KR101286347B1

KR101286347B1 - 덱스트란 설페이트를 포함하는 블록공중합체로 도포된 산화철 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 동맥경화 진단용 조영제

Info

Publication number: KR101286347B1
Application number: KR1020110141744A
Authority: KR
Inventors: 박재형; 권익찬; 김광명; 유동길; 윤홍열; 한화승
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2011-12-23
Filing date: 2011-12-23
Publication date: 2013-07-15
Also published as: KR20130073741A

Abstract

본 발명은 덱스트란 설페이트를 포함하는 블록공중합체로 도포된 산화철 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 동맥경화 진단용 조영제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트(PGMA)와 덱스트란 설페이트의 블록공중합체를 산화철 나노입자의 표면에 도포하여 얻은 블록공중합체로 표면이 개질된 산화철 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 동맥경화 진단용 조영제에 관한 것이다.

Description

덱스트란 설페이트를 포함하는 블록공중합체로 도포된 산화철 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 동맥경화 진단용 조영제{Iron oxide hybrid nanoparticles coated with block copolymer containing dextran sulfate, a preparation method thereof and a contrast agent for atherosclerosis imaging comprising the same}

동맥경화증은 지방을 많이 함유하는 플라그(plaques)가 동맥 내에 축적되면서 혈관의 탄력성이 감소하고 동맥이 좁아지는 질병으로서, 궁극적으로 혈압이 상승하고 동맥벽이 협착 되면서 심근경색, 협심증, 뇌졸중, 말초혈관 질환 등을 유발한다.

동맥경화 부위는 X-ray, CT, MRI 등의 장비를 이용하여 진단이 가능하지만, 현재의 기술로는 동맥경화로 인해 혈관이 협착되는 말기 단계에서 진단이 가능하다. 플라그가 축적되어 혈관이 좁아진 경우에는 이미 동맥경화가 상당히 진행된 상태이기 때문에 약물치료로는 완치가 불가능하다. 따라서, 동맥경화를 발견한 시점에는 이미 병이 상당히 악화되어 혈관 확장술(angioplasty)을 시행하거나 스텐트(stent)를 삽입하여 치료해야 한다. 한편, 동맥경화 초기시점에 혈관에 모여드는 활성화된 대식세포 또는 거품세포(지방을 탐식한 대식세포)에 특이적으로 결합하는 조영제를 개발할 경우 동맥경화증의 조기진단이 가능하여 환자를 외과적 시술 없이 효과적으로 치료할 수 있다.

최근에 MRI를 이용하여 동맥경화 부위를 진단하기 위하여 다양한 조영제가 개발되고 있으며, 특히 동맥경화 부위의 특성을 이용하여 표적지향성을 높인 조영제가 집중적으로 개발되고 있다(Zahi A. Fayad et al., Nat Rev Drug Discov ., 2004, 3, 913-925). 현재 표적지향형 조영제로는 동맥경화 부위의 피브린(fibrin), 혈전 내에 활성화되어 있는 혈소판(platelet), 신생혈관의 내피세포 표면에 존재하는 α_vβ₃ 인테그린 등을 표적으로 한 조영제가 개발되고 있으며, 주로 단일클론 항체(monoclonal antibody)와 펩타이드(peptide)를 조영제에 화학적으로 결합시킨 형태로 개발되고 있다(Umar Mahmood et al., Radiology, 2001, 219, 316-333).

그러나, 대부분의 조영제가 생체 내에서 불안정하며, 동맥경화가 상당부분 진행된 단계에서 진단 가능한 형태로 개발되고 있어, 조기진단에는 적용이 어려운 실정이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트(PGMA)와 덱스트란 설페이트의 블록공중합체를 제조하고, 상기 블록공중합체를 산화철 나노입자에 도포하여 블록공중합체로 표면이 개질된 산화철 나노입자를 제조한 다음, 상기 표면이 개질된 산화철 나노입자가 우수한 초상자성을 가지며, 현재 MRI용 조영제로 임상에 적용되고 있는 덱스트란으로 도포된 산화철 나노입자와 비교할 때, 수성환경에서 응집현상 없이 일주일 이상 안정하고 활성화된 대식세포에 보다 선택적으로 결합한 후 흡수될 수 있어 동맥경화증의 조기진단용 조영제로서 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 수성환경에서 안정하고 활성화된 대식세포에 보다 선택적으로 결합한 후 흡수될 수 있는, 덱스트란 설페이트를 포함하는 블록공중합체로 도포된 산화철 복합 나노입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 산화철 복합 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 산화철 복합 나노입자를 포함하는 동맥경화 진단용 조영제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 블록공중합체를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은

산화철 나노입자; 및

상기 산화철 나노입자의 표면에 도포된 블록공중합체를 포함하고,

상기 블록공중합체는 덱스트란 설페이트의 말단이 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트로 수식된 것인 산화철 복합 나노입자를 제공한다.

본 발명에서, 상기 블록공중합체는 덱스트란 설페이트와 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트(PGMA)가 아미노기를 통해 결합된 형태이다.

바람직하기로, 상기 블록공중합체는 하기 화학식 1의 블록공중합체이다.

[화학식 1]

상기 식에서,

n은 10 내지 1000의 정수이고,

m은 2 내지 1000의 정수이다.

본 발명에서, 상기 블록공중합체의 분자량은 2,000 내지 1,000,000의 범위로 다양하게 제조할 수 있다.

본 발명에서, 상기 산화철 복합 나노입자의 크기는 10 내지 500 ㎚이다.

본 발명에서, 상기 블록공중합체의 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트 부분의 다이올기는 산화철 나노입자의 표면에 결합되며, 상기 블록공중합체의 덱스트란 설페이트 부분은 나노입자의 외부에 위치하는 것을 특징으로 한다.

덱스트란 설페이트는 동맥경화 초기에 병변부위에 존재하는 활성화된 대식세포(activated macrophage) 표면의 마크로파지 스캐빈저 리셉터 클래스 A(macrophage scavenger receptor class A, 이하 SR-A)에 특이적으로 결합하는 특징이 있다.

한편, 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트(PGMA)는 주쇄의 반복단위에 1,2-다이올 작용기가 포함되어 있으며, 상기 1,2-다이올 작용기가 산화철 나노입자의 철 원자와 5원 킬레이트 고리(five-membered chelate ring)를 형성하여, 수성환경에서 매우 안정한 장점이 있다.

본 발명에서는 동맥경화의 조기진단을 가능하게 하는 덱스트란 설페이트와 산화철 나노입자의 표면에 강하게 결합될 수 있는 PGMA의 블록공중합체를, 자기공명영상용 조영제로 사용되는 산화철 나노입자 표면에 도포하여 얻은 산화철 복합 나노입자를 제공한다.

본 발명의 블록공중합체로 도포된 산화철 복합 나노입자는 상자기성을 나타내며, 표면이 덱스트란 설페이트함유 블록공중합체로 도포되어 생체 환경에서 응집되지 않고 수성 환경에서 안정하고, 생체적합성이 우수하여 인체에 무해하며, 동맥경화증 초기에 분포하는 활성화된 대식세포에 선택적으로 결합하기 때문에 동맥경화 부위에 전달 및 축적이 용이한 특성이 있어, 동맥경화 조기진단용 조영제로 응용이 가능하다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 산화철 복합 나노입자의 제조방법을 제공한다.

1) 글리세롤 모노메타크릴레이트를 사슬이동제로서 시스테아민을 사용하여 라디칼 중합시켜 하기 화학식 2의 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트를 제조하는 단계(단계 1);

2) 상기 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트를 하기 화학식 3의 덱스트란 설페이트와 반응시켜 하기 화학식 1의 블록공중합체를 제조하는 단계(단계 2); 및

3) 상기 블록공중합체를 산화철 나노입자의 표면에 도포시키는 단계(단계 3).

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 식에서,

n은 10 내지 1000의 정수이고,

m은 2 내지 1000의 정수이다.

상기 단계 1은, 글리세롤 모노메타크릴레이트를 사슬이동제로서 시스테아민을 사용하여 라디칼 중합시켜 화학식 2의 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트(PGMA)를 제조하는 단계로서, 시스테아민(cysteamine)을 사슬이동제(chain transfer agent)로 사용하여 글리세롤 모노메타크릴레이트를 라디칼 중합(radical polymerization)시켜 한쪽 말단에 아민기를 함유한 화학식 2의 PGMA-NH₂를 제조하는 단계이다.

상기 단계 1)의 라디칼 중합은 촉매로서 아조비스이소뷰티로나이트릴(AIBN), 또는 벤조일 퍼옥사이드(benzoyl peroxide) 등을 사용하여 수행할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 1)의 라디칼 중합 온도는 60 내지 75℃인 것이 바람직하다.

상기 단계 1)의 라디칼 중합 시간은 12 내지 24시간인 것이 바람직하다.

상기 단계 2는, 상기 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트(PGMA)를 화학식 3의 덱스트란 설페이트와 반응시켜 화학식 1의 블록공중합체를 제조하는 단계로서, PGMA의 말단에 위치하는 아민기를 통한, PGMA와 덱스트란 설페이트의 환원성 아민화(reductive amination) 반응을 이용하여 화학식 1의 블록공중합체를 제조하는 단계이다.

상기 단계 2)의 반응은 NaBH₃CN, 또는 NaBH(OAc)₃(sodium triacetoxyborohydride) 등을 사용하여 수행할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 2)의 반응은 용매로서 물을 사용하여 수행하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 2)의 반응 온도는 50 내지 60℃인 것이 바람직하다.

상기 단계 3은, 상기 블록공중합체를 산화철 나노입자의 표면에 도포시키는 단계로서, 상기 단계 2에서 제조한 블록공중합체를 산화철 나노입자의 표면에 도포시켜 산화철 나노입자의 표면을 개질하는 단계이다.

상기 단계 3)은 블록공중합체와 산화철 나노입자를 공침시켜 수행할 수 있다. 상기 공침은 수(water) 중에서 수행하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 산화철 복합 나노입자를 포함하는 동맥경화 진단용 조영제를 제공한다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 동맥경화 병변부위를 확인하여 동맥경화의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명의 산화철 복합 나노입자를 포함하는 동맥경화 진단용 조영제는 동맥경화 초기에 병변부위에 존재하는 활성화된 대식세포 표면의 SR-A에 특이적으로 결합하는 특징을 갖는 덱스트란 설페이트를 포함하는 블록공중합체로 도포되어 있어, 동맥경화 조기진단용 조영제로서 사용이 가능하다.

구체적으로, 상기 산화철 복합 나노입자가 상자기성을 나타내므로, 본 발명의 산화철 복합 나노입자를 포함하는 동맥경화 진단용 조영제는 자기공명영상(MRI)용 조영제로서 사용이 가능하다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 먼저 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트(PGMA)와 덱스트란 설페이트의 블록공중합체를 제조하고, 상기 블록공중합체를 산화철 나노입자에 도포하여 블록공중합체로 표면이 개질된 산화철 나노입자를 제조하였다.

본 발명의 블록공중합체는 하기 반응식 1과 같이 제조하였다.

구체적으로, 시스테아민을 사슬이동제로 사용하여 글리세롤 모노메타크릴레이트를 라디칼 중합시켜 한쪽 말단에 아민기를 함유한 PGMA-NH₂를 합성한 다음, 상기 PGMA-NH₂를 수성환경에서 덱스트란 설페이트와 환원성 아민화 반응을 통해 접합하여 블록공중합체를 제조하였다.

[반응식 1]

상기와 같이 제조된 블록공중합체는 동맥경화증 초기의 혈관부위에 존재하는 활성화된 대식세포와 선택적으로 결합하는 덱스트란 설페이트와 산화철 나노입자와 킬레이트 결합을 통해 강하게 흡착되는 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트로 구성된다.

그 다음, 공침전법(coprecipitation method)을 통해 산화철 나노입자를 제조하는 과정에서 상기 블록공중합체를 함께 첨가하여 산화철 나노입자의 표면에 블록공중합체를 도포하여 본 발명의 덱스트란 설페이트 함유 블록공중합체로 도포된 산화철 나노입자를 제조하였다. 이때, 공중합체의 PGMA에 존재하는 시스 1,2-다이올기가 산화철 나노입자 표면과 강한 킬레이트 결합을 형성하면서 도포가 될 수 있다. 이때, 블록공중합체의 도포는 공침법을 통한 산화철 나노입자의 제조와 동시에 가능하므로 제조방법이 간단하다.

본 발명의 블록공중합체로 도포된 산화철 나노입자는 이하에 기술된 특성으로 인해 동맥경화 조영제로 활용이 가능하다. 먼저, 블록공중합체에 함유된 덱스트란 설페이트는 동맥경화 부위에 존재하는 활성화된 대식세포의 SR-A에 특이적으로 결합하는 특성이 있으므로 나노입자를 동맥경화 부위에 선택적으로 전달시킬 수 있다. 특히, 활성화된 대식세포는 동맥경화의 초기단계에 다수 분포하는 세포이기 때문에, 본 발명의 블록공중합체는 동맥경화의 조기진단을 가능하게 한다. 또한, 블록공중합체에 함유된 PGMA는 1,2-다이올 작용기를 다수 함유하고 있으므로 산화철 나노입자의 표면에 존재하는 철 원자와 킬레이트 결합을 통해 매우 안정한 도포를 가능하게 한다. 블록공중합체로 도포된 산화철 나노입자는 표면에 친수성이 강한 덱스트란 설페이트가 있기 때문에 수성환경에서 나노입자 간의 응집현상이 없이 안정하다. 따라서, 수성 환경인 생체 환경 내에서 안정하여 동맥경화 부위에 보다 안정하게 전달될 수 있다.

즉, 덱스트란 설페이트와 PGMA의 블록공중합체로 도포된 산화철 나노입자가 함유된 본 발명의 조영제는 동맥경화를 일으키는 활성화된 대식세포에 대한 선택성이 높아 표적지향성이 우수할 뿐만 아니라, 친수성 표면으로 인해 생체 내에서 안정하며 체류 기간이 길기 때문에 동맥경화 진단의 효율성을 높일 수 있다.

본 발명의 블록공중합체로 도포된 산화철 나노입자는 MRI용 조영제로서 동맥경화 진단에 사용될 수 있으며 관상동맥, 뇌동맥, 경동맥, 신동맥 등을 영상화할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실험예에서는 상기 블록공중합체의 화학적 구조를 ¹H NMR과 FT-IR을 이용하여 확인하였으며(도 2 및 도 4), TGA를 이용하여 블록공중합체가 안정적으로 도포됨을 확인하였다(도 3). 또한, 초전도 양자 간섭 장치(SQUID)를 이용한 분석을 통해 본 발명의 나노입자가 우수한 초상자성을 가지고 있음을 확인하였다(도 6). 더 나아가, 본 발명의 나노입자를 현재 MRI용 조영제로 임상에 적용되고 있는 덱스트란으로 도포된 산화철 나노입자와 비교한 결과, 수성환경에서 응집현상 없이 일주일 이상 안정함을 확인하였다(도 7). 또한, 세포실험을 통하여 본 발명의 나노입자가 활성화된 대식세포에 선택적으로 결합한 후 흡수됨을 확인하였다(도 8). 따라서, 이상의 결과로부터 본 발명의 나노입자가 동맥경화증의 조기진단용 조영제로서 유용하게 사용 가능함을 알 수 있었다.

본 발명은 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트(PGMA)와 덱스트란 설페이트의 블록공중합체를 산화철 나노입자의 표면에 도포하여 얻은, 블록공중합체로 표면이 개질된 산화철 나노입자로서, 상자기성을 나타내며, 표면이 덱스트란 설페이트 함유 블록공중합체로 도포되어 생체 환경에서 응집되지 않고 수성 환경에서 안정하고, 생체적합성이 우수하여 인체에 무해하며, 동맥경화증 초기에 분포하는 활성화된 대식세포에 선택적으로 결합하기 때문에 동맥경화 부위에 전달 및 축적이 용이한 특성이 있어, 동맥경화 조기진단용 조영제로 사용 가능한 효과가 있다.

도 1은 실시예 1에서 제조한 PGMA-NH₂를 ¹H-NMR로 분석한 결과이다.
도 2는 실시예 1에서 제조한 DS-b-PGMA를 ¹H-NMR로 분석한 결과이다.
도 3은 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자를 열중량 분석기(TGA)를 통해 분석한 결과이다.
도 4는 실시예 1에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자의 FT-IR 분석결과이다.
도 5는 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자의 형태를 투과전자현미경(TEM)으로 촬영한 사진이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자의 초전도 양자 간섭 장치(SQUID) 분석 결과이다.
도 7은 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자의 시간에 따른 크기변화를 DLS로 분석한 결과이다.
도 8은 실시예 1 및 비교예 2에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자에 대한 활성화된 RAW264.7 세포, 비활성화된 RAW264.7 세포 및 BAEC 세포에서의 세포흡수 평가 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 덱스트란 설페이트와 PGMA 의 블록공중합체로 도포된 산화철 나노입자의 제조

본 발명에 따른 덱스트란 설페이트와 PGMA의 블록공중합체로 도포된 산화철 나노입자를 하기와 같이 제조하였다.

1 단계: 아민화된 PGMA 의 제조

아민화된 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트(PGMA-NH₂) 제조에는글리세롤 모노메타크릴레이트(GMA)를 단량체로 사용하였고, 아민기 도입을 위해 시스테아민을 사슬이동제(chain transfer agent)로 사용하여 중합하였다. 촉매로는 아조비스이소뷰티로나이트릴(AIBN)을 사용하였고 용매는 다이메틸포름아마이드(DMF)를 사용하여 중합하였다.

먼저, GMA 2 g, 시스테아민 하이드로클로라이드 97.87 ㎎, AIBN 14.14 ㎎ 및 DMF 12 ㎖를 플라스크에 넣고 동결-펌프-융해 과정(freeze-pump-thaw cycle)을 3회 실시하였다. 산소가 제거된 혼합물을 60℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 혼합물을 디메틸에테르에 침전시켰다. 침전된 고분자를 40℃ 진공오븐에서 건조하여 PGMA을 획득하였다.

2 단계: 덱스트란 설페이트와 PGMA 의 블록공중합체 제조

덱스트란 설페이트(4000 g/mol)와 PGMA의 블록공중합체(DS-b-PGMA)는 환원성 아민화 반응을 통하여 합성하였다. 덱스트란 설페이트 332 ㎎을 2%(w/v) 아세테이트 버퍼(50 mM, pH=5.0)에 녹인 후, PGMA-NH₂ 200 ㎎과 촉매로서 소듐 시아노보로하이드라이드 130.4 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 50℃로 온도를 유지시킨 상태에서 96시간 동안 반응시켰다. 반응시키는 동안, 소듐 시아노보로하이드라이드 130.4 ㎎을 24시간 마다 첨가하였다. 반응이 끝난 혼합물을 4일간 투석시킨 후, 동결건조하여 DS-b-PGMA를 획득하였다.

3 단계: 블록공중합체로 도포된 산화철 나노입자의 제조

덱스트란 설페이트와 PGMA의 블록공중합체로 표면이 개질된 초상자기성 산화철 나노입자(DS-SPION)는 공침 방법을 통하여 제조하였다.

먼저, 염화철(III) 0.338 g 및 염화철(II) 0.12 g을 증류수 6.25 ㎖에 녹인 후, 수산화나트륨 0.348 g을 증류수 2.5 ㎖에 녹인 용액을 천천히 첨가하였다. 상기 수산화나트륨 수용액의 첨가에 따라 반응 용액이 어두운 갈색으로 변하였다. 상기 어두운 갈색으로 변한 용액에 상기 2 단계에서 제조한 DS-b-PGMA 137.4 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 같은 조건에서 유지시킨 후 상온으로 냉각시키고, 증류수로 수세한 후 40℃ 진공오븐에서 건조시켰다.

비교예 1: 아민화된 PGMA 로 도포된 산화철 나노입자의 제조

PGMA-NH₂로 표면이 개질된 초상자기성 산화철 나노입자(PGMA-SPION)는 공침방법을 통하여 제조하였다.

먼저, 염화철(III) 0.338 g 및 염화철(II) 0.12 g을 증류수 6.25 ㎖에 녹인 후, 수산화나트륨 0.348 g을 증류수 2.5 ㎖에 녹인 용액을 천천히 첨가하였다. 상기 수산화나트륨 수용액의 첨가에 따라 반응 용액이 어두운 갈색으로 변하였다. 상기 어두운 갈색으로 변한 용액에 상기 실시예 1의 1 단계에서 제조한 PGMA-NH₂ 137.4 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 같은 조건에서 유지시킨 후 상온으로 냉각시키고, 증류수로 수세한 후 40℃ 진공오븐에서 건조시켰다.

비교예 2: 덱스트란으로 도포된 산화철 나노입자의 제조

덱스트란으로 표면이 개질된 초상자기성 산화철 나노입자(Dextran-SPION)는 공침방법을 통하여 제조하였다.

먼저, 염화철(III) 0.338 g 및 염화철(II) 0.12g을 증류수 6.25 ㎖에 녹인 후, 수산화나트륨 0.348 g을 증류수 2.5 ㎖에 녹인 용액을 천천히 첨가하였다. 상기 수산화나트륨 수용액의 첨가에 따라 반응 용액이 어두운 갈색으로 변하였다. 상기 어두운 갈색으로 변한 용액에 덱스트란 137.4 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 같은 조건에서 유지시킨 후 상온으로 냉각시키고, 증류수로 수세한 후 40℃ 진공오븐에서 건조시켰다.

실험예 1: 본 발명의 블록공중합체로 도포된 산화철 나노입자의 분석

실시예 1에서 제조한 PGMA-NH₂, 블록공중합체의 구조 및 분자량은 ¹H-NMR을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2로부터 본 발명을 통해 공중합체가 성공적으로 합성되었음을 확인하였다. 실시예를 통해 합성된 PGMA-NH₂는 분자량이 3800 g/mol이었으며 블록공중합체는 7800 g/mol이었다.

한편, 표면 개질된 산화철 나노입자의 크기는 0.5 ㎎/㎖의 나노입자 용액을 이용해 동적광산란장치(DLS)로 분석하였다.

그 결과, 순수한 산화철 나노입자는 수성환경에서 바로 응집되면서 침전된 반면, 본 발명의 블록공중합체로 도포된 나노입자는 100 ㎚ 이내의 크기로 응집현상 없이 안정적으로 분산되었다.

또한, 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자를 열중량 분석기(TGA)를 통해 분석함으로써, 각각의 나노입자에 블록공중합체, 아민화된 PGMA 및 덱스트란이 도포되어 있음을 확인하였다(도 3).

특히, 실시예 1의 표면 개질된 산화철 나노입자에 대하여는 FT-IR(Fourier Transform-Infrared spectroscopy) 분석을 통해 추가로 분석함으로써, 나노입자에 블록공중합체가 도포되어 있음을 재확인하였다.

FT-IR에 대한 분석 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서, 3400cm^-1에 나타난 a 피크는 OH 및 C-H 스트레칭(stretching)을 나타내고, 1725cm^-1에 나타난 b 피크는 C=O 스트레칭을 나타내며, 1258cm^-1에 나타난 c 피크는 C-O 스트레칭을 나타내고, 591cm^-1에 나타난 d 피크는 산화철의 특징적인 피크이다. 상기와 같이, 1725cm^- ¹와 1258cm^-1에서 DS-b-PGMA의 에스테르 결합(ester linkage) 피크가 나타나고, 591cm^-1에서 산화철 나노입자에 대한 피크가 나타난 것을 통해, 본 발명의 블록공중합체가 산화철 나노입자에 도포되어 있음을 알 수 있었다. 산화철의 비율은 하기 표 1과 같았다.

구분	산화철 함량(%)
실시예 1(DS-SPION)	78.58
비교예 1(PGMA-SPION)	78.9
비교예 2(Dextran-SPION)	83.95

또한, 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자의 형태는 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)으로 분석하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 통해, 산화철이 응집되어 있는 것을 확인할 수 있으며, 이로부터 나노미터 크기로 표면 개질된 마그네틱 나노입자가 형성되었음을 알 수 있었다.

한편, 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자의 상자기성은 초전도 양자 간섭 장치(superconducting quantum interference device, SQUID)를 이용하여 분석하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 통해, 나노입자의 자기적인 양(단위: electromagnetic system of units, emu)은 실시예 1(DS-SPION)과 비교예 1(PGMA-SPION)의 경우 -0.7 emu/mg ~ 0.7 emu/mg이고, 비교예 2(Dextran-SPION)의 경우 -0.5 emu/mg ~ 0.5 emu/mg인 것으로 나타나, DS-SPION과 PGMA-SPION의 자기이력 곡선(hysteresis curve)이 Dextran-SPION 보다 큼을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 DS-SPION과 PGMA-SPION의 상자기성이 Dextran-SPION보다 더 크다는 것을 알 수 있었다.

실험예 2: 나노입자의 안정성 평가

실시예 1 및 비교예 1 내지 2에서 제조한 표면 개질된 마그네틱 나노입자를 0.5 ㎎/㎖의 농도로 인산염 완충 식염수 용액(pH=7.4)에 분산시켜 7일 동안 크기변화를 DLS로 분석하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7을 통해, 실시예 1(DS-SPION)과 비교예 1(PGMA-SPION)의 경우 안정화 메커니즘을 통해 7일간 100~200 ㎚의 크기를 유지하였으나, 비교예 2(Dextran-SPION)는 3일 경과 후 크기가 급격히 증가하여, 7일 경과 후에는 크기가 1200 ㎚까지 증가함을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 나노입자의 활성화된 대식세포에 의한 선택적 세포흡수 평가

실시예 1 및 비교예 2에서 제조한 표면 개질된 산화철 나노입자 용액을 세포가 존재하는 배양액에 첨가하고, 프루시안 블루 염색(prussian blue staining)을 실시하여 나노입자에 축적된 세포를 OLYMPUS BX51 광학현미경으로 관찰하였다.

구체적으로, 먼저 10 ng/㎖의 지질다당(lipopolysaccharide, LPS)을 처리한 활성화된 RAW264.7 세포(LPS 처리시 SR-A가 3~5배 과발현되며, 16시간 후에 피크에 이르고, 48시간 동안 유지됨, Fitzgerald, M.L et al., Journal of Immunology ., 2000, 164, 5, 2692-2700), LPS 처리하지 않은 비활성화된 RAW264.7 세포 및 소의 대동맥 내피세포(Bovine Aortic Endotherial Cell, BAEC)를 2×10⁵개씩 6 웰 디시(well dish)에 접종하여 24시간 동안 배양한 후, Fe 기준 25 ㎍/㎖의 나노입자를 각각의 세포에 처리하여 추가로 30분 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포에 대해 프루시안 블루 염색을 실시하여 나노 입자가 축적된 세포를 OLYMPUS BX51 현미경으로 관찰하였다. 또한, 덱스트란 설페이트의 활성화된 대식세포에 의한 선택적 세포흡수를 극적으로 평가하기 위해 활성화된 RAW264.7에 미리 과량의 덱스트란 설페이트를 15분 동안 처리한 후 DS-SPION을 처리하여 프루시안 블루 염색을 실시하여 나노 입자가 축적된 세포를 OLYMPUS BX51 현미경으로 관찰하였다.

그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 통해, 실시예 1에서 제조한 본 발명의 나노입자(DS-SPION)가 소의 대동맥 내피세포보다 활성화된 대식세포에 더 많이 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 1에서 제조한 본 발명의 나노입자(DS-SPION)가 비교예 2에서 제조한 나노입자(Dextran-SPION)에 비해 더 효율적으로 활성화된 대식세포에 축적되는 것을 알 수 있었다.

Claims

산화철 나노입자; 및
상기 산화철 나노입자의 표면에 도포된 블록공중합체를 포함하고,
상기 블록공중합체는 덱스트란 설페이트의 말단이 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트로 수식된 것인 산화철 복합 나노입자.
제1항에 있어서, 상기 블록공중합체는 하기 화학식 1의 블록공중합체인 산화철 복합 나노입자:
[화학식 1]

상기 식에서,
n은 10 내지 1000의 정수이고,
m은 2 내지 1000의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 블록공중합체의 분자량은 2,000 내지 1,000,000인 산화철 복합 나노입자.
제1항에 있어서, 상기 산화철 복합 나노입자의 크기는 10 내지 500 ㎚인 산화철 복합 나노입자.
제1항에 있어서, 상기 블록공중합체의 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트 부분의 다이올기는 산화철 나노입자의 표면에 결합되며, 상기 블록공중합체의 덱스트란 설페이트 부분은 나노입자의 외부에 위치하는, 산화철 복합 나노입자.
하기 단계를 포함하는 산화철 복합 나노입자의 제조방법:
글리세롤 모노메타크릴레이트를 사슬이동제로서 시스테아민을 사용하여 라디칼 중합시켜 하기 화학식 2의 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트를 제조하는 단계(단계 1);
상기 폴리글리세롤 모노메타크릴레이트를 하기 화학식 3의 덱스트란 설페이트와 반응시켜 하기 화학식 1의 블록공중합체를 제조하는 단계(단계 2); 및
상기 블록공중합체를 산화철 나노입자의 표면에 도포시키는 단계(단계 3).
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 식에서,
n은 10 내지 1000의 정수이고,
m은 2 내지 1000의 정수이다.
제6항에 있어서, 상기 단계 1)의 라디칼 중합은 촉매로서 아조비스이소뷰티로나이트릴(AIBN), 또는 벤조일 퍼옥사이드를 사용하는 것인 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 2)의 반응은 NaBH₃CN, 또는 NaBH(OAc)₃를 사용하여 수행하는 것인 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 2)의 반응은 용매로서 물을 사용하여 수행하는 것인 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 3)은 블록공중합체와 산화철 나노입자를 공침시켜 수행하는 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 공침은 물 중에서 수행하는 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 산화철 복합 나노입자를 포함하는 동맥경화 진단용 조영제.
제12항에 있어서, 상기 조영제는 동맥경화의 조기진단에 사용되는 것인 동맥경화 진단용 조영제.
하기 화학식 1로 표시되는 블록공중합체:
[화학식 1]

상기 식에서,
n은 10 내지 1000의 정수이고,
m은 2 내지 1000의 정수이다.