KR20090026093A - 조영 및 약물운반용 다기능 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 복수의 나노입자를 포함하는 조영 및 약물운반용 다기능 복합체로서, 상기 나노입자는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 조영 및 약물운반용 다기능 복합체에 관한 것이다: (a) 신호 발생 코어(signal generating core); 및 (b) 실릴-, 하이드록시실릴- 또는 알콕시실릴-작용기성을 포함하는 표면 앵커링 부위 및 약물 결합 부위를 포함하며 상기 신호 발생 코어의 표면에 코팅되어 있는 수용성 고분자 외부 쉘(water soluble polymeric outer shell).
조영, 약물운반, 나노입자

Description

조영 및 약물운반용 다기능 복합체{Multi―Functional Complex for Imaging and Drug Delivery}
본 발명은 조영 및 약물운반용 다기능 복합체에 관한 것이다.
초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles: SPION)은, 자기공명영상(MRI) 진단(Baghi, M. et al., Anticancer Res. 2005, 25, 3665-3670; Martina, M. et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 10676-10685; Blasberg, R. G. Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 335-343; Artemov, D. J. Cell Biochem. 2003, 90, 518-524; Schmitz, S. A. Rofo 2003, 175, 469-476; Kroft, L. J. et al.,J. Magn. Reson. Imaging 1999, 10, 395-403; Bonnemain, B. J. Drug Target 1998, 6, 167-174; Bellin, M. F. et al., Eur. J. Radiol. 2000, 34, 257-264), 약물 운반(Kohler, N. et al., Langmuir 2005, 21, 8858-8864; Gupta, A. K et al., J. Mater. Sci. Mater. Med. 2004, 15, 493-496) 및 치료(발양성 변조기분, Gupta, A. K.; Gupta, M. Biomaterials 2005, 26, 3995-4021)와 같은 생물의학 분야에서 최근에 각광을 받고 있다. SPION(Ito, A. et al, Cancer Lett. 2004, 212, 167-175)은 그의 초상자성 특성 때문에, 종래의 상자성 Gd-계열의 조영제 보다 MRI에서 높은 조영능력을 발휘할 수 있다.
나노입자의 조영제 또는 약물운반체로서의 용도에 관하여는 많은 연구가 있었지만 조영과 약물운반을 하나의 입자에서 가능하도록 하는 다기능 입자에 대한 연구는 거의 이루어져 있지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 하나의 나노입자를 통하여 조영 및 약물운반을 동시에 할 수 있는 다기능 복합체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 이미징 시그널을 발생시키는 신호 발생 코어 및 이 코어의 표면에 적합한 수용성 고분자 외부 쉘을 코팅하여 약물을 선적(loading)하여 다기능 복합체를 제작(fabrication)하는 경우에는 이미징 및 약물치료가 모두 성공적으로 이루어질 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 목적은 조영 및 약물운반용 다기능 복합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 이미징 및 약물 운반 동시 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 복수의 나노입자를 포함하는 조영 및 약물운반용 다기능 복합체로서, 상기 나노입자는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 조영 및 약물운반용 다기능 복합체를 제공한다:
(a) 신호 발생 코어(signal generating core); 및
(b) 실릴-, 하이드록시실릴- 또는 알콕시실릴-작용기성을 포함하는 표면 앵 커링 부위 및 약물 결합부위를 포함하며 상기 신호 발생 코어의 표면에 코팅되어 있는 수용성 고분자 외부 쉘(water soluble polymeric outer shell).
본 발명자들은 하나의 나노입자를 통하여 조영 및 약물운반을 동시에 할 수 있는 다기능 복합체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 이미징 시그널을 발생시키는 신호 발생 코어 및 이 코어의 표면에 적합한 수용성 고분자 외부 쉘을 코팅하여 약물을 선적(loading)하여 다기능 복합체를 제작(fabrication)하는 경우에는 이미징 및 약물치료가 모두 성공적으로 이루어질 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 나노입자에서, 다양한 신호 발생 코어가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 신호 발생 코어는 상자성(paramagnetic), 초상자성(superparamagnetic) 또는 양성자 밀도(proton density) 신호 발생 코어이며, 가장 바람직하게는 초상자성 신호 발생 코어이다.
본 발명에 적합한 예시적인 상자성 신호 발생 코어는 안정된 자유 라디칼(예컨대, 안정된 니트록사이드(nitroxides)), 전이원소, 란탄족 원소 및 악티늄족 원소를 포함한다. 바람직한 원소는, Gd(Ⅲ), Mn(Ⅱ), Cu(Ⅱ), Cr(Ⅲ), Fe(Ⅱ), Fe(Ⅲ), Co(Ⅱ), Er(Ⅱ), Ni(Ⅱ), Eu(Ⅲ) 및 Dy(Ⅲ)를 포함한다.
본 발명에 적합한 예시적인 초상자정 신호 발생 코어는 페로-(ferro-) 또는 페리마그네틱 화합물(ferrimagnetic compounds), 예컨대, 순수 철, 자성 산화철(예컨대, 마그네타이트, Fe3O4),γ-Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페 라이트를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 초상자정 신호 발생 코어는 Fe3O4 또는 γ-Fe2O3이고, 가장 바람직하게는 Fe3O4이다.
본 발명에 적합한 예시적인 양성자 밀도 신호 발생 코어는 퍼플루오로카본이다.
신호 발생 코어의 표면에는 수용성 외부 쉘(water soluble outer shell)이 코팅되어 있다. 이 수용성 외부 쉘은 본 발명의 조영제가 수용성을 나타내도록 할 뿐만 아니라, 나노입자의 항-바이오파울링(anti-biofouling) 특성을 부여하며, 코팅되지 않은 나노입자와 비교하여 증가된 안정성 및 조영 능력을 발휘하도록 하는 작용을 한다.
외부 쉘은 실리콘이 포함된 수용성 고분자로 이루어져 있다. 본 발명에서 이용되는 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 실리콘이 공유결합된 다양한 수용성 고분자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 수용성 고분자는 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)) 또는 그 유도체, 폴리메타아크릴산(poly(meta)acrylic acid)) 또는 그 유도체, 폴리아크릴아미드(poly(acrylic amide)) 또는 그 유도체, 또는 폴리언데세노산(poly(undecenoic acid)) 또는 그 유도체, 또는 상기 고분자의 공중합체, 키토산 또는 그 유도체, 덱스트란 또는 그 유도체(예컨대, 카복시메틸 덱스트란), 셀룰로오스 또는 그 유도체(예컨대, 카복시메틸 셀룰로오스), 헤파린 또는 그 유도체, 알기네이트 또는 그 유도체, 또는 히알루론산 또는 그 유도체를 주골격(main backbone)으로 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 수용성 고분자는 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)) 또는 그 유도체, 또는 폴리메타아크릴산(poly(meta)acrylic acid)) 또는 그 유도체, 또는 상기 고분자의 공중합체를 주골격으로 갖는다.
실리콘은 상술한 수용성 고분자에 다양한 형태 또는 방식으로 결합되어 있을 수 있으며, 예를 들어, 모노에스테르 결합을 통해 결합되어 있을 수 있다. 실리콘이 모노에스테르 결합을 통해 상기 수용성 고분자에 결합되는 경우, 실리콘은 모노에스테르 결합에 직접 결합될 수도 있지만, 탄소수 1-5의 탄화수소 모이어티(예컨대, 프로필기)가 개입되어 간접적으로 결합될 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 실리콘 원소를 통하여 신호 발생 코어에 공유결합 되어 있다. 즉, 실리콘 원소와 신호 발생 코어의 표면에 있는 작용기 사이에 공유결합이 형성될 수 있다. 종래의 코팅은 비공유결합으로 되어 있어, 코팅의 안정성이 문제가 되었다. 본 발명에서 실리콘을 통한 신호 발생 코어와의 공유결합은 외부 쉘 코팅의 안정성을 크게 증대시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 실리콘 원소 사이의 결합을 통하여 가교결합(crosslinking)되어 있다. 이러한 가교결합은 합성된 고분자에 열(예컨대, 80℃)을 가하여 만들 수 있다. 상기 가교결합은 실리콘-포함 수용성 고분자 코팅의 안정성을 더욱 더 증가시키는 작용을 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자 는 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체가 결합되어 있다. 바람직하게는, 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드[예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 또는 이들의 공중합체(예컨대, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체)], 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이고, 보다 바람직하게는 PEG, 폴리알킬렌 옥사이드 또는 PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체이며, 가장 바람직하게는 PEG이다. 상기 추가적인 고분자도 수용성을 나타내며, 생체 내의 단백질 및 세포가 나노입자에 결합하는 것을 막는 항-바이오파울링 작용을 한다. 상기 추가적인 고분자, 예를 들어, PEG는 다양한 결합 방식으로 실리콘이 포함된 수용성 고분자에 결합되어 있으며, 예를 들어, 모노에스테르 결합을 통해 결합되어 있을 수 있다. PEG가 모노에스테르 결합을 통해 상기 수용성 고분자에 결합되는 경우, 실리콘은 모노에스테르 결합에 직접 결합될 수도 있지만, 탄소수 1-5의 탄화수소 모이어티가 개입되어 간접적으로 결합될 수도 있다.
또한, PEG가 수용성 고분자에 추가적으로 결합되어 있는 경우, 친수성의 PEG 층이 나노입자의 표면에 노출되어 우수한 수 분산성(water dispersibility)을 발휘하게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수용성 고분자는 다음 화학구조식 1로 표시된다:
화학식 1
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상기 화학식에서, R1은 실릴알킬기, (알콕시실릴)알킬기 또는 (하이드록시실릴)알킬기이고; R2는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이고; R3는 알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기 또는 히드록실기이며; R4, R5 및 R6는 서로 독립적으로, H 또는 C1-C5 알킬기이며; X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 산소, 황 또는 질소 원자이고; l, m 및 n은 서로 독립적으로 1-10,000의 정수이다.
상기 화학식 1에서 R1의 정의에 사용되는 용어 실릴알킬은 알킬기로 치환된 실릴기로 치환된 알킬기를 의미한다. 예를 들어, 실릴알킬은 실릴메틸, 실릴에틸, 실릴프로필 및 실릴부틸을 포함한다. 용어 (알콕시실릴)알킬은 알콕시-치환된 실릴알킬기를 의미한다. 예를 들어, (알콕시실릴)알킬은 트리메톡시실릴에틸, 트리메톡시실릴프로필, 트리메톡실릴부틸, 트리메톡실릴펜틸, 트리에톡시실릴에틸, 트리에톡시실릴프로필, 트리에톡실릴부틸, 트리메톡실릴펜틸, 메틸디메톡시실릴에틸, 메틸디메톡시실릴프로필, 디메틸메톡시실릴에틸 및 디메틸메톡시실릴프로필을 포함한다. 용어 (하이드록시실릴)알킬은 하이드록실-치환된 실릴알킬을 의미하며, 예컨대, 트리하이드록시실릴에틸, 트리하이드록시실릴프로필, 트리하이드록시실릴부틸 및 트리하이드록시실릴펜틸을 포함한다.
바람직하게는, 화학식 1에서 R1은 (알콕시실릴)알킬기 또는 (하이드록시실릴)알킬기이고, 보다 바람직하게는 (C1 -6 알콕시실릴)C1 -10 알킬기 또는 (하이드록시실릴)C1 -10 알킬기이며, 가장 바람직하게는 (C1-3 알콕시실릴)C1 -5 알킬기 또는 (하이드록시실릴)C1 -5 알킬기이다.
상기 화학식 1에서, R3는 약물이 결합되는 반응기이다. 반응기는, 알데하이드; 에폭시; 할로알킬; 1차아민; 티올; 말레이미드; 에스테르(바람직하게는 N-하이드록시석시너마이드 에스테르 작용기); 그리고 카르복실기(하이드록시-석시너마이드 에스테르 형성에 의해 활성화됨)와 히드록실기(사이아노겐 브로마이드로 활성화됨)와 같은 활성화되는 반응기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 반응기로서 카르복실기를 포함한다. 반응기로서 카르복실기를 포함하는 경우, 바람직하게는, 이 카르복실기는 석시너마이드, 석시너미딜 에스테르, 설포-석시너미딜 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 알데하이드, 산무수화물, 아자이드, 아졸리 드, 카보이마이드, 에폭사이드, 에스테르, 글리시딜 에테르, 할라이드, 이미다졸 또는 이미데이트에 의해 활성화 되어 있다. 가장 바람직하게는, 반응기로서의 카르복실기는 석시너마이드 또는 석시너미딜 에스테르에 의해 활성화 되어 있다.
바람직하게는, 화학식 1에서 R4, R5 및 R6는 서로 독립적으로, H 또는 C1-C3 알킬기이며 보다 바람직하게는 H 또는 C1-C2 알킬기이고, 가장 바람직하게는 H 또는 메틸기이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, X, Y 및 Z는 산소 원자이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조영제는 자기공명영상(magnetic resonance imaging: MRI)에 이용된다. 본 발명의 조영제는, 다양한 생체 조직을 자기공명영상화에 이용될 수 있지만, 특히 인 비보 암 자기공명영상화에서 매우 우수한 조영 작용을 한다. 본 발명의 조영제의 특징 중 하나는, 비록 암세포 특이적인 타겟팅 리간드(targeting ligand, 예컨대, 항체)를 가지지 않는 경우에도 인 비보 암 자기공명영상화를 효율적으로 할 수 있다는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 고분자-코팅된 나노입자들의 평균 직경은 5-50 nm이고, 보다 바람직하게는 10-50 nm이다. 이러한 나노입자들의 크기는 CLION 및 MION와 같은 종래의 덱스트란-코팅 SPIONs 보다 훨씬 작은 값이다. 또한, 본 발명의 고분자-코팅된 나노입자들은 좁은 크기 분포를 나타낸다. 이러한 작은 입자 크기는 본 발명의 나노입자가 목적의 조직(예컨대, 종양 조직)으로 침투하는 것을 용이하게 하여 조직 내에 나노입자가 축적되는 것을 증가시킨다. 결국, 이러한 침투 용이성은 본 발명의 나노입자의 조영 능력을 향상시 키는 작용을 한다. 또한, 본 발명의 고분자-코팅된 나노입자들의 작은 크기 및 좁은 크기 분포는 자성 시그널 및 이 시그널의 균질성(homogeneity)를 강화시키데 기여를 한다.
본 발명의 나노입자의 포화자성은 바람직하게는, 20-100 emu/g Fe, 보다 바람직하게는 40-90 emu/g Fe, 보다 더 바람직하게는 60-85 emu/g Fe, 가장 바람직하게는 75-85 emu/g Fe이다. 종래의 고분자-코팅 SPION의 포화자성이 30-50 emu/g Fe(48)인 것을 고려하면, 본 발명의 나노입자의 포화자성이 크게 개선되었음을 알 수 있다. 본 발명의 나노입자의 큰 포화자성은 시그널 발생에 매우 유리하며, 이는 조영능력을 증가시키는 데 기여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 수용성 외부 쉘의 반응성 부위에 약물이 추가적으로 결합되어 있다. 약물이 반응성 부위에 결합하는 특별하게 제한되지 않으며, 예컨대 이온결합, 공유결합, 배위결합 및 비공유결합 등을 통하여 결합되며, 바람직하게는 이온결합 및 공유결합에 의해 결합된다.
본 발명의 다기능성 복합체에 결합되는 약물은 예를 들어 화학약물, 단백질, 펩타이드 또는 뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)이다.
본 발명의 다기능 복합체에 결합 되는 단백질 또는 펩타이드는 특별하게 제한되지 않으며, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자 , 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하 게는, 본 발명의 다기능 복합체에 의해 운반되는 단백질 또는 펩타이드는 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 및 지코노타이드를 포함한다.
본 발명의 다기능 복합체에 결합되는 화학약물은 특별하게 한정되지 않으며, 예를 들어, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제, 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제 및 심혈관질환 치료제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 다기능 복합체에 결합되는 화학약물은 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사 이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864 및 조루비신를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
약물은 약물 결합 부위와 공유 또는 비공유 결합 방식으로 결합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약물은 상기 약물 결합 부위와 비공유성 결합으로 결합되어 있다. 바람직하게는, 상기 비공유성 결합은 이온결합, 배위결합, 소수성 상호작용, 반데르발스 결합 또는 이들의 조합이며, 가장 바람직하게는 이온결합, 소수성 상호작용, 반데르발스 결합 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 타겟팅 분자를 추가적으로 포함한다. 상기 타겟팅 분자는 예컨대 항체, 앱타머 또는 세포부착 펩타이드이며, 가장 바람직하게는 세포부착 펩타이드이다.
본 발명의 다기능성 복합체에 세포부착 펩타이드가 결합된 경우에는, 세포 유입(cellular uptake)이 보다 효율적으로 발생하게 되며 결국, 다기능성 복합체에있는 약물의 치료효과 및 조영물질에 의한 조영효과가 모두 동시에 크게 증가한다.
타겟팅 분자를 본 발명의 나노입자에 도입하는 경우에는 수용성 외부 쉘에 도입한다. 수용성 외부 쉘에 타겟팅 분자를 결합시킬 수 있는 작용기성을 추가적으로 도입함으로써 타겟팅 분자를 본 발명의 나노입자에 결합시킨다.
본 발명에서 세포부착 펩타이드로 적합한 것은 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu- Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val), EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val) 및 LDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)를 포함하며, 보다 바람직하게는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys) 또는 RGDV(Arg-Gly-Asp-Val)이고, 가장 바람직하게는 RGD(Arg-Gly-Asp)이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 다기능 복합체를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 이미징(특히, MR 이미징) 및 약물 운반 동시 방법을 제공한다.
본 발명의 다기능 복합체는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것 은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 조성물을 이용하여 MR 이미지를 얻는 방법은 종래의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, MR 이미징 방법 및 장치는, D. M. Kean and M. A. Smith, Magnetic Resonance Imaging : Principles and Applications(William and Wilkins, Baltimore 1986), 미국 특허 제6,151,377호, 제6,144,202호, 제6,128,522호, 제6,127,825호, 제6,121,775호, 제6,119,032호, 제 6,115,446호, 제6,111,410호 및 제602,891호에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 조영 및 약물운반을 하나의 시스템에서 하여, 진단 및 치료를 동시에 할 수 있도록 한다. 본 발명의 다기능 복 합체는 MR 조영물질뿐만 아니라 약물을 안정되게 선적하며,
흥미롭게도, 본 발명의 다기능 복합체는 bare drug(약물 자체)과 비교하여 보다 낮은 용량에서 높은 약리학적 효능을 발휘한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 폴리에틸렌글리콜/실리콘/카르복실(PEG/silicone/COOH) 공중합체 합성
TMSMA(3-트라이메톡시실릴프로필메타아크릴레이트, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 0.56 g (2.24 mmol) 및 PEGMA(폴리에틸렌글리콜메틸에테르메타아크릴레이트, Sigma-Aldrich) 1.06 g (2.24mmol) 및 NAS(N-아크릴록시석신이미드, Acros Co.) 0.32 g (1.92 mmol)을 THF(테트라하이드로퓨란) (Sigma-Aldrich) 8 ml 에 용해시켰다. 이 용액을 20분 간 질소 가스를 흘려주어서 가스를 제거하였다. AIBN (아조비스아이소부틸로나이트릴, Sigma-Aldrich) 10 mg (0.1 mmol)을 라디칼 고분자화 반응 개시제로 상기 용액에 첨가한 후, 70℃에서 24시간 동안 고분자 합성 반응을 진행하여 수용성의 폴리에틸렌글리콜-실리콘-N-아크릴록시석신이미드 (PEG- Silicone-NAS) 공중합체를 합성하였다. THF를 진공상에서 날려보내어 없애고, 순수한 1차 증류수에 분산시키면 NAS가 수용액 상에서 쉽게 카르복실 그룹으로 변환하여 폴리에틸렌/실리콘/카르복실(PEG/silicone/COOH) 공중합체가 된다. 이것을 핵 자기공명 분광학(Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 분석한 결과 도 1에 나타난 바와 같이 폴리에틸렌부분 및 실리콘 및 카르복실 부분의 비율이 각각 0.85: 1: 0.71 임을 확인하였다.
실시예 2: 폴리에틸렌글리콜/실리콘/카르복실 고분자가 코팅된 자성나노입자
증류수 30 ml에 FeCl3ㆍ6H2O(Sigma-Aldrich) 0.5 g 및 FeCl2ㆍ4H2O(Sigma-Aldrich) 0.184 g을 첨가하고 교반하여 혼합하였다. NH4OH(암모늄 수용액, Fluka) 7.5 ml을 첨가하여 용액의 pH를 약 1.8 근처에서 10 이상으로 맞춘 후 30분간 강하게 교반하여 검은색의 산화철 입자를 합성하였다. 이 합성물을 희토류 자석(Daehan-magnet Co.)을 이용하여 자기장에 노출시켜서 대부분의 검은 입자들을 자석 쪽으로 모은 후 상층의 수용액을 제거하였다. 증류수 30 ml을 첨가한 후 약하게 교반하여 가라앉은 검은 입자들을 분산시킨 후 다시 자기장에 노출시켜서 상층의 수용액을 제거하였다. THF가 제거된 수용성의 폴리에틸렌글리콜-실리콘-카르복실(PEG-Silicone-COOH) 공중합체 250 mg이 용해되어 있는 증류수 30 ml을 첨가한 후 1 시간 동안 교반하면서 자성 입자를 고분자로 코팅하였다. 고분자 코팅된 검은 입자의 합성물을 30분간 고주파 처리하였다. 이 수용액을 약 12시간 동안 자기장에 노출시켜서 가라앉은 극소량의 입자들은 제거한 후, 검은색의 상층액을 수득하였다. 이 용액을 6,000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 이어 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 용액에 존재할 수 있는 미소의 응집체를 제거하였다. 이 수용액을 80?에서 2 시간동안 가열하여서 고분자가 더 단단히 결합될 수 있도록 하였다. 최종적으로 얻은 용액을 분리하여 carboxyl-TCL-SPION(carboxyl Thermally Cross Linked-SPION)을 얻었다. 도 2에서와 같이 자성나노입자를 코팅하고 있는 고분자의 폴리에틸렌 부분은 생체내로 자성나노입자가 투여되었을 때 단백질이나 세포의 흡착을 막아주어 대식세포 등에 의해 잡아먹히지 않도록 막아주며 실리콘 부분은 자성나노입자의 Fe 부분과 강한 공유결합을 가능하게 하고 열적으로 경화되어 매우 안정한 코팅을 이루게 하며 카르복실 부분은 기능성 부분으로써 리간드나 독소루비신과 같은 항암제와의 결합을 가능하게 한다.
실시예 3: carboxyl TCL-SPION에 항암제 독소루비신(doxorubicin)을 선적
Carboxyl TCL-SPION 0.25 mg를 5 % 글루코오즈 생리용액(pH 7.4) 에 녹이고 2배씩 희석하여 0.18 ㎍까지 17 종류의 질량으로 준비하였다. 이때 각각의 질량에서 총 부피는 모두 10 ㎕로 준비하였다. 독소루비신 4 ㎍을 5 % 글루코오즈 생리용액 300 ㎕에 분산시킨 후 excitation 480 nm, emission 500-640 nm 에서 형광을 측정하였다. 준비한 carboxyl TCL-SPION의 가장 옅은 질량순부터(0.18 ㎍) 진한 질량순(0.25 mg)으로 독소루비신 용액에 첨가함으로써 적정하면서 각각의 농도에 대하여 독소루비신 형광을 측정하였다. 5 % 글루코오즈 용액상에서 독소루비신의 아민기는 양전하로 존재하는데, 여기에 carboxyl TCL-SPION을 첨가하게 되면 carboxyl TCL-SPION 표면에 노출되어 음전하로 존재하고 있는 카르복실그룹이 독소루비신의 아민기와 이온-이온 결합을 하면서 독소루비신이 carboxyl TCL-SPION에 선적된다. 도 3에서 보는바와 같이 독소루비신이 carboxyl TCL-SPION에 선적되는 양이 많아질수록 형광 세기가 감소하는 이유는 이온결합으로 인해 둘 간의 거리가 가까워지면서 서로 전자 교환을 함으로써 독소루비신의 형광이 빼앗기기 때문이다. 4 ㎍의 독소루비신 형광세기를 모두 빼앗는 carboxyl TCL-SPION의 양을 관찰한 결과 약 0.2 mg의 carboxyl TCL-SPION이 넣어준 독소루비신의 형광 세기를 모두 빼앗는 것으로 관찰되었다. 이를 바탕으로 독소루비신의 형광세기를 모두 빼앗는 carboxyl TCL-SPION의 양을 독소루비신이 최대로 선적될 수 있는 양으로 간주하여, 독소루비신이 선적된 TCL-SPION (DOX@TCL-SPION)을 준비할 때는 모두 4 ㎍의 독소루비신을 5 % 글루코오즈에 녹인후, 0.2 mg의 carboxyl TCL-SPION을 첨가하여 준비하였다. 또한 555 nm에서 독소루비신의 형광 세기를 통해 해리상수 Kd (dissociation constant)를 구한 결과 56.46 ㎍의 carboxyl TCL-SPION의 결과를 얻었다(도 4).
실시예 4: 독소루비신이 선적된 TCL-SPION (DOX@TCL-SPION)의 크기 및 표면 전하 분석
ELS 8000(Otsuka Electronics Korea)을 이용하여 다이나믹 광 스캐터링(DLS) 측정을 실시하여, 본 발명의 DOX@TCL-SPION의 수유동성(hydrodynamic) 크기를 측정 하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, carboxyl TCL-SPION 및 DOX@TCL-SPION의 평균 입자 크기는 각각 22.1 ± 5.0 nm 및 21.3 ± 6.4 nm의 평균 입자 크기를 나타내었고, 좁은 크기 분포도를 나타내었다. 따라서 독소루비신의 선적이 carboxyl TCL-SPION의 크기에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 이러한 입자 크기는 CLION 및 MION와 같은 종래의 덱스트란-코팅 SPIONs 보다 훨씬 작은 값이다. DLS 측정은 전체 클러스터(즉, 자성 코어와 코팅 폴리머)의 수유동성 입자크기에 대한 정보를 제공하는 것이기 때문에, TEM 이미지를 통하여 산화철 코어만의 크기를 측정하였다. 본 발명의 carboxyl TCL-SPION 및 DOX@TCL-SPION의 크기를 투사전자현미경(TEM, Philips TECNAI F20)을 이용하여 측정하였다. 현미경 관찰을 위해서, 증류수로 희석한 carboxyl TCL-SPION 및 DOX@TCL-SPION을 탄소로 코팅된 구리격자(carbon-coated copper grid) 위에 한 방울 떨어뜨리고 24시간 동안 건조시켰다. 도 4에서 나타난 바와 같이, carboxyl TCL-SPION 및 DOX@TCL-SPION의 산화철 나노 입자는 약 4-10 nm 정도의 크기를 가짐을 확인하였다.
표면전하(zeta-potential) 측정을 위하여 carboxyl TCL-SPION 및DOX@TCL-SPION을 증류수에 희석하여 1 mg/ml의 농도로 만들었다. 표면전하 측정을 통하여 자성 나노입자 표면에 카르복실기가 잘 노출 되어있는지와 독소루비신이 선적됨으로써 전위가 바뀌는지 여부를 관찰할 수 있다.
항목 크기(nm) 표면 전하(mV) 로딩 효율(%)
Carboxyl TCL-SPION 22.1±5.0 -37.26±1.73 -
DOX@TCL-SPION 21.3±6.4 -25.10±2.24 54.33±3.2
표 1에서 나타난 바와 같이, carboxyl TCL-SPION 및 DOX@TCL-SPION의 표면전하는 각각 -37.26 ± 1.73 mV 및 -25.10 ± 2.24 mV이었다. Carboxyl TCL-SPION의 표면이 노출된 카르복실기 때문에 강한 음전하를 띠다가 양전하를 띠는 독소루비신의 아민기와 이온결합을 하면서 약 8 mV 정도가 증가한 것으로 보인다.
실시예 5: TCL - SPION - DOX 의 약물 방출속도 분석
독소루비신이 수용액 상에서 DOX@TCL-SPION으로부터 얼마나 빨리 방출되는지를 시간에 따라 측정하였다. 4 ㎍의 독소루비신을 5 % 글루코오즈 용액 300 ㎕에 녹인 뒤, 여기에 0.2 mg의 carboxyl-TCL-SPION을 넣어 DOX@TCL-SPION을 만들었다. 이것을 50 K의 포어(pore)크기를 갖는 투석박막에 넣고 박막 집게로 양 끝을 막았다. DOX@TCL-SPION이 들어있는 투석박막을 인산완충용액(Phosphate Buffer Saline solution, pH 7.4) 과 아세테이트용액 (acetate buffer, pH 5.1) 30 ml 에 각각 집어넣고 이 용기를 37℃ 워터베스 (water bath)에서 50 rpm으로 흔들어주었다. 워터베스에 넣어준 시간으로부터 30 분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간이 지난 후에 각각의 용액에서 1 ml을 채취 하여 보관하였다. 이때 채취 할 때마다 투석박막이 들어있는 용기에 남은 29 ml의 용액은 버리고 새로운 인산완충용액과 아세테이트 용액으로 바꾸어주었다. 위에서 제시한 시간 별로 채취한 용액에는 투석박막으로부터 빠져 나온 독소루비신이 있는데 이를 excitation 480 nm, emission 500-640 nm에서 형광 측정하였다. 독소루비신의 표준 용액을 만들기 위하여 1차 증류수에서 1 ㎍/ml의 농도로 준비한 뒤 2배씩 희석하여 7 ng/ml의 농도까지 모두 8개의 농도를 만든 뒤, 이를 각각 excitation 480 nm, emission 500-640 nm 에서 형광 측정하였다. 555nm에서의 형광세기를 각각의 농도에서 구한 뒤, 이것을 다시 선형 그래프로 나타내었다. 각 시간 별로 채취한 용액에서 독소루비신의 양은 이 표준 선형그래프를 통하여 구하였다. 그 결과 도 6에서 보는 바와 같이 인산완충용액에서보다 아세테이트용액에서 독소루비신이 DOX@TCL-SPION으로부터 더 빨리 빠져 나오는 것을 관찰하였다. 인산완충용액에서는 2 시간 이내에 50 % 이상의 독소루비신이 빠져 나왔고, 아세테이트 용액에서는 45 분 이내에 50 % 이상의 독소루비신이 빠져 나왔다. 또한 두 용액에서 모두 독소루비신이 24시간 안에 80 % 이상 빠져나오는 것을 관찰하였다.
실시예 6: DOX@TCL-SPION의 생체내 종양 조직에서 MRI 조영능 실험
DOX@TCL-SPION을 MRI 조영제로 사용하였을 때, 종양 조직을 조영할 수 있음을 확인하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. 루이스 폐암 세포(Lewis lung carcinoma cell line, ATCC)를 등에 이식시킨 C57BL/6 웅성 마우스를 테스트 동물로 사용하였다. 마우스를 일반적인 흡식 마취 방법(O2/N2의 1:2 혼합물 내의 1.5% 이소플루란)으로 마취시켜 MR 조영에 이용하였다. 5 % 글루코즈 생리용액에 DOX@TCL-SPION(13 mg Fe/kg, 0.16 mg dox eq./kg)와 독소루비신 4 ㎍(0.16 mg/kg)을 준비한 뒤 마우스 꼬리의 정맥 혈관으로 직접 주사하였다. MR 촬영은 동물 코일(4.3 cm Quadrature Volume Coil, Nova Medical System)을 이용하여 1.5 T imager(GE Signa Exite Twin-speed, GE Health Care)로 실시하였다. 마우스의 MR 촬영을 위하여, T2-웨이티드 패스트-스핀 에코 (4,200/102의 반복 시간 ms/echo time ms, 플립각 90°, 10의 에코 트레인 길이, 5 cm 뷰 필드, 2 mm 단면 두께, 0.2-mm 단면간 갭, 256160 매트릭스) 및 T1-웨이티드 스포일드 그래디언트 에코(185/minimum, 60° 플립각, 2 mm 단면 두께, 0.2-mm 단 면간 갭, 256160 매트릭스) 시퀀스를 수행하였다.
모든 MR 촬영에 대한 정량적 분석은 한 사람의 방사선전문의사가 수행하였다. 시그널 강도(SI)는, 종양 중앙의 비교 위치들에 있는 목적의 특정 부위(ROI)에 대하여 측정 되었다. 또한, 종양에 인접한 후방 근육의 ROI 내의 SI 를 측정하였다. ROI의 크기는 종양의 최대 지름의 2/3로 선택되었다. 상대적 시그널 강화는 조영제의 주입 전(SI pre) 및 주입 후(SI post)에서 SI 측정값으로부터 다음 수학식으로 계산하였다: [(SI post - SI pre)/SI pre] x 100, SI pre 는 강화 전 스캔(대조군)에서 리젼 시그널 세기, SI post는 1 hr 과 3 hr 강화 후 스캔에서 리젼 시그널 세기.
DOX@TCL-SPION을 주입하기 전에, 종양은 T2-웨이티드 MR 이미지에서 높은 강도 부위(hyperintensive area)로 나타났다(도 7에서 화살표 표시). T2-웨이티드 이미지 에서 상대적 시그널 세기(SI)를 상술한 바와 같이 계산하였다. DOX@TCL-SPION을 주입하고 1시간이 경과한 경우, 종양 부위에서 T2-웨이티드 MR 이미지에서 어두운 부위가 나타났으며 40%의 T2 시그널 감소를 보였고, 이러한 결과는 빠른 시간 내에 종양 내에 본 발명의 DOX@TCL-SPION이 검출 가능한 양이 축적되었음을 보여주는 것이다. DOX@TCL-SPION을 주입하고 3시간이 경과한 후 53 %의 T2 시그널 감소를 나타내었다. 이는 DOX@TCL-SPION이 작은 크기를 갖고 대식세포에 잘 인식되지 않기 때문에 투여한 양의 대부분이 빠른 시간 안에 종양으로 잘 축적되어 진단제 로써의 가능성이 있음을 보여주는 결과이다. 반면에 독소루비신만 투여한 경우 1시간 또는 3시간이 경과한 후 모두 시그널 변화가 없었다.
실시예 7: DOX@TCL-SPION의 생체내 종양 조직 내에 독소루비신이 축적됨을 확인 및 각 장기에서의 생체 편재율 관찰
DOX@TCL-SPION의 MRI 실험에서와 같이 루이스 폐암 세포(Lewis lung carcinoma cell line, ATCC)를 등에 이식시킨 C57BL/6 웅성 마우스를 테스트 동물로 사용하였다. DOX@TCL-SPION (13 mg Fe/kg, 0.16 dox eq./kg) 및 독소루비신 4 ㎍ (0.16 dox eq./kg)을 5 % 글루코오즈 생리용액에 준비 한 후 마우스 꼬리 정맥을 통하여 투여하였다. 투여 후 1시간과 3시간 후에 각각 모든 동물을 희생시켜 간, 폐, 비장, 심장, 신장 및 암을 떼어내었다. 각 시간에서 각각의 장기를 배열 한 뒤, IVIS 100 영상 시스템 (Xenongen Corp., Alameda, CA)를 이용하여 광학영상을 촬영하였다. 독소루비신의 형광이 GFP/GFP 채널에서 검출될 수 있으므로 이 채널을 사용하여 형광을 측정하면 각 장기에서의 독소루비신 축적 양을 알 수 있다. 도 8에서와 같이 DOX@TCL-SPION을 투여한 경우 1시간과 3시간에서 모두 암 부위에 독소루비신의 강한 시그널을 보임을 관찰할 수 있었다. 그 밖에 간, 폐, 심장, 신장에서는 매우 약한 시그널을 보였고, 비장에서는 어떤 시그널도 검출되지 않았다. 반면 독소루비신만 투여한 경우 1시간과 3시간 후 모두 약한 시그널을 보였으며 1시간째 간에서는 상대적으로 강한 시그널을 보였다. 각 장기별로 적어도 3 부분 이상의 관심있는 영역(Region of Interest, ROI)을 지정하였는데 이때 ROI는 pcs/sec/cm2/sr로 측정되었다. 이것을 그래프로 그려 도 8 에 나타내었다. 1시간째와 3시간째 모두 독소루비신과 비교하여 DOX@TCL-SPION이 암 조직에서 2 배 이상 높은 시그널을 보임을 알 수 있었다. 따라서 독소루비신과 비교하여 암 표적지향 효과가 좋기 때문에 DOX@TCL-SPION은 진단효과와 더불어 치료효과도 좋을 것이라는 가능성을 제시하였다.
실시예 8: DOX@TCL-SPION의 종양 크기 성장 억제 효과
루이스 폐암 세포(Lewis lung carcinoma cell line, ATCC)를 등에 이식시킨 C57BL/6 웅성 마우스를 테스트 동물로 사용하였다. 암 이식 후 1주일이 지나면 암이 약 50 mm3이 되는데 이 때부터 약물투여를 시작하였다. 약물의 종류는 컨트롤 (5 % glucose solution), DOX@TCL-SPION (13 mg Fe/kg, 0.16 dox eq./kg), 독소루비신 (2 mg/kg) 의 세 그룹으로 정하고 각 그룹당 7 ~ 8 마리의 폐암 세포가 이식된 마우스로 구성 하였다. 약물투여는 이틀에 한번씩 총 6번을 투여하였다 (투여 날짜 화살표로 표시, 도 9). 약물투여시작 날짜로부터 21일 동안 계속 암의 크기 변화는 버니어캘리퍼스를 이용하여 암의 단경과 장경을 각각 측정하였으며, 암 크기는 (단경2단경)/2의 공식에 따라 구하였다. 도 9에서 나타낸 바와 같이 DOX@TCL-SPION 투여 시작 후 10일째부터 평균 암 크기가 차이를 보이기 시작하였으며 약물투여가 끝난 11일째부터 17일까지 암 크기 성장을 계속적으로 억제하는 효과를 나타내었다. 또한 암 크기 성장 억제 관찰 마지막 날인 21일째에는 DOX@TCL-SPION이 컨트롤과 비교하여 약 57 %의 암 크기 성장 억제 효과를 나타냄을 확인하였다. 반면 독소루비신 2 mg/kg를 투여한 그룹의 경우 독소루비신의 용량은 DOX@TCL-SPION보다 12.5배 높으나 약물효과는 전혀 없어 컨트롤과 같은 종양 크기 성장율을 보임을 확인하였다. 도 10에서 마우스 질량을 측정한 결과 DOX@TCL-SPION은 약물 투여기간에는 컨트롤 대비 큰 질량 변화를 보이지 않다가 약물이 계속적으로 체내에 축적되면서 약물 투여기간이 끝난 후부터 독소루비신 독성을 보였고, 반면 독소루비신은 처음 약물 투여시 부터 독성을 보였다가 독소루비신이 체내에서 빨리 빠져나가기 때문에 투여가 끝난 후부터 계속적으로 질량이 증가하여 약물 투여 후 시작 후 18일 째에는 컨트롤과 매우 비슷한 질량으로 회복함을 보였다. 이를 통해 DOX@TCL-SPION이 MR 진단 효과와 더불어 실제로 암 억제 효과도 보임을 입증하였으며 TCL-SPION이 새로운 약물 전달체로써 매우 좋은 후보물질임을 제시하였다.
실시예 9: cRGD - TCL - SPION 의 제조
1) amine TCL - SPION
15 mg/ml의 carboxyl TCL-SPION 용액 1 ml 에 1 M의 2,2‘-(에틸렌디옥실 비스-(에틸아민))[2,2‘-(ethylenedioxyl bis-(ethylamine)] 100 μl와 500 mM의 N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드[N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride] 100 μl를 첨가하여 6시간동안 교반하였다. 이것을 50 K의 포어(pore)크기를 갖는 투석박막에 넣고 박막 집게로 양 끝을 막고 증류수 용액에 넣고 교반하였다. 24시간동안 교반하면서 3~6 시간 마다 새로운 증류수 용액으로 바꾸어주었다. 24시간 후 투석박막안의 용액을 채취한다.
2) SPDP - TCL - SPION
1 mg의 3-(2-피리딜 다이티오)프로피온산[3-(2-pyridyl dithio) propionic acid]와 1.4 mg의 N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드[N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride], 1 mg의 N-하이드록시석시너마이드를 각각 DMSO에 녹이고 혼합한 후 2시간동안 교반하였다. 이것을 위의 채취한 amine-TCL-SPION 용액 1 ml에 넣고 반응용기를 intelli 믹서를 이용하여 회전시키면서 18 시간동안 혼합시켰다. 이것을 Sephadex G50 컬럼을 이용하여 미반응 물질로부터 분리하였으며 최종적으로 검은색 용액을 용기에 받아내었다.
3) cRGD - TCL - SPION
cRGD 3 mg/ml 스톡 용액에서 100 μl를 채취하여 여기에 NH2OH 7 μmol을 첨가한 후 1시간 동안 실온에 놓아두었다. 이것을 위의 SPDP TCL-SPION 용액 1 ml에 첨가하고 반응용기를 intelli 믹서를 이용하여 회전시키면서 18 시간동안 혼합시켰다. 이것을 Sephadex G50 컬럼을 이용하여 미반응 물질로부터 분리하였으며 최종적으로 검은색 용액을 용기에 받아내었다.
cRGD의 컨쥬게이션 되는 정도를 다음과 같은 방법으로 측정하였다. cRGD TCL SPION 합성후 Sephadex G50 컬럼을 이용하여 분리하기 전에 미리 10 μl를 채취하여 100 K (포어) 크기를 갖는 spin-filter를 이용해 원심분리하여 박막 아래 빠져나온 용액을 채취하였다. 이 용액을 343 nm에서 UV 측정하여 cRGD가 반응하면서 생성된 pyridine-2-thione의 양을 스탠다드 커브를 통해 정량하였다.
도 12a-12b에서 볼 수 있듯이, 343 nm에서 생성된 pyridine-2-thione의 피크를 확인할 수 있었으며 이는 TCL-SPION 1 mg 당 40 μg의 cRGD가 컨쥬게이션 된 양이며 약 4 wt (%)를 나타내었다.
실시예 10: cRGD - TCL - SPION 의 크기 및 표면 전하 분석
실시예 4에 기재된 방법과 동일하게, cRGD-TCL-SPION의 크기 및 표면 전하를 분석하였다. 실험 결과, 도 13에서 볼 수 있듯이, carboxyl TCL-SPION 및 amine TCL-SPION 및 cRGD-TCL-SPION의 평균 입자 크기는 각각 28.2 ± 6.7 nm 및 36.3 ± 8.3 nm 및 33.9 ± 8.1 nm의 평균 입자 크기를 나타내었고, 좁은 크기 분포도를 나타내었다. cRGD의 컨쥬게이션으로 TCL-SPION 나노입자크기가 약 5-6 nm 가량 증가하였다.
표면전하(zeta-potential) 측정을 위하여 carboxyl TCL-SPION 및 amine TCL-SPION 및 cRGD-TCL-SPION를 증류수에 희석하여 1 mg/ml의 농도로 만들었다. 표면전하 측정을 통하여 자성 나노입자 표면에 카르복실기가 아민기로 잘 바뀌었는지와 cRGD가 잘 컨쥬게이션 되었는지 여부를 관찰할 수 있다. carboxyl TCL-SPION 및 amine TCL-SPION 및 cRGD-TCL-SPION의 표면전하는 각각 -24.07 ± 1.06 mV 및 -5.28 ± 0.8 mV 및 -29.33 ± 3.01 mV이었다. Carboxyl TCL-SPION의 표면이 노출된 카르복실기 때문에 강한 음전하를 띠다가 중성을 띠는 아민기로 바뀌면서 약 19 mV 정도가 증가하였고, 다시 중성용액에서 COO- 형태를 띠는 아스팔테이트를 포함하는 cRGD의 컨쥬게이션으로 강한 음전하를 띠게 된 것으로 보인다.
실시예 11: cRGD - TCL - SPION 의 세포 유입( Cellular Uptake ) 분석
24 웰에 커버 슬립을 깔고 2 %　젤라틴 용액을 200 μl 씩 넣고 클린 벤치 내부의 UV와 flow 하에 약 4 시간동안 놔두면서 코팅하였다. alpha v beta 3 인테그린을 많이 발현하는 U87MG(glioblastoma cell line) 세포를 웰 당 50,000개씩 씨딩한 후 5 % CO2 인큐베이터 안에서 24시간동안 배양하였다. RPMI1640 배지를 이용해 0.1 mg/ml 농도의 cRGD-TCL-SPION과 TCL-SPION을 준비하여 각각의 well에 처리하고 12시간동안 배양하였다. 처리한 세포를 PBS로 2회 씻어준 후 4% 파라포름알데하이드로 10 분 동안 고정하였다. 이것을 다시 PBS로 2회 씻어준 후 2% 포타슘 페로시아나이드와 1 % HCl 의 1:1 부피 혼합물을 10 분동안 처리하였다. PBS로 2회 씻어준 후 커버 슬립을 슬라이드 유리 위에 놓고 현미경을 통해 관찰하였다. 도 14 에서와 같이 아무 약물도 처리하지 않은 컨트롤에 비해 cRGD-TCL-SPION과 TCL-SPION은 세포내로 uptake되어 포타슘 페로시아나이드에 의해 Fe가 염색이 되어 파란 색을 띠었으며 그 양이 TCL-SPION보다 cRGD-TCL-SPION이 월등히 많음을 확인하였다.
정량적인 Fe의 양을 측정하기 위해 ICP-AES((Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometry) 측정방법을 이용하였다. 6 웰에 U87MG 세포와 alpha v beta 3 인테그린을 적게 발현하는 MCF-7 세포를 웰 당 1000,000개씩 씨딩한후 5 % CO2 인큐베이터 안에서 6시간동안 배양하였다. 0.1 mg/ml 농도의 cRGD-TCL-SPION 및 TCL-SPION 및 cRGD-TCL-SPION에 200 μM의 free cRGD가 포함된 용액을 준비하여 각각의 웰에 처리한 후 각각 3시간, 12시간동안 배양하였다. PBS로 2회 씻어준 후 트립신을 이용하여 세포를 떼어내고 원심분리기를 통해 세포를 모은 후 ICP-AES를 측정하였다. 도 15는 U87MG에서 cRGD-TCL-SPION의 경우 더 많은 양이 uptake됨을 보인 반면 TCL-SPION은 Free cRGD로 인테그린을 블록킹한 경우와 큰 차이가 없음을 나타내었다. 이는 cRGD가 인테그린과 결합하면서 수용체 매개 엔도사이토시스에 의한 세포내 uptake를 용이하게 함을 나타내는 결과이다. 반면 MCF-7 세포에서는 나노입자의 cRGD 유무가 세포내 uptake에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
실시예 12: cRGD - TCL - SPION 에 독소루비신의 선적(Dox@cRGD-TCL-SPION)
실시예 3에 기재된 방법과 유사한 방법으로 cRGD-TCL-SPION에 독소루비신을 선적하고, 선적된 양을 형광 측정하였다. 도 16에서 보는바와 같이 4 ㎍의 독소루비신 형광세기를 모두 빼앗는 cRGD-TCL-SPION의 양을 관찰한 결과 약 0.22 mg의 cRGD-TCL-SPION이 넣어준 독소루비신의 형광 세기를 모두 빼앗는 것으로 관찰되었다. 이를 바탕으로 독소루비신의 형광세기를 모두 빼앗는 cRGD-TCL-SPION의 양을 독소루비신이 최대로 선적될 수 있는 양으로 간주하여, 독소루비신이 선적된 cRGD-TCL-SPION (DOX@cRGD-TCL-SPION)을 준비할 때는 모두 4 ㎍의 독소루비신을 5 % 글루코오즈에 녹인후, 0.22 mg의 cRGD-TCL-SPION을 첨가하여 준비하였다.
실시예 13: Dox@cRGD-TCL-SPION의 세포독성
인간 암세포종 세포주인 U87MG 세포주(ATCC)에 대한 Dox@cRGD-TCL-SPION의 세포독성을 MTT 방법으로 다음과 같이 분석하였다. 96 웰에 U87MG 세포를 5,000개씩 씨딩한 후, 5 % CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 여기에 TCL-SPION, cRGD-TCL-SPION, Dox@TCL-SPION, Dox@cRGD-TCL-SPION, 독소루비신을 독소루비신 농도로 10-4M부터 10-11M까지의 농도로 처리하였다. 즉, 3.2 mg/ml TCL-SPION과 cRGD-TCL-SPION에 각각 58 μl의 독소루비신을 첨가하여 독소루비신 기준 10-4M의 농도를 만든 후, 여기서부터 10배씩 묽혀서 10-11M까지의 농도를 준비하여 처리하였다. 독소루비신이 선적되지 않은 TCL-SPION과 cRGD-TCL-SPION은 각각 독소루비신을 선적하기 위해 필요한 동일한 양의 SPION으로 처리하였다. 즉, 3.2 mg/ml의 TCL-SPION과 cRGD-TCL-SPION을 준비한 후, 여기서부터 10배씩 묽혀가면서 세포에 처리하였다. 24시간이 경과한 후 PBS로 2회 씻어준 후 5 mg/ml 농도의 MTT를 각 well에 20 μl씩 처리하고 4시간동안 5 % CO2 인큐베이터에서 배양하였다. well에 들어있는 용액을 모두 버린 후 DMSO 용액을 넣고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 도 16에서 볼 수 있듯이, 독소루비신만 처리한 그룹, Dox@TCL-SPION 및 Dox@cRGD-TCL-SPION에서 IC50는 각각 0.24 μM, 0.14 μM, 0.02 μM로 Dox@cRGD-TCL-SPION이 가장 낮은 값을 나타내었다. 독소루비신이 선적되지 않은 TCL-SPION 및 cRGD-TCL-SPION에서도 3.2 mg/ml과 0.32 mg/ml의 농도에서는 세포독성을 보였다.
실시예 14: Dox@cRGD-TCL-SPION의 생체내 종양조직에서 MRI 조영능 분석
인간 암세포종 세포주인 U87MG cell line이 이식된 C57BL/6 웅성 마우스를 테스트 동물로 사용하여 Dox@cRGD-TCL-SPION의 MRI 조영능을 분석하였다. 실험 방법은 실시예 6과 거의 동일하게 하였다. 실험 결과, 도 18a에서 볼 수 있듯이, DOX@cRGD-TCL-SPION을 주입하고 1시간이 경과한 경우, 종양 부위에서 T2-웨이티드 MR 이미지에서 어두운 부위가 나타났으며 4시간이 경과 할 때까지도 평균 35~40%의 T2 시그널 감소를 보였다. 또한 12 시간이 경과한 후도 평균 30 % 이상의 T2 시그널 감소를 나타내었다.
한편, Dox@TCL-SPION을 이용한 MRI의 경우(도 18b), 주입 후 1시간이 경과한 후 평균 32 %의 T2 시그널 감소를 보였고, 4시간이 경과 할 때까지도 평균 38 %의 T2 시그널 감소를 나타내었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명의 고분자의 제조과정을 보여준다.
도 2는 고분자가 코팅된 본 발명의 다기능 복합체를 보여준다.
도 3은 본 발명의 다기능 복합체에서 항암제 독소루비신이 선적되는 양을 보여주는 형광 측정 결과이다. 가장 위쪽 곡선부터 가장 아래쪽 곡선은 각각 다음에 해당한다: 4 ㎍ 독소루비신 단독 및 표시된 양의 DOX@TCL-SPION.
도 4는 DOX@TCL-SPION에서 독소루비신에 대한 해리상수 Kd(dissociation constant)를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 다기능 복합체의 입자 분포를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 다기능 복합체에서 약물인 독소루비신이 방출되는 양상을 보여준다.
도 7은 본 발명의 DOX@TCL-SPION의 생체내 종양 조직에서 MRI 조영능 실험 결과이다.
도 8a-8b는 DOX@TCL-SPION의 생체내 종양 조직 내에 독소루비신이 축적됨을 확인 및 각 장기에서의 생체 편재율을 관찰한 결과이다. SD는 DOX@TCL-SPION을 나타낸다.
도 9는 DOX@TCL-SPION의 종양 크기 성장 억제 효과를 보여주는 그래프이다. SD는 DOX@TCL-SPION, DOX는 독소루비신 약물 자체를 나타낸다.
도 10은 DOX@TCL-SPION이 투여된 마우스의 체중 변화를 보여주는 그래프이다. SD는 DOX@TCL-SPION, DOX는 독소루비신 약물 자체를 나타낸다.
도 11은 cRGD-TCL-SPION의 제조과정을 나타낸다.
도 12a-12b는 cRGD-TCL-SPION에 컨쥬게이션된 cRGD의 양을 분석하기 위한 흡광도 측정 결과이다.
도 13은 Carboxyl TCL-SPION, Amine TCL-SPION 및 cRGD-TCL-SPION에 대한 크기 및 표면전하 분석 결과이다.
도 14는 TCL-SPION 및 cRGD-TCL-SPION의 세포 유입 정도를 분석한 결과에 대한 이미지이다.
도 15는 cRGD-TCL-SPION의 세포 유입 정도를 분석하기 위한 ICP-AES((Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometry) 측정 결과이다.
도 16은 cRGD-TCL-SPION에서 항암제 독소루비신이 선적되는 양을 보여주는 형광 측정 결과이다.
도 17은 독소루비신이 선적딘 Dox@cRGD-TCL-SPION의 U87MG 세포주에 대한 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 각각 Dox@cRGD-TCL-SPION 및 DOX@TCL-SPION의 생체내 종양 조직에서 MRI 조영능 실험 결과이다.

Claims (22)

  1. 복수의 나노입자를 포함하는 조영 및 약물운반용 다기능 복합체로서, 상기 나노입자는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 조영 및 약물운반용 다기능 복합체:
    (a) 신호 발생 코어(signal generating core); 및
    (b) 실릴-, 하이드록시실릴- 또는 알콕시실릴-작용기성을 포함하는 표면 앵커링 부위 및 약물 결합부위를 포함하며 상기 신호 발생 코어의 표면에 코팅되어 있는 수용성 고분자 외부 쉘(water soluble polymeric outer shell).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 신호 발생 코어는 상자성(paramagnetic), 초상자성(superparamagnetic) 또는 양성자 밀도(proton density) 신호 발생 코어인 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  3. 제 3 항에 있어서, 상기 신호 발생 코어는 산화철을 포함하는 초상자성 신호 발생 코어인 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 실릴-, 하이드록시실릴- 또는 알콕시실릴-작용기성이 포함된 수용성 고분자 외부 쉘은 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)) 또는 그 유도체, 폴리메타아크릴산(poly(meta)acrylic acid)) 또는 그 유도체, 폴리아크릴아미드(poly(acrylic amide)) 또는 그 유도체, 폴리언데세노산(poly(undecenoic acid)) 또는 그 유도체, 이들의 공중합체, 키토산 또는 그 유도체, 덱스트란 또는 그 유도체, 셀룰로오스 또는 그 유도체, 헤파린 또는 그 유도체, 알기네이트 또는 그 유도체, 또는 히알루론산 또는 그 유도체를 주골격으로 가지는 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 실릴-, 하이드록시실릴- 또는 알콕시실릴-작용기성이 포함된 수용성 고분자 외부 쉘은 실리콘 원소 사이의 결합을 통하여 가교결합된 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 실릴-, 하이드록시실릴- 또는 알콕시실릴-작용기성이 포함된 수용성 고분자 외부 쉘은 항-바이오파울링 특성을 갖는 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리알킬렌 옥사이드, 또는 이들의 모노에스테르화 유도체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 수용성 고분자 외부 쉘은 다음 화학구조식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 다기능 복합체:
    화학식 1
    Figure 112008063314751-PAT00002
    상기 화학식에서, R1은 실릴알킬기, (알콕시실릴)알킬기 또는 (하이드록시실릴)알킬기이고; R2는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이고; R3는 알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기 또는 히드록실기이며; R4, R5 및 R6는 서로 독립적으로, H 또는 C1-C5 알킬기이며; X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 산소, 황 또는 질소 원자이고; l, m 및 n은 서로 독립적으로 1-10,000의 정수이다.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 화학식 1의 고분자 내에 있는 실리콘은 다른 실리콘 원소와 열적 가교결합(thermally crosslinked) 되어 있는 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 다기능 복합체는 자기공명영상(magnetic resonance imaging)에 이용되는 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 다기능 복합체는 인 비보 암 자기공명영상화에 이용되는 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 고분자가 코팅된 나노입자들의 평균 직경은 5-50 nm인 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자의 포화자성은 20-100 emu/g Fe인 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 수용성 외부 쉘의 반응성 부위에 약물이 추가적으로 결합된 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 약물은 상기 약물 결합 부위와 비공유성 결합으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 비공유성 결합은 이온결합, 배위결합, 소수성 상호작용, 반데르발스 결합 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 비공유성 결합은 이온결합인 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 화학약물, 단백질, 펩타이드 또는 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  18. 제 7 항에 있어서, 상기 R3는 카르복실기이고, 상기 카르복실기는 석시너마이드, 석시너미딜 에스테르, 설포-석시너미딜 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 알데하이드, 산무수화물, 아자이드, 아졸리드, 카보이마이드, 에폭사이드, 에스테르, 글리시딜 에테르, 할라이드, 이미다졸 또는 이미데이트에 의해 활성화 되어 있는 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 타겟팅 분자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟팅 분자는 항체, 앱타머 또는 세포부착 펩타이드인 것을 특징으로 하는 다기능 복합체.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 세포부착 펩타이드는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg- Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val), EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val) 또는 LDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)인 것을 특징으로 하는 다기능복합체.
  22. 상기 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 다기능 복합체를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 이미징 및 약물 운반 동시 방법.
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