadratic (1/x, no Iterate)
Parameters Gefitinib (50mg/kg)
Without BJIKT co-administration (Distill water) With BJIKT co-administration (100mg/kg)
Tmax (hrs) 3.40 ± 1.34 3.00 ± 1.41
Cmax (μg/ml) 2.16 ± 0.76 2.54 ± 1.18
AUC0-t(hrg/ml) 14.60 ± 9.45 15.16 ± 9.87
AUC0-inf(hrg/ml) 16.39 ± 9.31 16.46 ± 9.66
t1/2(hr) 2.59 ± 0.76 2.30 ± 0.73
MRTinf(hr) 5.05 ± 0.90 4.35 ± 0.75
(1) 혈중 gefitinib 농도의 변화 확인
Gefitinib 또는 gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 각각 투여 30분 후부터 혈중에서 gefitinib 이 검출되기 시작하여, 투여후 8시간까지 검출되었다. 또한 gefitinib 단독 투여군과 비교하여 gefitinib + 보중익기탕 투여군에서 인정된 투여 2-4시간 후의 유의성 없는 혈중 gefitinib 농도의 증가 및 투여후 8시간에 인정된 유의성 없는 혈중 gefitinib 농도의 감소를 제외하고, 의미있는 혈중 gefitinib 농도의 변화는 인정되지 않았다 (도 2).
Gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 투여 후 30분, 투여 후 1, 2, 3, 4, 6 및 8시간의 혈중 gefitinib 농도가 gefitinib 단독 투여군에 비해 각각 9.68, 11.42, 17.47, 15.32, 14.94, -9.04 및 -13.99%의 변화를 나타내었다.
(2) Tmax 의 변화 확인
Gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib의 혈중 Tmax가 3.00±1.41hr로 관찰되어, gefitinib 단독 투여군의 3.40±1.34hr에 비해 -11.76%의 유의성 없는 경미한 감소를 나타내었다 (표 3).
(3) Cmax 의 변화 확인
Gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib의 혈중 Cmax가 2.54±1.18μg/ml로, gefitinib 단독 투여군의 2.16±0.76μg/ml에 비해 17.38%의 유의성 없는 증가를 타내었다 (표 3).
(4) AUC 의 변화 확인
Gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 혈중 gefitinib AUC0 -t 및 AUC0 - inf 가 각각 15.16±9.87 및 16.46±9.66hr·μg/ml로, gefitinib 단독 투여군의 14.60±9.45 및 16.39±9.31hr·μg/ml에 비해 AUC0 -t 및 AUC0 - inf 가 각각 3.82 및 0.44%의 의미 없는 변화를 나타내었다 (표 3).
(5) t 1 /2 의 변화 확인
Gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib의 혈중 t1/2가 2.30±0.73hr 로, gefitinib 단독 투여군의 2.59±0.76hr에 비해 -11.14%의 유의성 없는 경미한 감소를 나타내었다 (표 3).
(6) MRTinf 의 변화 확인
Gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib의 혈중 MRTinf가 4.53±0.75hr 로, gefitinib 단독 투여군의 5.05±0.90hr에 비해 -10.15%의 유의성 없는 경미한 감소를 나타내었다 (표 3).
실시예 2의 결과를 볼 때, 보중익기탕의 5분 이내 단회 병용투여시에는 gefitinib의 흡수 및 배설에 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었으므로, 좀더 명확한 보중익기탕과 gefitinib의 약물상호 작용을 평가하기 위해서, 보중익기탕 반복 전 투여후 gefitinib의 약물동력학에 미치는 영향을 일정 기간의 반복 병용 투여 후, gefitinib의 약물동력학에 미치는 영향을 실시예 3에서 관찰하였다.
실시예 3. Gefitinib 의 약물동력 ( pharmacokinetics )에 미치는 보중익기탕의 영향 평가 : 보중익기탕 6일 반복 경구 전 투여 및 5분이내 9일 반복 병용 경구투 여
3-1. 실험동물 준비
본 실시예에서는 실험 동물로 Male SD 랫트 (SLC, Japan)를 선택하여 사용하였다. 10마리의 마우스를 총 2군으로 군 당 5마리로 하기 표 4와 같이 실험에 사용하였다.
Group Sex Dose (mg/kg/day) Animal No.
Gefitinib + BJIKT [within 5min]
Active Male Gefitinib (50mg/kg; orally administration)) A01~A05
Active Male Gefitinib + BJIKT (50 + 100mg/kg; orally co-administration) B01~B05
3-2. 투여방법
100mg/kg의 보중익기탕을 멸균 증류수에 용해 시켜, 5ml/kg의 용량으로 매일 1회씩 16일간 반복 경구 투여하였으며, 보중익기탕 투여시작 7일 후부터 50mg/kg의 gefitinib (Hangzhou Tacon Co., Ltd, Hangzhou, China)을 멸균 증류수에 용해 시켜, 5ml/kg의 용량으로 매일 1회씩 9일간 반복 경구 투여하였다. 보중익기탕 전 투여 후 병용 투여군에서는 gefitinib 투여 후 5분이내에 보중익기탕 100mg/kg 경구 투여하였고, gefitinib 단독 투여군에서는 보중익기탕 전 투여기간 및 병용 투여기간 동안 보중익기탕 대신 동일한 용량의 멸균 증류수만을 투여하였다.
Gefitinib 초회 및 마지막 9회 투여전 30분, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간에 각각 안와 정맥총으로 부터 약 0.5ml의 전혈을 50IU의 heparin (Sigma, MO, USA)이 처리된 tube를 이용하여 채취하였고, 채취 직후 13,000rpm에 10분간 원심분리하여, 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장은 -70℃ 에 LC-MS/MS 분석 전까지 보관하였다.
3-3. 실험 방법 및 결과
혈중 gefitinib 농도 분석방법, HPLC 조건, LC-MS/MS 조건은 실시예 2와 같다.
Tmax, Cmax, AUC, t1 /2, 및 MRTinf 의 변화의 값은 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.
Parameters Gefitinib (50mg/kg)
Without BJIKT co-administration (Distill water) With BJIKT co-administration (100mg/kg)
Tmax (hrs) 4.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00
Cmax (g/ml) 3.01 ± 0.48 3.41 ± 0.15
AUC0-t(hrg/ml) 15.35 ± 2.24 15.94 ± 1.22
AUC0-inf(hrg/ml) 20.17 ± 4.61 19.19 ± 2.00
t1/2(hr) 2.82 ± 0.92 2.25 ± 0.27
MRTinf(hr) 5.94 ± 1.36 5.20 ± 0.29
Parameters Gefitinib (50mg/kg)
Without BJIKT co-administration (Distill water) With BJIKT co-administration (100mg/kg)
Tmax (hrs) 4.00 ± 0.00 3.60 ± 0.89
Cmax (g/ml) 3.12 ± 0.77 2.98 ± 0.25
AUC0 -t(hr·g/ml) 13.53 ± 2.78 14.73 ± 1.98
AUC0 -inf(hr·g/ml) 16.88 ± 4.14 17.87 ± 2.77
t1/2(hr) 2.38 ± 0.88 2.34 ± 0.33
MRTinf(hr) 5.71 ± 1.04 5.21 ± 0.44
(1) 혈중 gefitinib 농도의 변화 확인
보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 초회 및 마지막 9회 경구투여한 gefitinib 또는 gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 각각 투여 30분 후부터 혈중에서 gefitinib이 검출되기 시작하여, 투여후 8시간까지 검출되었다. 또한 보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 초회 및 마지막 9회 경구투여한 gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군과 비교하여, 초회 병용 투여 30분후에 혈중 gefitinib의 함량이 유의성 없는 경미한 증가가 관찰된 이외에 의미 있는 혈중 gefitinib 농도의 변화는 인정되지 않았다 (도 3).
보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 초회 경구투여 후, gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 투여 후 30분, 투여 후 1, 2, 3, 4, 6 및 8시간의 혈중 gefitinib 농도가 gefitinib 단독 투여군에 비해 각각 17.73, 8.93, 5.94, 1.87, 13.08, -5.87 및 -9.78%의 변화를 나타내었다.
보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 9회 반복 병용 경구투여 후, gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 투여 후 30분, 투여 후 1, 2, 3, 4, 6 및 8시간의 혈중 gefitinib 농도가 gefitinib 단독 투여군에 비해 각각 -9.93, -1.49, 4.23, -0.87, -4.68, -10.09 및 0.13%의 변화를 나타내었다.
(2) Tmax 의 변화 확인
보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 초회 경구투여 후, gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib의 혈중 Tmax가 4.00±0.00hr로 관찰되어, gefitinib 단독 투여군의 4.00±0.00hr와 동일하게 관찰되었으며, 보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 9회 반복 병용 경구투여 후는, gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib의 혈중 Tmax가 3.60±0.89hr로, gefitinib 단독 투여군의 4.00±0.00hr에 비해 -10.00%의 경미한 유의성 없는 감소를 나타냈다 (표 5 및 6).
(3) Cmax 의 변화 확인
보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 초회 경구투여 후, gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib의 혈중 Cmax가 3.41±0.15μg/ml로, gefitinib 단독 투여군의 3.01±0.48μg/ml 에 비해 13.08%의 유의성 없는 증가를 나타내었으나, 보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 9회 반복 병용 경구투여 후에도 gefitinib + 보중익기탕 투여군에서 gefitinib의 혈중 Cmax가 2.98±0.25μg/ml로, gefitinib 단독 투여군의 3.12±0.77μg/ml에 비해 -4.49%의 유의성 없는 감소를 나타내었다 (표 5 및 6).
(4) AUC 의 변화 확인
보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 초회 경구투여 후, gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 혈중 gefitinib AUC0-t 및 AUC0-inf 가 각각 15.94±1.22 및 19.19±2.00hr·μg/ml로, gefitinib 단독 투여군의 15.35±2.24 및 20.17±4.61hr·μg/ml 에 비해 각각 3.80 및 -4.86%의 유의성 없는 경미한 증감을 나타내었으며, 보중익기탕 전투여후 gefitinib을 9회 반복 병용 경구투여 한 경우에도, gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 혈중 gefitinib 의 AUC0-t 및 AUC0-inf 가 각각 14.73±1.98 및 17.87±2.77hr·μg/ml로 관찰되어, gefitinib 단독 투여군의 13.53±2.78 및 16.88±4.14hr·μg/ml에 비해 각각 8.93 및 5.85%의 의미 없는 경미한 증가를 나타내었다 (표 5 및 6).
(5) t 1/2 의 변화 확인
보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 초회 경구투여 후, gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib의 혈중 t1 /2가 2.25±0.27hr 로, gefitinib 단독 투여군의 2.82±0.92hr에 비해 -20.32%의 유의성 없는 감소를 나타내었으며, 보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 9회 반복 병용 경구투여 후에도 gefitinib + 보중익기탕 투여군에서 gefitinib의 혈중 t1 /2가 2.34±0.33hr 로, gefitinib 단독 투여군의 2.38±0.88hr에 비해 -1.83%의 의미 없는 경미한 감소를 나타내었다 (표 5 및 6).
(6) MRT inf 의 변화 확인
보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 초회 경구투여 후, gefitinib + 보중익기탕 투여군에서는 gefitinib의 혈중 MRTinf가 5.20±0.29hr 로, gefitinib 단독 투여군의 5.94±1.36hr에 비해 -12.46%의 유의성 없는 감소를 나타내었으며, 보중익기탕을 전투여한 다음 gefitinib을 9회 반복 병용 경구투여 후에도 gefitinib + 보중익기탕 투여군에서 gefitinib의 혈중 MRTinf가 5.21±0.44hr 로, gefitinib 단독 투여군의 5.71±1.04hr에 비해 -8.84%의 의미 없는 감소를 나타내었다 (표 5 및 6).
실시예 3의 결과를 볼때, 실시예 2와 유사하게 보중익기탕의 전투여는 gefitinib의 pharmacokinetics에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었으며, 9일간의 반복 병용 투여 역시 gefitinib의 경구 생체 이용률에 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
실시예 4. 보중익기탕과 gefitinib 의 병용투여실험: 보중익기탕의 gefitinib 독성 경감효과 확인
4-1. 실험 동물 준비
본 실시예에서는 실험 동물로 수컷 ICR 마우스 (Male ICR mice) 를 선택하여 사용하였다. 48마리의 마우스를 총 6군으로 군 당 8마리로 하기 표 7과 같이 실험에 사용하였다.
Group Dose (mg/kg) Animal No.
PCa004-TX: Mouse repeated oral dose toxicity test
Control Distilled water 10ml/kg M01~M08
Reference Gefitinib single (160mg/kg) M09~M16
Active Gefitinib and BJIKT (160 and 100mg/kg) M17~M24
Active Gefitinib and BJIKT (160 and 200mg/kg) M25~M32
Active Gefitinib and BJIKT (160 and 400mg/kg) M33~M40
Reference BJIKT single (400mg/kg) M41~M48
4-2. 투여방법
투여 방법은 멸균증류수를 용매로 사용하여, 10ml/kg의 용량으로 매일 1회씩 28일간 경구 투여하였다. 400, 200 또는 100mg/kg의 보중익기탕을 gefitinib 160mg/kg 투여 마우스에 5분 이내에 매일 1회씩 28일간 각각 병용 투여하였으며, 각 단독 투여군에서는 보중익기탕 또는 gefitinib 투여시 동일 용량의 멸균증류수만 투여하였고, 매체 대조군에서는 매체인 멸균증류수만 각각 5분 간격으로 2회 투여하였다.
상기 Gefitinib의 투여용량은 28일간 연속 투여시 랫트에서 간 독성을 나타내는 것으로 알려진 최소 용량인 40mg/kg(AstraZeneca Pharmaceuticals, 2005)의 4배인 160mg/kg으로 설정하였다.
28일 후 모든 실험 동물을 최종 부검하여 결과를 살펴보았다.
4-3. 체중 및 증체량의 변화 확인
Gefitinib 160mg/kg 단독 투여군에서는 투여 27일 및 28일에 각각 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 인정되었으며, 결과적으로 투여시작일~투여 14일 및 실험 전 기간 동안의 증체량 역시 매체 대조군에 비해 각각 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 감소를 나타내었다. 또한 보중익기탕 100 mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 체중의 감소가 투여 28일에 인정되었고, 보중익기탕 200mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 투여시작일~투여 14일 동안의 증체량 감소가 각각 인정되었다. 한편 gefitinib 단독 투여군에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 모든 보중익기탕 병용 투여군에서 인정되지 않았고, 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군에서는 매체 대조군과 비교하여 의미 있는 체중 및 증체량의 변화는 실험 전 기간 동안 각각 인정되지 않았다.
4-4. 장기중량의 변화 확인
Gefitinib 160mg/kg 단독 투여군에서는 투여 27일 및 28일에 각각 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 인정되었으며, 결과적으로 투여시작일~투여 14일 및 실험 전 기간 동안의 증체량 역시 매체 대조군에 비해 각각 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 감소를 나타내었다. 또한 보중익기탕 100 mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 체중의 감소가 투여 28일에 인정되었고, 보중익기탕 200mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 투여시작일~투여 14일동안의 증체량 감소가 각각 인정되었다. 한편 gefitinib 단독 투여군에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 모든 보중익기탕 병용 투여군에서 인정되지 않았고, 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군에서는 매체 대조군과 비교하여 의미 있는 체중 및 증체량의 변화는 실험 전 기간 동안 각각 인정되지 않았다.
4-5. 혈액학적 변화 확인
14개의 혈액학적 검사결과를 도 4에 나타내었다. gefitinib 단독 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 적혈구수, HGB, HCT의 감소와 함께 단핵구 비율의 증가가 각각 인정되었고, 보중익기탕 100mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 적혈구수, HGB 및 임파구 비율의 감소가 MCV, 백혈구 총수 및 단핵구 비율의 증가와 함께 관찰되었으며, 보중익기탕 200mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서도 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 적혈구수의 감소가 인정되었다. 한편 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군 및 보중익기탕 400mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군과 비교하여 의미 있는 혈액학적 변화는 인정되지 않았으며, 보중익기탕 200 또는 400mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 적혈구수, HGB 및 HCT의 증가가 단핵구 비율의 감소와 함께 관찰되었다. 또한 보중익기탕 100mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 임파구 비율의 감소가 인정되었다.
4-6. 혈액 생화학적 변화 확인
20개 혈액생화학적 검사를 수행한 결과를 도 5에 나타내었다. gefitinib 단독 투여군 및 보중익기탕 100mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) AST, ALT, globulin, LDH 함량의 증가가 albumin 및 A/G감소와 함께 인정되었고, 보중익기탕 200mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) AST, ALT 및 CPK 함량의 증가가 인정되었으며, 보중익기탕 400mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서도 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) AST 및 ALT 함량의 증가가 각각 인정되었다.
한편 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군 에서는 매체 대조군과 비교하여 의미 있는 혈액생화학적 변화는 인정되지 않았으며, 보중익기탕 200 또는 400mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해 현저한 AST, ALT, globulin, LDH 함량의 감소와 albumin 및 A/G함량의 증가가 각각 인정되었다.
4-7. 부검소견
도 6에 부검 소견 결과를 나타내었다(CG=congestion; DC=discolorization). Gefitinib 160mg/kg 단독 투여군 및 모든 세 용량의 보중익기탕과 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 현저한 비장 및 악하 임파절 종대 소견과 간 변색 소견의 정도 및 관찰 빈도 증가가 각각 인정되었으나, 보중익기탕 400mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해 현저한 비장 및 악하 임파절 종대 소견과 간 변색 소견의 정도 및 관찰 빈도의 감소가 각각 인정되었고, 보중익기탕 200mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서도 gefitinib 단독 투여군에 비해 비장 종대 소견과 간 변색 소견의 정도 및 관찰 빈도의 현저한 감소가 각각 인정되었다. 한편 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군에서는 매체 대조군과 비교하여 의미 있는 육안 부검 소견의 변화는 인정되지 않았으며, 경미한 [1+] 폐 충혈, 가슴샘 위축 및 비장 위축 소견이 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 산발적으로 관찰되었다.
4-8. 조직병리학적 관찰
Gefitinib 160mg/kg 단독 투여군 및 모든 세 용량의 보중익기탕과 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 비장 적색 수질(도 7) 및 악하 임파절 (도 8)의 임파구 증생 소견과 간의 국소 괴사 및 염증세포 침윤 소견 (도 9)의 정도 및 관찰 빈도 증가가 각각 인정되었으나, 보중익기탕 400mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해 현저한 비장 및 악하 임파절의 임파구 증생 소견과 간 변성 소견의 정도 및 그 관찰 빈도의 감소가 각각 인정되었고, 보중익기탕 200mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서도 gefitinib 단독 투여군에 비해 간 변성 소견의 정도 및 관찰 빈도의 감소가 각각 인정되었다. 한편 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군에서는 매체 대조군과 비교하여 의미 있는 육안 부검 소견의 변화는 인정되지 않았으며, 경미한 [1+] 폐 충혈 (도 10) 및 간 국소 염증세포 침윤 (도 9) 소견이 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 산발적으로 관찰되었다(도 11).
4-9. 간 지질과산화 및 항상화방어 시스템의 변화 확인
Gefitinib 160mg/kg 단독 투여군 및 모든 세 용량의 보중익기탕과 gefitinib 병용 투여군에서는 매체 대조군에 비해 현저한 간 지질 과사화의 증가 및 항산화 물질, GSH, SOD 및 catalase의 감소가 각각 인정되었으나, 보중익기탕 400 또는 200mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 지질 과산화의 억제와 항산화 물질의 함량 또는 활성 증가가 각각 인정되었다. 한편 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군에서는 매체 대조군에 비해 의미 있는 간 항산화 방어 시스템의 변화는 인정되지 않았고, 보중익기탕 100mg/kg 및 gefitinib 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군과 유사한 간 지질 과산화 및 항산화 물질의 함량 또는 활성의 변화가 관찰되었다(도 12).
상기 실시예의 결과들을 볼 때, 보중익기탕 400 또는 200mg/k의 병용투여는 gefitinib에 의한 빈혈 및 항산화방어 시스템의 장애에 의한 간 손상 소견을 현저히 억제하는 것으로 관찰되었다. 따라서 200mg/kg 이상의 보중익기탕의 병용 투여는 gefitinib의 생체 이용률에 영향을 미치지 않으면서, 간의 항산화 방어 시스템의 활성에 의해, gefitinib 투여에 의한 빈혈 및 간 독성을 현저히 감소시키는 것으로 판단되어, 폐암환자에 대한 gefitinib와 보중익기탕의 병용은 양한방 협진 및 치료에 매우 유용한 새로운 치료방법을 제공해 줄 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 5. 보중익기탕과 gefitinib 의 병용투여실험 : 보중익기탕이 NCI - H520 폐암세포 이식 누드 마우스에서 gefitinib 의 항암효과에 미치는 영향
본 실시예에서는 보중익기탕이 게피티닙의 항암효과에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 대표적인 게피티닙 내성을 나타내는 편평세포암종성 비소세포 폐암세포주인 NCI-H520을 이식한 Balb/c Slc nu / nu 마우스를 이용하여 평가하였다.
5-1. 실험 동물 준비
본 실시예에서는 실험 동물로 Balb/c Slc nu / nu 마우스 (5 주령 암컷, SLC, Shizuoka, Japan)를 선택하여 사용하였다. 73마리의 누드 마우스를 입수하여, 67 마리의 우측 둔부 피하부위에 NCI-H520 세포를 이식 14일 후 종양 volume 이 100mm3 이상 되는 이식 마우스만 선정하여, 표 8과 같이 군 당 6마리씩 7개의 군으로 하여 본 실험에 사용하였으며, 별도의 6마리의 정상 매체 대조군 역시 준비하였다. 하기 표 8과 같이 7개의 군으로 나누어 실험에 사용하였다.
Group Xenograft Dose (mg/kg/day) Animal No.
PCa003-PD: Effects on NCI-H520 cell xenograft nude mice
Control Saline Vehicle 10ml/kg M01~M06
Control NCI-H520 cells Vehicle 10ml/kg M07~M12
Reference NCI-H520 cells Gefitinib single (120mg/kg) M13~M18
Reference NCI-H520 cells BJIK single (400mg/kg) M19~M24
Active NCI-H520 cells Gefitinib and BJIKT (120 and 100mg/kg) M25~M30
Active NCI-H520 cells Gefitinib and BJIKT (120 and 200mg/kg) M31~M36
Active NCI-H520 cells Gefitinib and BJIKT (120 and 400mg/kg) M37~M42
5-2. 종양세포 이식 및 약물 투여 방법
NCI-H520 (American Type Culture Collection Center, VA, USA) 세포를 10% FBS 가 첨가된 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 계대 배양하여 유지하였으며, 1.0×108 cell/ml 이 되도록 종양세포 부유액을 만들어, 마우스의 우측 등쪽 둔부 피하에 NCI-H520 종양세포 부유액 0.2 mL (2×107 cell/mouse) 씩을 이식하여, 고형 종괴를 형성시켰다. NCI-H520 폐암 세포 주 이식 15일 (종양 volume; 100mm3 이상) 후부터 gefitinib 또는 보중익기탕을 투여하였다.
NCI-H520 폐암 세포 이식 15일 후부터, 400, 200 또는 100mg/kg의 보중익기탕을 gefitinib 120mg/kg과 5분 이내에 매일 1회씩 35일간 각각 병용 투여하였으며, 각 단독 투여군에서는 보중익기탕 또는 gefitinib 투여시 동일 용량의 멸균증류수만 투여하였고, 매체 대조군에서는 매체인 멸균증류수만 각각 5분 간격으로 2회 투여하였다.
5-3. 세포독성 확인
(1) 보중익기탕의 NCI - H520 세포생존율에 미치는 영향
매체 대조군과 비교하여 유의성 있는 (p<0.01) NCI-H520세포 생존률의 감소가 보중익기탕 0.5mg/ml 처리군에서부터 인정되기 시작하여, IC50가 102.17mg/ml로 산출되었다(도 13(A)).
보중익기탕 0.5, 1, 5, 10, 50, 100 및 500mg/ml 농도 처리군에서는 무처리 매체 대조군 (0mg/ml 처리군)에 비해 각각 -8.35, -9.21, -8.64, -12.11, -20.39, -52.43 및 -87.01%의 NCI-H520 세포 생존률의 변화를 나타내었다.
(2) Gefitinib 의 NCI - H520 세포생존율에 미치는 영향
매체 대조군과 비교하여 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) NCI-H520 세포 생존률의 감소가 gefitinib 0.01μM 처리군에서부터 인정되기 시작하여, IC50가 49.93μM (21.97μg/ml) 로 산출되었다 (도 13(B)).
Gefitinib 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 및 50μM 농도 처리군에서는 무처리 매체 대조군 (0mg/ml 처리군)에 비해 각각 -22.09, -29.64, -35.98, -37.31, -41.65 및 -53.32%의 NCI-H520 세포 생존률의 변화를 나타내었다.
따라서, 보중익기탕은 NCI-H520 세포에 대해 별 다른 세포독성을 나타내지 않았다.
5-4. 체중 및 증체량의 변화 확인
정상 매체 대조군에 비해 의미 있는 체중의 변화는 종양이식 대조군에서 전 실험 기간동안 인정되지 않았으나, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 종양 중량을 제외한 실제 체중 (actual body weight)의 감소와 실제 체중을 바탕으로 한 투여기간 동안의 증체량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 gefitinib 및 보중익기탕 단독 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 의미 있는 체중의 변화는 인정되지 않았으나, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 종양 이식 대조군 및 gefitinib 120mg/kg 단독 투여군과 비교하여, 투여 용량 의존적인 실제 체중 및 증체량의 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 증가가 인정되었다(도 14).
실제 체중을 바탕으로 한 투여기간 동안의 증체량 (35일; 실제 중량 - 투여 시작일의 체중)은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -184.92%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 68.23, 8.68, 163.92, 212.96 및 311.84%의 변화를 나타내었다.
5-5. 종양 volume 의 변화 확인
Gefitinib 단독 투여군에서는 투여 21일 후부터 종양이식 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 종양 volume의 감소를 나타내어, 투여기간 동안의 종양 volume의 변화량 역시 종양이식 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 감소를 나타내었다. 한편 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군에서도 투여 21일 후부터 종양 이식 대조군에 비해 현저한 종양 volume의 감소가 인정되었고, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 각각 투여 21, 7 및 3일 후부터 종양 이식 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 종양 volume의 감소가 관찰되었고, 특히 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 종양 volume의 감소가 보중익기탕 200 및 400mg/kg 투여군에서 각각 투여 28일 후부터 인정되었다(도 15 및 도 16).
약물 투여기간 동안의 tumor volume의 변화량 (5주; 최종 희생일의 tumor volume - 투여 시작일의 tumor volume)은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 -55.42, -39.38, -63.85, -80.05 및 -85.24%의 변화를 나타내었다.
5-6. 종양 중량의 변화 확인
보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군을 포함한 모든 약물 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 종양 상대 및 절대 중량의 감소가 인정되었다. 한편 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 120mg/kg 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 종양 중량의 감소가 인정되었고, 보중익기탕 100mg/kg 과 gefitinib 병용 투여군에서도 gefitinib 단독 투여군에 비해 유의성 없는 종양 절대 중량의 감소가 유의성 있는 (p<0.05) 상대 중량의 감소와 함께 인정되었다 (도 15 및 도 17).
종양 절대 중량은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 -39.14, -22.98, -56.77, -69.15 및 -72.12%의 변화를 나타내었다.
종양 상대 중량은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 -37.07, -21.92, -57.61, -68.59 및 -74.03%의 변화를 나타내었다.
상기 2-6 및 2-7의 결과를 살펴볼 때, gefitinib 120mg/kg 단독 투여군에 비해 현저히 우수한 종양 volume 및 종양 중량의 감소가 보중익기탕 200 및 400mg/kg 병용 투여군에서 인정되어, 보중익기탕의 병용 투여에 의해 gefitinib의 항암 효과가 현저히 증가되는 것으로 관찰되었다.
5-7. 비장 중량의 변화 확인
종양이식 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 절대 및 상대 중량의 감소가 각각 인정되었으나, 보중익기탕 및 모든 병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 중량의 증가가 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해 현저한 비장 절대 및 상대 중량의 증가가 인정되었다(도 17).
비장 절대 중량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -52.14%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 14.01, 56.42, 41.63, 57.20 및 66.15%의 변화를 나타내었다.
비장 상대 중량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -52.13%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 18.67, 60.53, 42.59, 57.45 및 58.47%의 변화를 나타내었다.
5-8. 악하임파절 중량의 변화 확인
종양이식 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 악하 임파절 절대 및 상대 중량의 감소가 각각 인정되었으나, 보중익기탕 및 모든 보중익기탕과 gefitinib병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 악하 임파절 중량의 증가가 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 악하 임파절 절대 및 상대 중량의 증가가 인정되었다(도 17).
악하 임파절 절대 중량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -81.08%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 50.00, 200.00, 142.86, 235.71 및 328.57%의 변화를 나타내었다.
악하 임파절 상대 중량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -80.84%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 56.54, 204.65, 136.35, 236.78 및 307.59%의 변화를 나타내었다.
상기 5-7 및 5-8 결과에서, NCI-H520 종양 세포 이식에 기인하는 현저한 면역억제가 인정되었으며, 면역장기의 중량 감소와 함께 조직병리학적으로도 비장 및 임파절의 임파구 감소에 의한 현저한 위축소견이 인정되었다. 한편 gefitinib 단독 투여군에서는 이러한 종양 이식 관련 면역 억제에 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰된 반면, 보중익기탕 단독 및 세 용량의 모든 보중익기탕 병용 투여군에서는 현저한 면역 활성 소견이 인정되었고, 특히 보중익기탕 400 및 200mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 현저한 면역활성 효과가 인정되었고, 이들 면역활성 효과와 잘 일치되어, 종양 중량 및 volume 감소 및 apoptosis의 증가가 인정되었으므로, 보중익기탕 병용 투여에 의한 gefitinib의 항암 효과 증가는 면역활성과 관련 있을 것으로 판단된다.
5-9. 난소주위 지방 중량의 변화 확인
종양이식 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 난소주위 지방 절대 및 상대 중량의 감소가 각각 인정되었으나, 보중익기탕 단독 투여군과 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 난소주위 지방 중량의 증가가 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 난소주위 지방 중량의 증가가 인정되었다 (도 17).
난소주위 지방 절대 중량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -86.27%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 -3.06, 151.02, 13.27, 88.78 및 127.55%의 변화를 나타내었다.
난소주위 지방 상대 중량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -85.90%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 -0.25, 155.28, 11.63, 85.80 및 113.11%의 변화를 나타내었다.
5-10. 혈중 IL -6 및 IFN -γ 함량의 변화 확인
종양이식 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 IL-6 함량의 증가와 IFN-γ 함량의 감소가 각각 인정되었으나, 보중익기탕 단독 및 모든 병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 IL-6 함량의 감소와 IFN-γ 함량의 증가가 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 IL-6 함량의 감소 및 IFN-γ 함량의 증가가 인정되었다(도 18(A)).
혈중 IL-6 함량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 583.52%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 -12.33, -39.83, -27.25, -33.96 및 -42.03%의 변화를 나타내었다.
혈중 IFN-γ 함량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -47.77%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 6.77, 32.65, 20.77, 28.44 및 36.89%의 변화를 나타내었다.
5-11. NK cell 활성의 변화 확인
종양이식 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 복강 NK cell 활성의 감소가 각각 인정되었으나, 보중익기탕 단독 및 모든 병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 현저한 비장 및 복강 NK cell 활성의 증가가 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 비장 및 복강 NK cell 활성의 증가가 인정되었다 (도 18(B)).
비장 NK cell 활성은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -73.98%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 4.93, 50.21, 33.13, 43.77 및 66.63%의 변화를 나타내었다.
복강 NK cell 활성은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -64.48%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 5.53, 66.30, 37.69, 50.20 및 74.46%의 변화를 나타내었다.
상기 결과에서, 종양 이식 대조군에서는 비장세포 및 복강 대식세포의 활성 감소가 인정되었고, gefitinib 단독 투여군에서는 NK cell의 활성에 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었으나, 모든 보중익기탕 투여군에서는 투여 용량 의존적인 복강 및 비장 NK cell활성이 인정되었고, 특히 보중익기탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) NK cell 활성의 증가가 관찰되었다.
5-12. 비장 cytokine 함량의 변화 확인
종양이식 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 TNF-α, IL-1β 및 IL-10함량의 감소가 각각 인정되었으나, 보중익기탕 단독 투여군과 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 비장 cytokine 함량의 증가가 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 비장 TNF-α, IL-1β 및 IL-10함량의 증가가 인정되었다(도 19).
비장 TNF-α 함량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -60.65%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 6.73, 76.83, 13.33, 47.43 및 79.42%의 변화를 나타내었다.
비장 IL-1β 함량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -71.90%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 8.36, 71.19, 19.66, 60.67 및 81.16%의 변화를 나타내었다.
비장 IL-10함량은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -54.88%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 5.16, 46.74, 12.80, 43.99 및 60.33%의 변화를 나타내었다.
상기 결과로부터, 사람 폐암 세포인 NCI-H520 세포의 이식에 의해 면역활성 cytokine인 TNF-α, IL-1β의 비장내 함량 및 IFN-γ 의 혈중 함량의 감소가 관찰되었으며, T 임파구 및 면역억제에 따른 면역억제성 cytokine인 IL-10의 비장내 감소 역시 인정되었다. 한편 이러한 TNF-α, IL-1β 및 IL-10 의 비장내 함량과 IFN-γ 의 혈중 함량의 감소가 모든 보중익기탕의 투여에 의해 현저히 억제되었으며, 특히 보중익기탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) TNF-α, IL-1β 및 IL-10 비장내 함량 과 IFN-γ 의 혈중 함량의 증가가 각각 인정되었다.
5-13. 조직학적 변화 확인
(1) 종괴의 조직병리학적 변화
도 20의 사진에서 볼 수 있는 것과 같이(A, B: Tumor-bearing control, C, D: Gefitinib 120mg/kg single treated mice, E, F: BJIKT 400mg/kg single treated mice, G, H: Gefitinib 120mg/kg and BJIKT 100mg/kg co-administered mice, I, J: Gefitinib 120mg/kg and BJIKT 200mg/kg co-administered mice, K, L: Gefitinib 120mg/kg and BJIKT 400mg/kg co-administered mice; 도 22 내지 도 26의 A~L도 상기 구분과 같음), 종양이식 대조군에서는 비교적 잘 분화된 NCI-H520 폐암 세포로 치밀하게 구성되어 있었으며, 일부 세포에서 apoptosis에 의한 세포질의 호산성 증가 및 핵 농축이 인정되었다.
한편, gefitinib 단독 투여군 및 세 용량의 모든 보중익기탕 병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 apoptotic 세포의 현저한 증가가 인정되었고, 결과적으로 NCI-H520 세포가 차지하는 비율 역시 현저히 감소되었으며, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 종양세포 volume의 감소 및 apoptotic 세포의 수적 증가가 인정되었다 (도 21).
또한 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군을 포함한 모든 투여군에서는 종양이식 대조군에서 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 종괴내 caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 수적 증가와 함께 COX-2 면역반응세포의 수적 감소가 인정되었으며, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 수적 증가가, 현저한 COX-2 면역반응 세포의 감소와 함께 인정되었다 (도 22-24, 도 21). 또한 모든 보중익기탕 단독 또는 병용 투여군에서는 종양 이식 대조군에 비해 현저한 종괴내 iNOS 및 TNF-α 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) iNOS 및 TNF-α 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었다 (도 25 및 도 26, 도 21).
종양 조직에서 종양세포가 차지하는 비율은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서 종양이식 대조군에 비해 각각 -36.78, -5.12, -31.15, -49.80 및 -63.69%의 변화를 나타내었다.
종양 조직에서 apoptotic 세포가 차지하는 비율은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서 종양이식 대조군에 비해 각각 131.78, 57.01, 180.37, 246.73 및 324.30%의 변화를 나타내었다.
종양 조직에서 caspase-3 면역반응세포가 차지하는 비율은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서 종양이식 대조군에 비해 각각 168.67, 42.17, 191.57, 263.86 및 349.40%의 변화를 나타내었다.
종양 조직에서 PARP 면역반응세포가 차지하는 비율은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서 종양이식 대조군에 비해 각각 125.47, 50.00, 106.60, 196.23 및 280.19%의 변화를 나타내었다.
종양 조직에서 COX-2 면역반응세포가 차지하는 비율은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서 종양이식 대조군에 비해 각각 -42.48, -17.11, -30.38, -59.29 및 -79.65%의 변화를 나타내었다.
종양 조직에서 iNOS 면역반응세포가 차지하는 비율은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서 종양이식 대조군에 비해 각각 9.02, 27.82, 39.85, 106.77 및 145.11%의 변화를 나타내었다.
종양 조직에서 TNF-α면역반응세포가 차지하는 비율은 gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서 종양이식 대조군에 비해 각각 12.63, 30.53, 41.05, 166.32 및 305.26%의 변화를 나타내었다.
Caspase-3 및 PARP는 대표적인 apoptosis 마커로, 종괴내 이들 caspase-3 및 PARP 면역반응성의 증가는 종양세포의 apoptosis를 의미한다. 상기 결과를 볼 때, gefitinib 또는 보중익기탕 투여와 관련된 caspase-3 및 PARP 면역반응성의 증가가 인정되었으며, 특히 보중익기탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 종양내 caspase-3 및 PARP 면역반응성의 증가가 각각 관찰되어, gefitinib의 항암 효과가, 200 및 400mg/kg의 보중익기탕 병용 투여에 의해 현저히 증가되는 것으로 관찰되었다.
또한, 대표적인 염증 매개체물인 prostaglandins의 합성에 중요한 역할을 하며, 종양에서 혈관신생에 관여하는 것으로 알려진 COX-2 면역반응성의 억제가 gefitinib 단독 투여군을 포함한 모든 약물 투여군에서 인정되었고, 이들 역시 보중익기탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서 gefitinib 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었다. iNOS의 활성 증가는 endotoxin, IL-1β, TNF-α 및 IFN-γ와 연계하여, shock와 과도한 염증반응을 유발하며, 종양에서 혈관신생 등 종양을 악화시키는 것으로 알려져 있으나, macrophage 등 면역활성 세포에서 분비되는 iNOS는 종양세포의 apoptosis를 유발하여, 종양의 성장 억제를 초래하는 것으로도 알려져 있다 [Xie et al ., 1995].
상기 실시예에서는 NCI-H520 세포 이식 종괴에서 현저한 iNOS 면역반응성의 증가가 모든 보중익기탕 투여군에서 인정되었으며, 특히 보중익기탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 종양내 iNOS 면역반응성의 증가가 관찰되었다. 이러한 iNOS 면역 반응성의 증가는 보중익기탕 투여에 따른 면역활성의 결과로 판단되며, gefitinib 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 종괴내 종양괴사를 촉진하는 TNF-α 면역반응성의 증가가 보중익기탕 400 및 200mg/kg 투여군에서 각각 인정되었다.
(2) 비장의 조직병리학적 변화
종양이식 대조군에서는, 정상 매체 대조군 비해 비장 백색수질 부분의 현저한 임파구 감소를 특징으로 하는 위축이 인정되어, 유의성 있는 (p<0.01) 비장 두께, 백색수질 직경 및 수의 감소가 각각 인정되었다. 한편 보중익기탕 및 모든 세용량의 병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 현저한 비장 두께, 백색수질 직경 및 수의 증가가 조직병리학적으로 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 비장 두께, 백색수질 직경 및 수의 증가가 인정되었다 (도 27, 도 28, A~C: Intact control, D~F: Tumor-bearing control, G~I: Gefitinib 120mg/kg single treated mice, J~L: BJIKT 400mg/kg single treated mice, M~O: Gefitinib 120mg/kg and BJIKT 100mg/kg co-administered mice, P~R: Gefitinib 120mg/kg and BJIKT 200mg/kg co-administered mice, S~U: Gefitinib 120mg/kg and BJIKT 400mg/kg co-administered mice).
비장 전체 두께는 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -35.23%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 -6.99, 18.08, 6.44, 24.25 및 33.56%의 변화를 나타내었다.
비장 백색수질의 수는 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -69.66%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 22.22, 103.70, 59.26, 107.41 및 133.33%의 변화를 나타내었다.
비장 백색 수질의 직경은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -49.04%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 6.51, 52.16, 14.90, 39.38 및 50.38%의 변화를 나타내었다
(3) 악하 임파절의 조직병리학적 변화
종양이식 대조군에서는, 정상 매체 대조군 비해 임파절 피질 부분의 현저한 임파구 감소를 특징으로 하는 위축이 인정되어, 유의성 있는 (p<0.01) 악하 임파절 두께, 피질 두께 및 피질내 follicle 수의 감소가 각각 인정되었다. 한편 보중익기탕 및 모든 세용량의 병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 현저한 임파절 두께, 피질 두께 및 피질내 follicle 수의 증가가 조직병리학적으로 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 임파절 두께, 피질 두께 및 피질내 follicle 수의 증가가 인정되었다 (도 29 및 도 30).
악하 임파절 전체 두께는 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -49.45%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 7.42, 71.41, 20.26, 53.10 및 93.39%의 변화를 나타내었다.
악하 임파절 피질내 follicle의 수는 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -71.01%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 15.00, 85.00, 45.00, 90.00 및 115.00%의 변화를 나타내었다.
악하 임파절 피질 두께는 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -59.19%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 16.19, 92.17, 27.11, 84.79 및 122.57%의 변화를 나타내었다.
(4) 난소주위 지방의 조직병리학적 변화
종양이식 대조군에서는, 정상 매체 대조군 비해 현저한 백색 지방세포의 크기 감소를 특징으로 하는 위축이 인정되어, 유의성 있는 (p<0.01) 축적 지방 두께 및 백색 지방세포 평균 직경의 감소가 각각 인정되었다. 한편 보중익기탕 및 모든 세용량의 병용 투여군에서는 각각 종양이식 대조군에 비해 현저한 축적 지방 두께 및 백색 지방세포 평균 직경의 증가가 조직병리학적으로 인정되었고, 특히 보중익기탕 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 각각 gefitinib 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 축적 지방 두께 및 백색 지방세포 평균 직경의 증가가 인정되었다(도 31, 도 32).
난소주위 축적 지방의 두께는 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -77.83%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 2.11, 160.76, 77.64, 150.63 및 206.33%의 변화를 나타내었다.
난소주위 백색 지방세포의 평균 직경은 종양 이식 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -61.49%의 변화를 나타내었으며, gefitinib 120mg/kg 및 보중익기탕 400mg/kg 단독 투여군, 보중익기탕 100, 200 및 400mg/kg과 gefitinib 120mg/kg 병용 투여군에서는 종양이식 대조군에 비해 각각 -7.01, 104.05, 10.90, 32.80 및 102.61%의 변화를 나타내었다.
상기 실시예 5 결과를 통해서, 보중익기탕 400 또는 200mg/kg의 병용투여는 gefitinib의 항암 효과를 면역활성을 통해 현저히 증가시키는 것으로 관찰되었으며, 종양 관련 악액질 현상 역시 현저히 억제하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 200mg/kg 이상의 보중익기탕의 병용 투여는 gefitinib의 생체 이용률에 영향을 미치지 않으면서, 면역활성에 의해, gefitinib의 NCI-H520 세포 이식 마우스에서의 항암 효과를 현저히 증가시키고, 종양 관련 약액질 현상을 감소시키는 것으로 판단되어, 폐암환자에 대한 gefitinib와 보중익기탕의 병용은 양한방 협진 및 치료에 매우 유용한 새로운 치료방법을 제공해 줄 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (6)

  1. 게피티닙(gefitinib) 및 보중익기탕을 포함하는 폐암 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 보중익기탕은 황기, 백출, 인삼, 당귀, 시호, 대추나무, 진피, 감초, 승마, 및 생강을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 게피티닙 및 보중익기탕은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 게피티닙 및 보중익기탕은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 보중익기탕의 투여기간은 상기 게피티닙 투여 후 30분 이내에 시작되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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