KR101299013B1

KR101299013B1 - 망고스틴 추출물을 포함하는 색소화 질환의 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101299013B1
Application number: KR1020100093096A
Authority: KR
Inventors: 박장서; 압둘 하미드 마리아니; 로지 사르미디 모하마드
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-14
Filing date: 2010-09-27
Publication date: 2013-08-23
Also published as: KR20110115066A

Abstract

본 발명은 망고스틴 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 멜라닌 합성을 유도하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 망고스틴 잎 추출물은 멜라닌의 합성을 촉진시키는 바, 색소화 질환의 치료제 또는 셀프-태닝용 화장품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

망고스틴 추출물을 포함하는 색소화 질환의 치료용 조성물 {Composition for Treatment of Pigmentation Disorders Containing the Extract of Mangosteen}

본 발명은 망고스틴 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 망고스틴 잎 추출물은 멜라닌의 합성을 촉진시키는 바, 망고스틴 잎 추출물을 포함하는 색소화 질환의 치료제 또는 셀프-태닝용 화장품에 관한 것이다.

멜라노제네시스 (melanogenesis)는 멜라닌 합성 과정으로, 많은 요인에 의해 유도된다. 생체 내에서는 멜라닌 합성 자극 호르몬인 α-MSH, cAMP 촉진물질 및 자외선 등으로 인해 발생하게 된다.

한편, 백반증은 멜라노사이트의 사멸 또는 괴사로 인한 여러 가지 크기 및 형태의 백색반이 피부에 나타나는 후천성 탈색소 질환이다. 전 세계적으로 인구의 약 1%에서 나타나는 비교적 흔한 질환으로, 인종이나 지역에 따른 차이는 없다. 발생 연령은 10~30세에서 가장 많고, 95%의 경우 40세 이전에 발병하고, 환자의 30%에서 가족력이 있다.

백반증은 초기에는 탈색 정도가 뚜렷하지 않으나 시간이 경과하면서 뚜렷해지는 경우가 많으며, 정상 피부와의 경계가 뚜렷하지 않을 수도 있으나, 정상 피부색보다 진하면서 뚜렷하게 나타날 수 있다. 드물게는 가려움을 느끼기도 한다. 털이 있는 부위, 특히 머리카락, 눈썹부위에 흰 반점이 나타나는 경우는 흰 털이 자라기도 한다. 백반증은 피부의 어디에나 발병할 수 있으나, 특히 손가락, 발가락, 무릎, 팔꿈치 등의 뼈가 돌출한 부위, 입 주위, 코 주위, 눈 주위, 겨드랑이, 손목 안쪽 등에서 자주 발생한다. 상처가 쉽게 생기는 부위에서 특히 잘 발생한다. 백반증은 좌우 대칭적이거나, 신경에 따른 분포를 보이기도 한다. 백반증은 단순히 피부에 흰 반점이 나타나는 경우 외에 눈의 홍채와 망막의 색소이상을 동반할 수 있으며, 당뇨병, 악성 빈혈, 갑상선 기능 저하 또는 항진, 다운 증후군, 담즙성 간경변, 위암, 아디손병, 원형탈모증, 홍반성 낭창 등의 자가면역질환과 병발할 수 있다.

현재 일반적으로 이용되고 있는 백반증의 치료방법에는 소랄렌 (psoralen) 자외선 요법, 스테로이드의 국소 및 전신 치료, 외과적 치료 등이 있다. 소랄렌 자외선 요법은 광화학 요법이라 칭하며, 소랄렌을 복용한 후 전신적인 자외선 조사를 하거나 소랄렌을 바른 후 부분적으로 자외선을 조사하는 것이다. 이는 장기적인 치료가 필요하므로 자외선 조사에 의한 피부 노화나 피부암의 발생 위험이 있다. 스테로이드 치료는 병변 부위가 적을 때는 국소 도포나 트리암시놀론을 이용한 국소주사를 시행하고, 광범위하게 퍼져 있으면 전신 투여를 시행한다. 이 또한 장기적인 치료를 요하므로 피부 및 전신적인 부작용을 유발할 위험이 있다. 외과적 치료는 수술에 의해 멜라노사이트를 이식하는 방법으로, 피부 이식과 세포 이식으로 나눌 수 있으며, 피부 이식을 위해서는 전층, 증간층 및 표피 이식이 사용되고 있다. 이러한 방법은 항상 사용될 수 있는 방법이 아니고 병변이 수년간 번지지 않은 경우에만 사용할 수 있다.

상기 방법 중 가장 일반적으로 사용되고 있는 방법은 스테로이드 외용제를 이용한 치료인데, 이를 장기간 사용하게 되면 피부 수축을 포함한 부작용이 나타나게 되므로 이를 해결하기 위한 방법이 필요하다.

본 발명자는 상기의 문제점을 인식하고, 생체 내에서 멜라닌 합성을 촉진하는 물질을 개발하기 위해 노력한 결과, 열대 추출물 특히 망고스틴 추출물이 멜라닌 합성 자극 호르몬인 α-MSH의 도움 없이도 멜라닌 합성을 촉진시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 색소화 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 색소화 질환의 개선을 위한 화장료 조성물 또는 셀프-태닝용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 망고스틴 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 망고스틴 잎 추출물로서, 물로 추출되는 것이 바람직하다.

또한 상기 색소화 질환은 저색소화증 (hypopigmentation), 백반증, 부분 백피증 (piebaldism), 점상 백피증 (leukoderma), 화학물질에 의한 백피증(leukoderma), 탈색소 모반, 백색 비강진 (piryriasis alba) 또는 염증 후 탈색증을 포함한다.

또한 상기 망고스틴 추출물은 4㎍/ml ~ 32㎍/ml (w/v)의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 망고스틴 추출물을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 색소화 질환의 개선을 위한 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 망고스틴 추출물을 유효성분으로 포함하는 셀프-태닝용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 의하면 망고스틴 잎 추출물은 멜라닌 합성을 촉진시키고, 멜라닌 합성 촉진인자로 알려진 α-MSH 및 포스콜린보다 멜라닌 합성 촉진효과가 뛰어난 바, 백반증을 포함한 색소화 질환을 효과적으로 치료할 수 있으며, 셀프 태닝 제품 등으로도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 망고스틴 잎 추출물의 독성 여부를 알아보기 위해 MTT assay 한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 α-MSH 없이 망고스틴 잎 추출물만을 세포에 처리하였을 때 분비되는 멜라닌 양을 나타낸 것이다.
도 3은 망고스틴 잎 추출물과 α-MSH 을 함께 세포에 처리했을 때 분비되는 멜라닌 양을 나타낸 것이다.
도 4는 α-MSH 존재 하에 망고스틴 잎 추출물을 처리했을 때 티로시나아제 활성효과를 나타낸 것이다.
도 5는 zymography를 통해 망고스틴 잎 추출물의 티로시나아제 발현효과를 나타낸 것이다.
도 6은 α-MSH 존재 하에 망고스틴 잎 추출물을 처리했을 때 MITF 및 티로시나아제의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 것이다.

본 발명은 망고스틴 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 함유되는 망고스틴 (mangosteen)은 고추나무과로 분류되며, 'Garcinia mangostana'라는 학명을 갖는 쌍떡잎식물 무환자나무목 고추나무과의 상록교목이다. 나무의 높이는 약 10m에 직경은 약 1m이며, 말레이시아가 원산지로 현재는 인도네시아, 말레이시아, 타이완, 필리핀, 인도, 스리랑카 등지에 분포되어 있다. 이러한 망고스틴 열매 (이하, '망고스틴'이라 한다)는 약간 납작한 공 모양으로 탁구공보다 다소 크며, 지름 4~7cm이며 꽃이 핀 다음 5개월 뒤에 자줏빛을 띤 검은색으로 익고 꽃받침이 붙어 있고, 종자는 방사상으로 늘어서고 종자 겉에 붙은 육질부를 먹는다. 특히, 망고스틴은 향기가 있고 새콤달콤하여 열매 중의 여왕이라고 할 정도로 맛이 뛰어나며, 20% 가까이가 당분이기 때문에 단맛이라면 견줄만한 과일이 없을 정도로, 과육의 색소에는 타닌이 들어 있어 쉽게 색이 변하지 않는 다는 특징을 가지고 있다.

상기 조성물에서 망고스틴 추출물은 잎 추출물이 바람직하다.

상기 망고스틴 잎 추출물은 해당 기술 분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 천연물 추출방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

망고스틴 잎 추출물은 물 또는 유기용매로 추출하여 얻을 수 있는데, 유기용매로는 저급 알코올, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 사용할 수 있다. 저급 알코올로는 탄소수 1-4인 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 사용할 수 있다.

바람직하게는 물로 추출하는 것이다.

본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 색소화 질환은 저색소화증 (hypopigmentation), 백반증 (vitiligo), 부분 백피증 (piebaldism), 점상 백피증 (leukoderma), 화학물질에 의한 백피증 (leukoderma), 탈색소 모반, 백색 비강진 (piryriasis alba) 또는 염증 후 탈색증이며, 가장 바람직하게는 백반증이다.

본 발명의 일 실시예에서는, 망고스틴 잎 추출물을 멜라노마 세포에 처리했을 때 α-MSH 및 포스콜린 (forskolin)보다 멜라닌 합성 촉진 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었으며, 세포 독성이 없었다.

따라서 본 발명의 망고스틴 잎 추출물을 포함하는 조성물은 색소화 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화되어 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 약제학적 단위 투여형의 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 유제, 시럽제 등 경구 투여용 제형, 에어로졸제, 멸균 주사제, 좌제 및 경피 투여용 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는 유당, 포도당, 백당, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 옥수수전분, 감자전분, 아라비아 고무, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 정제수, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산프로필, 탈크, 스테아린산마그네슘을 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제형화한다.

한 가지 형태의 예로서, 본 발명의 망고스틴 추출물을 함유하는 조성물은 경구 투여용 고형 제제로 제형화할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되는데, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 백당 또는 유당, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

다른 형태의 예로서, 본 발명의 망고스틴 추출물을 함유하는 조성물은 경구 투여용 액상 제제로 제형화하여 사용될 수도 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 이러한 액상 제제에는 통상적으로 사용되는 불활성 희석제 (예를 들면, 정제수, 에탄올, 유동파라핀) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또 다른 형태의 예로서, 본 발명의 망고스틴 추출물을 포함하는 조성물은 비경구용 제제로 제형화할 수도 있다. 망고스틴 추출물을 함유하는 비경구용 제제로는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁주사제, 유제형 주사제, 동결건조 주사제 등이 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 망고스틴 추출물의 유효량은 투여경로, 제형, 사용하는 목적, 환자의 질환의 정도 등에 따라 광범위한 범위 내에서 결정될 수 있다. 상기에서"유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 망고스틴 추출물은 4㎍/ml ~ 32㎍/ml (w/v)의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 망고스틴 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소화 질환의 개선을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 추출물은 망고스틴의 잎 추출물이다.

상기 색소화 질환은 저색소화증 (hypopigmentation), 백반증, 부분 백피증 (piebaldism), 점상 백피증 (leukoderma), 화학물질에 의한 백피증 (leukoderma), 탈색소 모반, 백색 비강진 (piryriasis alba) 또는 염증 후 탈색증을 포함하며, 바람직하게는 백반증이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 외용제 또는 화장품 등으로 제형화될 수 있다. 상기 피부 외용제는 연고제, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 화장품은 기초 화장품, 메이크업 화장품, 바디 화장품, 면도용 화장품 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 기초 화장품의 예로는 크림, 화장수, 팩, 마사지 크림, 유액 등이 있으며, 상기 메이크업 화장품의 예로는 파운데이션, 메이크업 베이스, 립스틱, 아이새도, 아이라이너, 마스카라, 아이브로우 펜슬 등이 있으며, 바디 화장품의 예로는, 비누, 액체 세정제, 입욕제, 선스크린 크림, 선 오일 등이 있으며, 면도용 화장품의 예로는 애프터 셰이브로션, 셰이빙 크림 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 망고스틴 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함될 수 있다.

발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린싱인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 망고스틴 추출물을 유효성분으로 포함하는 셀프-태닝 (self-tanning)용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 태닝 조성물은 멜라닌의 합성을 증가시켜 검은 피부를 갖게 해준다. 본 발명의 셀프 태닝 화장료는 종래의 화장료 기제에 상기 필수 성분을 배합함으로써 제조된다. 본 발명의 셀프 태닝 화장료에는 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서 다른 성분을 배합할 수 있다. 예컨대 분말 성분, 액체 유지, 고체 유지, 납(蠟), 탄화 수소, 고급 지방산, 고급 알코올, 에스테르, 실리콘, 음이온 계면 활성제, 양이온 계면 활성제, 양쪽성 계면 활성제, 비이온 계면 활성제, 보습제, 수용성 고분자, 증점제, 피막제, 자외선 흡수제, 금속 이온 봉쇄제, 저급 알코올, 다가 알코올, 당, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀전, pH조정제, 피부 영양제, 비타민, 산화 방지제, 산화 방지 보조제, 향료, 물 등을 필요에 따라 적당히 배합하고 목적으로 하는 제형에 따라 상법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 셀프 태닝 화장료의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 사용감 및 안정성의 점에서 유중수형 유화 조성물이 바람직하다. 그리고 상기 무기 안료 분말은 유상 중에 분산시키는 것이 바람직하다. 유상 중에 분산시킴으로써 무기 안료 분말을 원하는 함유량만큼 안정적으로 배합할 수 있다. 그 결과, 즉시성이 있는 착색 효과 (즉 연출 효과)가 뛰어난 메이크업 화장료적인 셀프 태닝 화장료를 제공할 수 있다.

유중수형 유화 조성물의 셀프 태닝 화장료에 있어서, 무기 안료 분말을 분산시키는 유상을 구성하는 유분은 특별히 한정되지 않는다. 예컨대 하기의 유분을 사용할 수 있다. 유상은 셀프 태닝 화장료 전량에 대하여 통상 10∼60질량%이며, 20∼40질량%가 바람직하다. 하기 유분 이외에 유상 중에는 약제 등의 유용성 성분을 배합하는 것도 가능하다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 세포 및 시료의 준비

본 발명에서는 B16F1 멜라노마 세포 (melanoma cell)를 사용하여 망고스틴 추출물의 멜라닌 합성 효과를 관찰하였다. B16F1 멜라노마 세포 (melanoma cell)는 한국 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다. MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl tetrazolium bromide), α-MSH (α-Melanocyte stimulating hormone), DMSO (Dimethyl sulfoxide) 및 forskolin (FSK)은 Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. DMEM (Dulbecco's modified eagle's medium), FBS (Fetal bovine serum) 및 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)은 Welgene (Daegu,Korea)에서 구입하였고, 티로시나제, MITF 및 β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotech (SantaCruz,CA,USA)에서 구입하였다.

<실시예 2> 망고스틴 잎 추출물의 준비

망고스틴 잎은 Toko Tenaga Keluarga Sdn Bhd, Johor, Malaysia에서 구매하였다.

잎을 물로 세척하고 즉시 45-50℃에서 진공 건조기로 8시간 가량 건조시켰다. 건조된 잎을 10HP Stainless Steel Powder Grinder PG-10 (SUS)를 이용하여 100mesh정도로 만들었다. 20kg의 망고스틴 잎을 임의로 선택하여 mechanical extractor stainless steel 100 liter tank을 사용하여 더 추출하였다. 건조 망고스틴 잎과 물의 비율이 1:16이 되도록 100℃, 2% brix에서 2시간가량 추출하였다.

<실시예 3> 세포 배양

B16F1 멜라노마 세포 (melanoma cell)를 1.5ⅹ10⁵cells/well의 농도로 6-웰 플레이트에 분주하고, 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)이 함유된 Dulbecco's modified essential medium (DMEM)에 첨가하여 37℃, 6% CO₂상태에서 배양시켰다.

24시간 배양 후, 5nM의 α-MSH와 적당 농도의 망고스틴 잎 추출물이 함유된 새로운 배지로 교체하고, 48시간 더 배양하였다. α-MSH 처리하지 않은 DMEM은 음성 대조군으로 사용하였고, α-MSH 5nM과 포스콜린 (forskolin) 10μM을 처리한 군을 양성대조군으로 사용하였다.

<실시예 4> 세포 독성 실험

독성 실험은 MTT assay를 이용하였다.

상기 MTT assay는 배양 후 세포에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 처리한 후, 이 물질이 포르마잔 (formazan)으로 환원되어진 양을 측정하여 이루어질 수 있으며, 대사능력이 정상인, 즉, 살아있는 세포의 상대적인 수를 가늠할 수 있다.

48시간 배양 후, 배지를 제거하고, 세포를 MTT 용액과 함께 37℃에서 90분간 배양하였다. 배양 후, MTT 용액을 제거하고, 0.04N HCl-이소프로필 알코올 (HCl - isopropyl alcohol) 용액으로 30분간 상온에서 배양하였다. 회수한 용액은 13,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 마이크로플레이트 리더 (microplate reader (Perkin Elmer, USA))를 사용하여 570nm에서 침전물의 흡광도를 관찰하였다.

그 결과, 망고스틴 잎 추출물은 4㎍/ml ~ 32㎍/ml (w/v) 농도에서는 세포 생존력에 영향을 미치지 않았다. 즉, 망고스틴 잎 추출물은 상기 멜라노마 세포에 독성이 없었다 (도 1). 다만, 망고스틴 잎 추출물의 농도가 32㎍/ml (w/v) 초과일 때 세포 생존력이 약간 감소되었다.

<실시예 5> 망고스틴 잎 추출물의 멜라닌 생성 효과

분비되는 멜라닌의 분석은 기존의 공지된 방법으로 수행하였다. 48시간 배양 후, 배지를 수확하여 10,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 분비된 멜라닌의 비율은 하기의 수학식으로 측정하였다.

[분비된 멜라닌 (%) = (C-A)/Bⅹ100]

상기 식에서 A 는 각 샘플 (배양 전)이 함유된 배지의 흡광도를 나타내고, B는 α-MSH를 처리하지 않은 배지의 흡광도 (48시간 배양 후 수확된 배지), C는 각 샘플이 포함된 배지의 흡광도 (48시간 배양 후 수확된 배지)를 나타낸다.

추출물의 농도를 4㎍/ml, 8㎍/ml, 16㎍/ml 및 32㎍/ml (w/v)로 달리하여 B16F1멜라노마 세포에 2일간 처리하였다. α-MSH를 처리하지 않은 경우 (도 2)와 처리한 경우 (도 3)를 나누어 실험하였다.

우선, 멜라닌 합성 자극 호르몬인 α-MSH의 처리 없이 망고스틴 잎 추출물만을 세포에 처리하여 멜라닌 합성 유도 여부를 알아보았다. 그 결과 멜라닌 합성 자극 호르몬인 α-MSH의 도움 없이도 망고스틴 잎 추출물의 농도 의존적으로 α-MSH 만큼의 멜라닌 합성 능력을 보여주었다 (도 2). α-MSH를 처리하지 않은 경우, 망고스틴 잎은 α-MSH와 같은 역할을 하였다. 망고스틴 잎 추출물을 처리한 군은 음성대조군과 비교했을 때 최고 3.5배 정도 멜라닌 합성 (melanogenesis)이 촉진되었다. 유사 농도에서 망고스틴 잎의 멜라닌 합성 촉진 효과는 α-MSH 및 포스콜린 (forskolin (FSK))을 처리한 대조군보다 더 높았다.

또한 α-MSH 및 포스콜린을 처리한 양성대조군과 망고스틴 잎 및 α-MSH를 처리한 군에서 멜라닌의 함량을 비교하였다. α-MSH 및 포스콜린은 cAMP 촉진물질로 알려져 있으며, cAMP경로는 멜라노제네시스의 신호경로 중 하나이다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 망고스틴 잎과 α-MSH를 처리한 경우 α-MSH 만을 처리한 경우에 비해서는 최고 2.5배정도 멜라닌의 함량이 높았으며, α-MSH 및 포스콜린을 함께 처리한 경우보다는 최고 1.8배 정도 멜라닌의 함량이 높았다. 즉, α-MSH와 망고스틴 잎 추출물을 혼합하여 세포에 투여했을 때 시너지 효과를 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 종합하면, 망고스틴 잎 추출물은 멜라노사이트의 증식에는 영향을 미치지 않으나, 멜라노제네시스를 촉진함을 알 수 있다.

<실시예 6> 망고스틴 잎 추출물의 티로시나아제 활성도에 미치는 영향

망고스틴 잎 추출물에 의한 멜라닌 합성 기전을 알아보기 위해 멜라닌 측정에서 사용했던 동일 농도로 망고스틴 잎 추출물을 B16F1 멜라노마 세포에 처리하여 관찰하였다. 티로시나아제는 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 바, 망고스틴 잎 추출물의 티로시나아제의 활성효과를 확인하였다.

멜라닌의 합성 증가가 티로시나아제 활성증가로 인한 것인지 확인하기 위해 망고스틴 잎 추출물을 처리하여 배양한 B16F1 멜라노마 세포의 세포 내 티로시나아제의 활성을 측정하였다.

티로시나아제의 활성도는 DOPA oxidase의 활성도로 측정하였다. 동일양의 세포 용해물을 L-DOPA 를 포함하는 산화 반응에 적용시켜 측정하였다. 보다 구체적으로는, 48시간 배양 후, 세포를 PBS로 세척하고, 프로테아제 억제제 (protease inhibitor)가 첨가된 RIPA 세포 용해 완충액과 반응시켰다. 세포 용해물은 13,000rpm으로 15분간 원심분리하여 얻었으며, Bradford assay 에 따라 단백질을 정량하였다. 그런 후, 10μl 의 10mM L-DOPA 를 첨가하여 상온에서 1시간동안 배양하고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, α-MSH만을 처리했을 때 세포 내 티로시나아제의 활성은 음성 대조군에 비해 2배 정도 증가하였으며, 포스콜린 처리한 군에서는 2.3 배 증가하였고, 망고스틴 잎 추출물을 처리한 군에서는 2.8배 증가하였다 (도 4).

즉, 멜라닌 레벨과 함께 세포 내 티로시나제의 활성또한 망고스틴 잎 추출물의 농도 의존적으로 증가하였다.

<실시예 7> zymography를 통한 티로시나아제 활성 측정

망고스틴 잎 추출물의 티로시나아제 활성메커니즘을 보다 명확히 알아보기 위해 B16F1 멜라노마 세포에서의 티로시나아제 발현 정도를 티로시나아제 zymography를 통해 알아보았다. 티로시나아제 zymography는 공지된 방법으로 수행하였다. 각 샘플을 zymogram 샘플 버퍼와 혼합한 후, 8% SDS-PAGE에 로딩시켰다. SDS-PAGE 수행 후, 겔을 0.1M sodium phosphate buffer로 옮겼다. 겔을 0.1M sodium phosphate buffer 내에서 10 mM L-DOPA로 1시간 동안 염색시켰다.

도 5에서와 같이, α-MSH 및 FSK을 처리한 대조군에 비해 망고스틴 잎 추출물을 처리한 세포에서 티로시나아제의 발현이 명확하고 진했다. 상기 결과는 망고스틴 잎 추출물 처리 세포에서 티로시나아제의 활성이 증가됨을 다시 한번 확인시켜주었다. α-MSH 만을 처리한 군에서 진하게 염색된 티로시나아제 밴드를 확인하였다. α-MSH 및 포스콜린을 함께 처리한 군에서 그 색이 더 진했으며, 망고스틴 잎 추출물을 처리한 군에서는 더 명확하고 색이 진했다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 16㎍/ml 및 32㎍/ml의 망고스틴 잎 추출물을 처리한 경우 α-MSH 및 FSK을 처리한 경우보다 티로시나아제 분해효과가 더 뛰어났다.

<실시예 8> MITF 및 티로시나아제의 발현

티로시나아제 유전자 계통이 멜라노제네시스 조절에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 티로시나아제는 멜라닌 합성 시 속도-제한단계를 촉진시킨다고 알려져 있으며, 멜라노사이트와 멜라노마 세포에서 분화 마커로서 잘 알려져 있다.

b-HLH (basic-helix-loop-helix) 및 b-HLH-루신 지퍼 모티브를 가지고 있는 MITF도 멜라닌 발현의 전사인자로서 매우 중요한 역할을 한다. 멜라닌 합성과 관련된 인자인 티로시나아제와 MITF의 높은 발현은 멜라닌 합성의 증가를 의미한다. 따라서 멜라닌 합성을 유도하는 망고스틴 잎 추출물의 메커니즘을 알아보기 위해 본 발명자는 티로시나제 및 MITF 유전자의 면역블롯 분석을 수행하였다.

각 샘플을 전기영동 샘플 버퍼와 혼합시키고, 85℃에서 5분간 변성시킨 후, 8% SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis)로 로딩하였다. 수행 후, 단백질을 PVDF 멤브레인에 부착시키고, 5% 탈지유로 반응시켰다. 항-티로시나제 (Santa cruz), 및 항-MITF (microphthalmia-associated transcription factor, Santa cruz)를 1차 항체로 사용하였고, 항-염소 IgG-HRP 및 항-마우스 IgG-HRP를 2차 항체로 사용하였다. 멤브레인에 있는 모든 단백질 밴드는 ECL solution (Perkin Elmer)으로 검출하였다.

그 결과, 망고스틴 잎 추출물을 처리한 후에 티로시나아제 및 MITF의 발현이 유의적으로 증가되었으며, 이는 망고스틴 잎 추출물의 농도와 비례하였다 (도 6). 5 nM α-MSH 및 10μM 포스콜린만을 처리한 세포와 비교했을 때 망고스틴 잎 추출물을 처리한 군에서의 MITF 및 티로시나제의 발현은 명확하고 뚜렷했다.

Claims

망고스틴 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 망고스틴 잎 추출물은 망고스틴 잎의 물 추출물인 것을 특징으로 하는 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 색소화 질환은 저색소화증 (hypopigmentation), 백반증, 부분 백피증 (piebaldism), 점상 백피증 (leukoderma), 화학물질에 의한 백피증(leukoderma), 탈색소 모반, 백색 비강진 (piryriasis alba) 또는 염증 후 탈색증인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 망고스틴 잎 추출물은 4㎍/ml ~ 32㎍/ml (w/v)의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
망고스틴 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 생성을 촉진하는 색소 침착용 화장료 조성물.
삭제
삭제
망고스틴 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 셀프-태닝용 화장료 조성물.