KR101325347B1 - 강한 백그라운드 형광의 존재 하에서 미약 신호를 측정하기위한 라만 기기 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 조직 내의 화학물질의 농도를 측정하기 위한 방법은 두 개의 측정 단계를 갖는다. 우선, 제1 광을 발생시키고 제1 광으로 조직의 일부를 조사하는 단계와, 조직으로부터 제1 반사광을 포획하는 단계와, 조직 내의 화학물질의 예상 라만 시프트 파장의 파장에 근접한 각각 상이한 파장의 광을 측정하는 복수의 광 센서로 제1 반사광을 지향시키는 단계와, 광 센서를 통과한 제1 반사광에 특정한 각각의 측정치를 각각의 광 센서로부터 획득하는 단계를 포함한다. 둘째로, 제2 광을 발생시키고 제2 광으로 조직의 일부를 조사하는 단계와, 조직으로부터 제2 반사광을 포획하는 단계와, 조직 내의 화학물질의 예상 라만 시프트 파장의 파장에 근접한 각각 상이한 파장의 광을 측정하는 복수의 광 센서로 제2 반사광을 지향시키는 단계와, 광 센서를 통과한 제2 반사광에 특정한 각각의 측정치를 각각의 광 센서로부터 획득하는 단계를 포함한다. 제1 반사광의 측정치와 제2 반사광의 측정치는 조직 내의 화학물질의 농도를 계산하기 위해 사용된다.
라만 시프트 파장, 광 센서, 제1 반사광, 제2 반사광, 캘리브레이션
Description
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 그 전체 내용이 참조로서 여기에 포함된, 발명의 명칭이 "강한 백그라운드 형광의 존재 하에서 미약 신호를 측정하기 위한 라만 기기(Raman Instrument for Measuring Weak Signals in the Presence of Strong Background Fluorescence)"인 2005년 10월 4일자로 출원된 (대리인 정리 번호 187128/US) 미국 특허 출원 제11/244,434호를 우선권 주장한다.
본 발명은 생체 조직에서 발견되는 화학 성분의 수준을 측정하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 생체 조직의 카로티노이드(carotenoid) 또는 다른 선택된 분자 수준의 비관혈적 검출 및 측정을 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
카로티노이드는 인체에 중요한 효과를 가질 수 있는 음식물로부터 섭취 가능한 식물성 안료이다. 예를 들어, 다수의 카로티노이드는 면역 기능에 긍정적인 효과를 가져서 암을 억제하는데 결정적일 수 있는 것으로 생각된다. 카로티노이드는 또한 심장 질환을 방지할 수 있는 항산화 효과를 갖는다. 또한, 몇몇 연구는 카로티노이드가 연령관련황반변성과 같은 퇴행병의 위험을 감소시키는 것을 도울 수 있다는 것을 밝혀냈다.
최근, 연구자들은 카로티노이드 (당근 내의) 알파-카로틴, (토마토와 붉은 고추와 같은 붉은 과일 및 야채 내의) 리코펜, (오렌지 내의) 베타 크립토크산틴 및 (브로콜리 및 녹색 잎 야채 내의) 루테인(lutein)과 제아잔틴(zeaxanthin)에 초점을 두고 있다. 몇몇 연구들은 이들 물질이 결핍된 사람들이 몇몇 종류의 암, 특히 폐암이 발병하기 쉽다는 것을 나타내고, 이는 이들 카로티노이드의 증가된 소비가 암으로부터 보호하고 이들 물질의 결핍의 확인은 개인에게 잠재적 건강 문제를 경고할 수 있다는 이론을 뒷받침한다. 한 연구는 특히 시금치, 브로콜리, 상추, 토마토, 오렌지, 당근, 샐러리 및 푸성귀를 포함하는 많은 야채 및 과일에서 발견될 수 있는 카로티노이드인 루테인에 주목하였다. 연구는 근 2000명의 결장암을 앓는 사람들에 대해서 수행되었고, 연구 그룹에서 루테인의 섭취가 암이 없는 사람들보다 상당히 낮다는 것을 발견하였다.
카로티노이드가 다양한 조직 내의 악성 종양의 형성에 대한 생물학적 보호를 어느 정도 제공한다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 카로티노이드는 피부, 침샘(salivary gland), 젖샘(mammary gland), 간 및 결장과 같은 조직에 암종(carcinoma)의 형성을 방지한다는 것이 동물 모델에서 나타났다. 부가적으로, 낮은 수준의 카로티노이드 및 레티노이드(retinoid)와 같은 관련 물질의 낮은 수준은 악성 장애에 대해 높은 위험 요인으로서 평가되었다. 예를 들어, 카로티노이드 리코펜의 낮은 수치는 전립선 및 경부 암과 연관되고, 카로티노이드 루테인, 제아잔틴, 알파-카로틴 및 베타-카로틴은 폐암과 연관되고, 베타 카로틴은 구강암과 연관된다. 따라서, 이들 카로티노이드, 레티노이드 및 다른 관련 물질의 화학 농도를 정량적으로 측정하는 것은 암의 위험 또는 존재의 지표를 제공한다.
피부암은 미국에서 가장 일반적인 암이다. 피부 관련 악성 종양과 관련된 화학물질 수준의 검출을 제공하기 위한 방법은 의사 및 의료 종사자에게 피부암의 조기 진단 및 치료에 큰 도움이 된다.
피부 내의 카로티노이드가 피부 종양으로부터의 생물학적 보호를 제공한다는 것이 이론화되었다. 피부암과 관련된 화학물질의 존재를 검출하는데 사용되는 종래의 방법은 주로 생체검사 또는 다른 관혈적 절차에 의해 얻어진 조직의 분석을 통한 것이다. 카로티노이드를 측정하기 위해 현재 사용되는 표준 방법은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 기술을 통한 것이다. 이러한 기술은, 수반되는 분석 및 처리를 위해 환자로부터 대량의 조직 샘플을 제거하는 것을 필요로 하고, 이는 통상적으로 완료되는데 적어도 24시간이 걸린다. 따라서, 이러한 기술은 관혈적이고 느리고 또한 고가이다.
눈의 황반 조직의 카로티노이드 수준을 측정하기 위한 비관혈적 방법은 카로티노이드 및 관련 물질의 수준이 라만(Raman) 분광법을 이용하여 측정되는 미국 특허 제5,873,831호에 개시된다. 라만 분광법은 소정의 화학 성분의 존재와 농도(적절한 캘리브레이션이 수행된 경우)를 식별할 수 있다. 근단색성 광이 측정될 샘플에 입사되고, 입사광과 상이한 파장의 비탄성적으로 산란된 광이 검출되어 측정된 다. 입사광과 산란광 사이의 파장 시프트는 라만 시프트(Raman shift)로 공지되었고, 이러한 시프트는 소정 분자의 진동 또는 회전 에너지 상태의 "지문(finger print)"인 에너지에 대응한다. 통상적으로, 분자는 몇몇 특정 라만 활성(Raman active) 진동 또는 회전 에너지 상태를 나타내고, 따라서 분자의 라만 스펙트럼의 측정은 분자의 지문을 제공하는데, 즉 특정 분자의 일련의 분광학적으로 예리한 진동 또는 회전 피크를 제공한다. 라만 산란광의 강도는 대상 분자(들)의 농도에 직접적으로 대응된다.
라만 분광법과 관련된 난점은 라만 산란광 고유의 매우 낮은 신호 강도이다. 산란광 강도는 그 파장을 4배로 상승시켜 측정되는 것으로 알려졌다. 미약한 라만 신호는, 입사광과 동일한 파장의 탄성 산란광이고 전체 산란광의 많은 부분을 구성하는 레일리(Rayleigh) 산란광과 구별되어야 한다. 라만 신호는 필터, 격자 또는 다른 파장 분리 장치를 사용하여 레일리 산란광으로부터 분리될 수 있지만, 이는 광이 파장 분리 장치를 통과할 때 발생할 수 있는 부가의 감쇠를 통해 측정된 라만 신호가 더 약화되는 효과를 가질 수 있다. 실질적으로, 라만 산란광은 검출하기 매우 어렵다. 조직 샘플의 입사광의 강도를 증가시킴으로써 라만 신호를 증가시키기 위한 시도가 있다. 광 강도를 증가시키기 위한 광원으로서 레이저가 사용되지만, 이는 샘플을 태우거나 샘플의 저하를 야기할 수 있다.
이들 몇몇 난점의 일부를 극복하기 위해, 본원에 참조된 미국 특허 제5,873,831호에 개시된 바와 같은 공명 라만 분광법을 사용하는 기술이 공지되었다. 이러한 기술은 또한 미국 특허 제4,832,483호에 개시된다. 공명 라만 분광법에서, 사용되는 입사 조사는 대상 분자의 전자 에너지 전이에 대응하는 공명 파장에 상당하는 파장을 갖는다. 이는 더 높은 강도의 입력 신호를 사용하지 않고 라만 출력 신호를 강하게 향상시키는 효과를 가져서, 레이저로 태워서 야기될 수 있는 샘플에 대한 손상을 방지한다. 또한, 이들 공명 라만 신호는 인체 조직에 손상을 주지 않는 전력 수준에서 사실상 구별되지 않는, 공명없는 라만 신호보다 더 높은 강도를 갖는다. 따라서, 공명 라만 분광법에서, 대상 종에 속한 라만 신호만이 얻어진다.
상기에서 참조된 미국 특허 제5,873,831호에서, 공명 라만 기술은 카로티노이드 루테인 및 제아잔틴의 수준을 측정하기 위해 사용되고, 이들 두 개의 화학물질은 사람 눈의 건강한 황반 조직과 관련된다. 상기에서 참조된 미국 특허 제4,832,483호는 혈장 내의 소정의 카로티노이드를 측정하기 위해 공명 라만 분광법을 사용하고, 다양한 악성 종양 질환의 존재를 나타내는 방법으로서 라만 분광 피크의 강도 비율을 이용하는 것을 제안하였다.
라만 측정법과 관련된 다른 난점은 피부의 대상 물질이 입사광을 산란할 뿐만 아니라 흡수할 수 있고, 따라서 상당한 강도로 형광을 낸다는 점이다. 이러한 형광은 종종 라만 분광 피크가 "드러나지 않게(drown out)"하거나 라만 분광 피크를 압도하는 경향이 있는 매우 강한 분광학적으로 넓은 신호를 포함하고, 물질의 식별 및 정량화의 어려움을 증가시킨다.
형광 분광법은 생물학적 조직의 화학 성분의 양을 측정하기 위해 이용될 수 있는 그 자체가 다른 기술이다. 예를 들어, 미국 특허 제5,697,373호는 경부의 조직 비정상을 검출하기 위한 형광 및/또는 라만 분광법의 사용을 개시한다. 형광 측정의 단점은 다수의 상이한 분자가 넓은 대역의 파장으로 형광하기 때문에, 이러한 측정은 특정 물질의 존재 또는 농도를 결정적으로 식별하는데 사용할 수 없다는 것이다.
미국 특허 제6,205,354호는 손의 피부 영역과 같은 영역을 여기시키도록 레이저를 이용하여 최종 산란광의 스펙트럼의 관찰을 통해 카로티노이드의 수준을 측정하는 시스템을 개시한다. 희미하지만 좁은 대역의 라만 피크는 스펙트럼의 광대역 형광 백그라운드(통상적으로 100배 이상 밝음)로부터 구별되어야 한다. 미국 특허 제6,205,354호의 시스템은 예상 라만 피크의 양측에 인접하지만 피크 부분은 아닌 스펙트럼의 부분에 대해 커브 피팅(curve fitting)을 수행함으로써 라만 피크 아래의 형광(또는 백그라운드 광) 수준을 추정하는 기술을 사용한다. 이러한 분석에 필요한 표준 분광계에 의해 조직으로부터 수집될 수 있는 광량을 크게 제한하며, 이는 분광 해상도는 시스템에 따라 결정된다. 이는 대상 조직 영역이 단지 밀리미터 크기로 작아야 할 것이 요구된다. 레이저는 라만 여기를 위해 작은 스폿으로 포커싱될 수 있는 단색광의 우수한 공급원이지만, 필요한 청색-녹색 분광 영역의 파장을 갖는 레이저는 고가이고, 다양한 물리적인 조건을 갖는 환경에서 안정적으로 유지하기 어렵다. 게다가, 피크의 양측에 대한 광의 측정에 기초한 라만 피크 아래의 백그라운드 광의 수준을 추정하는 것은 특정 하드웨어 변화에 따라 변경될 수 있는 에러의 여지가 있다.
따라서 상대적으로 큰 조직의 여기 영역을 수용하기 위해 충분한 분광 측정 감도를 갖고, 라만 피크 아래의 형광 수준의 기준선 추정 또는 레이저의 사용이 필 요없는 라만 분광법을 이용하여, 조직의 화학물질 농도를 측정하기 위한 장치 및 방법을 제공하는 것은 상당한 발전이 될 것이다. 이러한 장치는 생물학적 조직에서 변화도가 존재하는 카로티노이드 및 다른 유사한 물질의 수준의 보다 광범위하게 활용 가능한 안전하고, 비관혈성이고, 신속하고, 정확하고 특정한 측정을 달성할 수 있다.
조직의 화학물질의 농도를 측정하기 위한 방법은 두 개의 측정 단계를 갖는다. 우선, 제1 광을 발생시키고 제1 광으로 조직의 일부를 조사하는 단계와, 조직으로부터 제1 반사광을 포획하는 단계와, 조직 내의 화학물질에 대한 예상 라만 시프트 파장의 파장에 근접한 각각 상이한 파장의 광을 측정하는 복수의 광 센서로 제1 반사광을 지향시키는 단계와, 광 센서를 통한 제1 반사광에 특정한 각각의 측정치를 각각의 광 센서로부터 획득하는 단계를 포함한다. 둘째로, 제2 광을 발생시키고 제2 광으로 조직의 일부를 조사하는 단계와, 조직으로부터 제2 반사광을 포획하는 단계와, 조직 내의 화학물질에 대한 예상 라만 시프트 파장의 파장에 근접한 각각 상이한 파장의 광을 측정하는 복수의 광 센서로 제2 반사광을 지향시키는 단계와, 광 센서를 통한 제2 반사광에 특정한 각각의 측정치를 각각의 광 센서로부터 획득하는 단계를 포함한다. 제1 반사광의 측정치와 제2 반사광의 측정치는 조직 내의 화학물질의 농도를 계산하기 위해 사용된다.
여러 실시예가 개시되지만, 본 발명의 도식적인 실시예를 도시하고 설명하는 이하의 상세한 설명으로부터 해당 기술 분야의 종사자들에게 본 발명의 다른 실시예 또한 명백하게 될 것이다. 구체화되는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 사상과 범주로부터 벗어나지 않는 모든 다양한 명백한 태양의 변경이 가능하다. 따라서, 도면 및 상세한 설명은 단지 도시만을 위한 것이고 이에 제한되지 않는다.
도1은 장치의 기본 광 취급 컴포넌트의 개략도이다.
도2는 장치, 제어 컴퓨터 및 전원 공급원의 전방으로부터 본 개략도이다.
도3은 분광기의 주 컴포넌트용 내부 하우징의 후방으로부터 본 도면이다.
도4는 장치의 주 컴포넌트용 내부 하우징의 평면도이다.
도5는 장치의 주 컴포넌트용 내부 하우징의 전방으로부터 본 도면이며 냉각 팬과 지지 컴포넌트용 상부 회로 보드의 위치를 도시한다.
도6은 장치의 주 컴포넌트용 내부 하우징의 후방으로부터 본 도면이며 냉각 팬과 지지 컴포넌트용 하부 회로 보드의 위치를 도시한다.
도7은 장치의 주 컴포넌트용 내부 하우징의 좌측면도이다.
도8은 장치의 주 컴포넌트용 내부 하우징의 우측면도이다.
도9는 장치 외부의 전방으로부터 본 도면이다.
도10은 장치 외부의 후방으로부터 본 도면이다.
도11은 장치 외부의 후면도이다.
도12는 장치 내부의 좌측으로부터의 단면도이다.
도13은 장치 내부의 상부로부터 본 내부도이다.
도14는 장치 내부의 후방으로부터 경사지게 본 내부도이다.
도15는 장치와 함께 사용되는 방법의 고수준 흐름도이다.
도16은 장치와 함께 사용되는 필드 캘리브레이션 공정의 흐름도이다.
도17은 장치와 함께 사용되는 필드 캘리브레이션 공정의 자동 튜닝부의 흐름도이다.
도18은 조직 측정의 판독치를 수집하기 위해 사용되는 데이터 수집 및 최초 계산의 흐름도이다.
도19는 최종 라만 산란값을 생성하기 위해 분석되는 측정치를 제공하기 위해 필요한 두 개의 스캔을 수행하기 위한 단계들의 흐름도이다.
도20은 비율값을 이용하여 구성된 포물선 곡선과 두 개의 상이한 여기 파장에서 측정하기 위한 PMT 비율의 그래프를 도시하는 챠트이다.
살아있는 피부와 같은 생체 조직 또는 타겟 샘플에서 카로티노이드 및 다른 관련 물질 또는 다른 선택된 분자의 수준을 측정하기 위한 방법 및 장치가 제공된다. 장치는 여기부, 분석부 및 캘리브레이션부를 포함한다. 장치는 조직 내의 카로티노이드(카로티노이드의 이성체 및 대사 산물을 포함) 및 유사한 물질의 수준을 비관혈적이고, 신속하고, 안정하고 정확하게 결정할 수 있다. 이러한 정보는 카로티노이드 또는 다른 항산화 성분이 유용한 정보를 제공할 수 있는 상태의 마커일 수 있다.
본 발명의 기술로 비관혈적으로 측정되는 생물학적 조직의 예는 손의 인체 피부를 포함한다. 측정은 또한 경부, 결장 및 폐에서 이루어질 수 있는 것으로 예 상된다. 적절한 샘플 제공 액세서리의 추가로, 측정 가능한 신체 액체는 타액, 혈액 및 점액을 포함할 수 있는 것으로 예상된다.
본 방법의 개요
본 방법 및 장치는 피부와 같은 생물학적 조직 내에서 카로티노이드 및 유사한 물질 또는 다른 선택된 분자의 식별 및 정량화에 사용되는 공명 라만 분광법을 사용한다. (예를 들어 발광 다이오드로부터의) 단색성 또는 근단색성 여기광이 조직 또는 다른 타겟 상으로 지향된 후, 산란광이 분광학적으로 필터링되어 검출된다. 이러한 공정은 타겟에 충돌하는 특징 파장의 광이 여기될 때 타겟 내의 소정의 분자 구조가 상이한 특정 파장의 광을 방출할 것이라는 전제에 기초한다. 분자 구조에 의해 방출된 비탄성 산란 광자의 강도, 라만 방출은 단색 여기 공급원의 파장으로부터의 파장 분리 또는 라만 시프트의 함수이다. 예를 들어, 473.0 ㎚의 광에 노출될 때, 카로티노이드 내의 카본 대 카본 공액 이중 결합은 509.8 ㎚의 광을 방출할 것이다.
이하에서 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 대략 473.0 ㎚의 근단색성 여기광이 타겟으로 지향될 것이다. 타겟으로부터 산란광이 방출되고, 이는 레일리 및 라만 산란광을 모두 포함하고 또한 타겟으로부터의 형광도 포함한다. 레일리광은 탄성 산란된 (또는 입사 여기광과 동일한 파장으로 산란된) 광이다.
비탄성 방식으로 산란되어 입사 여기광과 상이한 파장을 갖는 광의 작은 잔여부의 일부는 라만 신호를 형성한다. 광원이 473.0 ㎚의 광으로 카로티노이드를 여기하면, 카로티노이드는 509.8 ㎚에서 중심을 갖는 라만 신호를 방출하고, 그 강 도는 조직 내의 카로티노이드의 양과 관련된다. 레일리 및 라만 산란광은 파장이 분리된다. 대부분의 여기 광은 또한 타겟에서 흡수되어 타겟으로부터 형광 방출된다. 라만 측정의 난점은 라만 신호보다 통상적으로 100배 강한 509.8 ㎚ 부근의 이러한 불명료한 비라만 형광 컴포넌트를 제거하는 것이다. 라만 신호의 분석은 측정으로부터 백그라운드 광(형광 및 레일리 방출)을 제거하는 단계를 포함한다.
여기광과 라만 산란광 사이의 파장은 라만 시프트로서 공지되고, 통상적으로 파수(wave number) 또는 파장의 차이로 측정되고, 대응하는 파장 시프트 내로 변환될 수 있다. 라만 시프트는 사용되는 입사광의 파장에 독립적이다. 따라서, 예를 들어 여기 파장이 473.0 ㎚이면, 카로티노이드 분자에 대한 라만 피크는 509.8 ㎚에서 발생되는 반면, 여기 파장이 471.3 ㎚이면, 라만 피크는 507.8 ㎚에서 발생된다. 여기광의 파장으로부터의 시프트 양은 존재하는 분자의 유형을 나타내고, 라만 피크의 강도는 시프트를 야기하는 존재하는 분자의 농도에 직접적으로 대응된다. 전술한 바와 같이, 특정 파수의 시프트는 이들 화학적인 구조의 소정 진동 또는 회전 모드에 대응한다. 따라서, 대략 471.3 ㎚ 및 473.0 ㎚의 여기 광을 제공하는 광원에 대한 방법 및 장치가 설명되었지만, 넓은 범위의 여기 파장은 대응하는 파장 시프트와 대략 동일하게 작동한다.
전술한 바와 같이, 짧은 가시 파장을 사용하는 조직의 라만 분광법은 특히 피부 조직에서 미약한 라만 신호를 가려버리는 매우 높은 네거티브의 형광 때문에 복잡하게 된다. 백그라운드 형광(라만 신호보다 적어도 50배이고 통상적으로 100배 밝음)으로부터 라만 신호를 구별하기 위해, 백그라운드 형광의 제거를 가능하게 하는 두 개의 측정이 이루어진다. 제1 측정에서, 조직은 473.0 ㎚의 여기 파장에 단순히 노출된다. 제2 측정에서, 조직은 471.3 ㎚의 여기 파장에 노출된다. 두 개의 파장 사이의 정확한 분리는 정확한 파장값이 주용하지 않는 것과 같이 중요하지 않다. 따라서, 파장들 사이의 다른 파장 및/또는 다른 분리가 사용될 수 있다. 일반적으로, 서로 접하거나 인접하지만 필터(예를 들어, 이하에서 설명되는 여기 대역 여파기 및 PMT 대역 여파기를 포함)의 대역폭으로 인해 병합되지 않도록 충분히 이격된 두 개의 여기 파장을 갖는 것이 바람직하다. 상술한 특정 실시예에서, 여기 필터들은 0.8 ㎚의 필터 폭을 갖고 1.7 ㎚ 이격되어 있다. 이는 라만 피크가 여기 필터의 대역폭으로 인해 약간 넓어진 2 ㎚로 이격된 두 개의 여기 파장에 대응한다. 라만 광을 관찰하도록 설계된 PMT의 전방의 대역 여파기는, 피크가 추가로 넓어지는 것을 효과적으로 안내하는 1 ㎚의 대역폭을 갖는다. 파장 분리는 바람직하게는 필터의 대역폭의 제한 내에서 가능한 엄격하게 한다. 또한, 바람직하다면, 필터 분리는 예를 들어 3 ㎚로 넓게 할 수 있다.
조직으로부터 방출된 광은 조직에서 검출된 광의 변형이 비교적 작기 때문에 제1 및 제2 측정의 형광 수준과 유사하게 나타난다. 예를 들어 505.8 ㎚, 507.8 ㎚, 509.8 ㎚ 및 511.8 ㎚인 라만 신호 피크 부근의 파장 또는 이를 포함하는 몇몇 파장으로 방출된 광은 473.0 ㎚와 471.3 ㎚인 각각의 여기 파장에 대해 측정된다. 즉, 4개의 방출 샘플은 약 505 ㎚ 내지 약 512 ㎚의 파장 범위로 취해진다. 파장 범위와 특정 샘플링 파장은 선택된 분자 및 각각의 여기 파장과 관련된 특징 방출 파장(Fc) 또는 그 부근의 값을 포함하도록 선택되고, 적어도 하나의 샘플은 특징 파장(Fc)에 인접하지만 이러한 여기 파장용 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외하기 위해 그 파장 아래로 충분히 떨어져 있고, 적어도 하나의 샘플은 특징 파장(Fc)에 인접하지만 이러한 여기 파장용 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외하도록 그 파장 위로 충분히 떨어져 있다. 이후에 이러한 측정은 조직에서 카로티노이드(이러한 라만 시프트와 관련된 화학물질)의 농도를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 보다 상세하게는, 이후에 두 개의 여기 파장으로 조직으로부터 방출되는 개별 파장의 측정치는 이들 자신으로 나누어진다. 이러한 측정치는 두 개의 여기 파장에 대해 거의 동일하기 때문에, 라만 신호 피크 파장에 근접하여 관찰된 각각의 파장의 비율은 1에 근접한다. 이러한 방식으로, 강한 형광 백그라운드뿐만 아니라 검출기 반응의 변화성이 이러한 나누어짐으로 의해 제거된다. 그러나, 카로티노이드에 의한 라만 피크는 두 개의 여기 파장에 대해 상이한 파장으로 발생하기 때문에, 나누어지지 않는다. 따라서, 이러한 방법 및 장치를 사용하여, 카로티노이드 수준은 강한 고유 형광의 존재 하에서도 결정될 수 있다.
장치의 개요
장치는 카로티노이드의 특징인 파장 시프트를 갖는 라만 반응을 생성하는 파장의 광을 발생시킨다. 장치는 통상적으로 대략 470 및 475 ㎚ 사이에서 선택되는 두 개의 여기 파장으로부터 야기된 방출광의 측정을 수행하는 컴포넌트를 갖고, 조직 또는 다른 타겟 상에 상기 광을 지향하지만, 다른 파장 또한 사용될 수 있다. 조직으로부터의 탄성 및 비탄성 산란광과 형광이 수집되고, 이때 비탄성 산란광은 특징 에너지 시프트와 조직의 카로티노이드에 대응하는 라만 신호를 생성하는 정량 화 가능한 강도를 갖는다. 라만 신호를 형성하는 비탄성 산란광의 강도는 두 개의 측정치의 분석을 통해 정량화된다.
광 취급 컴포넌트
도1은 장치(10)의 컴포넌트를 개략적으로 도시한다. 장치(10)는 여기부(12), 분석부(14) 및 캘리브레이션부(16)를 포함한다. 여기부(12)는 조직 또는 다른 타겟이 노출되는 광을 발생시킨다. 분석부(14)는 타겟으로부터 복귀되는 광을 수신하고 특정 파장의 광량을 측정한다. 캘리브레이션부(16)는 미가공 데이터를 분석하기 위해 사용될 수 있는 데이터를 수집하고 카로티노이드의 양의 최종 측정치를 계산한다. 컴퓨터(도1에는 도시 안함)는 장치(10)를 제어하고 분석을 수행하기 위해 사용된다. 모든 미가공 데이터를 수신한 후에 최종 카로티노이드 수준값의 계산은 컴퓨터에서 또는 미가공 데이터를 수집하는 것을 돕는 장치 내에 상주하는 프로세서에서 수행될 수 있다. 후자에서, 소량의 분석된 데이터와 결과는 표시 또는 저장을 위해 컴퓨터에 통신될 수 있다. 데이터 분석 위치는 방법적으로 중요하지 않다.
여기부(12)는 두 개의 광원(20, 22)을 포함한다. 광원(20, 22)은 예를 들어 발광 다이오드(LEDs)를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, LED(20, 22)는 유사하고, 470 내지 475 ㎚의 파장을 포함하는 파장 범위에서 발광한다. 두 개의 상이한 특정 파장을 획득하기 위해, 각각의 광원(20, 22)으로부터의 광은 관련된 비구면 시준 렌즈(28, 30)와 협대역 광학 필터(24, 26)를 통과한다. 시준 렌즈와 광필터는 단지 예시적인 광학 컴포넌트 및 포커싱 구조이며, 타겟에 도달하는 광이 원하는 품질을 가지는 한 다른 것들이 사용될 수 있거나 이들이 사용되지 않을 수 있다. 따라서, 예를 들어 제1 광원(20)으로부터의 광은 473.0 ㎚의 협대역 광학 필터(24)를 통과한다. 제2 광원(22)으로부터의 광은 471.3 ㎚의 협대역 광학 필터(26)를 통과한다. 그러나, 본 발명은 이들 파장 내에서 발생된 광으로 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 광원은 LED일 필요는 없고, 이들은 예를 들어, 두 개의 개별 파장으로 방출되는 레이저일 수 있다.
제1 광원(20)으로부터의 시준된 광은 비임스플리터(32)를 타격하고 이를 통과하여 진행하는 반면, 제2 광원(22)으로부터 시준된 광은 동일한 비임스플리터(32)의 대향측을 타격하여 이로부터 반사된다. 도시된 실시예에서, 비임스플리터는 50:50 비임스플리터이다. 이는 광의 절반의 비용(expense)으로 두 개의 광원으로부터의 광을 공통 광로 상에 지향시킨다. 비임스플리터(32)는 광로를 확립하고 광원(20, 22)으로부터의 광을 타겟으로 지향시키도록 작동할 뿐이고, 시준된 광로로 그리고 시준된 광로로부터 이동하는 두 개의 협대역 필터를 갖는 단일 광원 또는 광섬유와 같은 다른 수단에 의해 조직에 광이 지향되는 실시예에서는 제공될 필요가 없다. 이어서 광은, 생성되는 라만 신호의 이웃의 파장을 갖는 광을 광원으로부터 보다 완전하게 제거하도록 사용되는 여기 블로커(36)를 통과하여 진행한다. 여기 블로커는 대상 파장 이외의 파장을 차단한다. 보다 상세하게는, 여기 블로커는 조직으로부터 수집되는 파장을 차단한다. 따라서, 예를 들어 조직으로부터 반사된 광이 시안색(cyan) 광을 포함하면, 시안색 광은 여기 블로커에 의해 차단된다. 광다이오드(38)는 광원의 강도를 모니터하기 위해 사용되고, 50:50 비임 스플리터에 의해 폐기되는 광을 관찰하고, 발생할 수 있는 광원의 강도 변화를 보정하기 위한 캘리브레이션(calibration) 공정에서 통합될 수 있다. 그 다음에 두 광원(20, 22)으로부터 시작된 광은 여기 파장의 광에 대해 높은 반사성을 갖지만 생성되는 예상 라만 피크 부근의 파장에 대해서는 우수한 투과성을 갖도록 설계된 이색성(dichroic) 비임스플리터(34)에 의해 반사된다.
이색성 비임스플리터(34)에 의해 반사된 여기광은 축(60)을 따라 진행하고 광이 조직에 도달하기 전에 비임 균질기(homogenizer)로서 제공되는 도광 로드(40)의 단부의 비구면 집광 렌즈(61)에 의해 포커스된다. 이는 측정에 오류를 일으킬 수 있는 광 필터와 광원의 변화로부터의 영향을 제거한다. 로드(40)는 조직 또는 조직 내로 광을 지향시키고 조직의 스폿을 조사한다. 일 실시예에서 로드(40)는 대략 2 ㎜의 직경의 스폿을 조사하는 유리 로드이다. 도2 및 도12를 참조하여 알 수 있는 바와 같이, 로드(40)는 로드(40)가 조직 또는 타겟(13)과 접촉하는 것을 보장하기 위해 장치(10)의 개구(71)를 약간 지나서 연장될 수 있다. 조직 또는 타겟(13)은 예를 들어 도1에 도시된 바와 같이 손일 수 있다.
광로의 컴포넌트[예를 들어 비구면 집광기(28, 30) 및 로드(40)]는 그 표면에서의 반사를 감소시키기 위해 반사방지 코팅을 가질 수 있다.
조직으로부터 복귀된 방출광은 로드(40)를 통해 중심 광축(63)으로 다시 진행하고 비구면 집광기와 이색성 비임스플리터(34)를 통해 분석부(14)로 진행한다. [광 복귀축(63)은 도1에서 중심축(60)과 분리되어 도시되고, 이는 설명을 위한 것이며, 축(60)과 축(63)은 실질적으로 일치한다.] 방출 블로커(41)는 장치(10)의 분석부(14)에서 사용되는 파장들을 파악(span)하도록 광의 분광물(spectral content)을 제한한다. 도시된 실시예에서, 광은 방출 블로커(41)를 통과하고 이는 여기 파장에서 레일리 산란광을 감소시킨다. 이어서 광은 색유리 필터(43)를 통해 지향될 수 있다. 색유리 필터는 분광 블로커이고 레일리 산란광을 흡수하도록 제공될 수 있다. 색유리 필터의 통과대역은 분석부의 센서에 의해 측정되는 파장을 투과시키도록 충분히 넓다. 분석부(14)는 피부의 카로티노이드의 특징 파장과 같은 대상 범위의 몇몇 파장에서 방출광의 강도를 측정할 수 있는 광 검출 시스템으로 광을 지향시킨다. 도시된 실시예에서, 광 검출 시스템은 광전자 배증관(photomultiplier)과 같은 복수의 개별 고감도 광검출기로 구성된다. 충분한 이득과 낮은 노이즈 수준을 갖는다면 전자 사태(avalanche) 광다이오드, CCD(전하결합소자; charge coupled device) 검출기 어레이 또는 강화 CCD 검출기와 같은 다른 고감도 장치가 채용될 수 있다.
도시된 실시예에서, 광 검출 시스템은 4개의 광전자 배증관(PMTs)(42, 44, 46, 48)을 포함한다. 광은 분할되어 각각의 PMT로 대략 동일한 양이 지향된다. PMT는 형광 분광법과 같은 저감도 응용예에서 유용한 광 검출기이다. 높은 내부 이득 때문에, PMT는 높은 감도로 낮은 수준의 광을 측정할 수 있는 능력을 갖는다. 광전자 배증관은 일반적으로 소기된 유리 인클로저 내에 일련의 다이노드(dynodes)와 광음극을 포함한다. 광전자 방출 음극을 타격하는 광자는 광전 효과에 의해 전자를 방출한다. 전자는 다이노드 체인을 통해 가속되고 종속 효과가 제1 음극을 타격하는 각각의 광자용으로 105 내지 107의 전자를 생성한다.
비임 스플리터는 각각의 PMT(도1에서 PMT0 내지 PMT3)와 연계되어 제공되어, 중심축(63)을 따라 지향된 광이 PMT(42, 44, 46, 48)에 동일하게 분배된다. 따라서, 도시된 실시예에서, 4개의 비임 스플리터(50a 내지 50d)가 제공된다. 분석기 필터(54)와 포커싱 렌즈(52)는 각각의 비임 스플리터(50a 내지 50d)로부터 각각의 PMT(42, 44, 46, 48)까지의 광로 내에 제공된다. 포커싱 렌즈(52)는 PMT의 활성 영역 상에 광을 포커싱하는 프레넬(fresnel) 렌즈일 수 있다. 각각의 필터(54)는 특정 파장의 광만을 통과시키는 대역통과 필터이다. 제1 비임 스플리터(50a)는 PMT0(42)으로 광의 1/4을 전환시킨다. 제2 비임 스플리터(50b)는 PMT1(44)로 전체 방출광의 1/4을 제공하도록 잔여 광의 1/3을 전환시킨다. 제3 비임 스플리터(50c)는 PMT2(46)로 전체 방출광의 1/4을 제공하도록 잔여 광의 1/2을 전환시킨다. 제4 비임 스플리터(50d), 즉 미러는 PMT3(48)으로 전체 방출광의 1/4을 제공하도록 잔여광 전부를 전환시킨다. 이러한 방식으로 PMT(42, 44, 46, 48)는 각각 방출광의 동일한 부분의 강도를 측정할 수 있고, 각각 관련된 대역통과 필터의 사용에 의해 대상 파장의 범위의 특정부를 측정할 수 있다. 이러한 접근법으로, 활용 가능한 광의 대부분(large fraction)이 비교적 소수의 검출기에 대해 활용 가능하게 되고, 측정되는 특정 파장에서 개선된 감도를 제공한다. 또한, 4개의 검출기의 상대 감도는 이러한 방법 및 장치에 대해서는 중요하지 않고, 광에 대해 초고감도인 PMT를 사용하는 것을 가능하게 한다.
각각의 PMT(42, 44, 46, 48)는 광원(20, 22)에 의해 방출된 광에 기초하여 카로티노이드에 대한 라만 신호의 파장에 근접한 광의 상이하고 특정한 파장에 노출되고이를 측정한다. 따라서, LED(20, 22)가 471.3 내지 473.0 ㎚의 파장의 광을 방출하면, 분석기 필터(54)는 505.8, 507.8, 509.8 및 511.8 ㎚를 중심에 둘 수 있다. 특정 실시예에서, 각각의 필터(54)는 1 ㎚ 통과대역폭을 갖는다. 그러나, 다른 통과대역폭과 다른 중심 파장이 사용될 수 있다. 따라서, 제1 PMT(42)는 505.8 ㎚의 광을 측정할 수 있고, 제2 PMT(44)는 507.8 ㎚의 광을 측정할 수 있고, 제3 PMT(46)는 509.8 ㎚의 광을 측정할 수 있고, 제4 PMT(48)는 511.8 ㎚의 광을 측정할 수 있다.
각각의 PMT로부터의 출력은 조직 내에 존재하는 카로티노이드의 수준을 결정하기 위해 장치의 분석 컴포넌트와 통신한다. 특정 실시예에서, 각각의 PMT의 출력은 초당 3000회 샘플링되고 아날로그 대 디지털 컨버터를 통과하여 진행한다. PMT 출력은 0 내지 10 볼트의 범위의 값을 갖는 전압으로서 분석 컴포넌트와 통신한다. 이러한 전압은 PMT가 노출되는 광량과 관련된다.
측정은 다음과 같이 실시된다. 471.3 ㎚로 필터링된 광원이 켜지고 조직 샘플에 조사되어 원치않는 강한 형광 백그라운드 광량뿐 아니라 507.8 ㎚의 라만 신호가 발생된다. 4개의 PMT는 샘플로부터 발생되어 방출되는 예상 라만 시프트 파장에 근접한 파장을 측정한다. 예를 들어, 4개의 PMT들은 각각 505.8 ㎚의 광, 507.8 ㎚의 광, 509.8 ㎚의 광 및 511.8 ㎚의 광을 측정할 수 있다. 이러한 광의 대부분은 형광이다. 그러나, 507.8 ㎚의 광을 관찰하는 PMT는 라만 신호에 의한 소량의 부가의 광을 찾아낸다. 측정 인터벌 동안 각각의 PMT의 평균 판독이 얻어지고 기록된다. 그 후, 471.3 ㎚로 필터링된 광원이 꺼지고 473.0 ㎚로 필터링된 광원이 켜진다. 측정은 반복된다. 각각의 PMT에서 관찰되는 형광 수준은 유사하지만, 509.8 ㎚를 측정하는 PMT에서 부가의 광으로서 소량의 라만 신호가 나타난다. 이러한 측정 시퀀스는 PMT의 평균 판독에서 노이즈를 감소시키도록 반복되고 평균이 구해질 수 있다(전체 8회 판독, 각각의 PMT는 각각의 광원으로 샘플에 조사하는 동안 판독됨). 다음에, 샘플의 471.3 ㎚ 조사로 얻어진 4개의 PMT 판독은 각각 샘플의 473.0 ㎚ 조사로 얻어진 4개의 PMT 판독으로 나누어진다. 4개의 PMT 판독의 2개의 그룹이 형광에 의해 압도되고 매우 유사하기 때문에, 이는 그 값이 1에 가까운 4개의 수를 생성한다. 그러나, 507.8 ㎚의 광을 관찰한 PMT에서 생성된 수는, 제1 측정에서의 초과 라만 신호 때문에 예를 들어 1.005와 같이 1보다 약간 클 것이고, 509.8 ㎚의 광을 관찰한 PMT에서 생성된 수는 제2 측정에서의 초과 라만 신호 때문에 예를 들어 0.995와 같이 1보다 약간 작을 것이다. 1과의 이러한 차이는 샘플의 형광에 대한 라만 피크의 비율을 나타낸다. 형광의 평균 수준의 이어진 곱은 샘플의 카로티노이드 분자량에 비례하는 수를 산출한다.
전술한 측정 설명은 471.3 ㎚로 필터링된 제1 광원과 473.0 ㎚로 필터링된 제2 광원에 특화되었지만, 광원이 임의의 적합한 파장으로 필터링될 수 있다는 것은 명백하다.
캘리브레이션부(16)는 인가된 전압의 변화 또는 온도 변화로 발생하는 드리프트(drift)의 영향을 제거하기 위해 PMT 반응의 캘리브레이션 전용으로 사용되는 광을 방출하는 광원(23)을 포함한다. 광원(23)에서 방출된 광의 파장은 일반적으로 분석부(14)에 의해 처리하도록 조직으로부터 수광되는 것으로 예상되는 광의 파장에 대응한다. 따라서, 광원(23)으로부터 방출된 광은 대략 505 ㎚ 내지 대략 512 ㎚의 범위의 LED 광일 수 있다. 광은 필터(56)를 통과한다. 필터(56)는 예를 들어 중성 농도 필터(neutral density filter)를 포함할 수 있다. 중성 농도 필터(56)는 라만 측정에서 조직으로부터 복귀하는 광에 비견되는 유사한 수준으로 광의 출력을 감소시킨다. 광다이오드(58)는 캘리브레이션부(16)에 제공된다. 광다이오드는 캘리브레이션광이 통과하는 캐비티 내에서 광을 측정한다.
광원(23)으로부터의 광은 광 비임 운반 시스템을 통해 중심 광축으로 그리고 분석부(14)쪽으로 지향된다. 광 비임 운반 시스템은 측정되는 PMT로 광을 지향하기 위한 광학 구성 요소들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 광 비임 운반 시스템은 505 내지 512 ㎚ 범위의 광을 투과시키도록 설계되었지만 소량의 광을 반사하는 이색성 미러(34)를 포함한다. 따라서, 광원(23)으로부터의 광은 필터(56)를 통과하고 중심 광로(60) 상의 이색성 미러(34)에 의해 분석부(14)로 지향된다.
도2 내지 도8은 도1에 개략적으로 도시된 컴포넌트를 구체화하는 상업용 제품의 대표적인 물리적 레이아웃을 도시한다. 이러한 레이아웃은 제품의 휴대용 버전에 적합한 외부 하우징(900)에 수납될 수 있는 논의된 다양한 컴포넌트용 내부 하우징(일반적으로 도면부호 70임)을 포함한다. 이러한 버전은 유리 로드(40)의 단부에 대해 직접 손 또는 다른 조직을 비교적 용이하게 위치시키도록 한다. 온도 센서(도시 안함)는 PMT 온도를 검지하기 위해 PMT(42, 44, 46, 48) 또는 그 근방에 제공될 수 있다. 도9 내지 도14는 외부 하우징과 다양한 내부 하우징 및 그 구조를 도시한다. 도9 내지 도14는 컴포넌트의 일반적인 배치를 도시하지만, 편의상 도1에 나타난 바와 같이 광로를 도시하는 것을 의도하지는 않았다.
지지 전기 컴포넌트
전술한 광 취급 컴포넌트는 장치 내에서 사용되는 여기 광을 발생시키고 지향하여, 미가공 방출값을 생성하도록 방출광이 수신되고 지향되어 측정되도록 한다. 이들 컴포넌트는 후술하는 작동 방법을 수행하기 위해 필요한 소프트웨어를 포함하는 관련 지지 및 제어 컴포넌트를 갖는다. 지지 및 제어 컴포넌트는 광 취급 구성요소용 하우징(900)(도9 참조) 내에 일부가 위치되고, 일부는 장치(10)의 광 취급 구성요소용 하우징 내에 포함된 지지 및 제어 컴포넌트와 통신하는 개별 컴퓨터(200)(도2 참조) 상에 또는 데이터 프로세서 상에 위치될 수 있다. 팬(203)(도5 및 6 참조)이 컴포넌트를 냉각시키기 위해 포함될 수 있다.
컴퓨터(200)는 장치(10)의 전원을 온/오프하고, PMT로의 전압을 조정하고, 광원으로의 전류를 조정하고, 개별 광원의 스위치 온/오프하고, PMT, 광다이오드 및 온도 센서의 출력값을 판독하는 것과 같은 기능을 제어할 수 있다. 컴퓨터(200)는 또한 디지털화되고 데이터 분석의 다양한 단계를 위해 준비되는 미가공 데이터를 수신할 수 있다. 다르게는, 데이터 처리 컴포넌트(마이크로프로세서, DSP 또는 다른 로직 컴포넌트)는 하우징(900) 내의 회로 기판(1210, 1212, 1214)(도12 참조)에 위치될 수 있다. 이들 데이터 처리 컴포넌트는 프로세싱의 전 부 또는 대부분을 수행할 수 있고, 약간의 계산이 필요하거나 또는 계산이 전혀 필요하지 않지만 사용자의 검토, 저장 또는 부가의 통신을 위해 표시될 수 있는 결과 데이터의 소량의 세트를 컴퓨터(200)로 통과시킬 수 있다.
지지 및 제어 컴포넌트의 기능은, 여기 광원(20, 22) 및 캘리브레이션 광원(16)으로의 전력 공급과 공급된 전류의 검지, 제어 및 조정과; 광전자 배증관으로의 전력 공급 및 인가된 전압의 조절과; PMT(42, 44, 46, 48), 광다이오드(38, 58) 및 온도 센서(도시 안함)의 출력인 출력 전압 또는 다른 값의 판독과; 검지된 전압 및 다른 값들의 디지털화와 디지털 프로세싱 컴포넌트로의 통신을 위한 포맷, 임의의 가능한 기계적인 구성요소의 작동, 데이터의 저장과 통신 및 장치 및 임의의 작동 가능한 구성요소의 작동 시퀀스 및 시스템 테스트를 제어하는, 소프트웨어 및 사용자 인터페이스로부터의 제어 신호의 수신 및 수행을 포함한다. 이는 후술하는 방법을 실행하는 제어 소프트웨어와 전술한 광 취급 컴포넌트로 작동하도록 구성된 종래의 컴포넌트에 의해 수행될 수 있다.
하우징(900) 내의 모든 지지 및 제어 컴포넌트용 전원은 예를 들어 전원 공급원(201)(도2 참조)으로부터 커넥터(1412)에서 공급되지만, 컴퓨터(200)와의 통신은 커넥터(1410)에서 하우징(900)에 연결된 통신 채널 상에서 이루어진다. 전원은 또한 배터리와 같은 내부 공급원에 의해 제공될 수 있고, 통신 채널은 물리적인 또는 무선 접속일 수 있다.
방법의 설명
도15의 고수준 흐름도에서 도시된 바와 같이, 장치의 작동에 사용되는 3개의 전체 방법은, 블록(500)에서 도시된 장치의 캘리브레이션과, 블록(502)에서 도시된 두 개의 여기 파장으로부터의 조직 또는 다른 타겟으로부터 산란된 광의 측정과; 블록(504)에서 도시된 카로티노이드 수준에 대한 최종값을 취하기 위해 이들 두 개의 측정으로부터의 데이터의 분석이다. 이들 방법 각각은 후술된다.
1. 캘리브레이션
캘리브레이션 공정은 적절한 작동 파라미터로 컴포넌트를 설정하고, 예를 들어 카로티노이드(또는 다른 선택된 분자)인 화학물질의 양의 최종 측정치를 계산하도록 미가공 데이터를 분석하여 표준화하기 위해 사용되는 데이터를 수집한다. 이러한 최종 측정치는 카로티노이드 스코어(Carotenoid Score)로 지칭될 수 있다. 카로티노이드 스코어는 임의의 적절한 범위일 수 있고 조직 내의 카로티노이드의 수준을 반영한다. 적절한 범위는 0 내지 100000일 수 있다. 도16에 도시된 바와 같이, 캘리브레이션 공정은, (1) 블록(506) 및 블록(508)에 도시된 바와 같이 광원으로 공급되는 전류와 PMT로 공급되는 전압의 최적값을 찾는 단계와, (2) 블록(510)에 도시된 바와 같이 "다크감산(Dark Subtract)" 처리에 사용하기 위해 광학적 다크 재료를 측정하는 단계와, (3) 블록(512)에 도시된 바와 같이 카로티노이드에 대응하는 시프트된 방출 파장에서 라만 신호(따라서 대략 473 ㎚의 광원에 대해 대략 509 ㎚의 라만 신호)를 발생시키는 참조 표준 재료를 측정하는 단계와, (4) 블록(514)에 도시된 바와 같이 판독치를 카로티노이드 스코어로 변환하기 위한 데이터 분석에 사용되는 1차 방정식의 계수를 계산하는 단계와, (5) 블록(516)에 도시된 바와 같이 데이터 분석에서 표준화하기 위한 데이터를 수집하는 단계를 포 함한다. 이들 모든 단계는 한번에 수행되지 않을 것이고, 이들은 도시된 것과 다른 순서로 수행될 수 있다. 참조 표준 재료는 캘리브레이션 공정에 사용하도록 설계된 준비된 샘플이다. 이들 재료는 예를 들어 본원에서 참조로서 합체된, 발명의 명칭이 "생물학적 광자 스캐너의 합성 캘리브레이션을 위한 처리 및 구성(Process and Composition for Synthetic Calibration of Bio-photonic Scanners)"인 2004년 11월 3일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/981139호에 개시된 방법과 구성의 이용에 의해 또는 해당 기술 분야에 공지된 다른 방법에 의해 준비될 수 있다.
캘리브레이션은 원할 때마다 수행될 수 있지만, 일반적으로 조직 측정 전에 수행되고 조직 측정보다 긴 주기로 수행된다. 캘리브레이션으로부터의 데이터 및 작동 파라미터는 본 명세서에서 후술하는 바와 같이 데이터를 분석하기 위해 사용된다.
"자동 튜닝"(520)으로 공지된 캘리브레이션 공정의 일부는 도17에 도식적으로 나타내어진다. 자동 튜닝은 PMT 입력 전압과 광원 전류의 최적 설정을 결정하기 위해 사용된다. 일반적으로, 제1 및 제2 광원(20, 22)은 동일한 조건 하에서 작동할 때 상이한 광 출력 수준을 생성한다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 광원(20, 22)용 전류와 각각의 PMT용 입력 전압은 통상적인 설정으로 초기화된다.
박스(522)에서 시작하는 최적 전압을 결정하기 위해, 참조 표준 재료는 광원(20, 22) 중 하나를 이용하여 조사된다. PMT 입력 전압은 가장 낮은 PMT 출력값이 1.2 볼트의 5% 내에 있을 때까지 박스(524)에 도시된 바와 같이 변경되어, 박스(526)에서 결정된다. 이러한 입력 전압에서, PMT는 참조 표준 및 대부분의 조직 을 우수한 품질로 판독할 것이다(후술하는 바와 같이, PMT 전압의 미세 튜닝은 현저하게 높은 형광을 갖는 조직의 측정을 수행하는 데에 필요할 수 있다). 따라서, 박스(528)에 도시된 바와 같이, 이것이 최적 전압이다.
박스(520)에서 시작하는 캘리브레이션 광원에 대한 최적 전류 수준을 결정하기 위해, PMT의 최고 판독 출력 전압이 7.5 볼트의 5% 내에 있을 때까지, 캘리브레이션부(16)의 캘리브레이션 광원(23)에 대한 전류 수준이 박스(532)에 도시된 바와 같이 조정되고, 박스(534)에서 결정된다. 박스(535)에 도시된 바와 같이, 이것이 최적 전류이다.
박스(536)에서 시작하는 제1 및 제2 여기 광원(20, 22)용의 최적 전류 수준을 결정하기 위해, 하나의 광원이 온일 때 참조 표준 재료(reference standard material)를 조사하면서 측정된 평균 PMT 출력 전압이 다른 광원이 온일 때 평균의 1% 내에 있을 때까지, 제1 및 제2 광원(20, 22)에 사용되는 광원 전류는 박스(538)에 도시된 바와 같이 조정되고, 박스(540)에서 결정된다. 박스(541)에 도시된 바와 같이, 이것이 최적 전류이다.
일반적으로, 자동 튜닝 공정에서 유도된 값은 날마다 약간씩 변동한다. 이러한 공정은 공장에서의 캘리브레이션의 필요성을 제거하고, 장치가 경년변화하는 것 또는 다른 환경에서 작동되는 것을 적합하게 한다.
광학적 다크 재료의 판독["다크 스캔(dark scan)"]은 형광의 외부 공급원의 부재 시에 광학 및 전기적인 신호의 기준 측정치를 제공한다. 이는 "다크 데이터(dark date)"로 지칭될 수 있다. 흑색 애노다이징 처리된 렌즈 캡(1211)(도12 참조)이 광학적 다크 재료로서 사용하기 위해 장치에 제공될 수 있다. 타겟으로서의 다크 재료의 PMT의 출력값은 데이터 분석에서 후일 사용하기 위해 저장된다(후술함). 다크 데이터는 광원을 스위치 온오프함으로써 각각의 제1 및 제2 광원(20, 22)용으로 포획된다. "다크 데이터"값은 PMT의 모든 순차 판독으로부터의 미가공 데이터로부터 감산된다. 이들 값은 통상적으로 다른 캘리브레이션 물질 또는 조직이 판독될 때 포획된 값에 비해 작다.
참조 표준 재료의 측정은 "C"로 지칭될 수 있는 캘리브레이션되지 않은 스코어를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 매우 높은 판독 조직과 동일한 509 ㎚의 라만 공진을 갖는 참조 재료가 장치를 사용하여 측정된다. 이러한 "높은" 참조 재료의 측정으로부터의 데이터는 캘리브레이션되지 않은 데이터를 계산하기 위해 분석된다. 높은 참조 재료의 C값은 데이터 분석에 사용하기 위해 1차 방정식의 계수의 계산을 수행한다. 캘리브레이션 공정은 또한 데이터 분석을 위해 고차 방정식을 사용할 수 있다.
특정 실시예에서, 캘리브레이션 공정은 조직의 측정치의 C값으로부터 카로티노이드 스코어를 계산하기 위해 사용된 1차 방정식의 계수와 오프셋을 계산한다. 방정식은 데이터 분석과 관련하여 이하에서 보다 상세히 논의된다. 높은 참조 물질로서 전술한 높은 캘리브레이션 표준 타겟 샘플은 공칭 카로티노이드 스코어가 77000으로 할당된다. 이러한 수는 임의이고, 변경될 수 있다. 그러나, 수는 조직 내의 상대적인 카로티노이드 함량을 반영하는 스케일을 이용하여 0과 100000 사이에서 스코어링되도록 넓은 조직 샘플링을 허용한다. 특정 실시예에서, C값은 선에 대한 기울기-절편 공식(slope intercept formula)인 단순한 1차 방정식에 의해 이러한 스케일에 대해 매핑된다.
카로티노이드 스코어 = C값 * 계수 + 오프셋
계수는 판독될 때 얻어진 C값에 의한 높은 참조 표준의 할당(공칭)값을 나눔으로써 계산된다. 일반적으로, 제2 참조 표준은 선의 오프셋과 계수의 계산에 사용하기 위해 두 개의 점이 부여되어 판독될 수 있다. 그러나, 장치는 제2 점이 0인 할당값과 0인 C값을 갖는 것으로 가정할 수 있는 라만 활성 물질을 포함하지 않는 참조 샘플을 판독할 때 사실상 0에 근접하는 C값을 얻는다. 따라서, 계수를 계산하기 위한 공식은 하나의 판독치만을 필요로하고 오프셋은 0이다. 캘리브레이션은 보다 복잡하고 시간 소모적인 2점 캘리브레이션이 아닌 단일점 캘리브레이션이다. 고차 캘리브레이션 방정식을 생성하도록 상이한 할당 스코어를 갖는 표준 참조 물질을 이용하여 부가의 측정이 이루어질 수 있다.
몇몇 다른 값들은 데이터 분석 동안 미가공 데이터를 표준화하는데 사용하기 위해 캘리브레이션 동안 포획될 수 있다. 이들은 (a) 캘리브레이션부(16)의 시안색/녹색 광다이오드(58)의 판독치("녹색 다이오드 캘리브레이션 판독치")와, (b) 캘리브레이션광원(23)이 자동 튜닝되는 동안 각각의 PMT의 출력 전압의 판독치("녹색 캘리브레이션 데이터"로 지칭됨) 및 (c) 높은 참조 물질의 판독 동안 제1 및 제2 광원(20, 22)용으로 포획된 여기부(12)의 광다이오드(38)의 판독치(각각 제1 및 제2 광원용으로 "제1 청색 다이오드 캘리브레이션 판독치"와 "제2 청색 다이오드 캘리브레이션 판독치")를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
장치가 "영점화(zeroing)"되는 것을 결정하기 위한 캘리브레이션 공정의 종료시에 체크가 수행된다. 이는 고품질 판독을 생성하기 위한 기계의 능력을 측정한다. 카로티노이드와 동일한 파장(예를 들어, 509 ㎚)의 라만 신호를 갖지 않고 형광을 갖는 참조 물질을 판독할 때 적절한 영점화 기기는 0 부근의 C값을 얻는다. 이러한 체크를 수행하기 위한 데이터는 자동 튜닝 처리 동안 포획된다. 다크 데이터가 포획된 후까지 C값이 계산되지 않기 때문에, "영점화" 체크는 캘리브레이션 공정의 종료시에 수행된다.
2, 스캔 및 측정
도18은 스캐닝 및 측정 처리를 대략적으로 도시한다. 각각의 조직 스캔을 수행하기 전에, 데이터 분석(후술함)에 사용하기 위해, 블록(600)에 도시된 바와 같이 데이터가 수집된다. 캘리브레이션부(16)의 녹색/시안색 광원(23)을 조사하고 분석부(14)를 통해 광을 지향시키고 PMT로 광을 프로세싱함으로써 블록(602)에 도시된 바와 같이 "녹색 판독치"가 수집된다. 각각의 PMT의 출력이 수집되고, 이는 스캔용 "녹색 판독치"를 포함한다. 여기부(12)의 제1 광원(20)에 대한 "제1 청색 다이오드 판독치"[블록(604)]와, 여기부(12)의 제2 광원(22)에 대한 "제2 청색 다이오드 판독치"[블록(606)]와, 캘리브레이션부(16)의 광원(23)에 대한 "녹색 다이오드 판독치"[블록(608)]는 각각의 광원을 개별적으로 조사하고, 관련 광다이오드(38 또는 58)에서 값을 취하여 수집된다.
장치(10)의 작동 중, 제1 광원(20)은 제1 여기광을 발생시키기 위해 활성화된다. 광은 여기 필터[예를 들어, 협대역 필터(24)]를 통과하고 광 운반 시스템을 통해 조직 또는 다른 타겟으로 지향된다. 제1 광원(20)으로의 전류는 그 휘도를 제어하도록 조정될 수 있다. 제1 광원(20)으로부터의 출력을 안정시키기 위해 짧은 딜레이가 제공될 수 있다. 조직으로부터의 역산란광(backscattered light)은 광 수집 시스템을 통해 분석부(14)를 통과한다. 광은 균등하게 분할되어 PMT로 지향된다. 각각의 PMT의 출력은 예를 들어 100 밀리초의 간격에 대해 초당 3000 샘플의 비율로 샘플링된다. 각각의 샘플의 PMT 출력은 아날로그로부터 디지털로 변환되어 전압으로써 보고된다. 각각의 PMT에 대한 값이 수집된다. 이후, 이러한 처리는 제2 광원(22)에 대해 반복된다.
각각의 제1 및 제2 광원(20, 22)에 인가된 전류는 상이할 수 있다. 일반적으로, 조직으로 지향될 때 광의 강도가 각각의 광원(20, 22)과 동일하도록 하는 것이 바람직하다. 이를 수행하기 위해서는, 두 개의 광원들의 휘도 사이에 차이가 있고, 두 개의 여기 필터의 투과 효율의 차이가 있기 때문에 광원은 상이한 전류로 구동될 수 있다. 각각의 광원에 대한 최적 전류는 캘리브레이션 공정의 "자동 튜닝"부에서 결정될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 최적 전류는 각각의 개별 스캔에 대해 반드시 결정될 필요는 없다.
PMT에 인가되는 전압은 또한 자동 튜닝 처리 동안 결정될 수 있다. 일반적으로, PMT 전압은 아날로그-대-디지털 컨버터가 높은 형광을 갖는 조직을 판독할 때 포화되는 것처럼 너무 높지 않으면서, 참조 표준 재료(전술함)의 우수한 판독을 부여하도록 충분히 높은 PMT로부터의 출력을 생성하는 값으로 설정된다.
판독은 두 개의 측정을 이용하여 전개되는데, 하나는 제1 광원(20)으로부터 의 것이고, 하나는 제2 광원(22)으로부터의 것이다. 따라서, 일 실시예에서, 판독을 전개하기 위해, 제1 측정은 471.3 ㎚의 여기 필터를 통한 제1 광원으로 얻어진다. 따라서, 제1 측정은 제1 파장(F1)의 광으로 타겟을 조사하는 것에 대응한다. 이러한 제1 측정으로부터 각각의 PMT 당 하나씩의 4개의 PMT값이 저장된다. 제2 측정은 473.0 ㎚의 여기 필터를 통한 제2 광원으로 얻어진다. 따라서, 제2 측정은 제2 파장(F2)의 광으로 타겟을 조사하는 것에 대응한다. 이러한 제2 측정으로 각각의 PMT 당 하나씩의 4개의 PMT값이 저장된다. 따라서, 판독은 8개의 값, 471.3 필터로 측정된 4개의 PMT값과 473.0 필터로 측정된 4개의 PMT값을 이용한다. (해당 기술 분야의 종사자에게 명백한 바와 같이, 상이한 개수의 PMT가 판독을 위해 사용되는 상이한 개수의 값과 함께 사용될 수 있다. 특징 라만 방출 파장(Fc)은 조직에서 측정되는 선택된 분자와 연관된다. 각각의 PMT는 예상 방출광 파장 또는 이에 근접한 파장에서 광 강도를 샘플링하여, 라만 산란 신호만을 측정하는 것이 필요한 파장 부근의 타겟 형광의 데이터를 제공한다.)
복수의 PMT는 동시에 판독된다. PMT로부터의 값은 제1 광원(20)을 사용한 측정에서 포획된다. 그 후, PMT로부터의 값은 제2 광원(22)을 사용한 측정에서 포획된다. 이러한 한 쌍의 측정은 함께 단일 판독을 나타낸다. 다중 판독이 각각의 광원(20, 22)에 대해 수행되고, 그 결과는 완전한 스캔을 위해 미가공 데이터의 8개의 값을 수집하도록 평균이 구해진다. 이러한 값은 수집되고, 일 측정으로부터 다음 측정으로 발생될 수 있는 작은 변경을 완화하도록 평균이 구해진다.
따라서, 샘플링된 강도값들의 제1 세트는 제1 파장(F1)의 광으로 타겟을 조 사하는 것으로부터 유래된 광에 대해 전개되고, 샘플링된 강도값들의 제2 세트는 제2 파장(F2)의 광으로 타겟을 조사하는 것으로부터 유래된 광에 대해 전개된다. 각각의 세트는 선택된 모듈과 관련된 특징 방출 파장(Fc)과 각각의 파장(F1 또는 F2) 또는 그 부근의 값을 포함한다. 각각의 세트는 또한 특징 파장(Fc)에 인접하지만 각각의 파장(F1 또는 F2)으로부터 야기된 라만 방출을 제외하도록 파장으로부터 충분히 떨어져 있는 적어도 두 개의 값을 포함한다. 이들 값 중 적어도 하나는 예상 특징 파장(Fc)보다 아래에 있고, 이들 값 중 적어도 하나는 예상 특징 파장(Fc)보다 위에 있다. 강도값의 각각의 세트는 각각의 강도 센서(예를 들어 PMT)로부터의 값을 포함한다. 따라서, 샘플링된 강도값들의 제1 세트는 제1 파장(F1)에 대한 조사로부터 야기된 복수의 센서로부터의 값을 포함한다. 예를 들어, 제1 세트는 SF10, SF11, SF12, SF13인 4개의 값을 포함할 수 있다. 이는 각각 4개의 센서 각각으로부터 야기된다. 이러한 값의 세트는 정렬된 세트(ordered set)이고, 하나의 값, 예를 들어 SF11은 선택된 분자와 관련된 특징 파장(Fc)과 제1 파장(F1)의 측정치이다. 유사하게, 샘플링된 강도값들의 제2 세트는 제2 파장(F2)의 조사로부터 야기된 복수의 센서로부터의 값을 포함한다. 예를 들어, 제2 세트는 SF20, SF21, SF22, SF23인 4개의 값을 포함할 수 있다. 이들은 각각 4개의 센서 각각으로부터 야기된다. 이러한 값의 세트는 정렬된 세트이고, 하나의 값, 예를 들어 SF21은 선택된 분자와 관련된 특징 파장(Fc)과 제2 파장(F2)의 측정치이다.
따라서, 완전한 스캔과 측정은, (1) 블록(60)에 도시된 바와 같이 수행되는 판독 횟수를 결정하는 단계(일반적으로, 참조 표준을 판독할 때보다 피부를 판독할 때 우수한 결과를 얻기 위해 더 많은 판독과 더 긴 스캔을 취하고, 수행되는 스캔의 횟수는 해당 기술 분야의 종사자들에게 정규의 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있음)와, (2) 자동 튜닝 공정 중 결정된 값으로 PMT로의 전압을 조정하는 단계와, (3) 블록(612, 614)에 도시된 바와 같이 결정된 판독 횟수를 수행하여 각각으로부터 복귀된 8개의 값을 저장하는 단계와, (4) 블록(616)에 도시된 바와 같이 각각의 측정으로부터 복귀된 8개의 값의 결과의 평균을 구하는 단계를 포함한다. 따라서 스캔으로부터의 미가공, 미처리된 데이터는 전체 8개의 값에 대한 각각의 광원을 갖는 각각의 PMT의 평균값을 포함한다. (캘리브레이션 공정이 재동작하기 때문에 이들이 변경되지 않은 한 PMT 전압을 조정하는 단계가 수행될 필요가 없다는 점에 주의한다.)
후술하는 바와 같이, 미가공, 미처리된 데이터는 카로티노이드 스코어로 변환하기 위한 데이터 분석이 수행된다. 일반적으로, 각각의 제1 및 제2 파장(F1, F2)과 관련된 특징 파장(Fc) 사이의 방출된 광의 보간된 강도값은 샘플링된 강도값의 제1 및 제2 세트로부터 유도된다. 보간된 강도값은 라만 방출이 없기 때문에 강도값 컴포넌트가 제거된다.
비상식적으로 높은 형광을 나타내는 조직은 아날로그-대-디지털 컨버터가 값을 정확하게 변환할 수 없을 정도의 PMT로부터의 높은 출력을 발생할 수 있다는 것에 주의한다. 이러한 것이 발생되면, PMT 전압은 대략 20 볼트 감소될 수 있고 스캔이 반복된 것이다. 전압은 스캔이 성공할 때까지 대략 20 볼트 반복해서 감소될 수 있다. 녹색 다이오드 신호는 다시 판독될 수 있고, 감소된 PMT 전압에서 조직 판독치를 적절하게 캘리브레이션하기 위해 이전의 녹색 다이오드 판독치와 비교된다.
3. 데이터 분석
데이터 분석 공정은 판독하여 얻어진 미가공 데이터를 카로티노이드 스코어로 변환한다. 카로티노이드 스코어는 임의의 범위로 표현될 수 있고 조직 내의 카로티노이드의 수준을 나타낼 수 있다. 일 실시예에서, 범위는 0 내지 100000이다. 전술한 바와 같이, 카로티노이드 스코어의 계산은,
카로티노이드 스코어 = C값 * 계수 + 오프셋이다.
분석 공정은 현재의 스캔(current scan)으로부터의 미가공 데이터를 처리하기 위해 캘리브레이션 중 수집된 데이터를 이용한다.
전술한 바와 같이, 현재의 스캔은 복수의 값을 산출하고, 이러한 복수의 값은 제1 광원을 이용하는 각각의 PMT에 대한 복수의 값과 제2 광원을 이용하는 각각의 PMT에 대한 복수의 값이다. 따라서 논의된 실시예에서, 스캔은 8개의 값을 산출하는데, 이는, 471.3 ㎚ 필터를 갖는 광원을 이용하는 4개의 PMT 각각에 대한 값과 473.0 ㎚ 필터를 갖는 광원을 이용하는 4개의 PMT 각각에 대한 값이다. 각각의 값은 PMT와 그 대역통과 필터에 의해 커버된 파장 범위에서 상이한 파장의 샘플을 나타내는, 각각의 PMT의 판독의 평균을 포함한다.
스캔이 수행되는 환경에서의 변화로 인해, 또는 정규 작동 중의 기계와 PMT의 단순한 가열에 의해 온도 변화가 발생될 수 있다. PMT의 광감도의 임의의 변화와 PMT의 반응의 결과 변화를 보정하기 위해 미가공 데이터에 "녹색 표준화(green Normalization)"가 수행된다. 녹색 표준화는 녹색 캘리브레이션 데이터(도16에서 도면부호 516으로 도시된 바와 같이 캘리브레이션이 취해진 캘리브레이션부의 광원의 PMT 판독치)를 녹색 판독치(도18의 도면부호 602로 도시된 바와 같이 조사된 캘리브레이션부의 광원으로 스캔 시작 시에 취해진 PMT 판독치)로 나눈 비율에 의해 미가공 데이터를 조정(곱)하는 단계를 포함한다. 이러한 절차는 캘리브레이션시에 취해진 스캔을 포함하도록 미가공 PMT 판독을 조정한다.
녹색 표준화가 PMT 반응의 변화를 보정하는 반면, 휘도 캘리브레이션은 두 광원(20 또는 22) 중 어느 하나의 휘도의 변화를 보정하기 위해 수행된다. 일 실시예에서, 여기부(12)의 제1 또는 제2 광원(20, 22)과 함께 취해진 PMT 판독치는 조직 판독 동안 측정된 청색 LED 신호에 대한 캘리브레이션 공정 중 측정된 대응 청색 LED 신호의 비율을 PMT 신호와 곱함으로써 보정될 수 있다.
따라서, 미가공 데이터는 (예를 들어, 온도 변화로 인한) PMT 반응의 변화와, 기계가 캘리브레이션되었을 때와 스캔이 실행되었을 때의 사이에 발생할 수 있는 광원 휘도에 대해 보정된다. PMT 전압은 캘리브레이션부(16)의 광원(23)의 판독치 변화를 이용하여 보정된다. 광원 휘도는 청색 광다이오드(38)의 판독치 변화를 이용하여 보정된다.
광다이오드 판독이 또한 보정될 수 있다. 광원(20, 22, 23)이 스위치 오프될 때에는, 시스템에 광이 없고 광다이오드가 0으로 판독될 것이다. 이는 항상 그렇지는 않다. 따라서, 스캔의 시작 시에, 광원(20, 22, 23)은 스위치 오프될 것이고 광다이오드(38, 58)에서 0이 아닌 전압의 간단한 판독이 취해진다. 측정된 0이 아닌 전압은 동일한 스캔 내에서 이루어진 모든 후속 광다이오드 판독치에서 감산될 것이다.
모든 PMT 판독은 데이터 분석동안 "다크 감산(dark subtracted)"된다. 다크 스캔으로부터의 다크 데이터가 다크 감산 동안 사용된다. 다크 스캔으로부터 저장된 각각의 미가공 데이터값은 표준화된 데이터 어레이의 대응부로부터 감산된다. (즉, 제1 광원(20)과 필터(24)를 갖는 PMT(42)에서의 다크값은 제1 광원(20)과 필터(24)를 갖는 PMT(24)에서 표준화된 데이터로부터 감산된다.) 일 실시예에서, 다크 데이터는 포획시 또는 인가시에 표준화되거나 보정되지 않는다.
각각의 PMT에 대해, 제1 광원(예를 들어 471.3 ㎚의 여기 필터를 가짐)이 조사될 때 포획된 다크 감산된 녹색 표준화 미가공 데이터의 비율은 제2 광원(예를 들어, 473 ㎚ 필터를 가짐)이 조사될 때의 등가 데이터로 나누어진다. 도시된 실시예에서, 이러한 공정은 각각의 PMT에 대해 하나인 4개의 표준화된 신호 비율을 생성한다. 따라서 이들 비율은 SF10/SF20, SF11/SF21. SF12/SF22 및 SF13/SF23을 포함할 수 있다. 값"D"은 이들 4개의 비율을 이용하여 계산된다.
D는 카로티노이드 신호의 존재 또는 부재에서 PMT의 비율들 사이의 차이의 측정값이다. 기계에 의해 측정된 타겟 형광에 더하여 카로티노이드가 첨가되는 신호의 차이가 있다. "D"는 도20에 도시된 4개의 비율을 통해 그려진 포물선에 비례하여 계산된다. 포물선은 두 가지 특성을 갖는다. 먼저, 포물선은 제1 및 최종 PMT의 비율을 통과한다. 두 번째로, 이러한 비율과 제2 PMT에 대한 포물선 사이의 거리의 크기는 제3 PMT에서의 거리의 크기와 동일하다. 도20은 PMT 비율과 이들로 부터 유도된 포물선을 도시한다. D는 PMT 비율로부터 하향으로 PMT1에 대한 곡선까지 또는 상향으로 PMT2에 대한 곡선까지의 거리이다. 도시된 실시예의 알고리즘에서, 이들 거리는 동일하다. 이러한 보간 알고리즘에서 사용되는 포물선의 방정식은 이하에서 보다 상세히 설명한다.
일반적으로, 포물선 곡선은 PMT1과 PMT2 사이의 중간의 타겟 형광 수준을 찾아내기 위해 두 개의 공지된 단부점(PMT0 및 PMT3) 사이를 보간하기 위해 사용된다. 이러한 수준은 D의 값을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 PMT0 및 PMT3에서 측정된 비율은 PMT0과 PMT3 사이에서 측정된 스펙트럼(파장 샘플링 범위)의 중간점에서의 타겟 형광을 결정하기 위한 포물선 보간 알고리즘에서 사용된다. 이러한 절차는 PMT1에서 측정된 비율과 백그라운드 형광 신호 수준 사이의 크기차 및/또는 PMT2에서 측정된 비율과 백그라운드 형광 신호 수준 사이의 크기차인 값 D로 복귀한다.
달리 말하면, 곡선은 계산된 비율에 맞춰지도록 외삽(extrapolate)되고, 곡선은 점{f0, SF10/SF20} 및 {f3, SF13/SF23}을 통과하고, 여기서 f0, f1, f2 및 f3은 각각의 4개의 센서, 즉 제1, 제2, 제3 및 제4 센서에 대한 중심 파장이고, 곡선은 점{f1, SF11/SF21}과 {f2, SF12/SF22}로부터 등거리에 있다.
따라서, 값 D는 라만 신호가 존재할 때와 라만 신호가 존재하지 않을 때 PMT 판독 비율들 사이의 차의 측정값을 나타낸다. 이러한 차이는 장치에 의해 측정된 타겟 형광에 더하여 카로티노이드가 첨가된 신호의 차이이다. 이러한 값은 타겟의 상대 카로티노이드 수준을 나타낸다. D는 매우 작은 수이고, 백그라운드 형광에 비해 라만 신호가 매우 작다는 사실을 반영한다. 일반적으로, D는 라만 활성 성분이 없는 참조 표준을 판독할 때 0에 근접할 것이다. D는 상당한 라만 신호를 생성하는 물질을 포함하는 참조 표준을 판독할 때 0.02를 초과할 것이다. 피부의 D는 통상적으로 0.0050 내지 0.0100의 범위이다. 특정값은 본 실시예에서는 PMT 세트인 센서 또는 검출기의 분광 해상도에 의해 영향을 받는다.
일반적으로, 이하에서 보다 상세히 설명하는 바와 같이, D를 계산하기 위해, 포물선이 PMT 비율을 따라 그려진다. 포물선은 두 가지 특성을 갖는다. 우선, 포물선은 제1 및 최종 PMT의 비율을 통과한다. 둘째로, 이러한 비율과 제2 PMT에 대한 포물선 사이의 거리는 이러한 비율과 제3 PMT에 대한 포물선 사이의 거리와 동일하다. D는 PMT 비율로부터 하향으로 제2 PMT의 곡선까지 또는 상향으로 제3 PMT의 곡선까지의 거리이다(이들 거리는 동일함).
따라서, D는 라만 신호의 존재에 의한 PMT 비율의 증가를 측정한다. D가 PMT 신호의 비율을 이용하여 계산되기 때문에, 존재하는 라만 활성 물질의 양의 중요한 측정을 생성하는 것은 제2 광원이 제2 필터를 조사할 때 측정되는 평균 PMT 전압과 D를 곱할 것을 요구한다. 이러한 값은 C로 지칭되고, 조직 내의 라만 활성 물질의 양의 최종의 캘리브레이션되지 않은 측정치이다.
최종 단계에서, 카로티노이드 스코어는 스캔으로부터 얻어진 C값과, 캘리브레이션 공정에 의해 생성된 계수와 오프셋으로부터 계산된다. 이는 캘리브레이션된 카로티노이드 스코어를 생성한다. 캘리브레이션 공정은 기계 내에서 나날이 또는 기계에서 다른 기계를 거칠 때 발생할 수 있는 변경을 완화한다. 컴포넌트는 경년 변화(age)되고 하나의 기계에서 다음 기계를 거치면 결코 동일하지 않는다. 캘리브레이션 공정은 이들이 스코어에 영향을 미치는 것을 방지한다.
활성 물질의 증가 농도와 C값 사이에서 참조 표준을 판독할 때 일반적으로 선형 관계가 발견된다. 따라서 1차 방정식은 스캔의 최종 결과를 계산하기 위해 사용된다.
카로티노이드 스코어 = (C * 계수) + 오프셋
다른 실시예에서, 활성 물질의 농도가 증가하는 캘리브레이션 물질 판독을 나타내는데 고차 다항식이 사용될 수 있다.
4개의 PMT 측정으로, 커브 피팅은 단지 선형 또는 포물선일 것이다. 그러나, PMT의 수가 증가되면, 최대 PMT의 수 - 2의 다항식이 생성될 수 있다. 따라서, 예를 들어 5개의 PMT가 제공되면, 3차 다항식이 맞춤될 것이다.
또한, 두 개의 여기 파장이 사용되지만, 임의의 수의 여기 파장이 사용될 수 있다.
잇점 및 사용
본 방법 및 장치는 인체 피부와 같은 조직 내의 카로티노이드 함량을 검출하고 측정하는데 사용할 수 있다. 유사한 설비 및 캘리브레이션으로 2백만회 이상의 스캔으로부터의 데이터를 이용하면, 인체 피부의 평균 카로티노이드 스코어는 26,000이다. 과일 및 야채가 많은 식이요법과 카로티노이드 스코어 사이의 높은 상관 관계가 있다. 건강하게 식이요법을 하는 사람과 영양 보충제(nutritional supplementation)를 사용하는 사람은 70,000 이상의 스코어를 가질 것이다. 열악 한 식습관 또는 흡연과 같은 다른 습관을 갖는 사람들은 종종 10,000 미만의 스코어를 갖는다.
피부 내의 카로티노이드, 레티노이드 및 유사한 화학 물질과 소정의 건강 상태 사이의 상관 관계가 있다는 것이 몇몇 연구에서 이미 밝혀졌다. 낮은 수준의 카로티노이드가 측정되면, 식이요법 보충제를 포함하는 식이요법 교정과 같은 예방 단계가 취해진다.
우수한 건강과 연관되어 있다는 것이 밝혀진 몇몇 카로티노이드는 올-트랜스-.베타.-카로틴, 리코펜, .알파.-카로틴, .감마.-카로틴, 파이토인(phytoene), 파이토플루엔(phytofluene), 셉터프레노(septapreno)-.베타.-카로틴, 7,7'디하이드로-.베타.-카로틴, 아스타산틴(astaxanthin), 캔타산틴(canthaxanthin), 제아잔틴, 루테인, .베타.-아포-8'-카로티날, 비올라잔틴(violaxanthin) 및 로독잔틴(rhodoxanthin)을 포함한다. 이들은 상이한 길이와 부착부를 갖는 연쇄형 분자이고, 각각 모두 교호하는 이중 카본 및 단일 본드를 갖는 카본 백본을 갖는다. 모든 카로티노이드에 공통인 이들 본드의 변형은 라만 분광법으로 검출될 수 있다. 이들 카로티노이드의 파수 시프트가 일반적으로 800 내지 2000 ㎝-1(파수)의 범위 내에 있는 것이 개별 측정으로부터 밝혀졌다. 예를 들어, 카로티노이드 루테인과 제아잔틴은 각각 대략 1160 ㎝-1 및 1520 ㎝-1의 파수 시프트를 갖는 것이 밝혀졌다.
카로티노이드는 피부의 항산화 방어 시스템의 중요한 성분이고, 여기서, 이들은 자유 라디칼이고 단일 산소 스케빈저(scavenger)로서 작용하는 것으로 생각된 다. 또한, 카로티노이드는 예를 들어 태양광과 같은 자외선(UV)광을 피부에 과도하게 노출시킴으로써 형성되는 유해한 다수의 활성 산소(ROS)로부터 피부를 보호한다. 형성되면, ROS는 DNA, 단백질 및 불포화 지방산과 효과적으로 반응하여, 단백질-단백질 및 단백질-DNA 가교결합뿐만 아니라 DNA 가닥을 파단시키고 산화시켜 손상시킨다. 지질(lipid)의 산화는 세포에서 상대적으로 긴 시간을 지속하는 지질 과산화물의 형성을 야기할 수 있고, 따라서 라디칼 연쇄 반응을 시작시키고 산화 손상을 향상시킬 수 있다.
본 방법 및 장치는 다양한 인체 조직과 체액에서 카로티노이드 수준의 신속하고, 비관혈적인 평가를 제공하고, 다른 유용한 사용을 갖는다. 이들은 인체 조직의 전체 항산화 상태를 평가하고, 조직 카로티노이드 또는 다른 항산화 성분의 식이요법 처치의 모니터링을 제공하고, 카로티노이드 분포를 평가하여 화장품으로부터 취하는 도구를 제공한다.
또한, 본 방법 및 장치는 피부의 카로티노이드 수준 및 피부 손상을 측정하는데 사용될 수 있다. 카로티노이드 분자로부터 비탄성적으로 산란된 광의 강도와 라만 신호의 형성은 정규 생물학적 조직으로부터 평가 상태로 산란된 라만광의 강도에 비교될 수 있다. 라만 신호의 강도는 또한 조직의 항산화 상태를 평가하기 위해 정량화될 수 있다.
"D"의 유도
포물선의 방정식의 일반형과, 473.0 필터가 사용될 때의 값으로 나누어진 판독값을 위해 471.3 필터가 사용될 때의 그 출력값의 비율과 그 값이 PMT 번호인 점 의 (x, y) 쌍과 그 출력값의 비율에 대한 다음의 설명이 개시된다. 이러한 설명은 기준선 포물선의 계수와 D를 계산하는데 사용할 수 있는 방정식의 유도가 설명된다. 도20을 참조한다.
P0, P1, P2 및 P3은 각각 PMT 0 내지 3의 비율값이다. 포물선의 4개의 점이 공지되었다.
(x0, y0) = (0, P0)
(x1, y1) = (1, P1 - D)
(x2, y2) = (2, P1 + D)
(x3, y3) = (3, P3)
이들 값과 포물선 방정식의 일반형(y= ax2 + bx + c))을 이용하여, D를 푸는 것이 가능하다.
x0 = 0이고 y0 = P0일 때, P0 = a(02) + b(0)+c이고,
x1 = 1이고 y1 = P1 - D이면, P1 - D = a(12) + b(1) + c이고,
x2 = 2이고 y2 = P2 + D이면, P2 + D = a(22) + b(2) + c이고,
x3 = 3이고 y3 = P3이면, P3 = a(32) + b(3) + c이다.
제1 방정식에서, P0 = c이다. 방정식은 P0을 c로 치환하고, P0를 좌변으로 이동시키고 상수를 곱함으로써 단순화될 수 있다.
식1 P0 = c
식2 P1 - D - P0 = a + b
식3 P2 + D - P0 = 4a + 2b
식4 P3 - P0 = 9a + 3b
따라서, c값이 결정된다. D는 a와 b에 대해 풀어서 삭제된다. 우선, D에 대해 식2와 식3을 정리한다.
P1 - D - P0 = a + b에서, D = P1 - P0 - a - b가 된다.
P2 + D - P0 = 4a + 2b에서, D = P0 - P2 - 4a + 2b가 된다.
D = D이기 때문에, 두 개의 방정식은 동일하게 되어 재배열된다.
P1 - P0 - a - b = P0 - P2 + 4a + 2b
식5 -2P0 + P1 + P2 = 5a + 3b
식5를 a에 대해 정리한다.
식6 a = (-2P0 + P1 + P2 - 3b)/5
식2 및 식3을 a에 대해 구한다. b를 구하기 위해 식4에 a를 대입한다.
P3 - P0 = 9a + 3b
3b = P3 - P0 - 9a
3b = P3 - P0 - 9((-2P0 + P1 + P2 - 3b)/5)
15b = 5P3 - 5P0 - 9(-2P0 + P1 + P2 - 3b)
15b = 5P3 - 5P0 + 18P0 - 9P1 - 9P2 + 27b
-12b = 13P0 - 9P1 - 9P2 + 5P3
식7 b = (- 13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)/12
구해진 b를 갖고, 식2의 단순화된 형태가 D를 찾아내기 위해 이용될 수 있다.
d = P1 - P0 - a - b
식6으로부터 a의 값을 치환한다.
d = P1 - P0 - ((-2P0 + P1 + P2 - 3b)/5) - b
5d = 5P1 - 5P0 -(-2P0 + P1 + P2 - 3b) - 5b
5d = 5P1 - 5P0 + 2P0 - P1 - P2 + 3b - 5b
5d = -3P0 + 4P1 - P2 - 2b
최종적으로, D를 구하기 위해 식7의 b값을 대입한다.
5D = -3P0 + 4P1 - P2 - 2((-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)/12)
30D = -18P0 + 24P1 - 6P2 - (-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)
30D = -18P0 + 24P1 - 6P2 + 13P0 - 9P1 - 9P2 + 5P3
30D = -5P0 + 15P1 - 15P2 + 5P3
6D = -P0 + 3P1 - 3P2 + P3
D = (-P0 + 3P1 - 3P2 + P3)/6
결과값 D는 식3을 이용하여 처리를 반복함으로써 체크된다.
D = P0 - P2 + 4a + 2b
우선, a = (-2P0 + P1 + P2 - 3b)/5를 대입하고, 이어서 b = (-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)/12를 대입하는 것은 D의 동일한 결과를 생성할 것이다.
D = P0 - P2 + 4a + 2b
D = P0 - P2 + 4*((-2P0 + P1 + P2 - 3b)/5) + 2b
5D = 5P0 - 5P2 + 4*(-2P0 + P1 + P2 - 3b) + 10b
5D = 5P0 - 5P2 -8P0 + 4P1 + 4P2 - 12b + 10b
5D = -3P0 + 4P1 - P2 - 2b
5D = -3P0 + 4P1 - P2 - 2*((-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)/12)
5D = -3P0 + 4P1 - P2 + (26P0 - 18P1 - 18P2 + 10P3)/12
60D = -36P0 + 48P1 - 12P2 + 26P0 - 18P1 - 18P2 + 10P3
60D = -10P0 + 30P1 - 30P2 + 10P3
D = (-P0 + 3P1 - 3P2 + P3)/6
식3으로부터 유도된 D의 이러한 마지막 방정식은 식2에서 유도된 것과 동일하다는 것에 주의한다.
"a"는 D를 계산하는데 필요하지 않고, 이를 구할 수 없다는 점에 주의한다. 기준선 포물선이 계산되면, "a"가 구해진다. 임의의 원래 방정식이 사용될 수 있다. 예를 들어, 식4가 사용될 수 있다.
식4 P3 - P0 = 9a + 3b
P3 - P0 = 9a + 3*((-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)/12)
12P3 - 12P0 = 108a + 3*(-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)
12P3 - 12P0 = 108a - 39P0 + 27P1 + 27P2 - 15P3
-108a = -12P3 + 12P0 - 39P0 + 27P1 + 27P2 - 15P3
108a = 12P3 - 12P0 + 39P0 - 27P1 - 27P2 + 15P3
108a = 27P0 - 27P1 - 27P2 + 27P3
a = (P0 - P1 - P2 + P3)/4
따라서, a, b, c의 값이 계산되고, D는 다음식을 이용하여 PMT 비율의 값에 주어진다.
a = (P0 - P1 - P2 + P3)/4
b = (-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)/12
c = P0
D = (-P0 + 3P1 - 3P2 + P3)/6
최종 체크가 4개의 원래 방정식 각각을 확인함으로써 수행될 수 있다.
식1 P0 = c
식2 P1 - D - P0 = a + b
식3 P2 + D - P0 = 4a + 2b
식4 P3 - P0 = 9a + 3b
식1 P0 = c
이는 참이다.
식2 P1 - D - P0 = a + b
P1 - ((-P0 + 3P1 - 3P2 + P3)/6) - P0 = (P0 - P1 - P2 + P3)/4
+ (-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)/12
12P1 + 2P0 - 6P1 + 6P2 - 2P3 - 12P0 = 3P0 - 3P1 - 3P2 + 3P3 - 13P0
+ 9P1 + 9P2 - 5P3
-10P0 + 6P1 + 6P2 - 2P3 = -10P0 + 6P1 + 6P2 - 2P3
이는 참이다.
식3 P2 + D - P0 = 4a + 2b
P2 + ((-P0 + 3P1 - 3P2 + P3)/6) - P0 =
4*((P0 - P1 - P2 + P3)/4) + 2*((-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)/12)
12P2 - 2P0 + 6P1 - 6P2 + 2P3 - 12P0
= 12P0 - 12P1 - 12P2 + 12P3 - 26P0 + 18P1 + 18P2 - 10P3
-14P0 + 6P1 + 6P2 + 2P3 = -14P0 + 6P1 + 6P2 + 2P3
이는 참이다.
식4 P3 - P0 = 9a + 3b
P3 - P0 = 9((P0 - P1 - P2 + P3)/4) +3((-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)/12)
12P3 - 12P0 = 3*9(P0 - P1 - P2 + P3) + 3*(-13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3)
4P3 - 4P0 = 9P0 - 9P1 - 9P2 + 9P3 - 13P0 + 9P1 + 9P2 - 5P3
4P3 - 4P0 = 4P3 - 4P0
이 또한 참이다.
본 발명은 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 종사자들은 본 발명의 사상과 범주로부터 벗어남이 없이 그 형상 및 세부사항의 변경을 실시할 수 있다는 것을 알 수 있다.
Claims (43)
- 타겟 샘플 내의 선택된 분자의 수준을 측정하는 방법이며,제1 파장(F1)의 광으로 타겟 샘플을 조사하는 단계와,제1 파장(F1)의 광이 꺼지고, 제1 파장(F1)에 인접한 제2 파장(F2)의 광으로 타겟 샘플을 조사하는 단계와,파장(F1, F2)들에서의 각각의 조사로부터 야기된 방출광을 타겟 샘플로부터 수광하고 선택된 분자와 관련된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 각각의 조사 파장을 포함하는 파장 범위에서 방출광의 강도를 샘플링하는 단계와,파장(F1)에 대한 조사로부터 야기된 방출광에 대한 샘플링된 강도값들의 제1 세트를 전개하는 단계로서, 상기 샘플은 선택된 분자와 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 파장(F1)에서의 또는 그 부근의 값을 포함하고, 적어도 하나의 샘플은 특징 라만 방출 파장(Fc)에 인접하지만 파장(F1)에 대한 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외시키도록 파장 아래로 충분히 변위되고, 적어도 하나의 샘플은 특징 라만 방출 파장(Fc)에 인접하지만 파장(F1)의 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외시키도록 파장 위로 충분히 변위되는, 샘플링된 강도값들의 제1 세트를 전개하는 단계와,파장(F2)에 대한 조사로부터 야기된 방출광에 대한 샘플링된 강도값들의 제2 세트를 전개하는 단계로서, 상기 샘플은 선택된 분자와 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 파장(F2)에서의 또는 그 부근의 값을 포함하고, 적어도 하나의 샘플은 특징 라만 방출 파장(Fc)에 인접하지만 파장(F2)에 대한 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외시키도록 파장 아래로 충분히 변위되고, 적어도 하나의 샘플은 특징 라만 방출 파장(Fc)에 인접하지만 파장(F2)의 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외시키도록 파장 위로 충분히 변위되는, 샘플링된 강도값들의 제2 세트를 전개하는 단계와,비라만 방출에 의한 강도값 컴포넌트를 제거하는 파장(F1, F2)의 각각과 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc) 사이의 방출광에 대한 보간 강도값을 샘플링된 강도값의 제1 및 제2 세트로부터 유도하는 단계를 포함하고,상기 보간 강도값은 타겟 샘플 내의 선택된 분자의 수준의 측정치를 나타내는 샘플링된 강도값의 제1 및 제2 세트에 대응하는 값들의 비로부터 유도되는, 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 파장(F1)에 대한 조사로부터 야기된 방출광에 대한 샘플링된 강도값들의 제1 세트를 전개하는 단계는 적어도 4개의 강도 센서가 파장(F1)의 조사로부터 야기된 샘플값{SF10, SF11, SF12, SF13}을 전개하는 단계를 포함하고, 파장(F2)에 대한 조사로부터 야기된 방출광의 샘플링된 강도값들의 제2 세트를 전개하는 단계는 적어도 4개의 강도 센서가 파장(F2)에 대한 조사로부터 야기된 샘플값{SF20, SF21, SF22, SF23}을 전개하는 단계를 포함하고, 이때 {SF10, SF11, SF12, SF13}과 {SF20, SF21, SF22, SF23}의 각각은 파장(F1) 및 선택된 분자와 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc)에서의 측정치인 SF11과 파장(F2) 및 선택된 분자와 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc)에서의 측정치인 SF22를 갖는 값의 정렬된 세트인 분자 수준 측정 방법.
- 제2항에 있어서, 적어도 4개의 강도 센서의 출력의 변동에 대해, 이러한 센서들의 캘리브레이션 이후로, {SF10, SF11, SF12, SF13}과 {SF20, SF21, SF22, SF23}의 각각을 조정하는 단계를 더 포함하는 분자 수준 측정 방법.
- 제2항에 있어서, 샘플로부터의 방출광에 라만 산란이 없는 광학적 다크 샘플 타겟으로부터 유도된 다크값에 대해 {SF10, SF11, SF12, SF13}과 {SF20, SF21, SF22, SF23}의 각각을 조정하는 단계를 더 포함하는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 샘플링된 강도값들의 제1 및 제2 세트로부터 보간 강도값을 유도하는 단계는, 비율{SF10/SF20, SF11/SF21, SF12/SF22, SF13/SF23}을 계산하는 단계와, 최종 계산된 비율로부터 점{f0, SF10/SF20} 및 점{f3, SF13/SF23}을 통과하는 곡선을 찾아내도록 커브 피팅함으로써 외삽하는 단계를 더 포함하고, 상기 곡선은 점{f1, SF11/SF21} 및 점{f2, SF12/SF22}으로부터 등거리에 있고, f0, f1, f2 및 f3은 4개의 센서 중 각각 제1, 제2, 제3 및 제4 센서에 대한 중심 파장인 분자 수준 측정 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 커브 피팅은 곡선으로서 포물선을 사용하는 분자 수준 측정 방법.
- 제5항에 있어서, 최종 계산된 비율로부터, 4개 센서에 대한 파장 범위의 중간점에 있고 점{f1, SF11/SF21} 및 점{f2, SF12/SF22} 사이에 놓인 값을 {f0, SF10/SF20}과 {f3, SF13/SF23}에 걸친 곡선을 이용하여 포물선 보간법으로 도식적으로 결정하는 단계를 포함하는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 최종 계산된 비율로부터, {f0, SF10/SF20}과 {f3, SF13/SF23}에 걸친 비선형 곡선으로 커브 피팅하여 측정될 때, 점{f1, SF11/SF21}과 점{f2, SF12/SF22} 사이에 놓인 값을 도식적으로 결정하는 단계를 포함하는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 파장(F1, F2)들에서의 각각의 조사로부터 야기된 방출광을 타겟 샘플로부터 수광하고 선택된 분자와 관련된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 각각의 조사 파장을 포함하는 파장 범위에서 방출광의 강도를 샘플링하는 단계는, 소정부의 방출광을 적어도 4개의 강도 센서로 지향시키는 단계를 포함하는 분자 수준 측정 방법.
- 제9항에 있어서, 소정부의 방출광을 적어도 4개의 강도 센서로 지향시키는 단계는 균등부 내에서 방출광을 지향시키는 단계를 포함하는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 선택된 분자는 카로티노이드인 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 타겟 샘플은 인체 조직인 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 타겟 샘플은 인체의 손 조직인 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 파장(F1)에 인접하고 제1 파장(F1)의 광 강도에 대한 소정의 관계의 강도를 갖는 제2 파장(F2)의 광으로 타겟 샘플을 조사하는 단계는, 제1 파장(F1)의 광 강도와 사실상 동일한 강도를 갖는 제2 파장(F2)의 광으로 타겟 샘플을 조사하는 단계를 포함하는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, F1 및 F2는 3 ㎚ 미만으로 분리되는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, F1 및 F2는 2 ㎚ 미만으로 분리되는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 샘플링된 방출 강도값은 10 ㎚ 미만의 파장 범위를 커버하는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 샘플링된 방출 강도값은 7 ㎚ 미만의 파장 범위를 커버하는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 각각의 광이 조사할 때 각각의 광으로부터 타겟 샘플에서 동일한 강도를 제공하기 위해 제1 파장(F1)의 광과 제2 파장(F2)의 광의 강도를 조정하는 단계를 더 포함하는 분자 수준 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 및 제2 파장(F1, F2)은 사실상 라만 공명 파장인 방법.
- 타겟 샘플 내의 선택된 분자의 수준을 측정하는 장치이며,제1 파장(F1)의 광으로 타겟 샘플을 조사하는 제1 광원과,제1 광원이 꺼지면, 제1 파장(F1)에 인접한 제2 파장(F2)의 광으로 타겟 샘플을 조사하는 제2 광원과,파장(F1, F2)들에서의 각각의 조사로부터 야기된 방출광을 타켓 샘플로부터 수광하고 선택된 분자와 관련된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 각각의 조사 파장을 포함하는 파장 범위에서 방출광의 강도를 샘플링하는 수단과,파장(F1)에 대한 조사로부터 야기된 방출광에 대한 샘플링된 강도값들의 제1 세트를 전개하는 제1 샘플러로서, 상기 샘플은 선택된 분자와 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 파장(F1)에서의 또는 그 부근의 값을 포함하고, 적어도 하나의 샘플은 특징 라만 방출 파장(Fc)에 인접하지만 파장(F1)에 대한 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외시키도록 파장 아래로 충분히 변위되고, 적어도 하나의 샘플은 특징 라만 방출 파장(Fc)에 인접하지만 파장(F1)에 대한 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외시키도록 파장 위로 충분히 변위되는, 제1 샘플러와,파장(F2)에 대한 조사로부터 야기된 방출광에 대한 샘플링된 강도값들의 제2 세트를 전개하는 제2 샘플러로서, 상기 샘플은 선택된 분자와 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 파장(F2)에서의 또는 그 부근의 값을 포함하고, 적어도 하나의 샘플은 특징 라만 방출 파장(Fc)에 인접하지만 파장(F2)에 대한 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외시키도록 파장 아래로 충분히 변위되고, 적어도 하나의 샘플은 특징 라만 방출 파장(Fc)에 인접하지만 파장(F2)의 조사로부터 야기되는 라만 방출을 제외시키도록 파장 위로 충분히 변위되는, 제2 샘플러와,비라만 방출에 의한 강도값 컴포넌트를 제거하는 파장(F1, F2)의 각각과 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc) 사이의 방출광에 대한 보간 강도값을 샘플링된 강도값들의 제1 및 제2 세트로부터 유도하는 로직을 포함하고,상기 보간 강도값은 타겟 샘플 내의 선택된 분자의 수준의 측정치를 나타내는 샘플링된 강도값의 제1 및 제2 세트에 대응하는 값들의 비로부터 유도되는, 분자 수준 측정 장치.
- 제21항에 있어서, 파장(F1)과 파장(F2) 각각에 대한 조사로부터 야기된 방출광에 대한 샘플링된 강도값들의 제1 및 제2 세트를 전개하기 위한 샘플러는 파장(F1)에 대한 조사로부터 야기된 4개의 샘플값{SF10, SF11, SF12. SF13}을 검지하기 위한 로직과 파장(F2)에서의 조사로부터 야기된 4개의 샘플값{SF20, SF21, SF22, SF23}을 검지하기 위한 로직을 갖는 적어도 4개의 강도 센서를 포함하고, 이때, {SF10, SF111, SF12. SF13}과 {SF20, SF21, SF22, SF23}의 각각은 선택된 분자와 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 파장(F1)에서의 측정치인 SF11과 선택된 분자와 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 파장(F2)에서의 측정치인 SF22를 갖는 값의 정렬된 세트인 분자 수준 측정 장치.
- 제22항에 있어서, 적어도 4개의 강도 센서의 출력의 변동에 대해, 이러한 센서의 캘리브레이션 이후로, {SF10, SF111, SF12. SF13}과 {SF20, SF21, SF22, SF23}의 각각을 조정하기 위한 수단을 더 포함하는 분자 수준 측정 장치.
- 제22항에 있어서, 샘플로부터의 방출광에 라만 산란이 없는 광학적 다크 샘플 타겟으로부터 유도된 다크값에 대해 {SF10, SF11, SF12. SF13}과 {SF20, SF21, SF22, SF23}의 각각을 조정하기 위한 수단을 더 포함하는 분자 수준 측정 장치.
- 제21항에 있어서, 샘플링된 강도값들의 제1 및 제2 세트로부터 보간된 강도값을 유도하기 위한 로직은 비율{SF10/SF20, SF11/SF21, SF12/SF22, SF13/SF23}을 계산하고, 최종 계산된 비율로부터 점{f0, SF10/SF20} 및 점{f3, SF13/SF23}을 통과하는 곡선을 찾아내도록 커브 피팅함으로써 외삽하는 로직을 포함하고, 상기 곡선은 점{f1, SF11/SF21} 및 점{f2, SF12/SF22}으로부터 등거리에 있고, f0, f1, f2 및 f3은 4개의 센서 중 각각 제1, 제2, 제3 및 제4 센서에 대한 중심 파장인 분자 수준 측정 장치.
- 제25항에 있어서, 커브 피팅을 하기 위한 로직은 곡선으로서 포물선을 이용하는 분자 수준 측정 장치.
- 제25항에 있어서, 최종 계산된 비율을 이용하여, 4개 센서에 대한 파장 범위의 중간점에 있고 점{f1, SF11/SF21}과 점{f2, SF12/SF22} 사이에 놓인 값을 {f0, SF10/SF20} 및 {f3, SF13/SF23}에 걸친 곡선을 기초로 하여 포물선 보간법으로 도식적으로 결정하는 로직을 포함하는 분자 수준 측정 장치.
- 제21항에 있어서, 최종 계산된 비율을 이용하여, {f0, SF10/SF20} 및 {f3, SF13/SF23}에 걸친 비선형 곡선으로 커브 피팅하여 측정될 때, 점{f1, SF11/SF21}과 점{f2, SF12/SF22} 사이에 놓인 값을 도식적으로 결정하는 로직을 포함하는 분자 수준 측정 장치.
- 제21항에 있어서, 파장(F1, F2)들에서의 각각의 조사로부터 야기된 방출광을 타겟 샘플로부터 수광하고 선택된 분자와 연관된 특징 라만 방출 파장(Fc)과 각각의 조사 파장을 포함하는 파장 범위에서 방출광의 강도를 샘플링하기 위한 수단은 소정부의 방출광을 적어도 4개의 강도 센서로 지향시키는 수단을 포함하는 분자 수준 측정 장치.
- 제29항에 있어서, 소정부의 방출광을 적어도 4개의 강도 센서로 지향시키는 수단은 균등부 내에서 방출광을 지향시키는 수단을 포함하는 분자 수준 측정 장치.
- 조직 내의 화학물질 농도를 측정하기 위한 방법이며,제1 광을 발생시키고 제1 광으로 조직의 일부를 조사하는 단계와,조직으로부터 제1 방출광을 포획하는 단계와,복수의 광센서로 제1 방출광을 지향시키는 단계로서, 각각의 광센서는 상이한 파장에서 광을 측정하고 이 파장들은 조직 내의 화학물질의 예상 라만 시프트된 파장의 파장에 근접하는, 제1 방출광 지향 단계와,광 센서를 통한 제1 방출광에 특정한 각각의 측정치를 각각의 광 센서로부터 획득하는 단계와,제1 광이 꺼지면, 제2 광을 발생시키고 제2 광으로 조직의 일부를 조사하는 단계와,조직으로부터 제2 방출광을 포획하는 단계와,복수의 광센서로 제2 방출광을 지향시키는 단계로서, 각각의 광센서는 상이한 파장에서 광을 측정하고 이 파장들은 조직 내의 화학물질의 예상 라만 시프트된 파장의 파장에 근접하는, 제2 방출광 지향 단계와,광 센서에서의 제2 방출광에 특정한 각각의 측정치를 각각의 광 센서로부터 획득하는 단계와,조직 내의 화학물질의 농도를 계산하기 위해 제1 방출광의 측정치와 제2 방출광의 측정치를 이용하는 단계를 포함하고,화학물질의 농도를 계산하기 위해 측정치를 이용하는 단계는, 측정치로부터 형광의 백그라운드 수준을 제거하는 라만 비율을 얻기 위해 광 센서를 통한 제1 방출광에 특정한 각각의 광 센서로부터의 측정치를, 광 센서를 통한 제2 방출광에 특정한 각각의 광 센서로부터의 측정치로 나누는 단계를 포함하는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제31항에 있어서, 제1 및 제2 광은 발광 다이오드에 의해 생성되는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제31항에 있어서, 제1 및 제2 광은 제1 및 제2 필터를 각각 통과하는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제31항에 있어서, 제1 필터는 471.3 ㎚의 광만을 통과시키고, 제2 필터는 473 ㎚의 광만을 통과시키는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제34항에 있어서, 제1 및 제2 방출광은 4개의 균등부로 각각 분할되고, 4개의 균등부는 4개의 광 센서로 지향되는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제35항에 있어서, 제1 광 센서는 505.8 ㎚의 광을 측정하고, 제2 광 센서는 507.8 ㎚의 광을 측정하고, 제3 광 센서는 509.8 ㎚의 광을 측정하고, 제4 광 센서는 511.8 ㎚의 광을 측정하는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제31항에 있어서, 제1 및 제2 방출광은 4개의 광 센서로 지향되는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제37항에 있어서, 제1 및 제2 방출광의 각각은 각 광의 균등부가 각각의 광 센서로 지향된 채로 균등하게 분할되는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제31항에 있어서, 조직 내의 화학물질의 농도를 계산하기 위해 제1 방출광의 측정치와 제2 방출광의 측정치를 이용하는 단계는 라만 비율과 조직으로부터의 형광의 평균 수준을 곱하는 단계를 더 포함하는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제39항에 있어서, 형광의 평균 수준은 조직의 일부가 제2 광으로 조사될 때 측정된 평균 PMT 전압에 의해 근사되는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제39항에 있어서, 조직으로부터의 형광의 평균 강도 수준은 조직으로부터의 라만 시프트된 방출의 강도보다 적어도 50배 더 큰 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제31항에 있어서, 조직 내의 화학물질의 농도를 계산하기 위해, 표준화 데이터를 수집하는 단계와, 제1 방출광의 측정치와 제2 방출광의 측정치를 갖는 표준화 데이터를 이용하는 단계를 더 포함하는 화학 물질 농도 측정 방법.
- 제31항에 있어서, 광 센서는 광전자 배증관인 화학 물질 농도 측정 방법.
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