KR101267313B1 - 유기 고분자 나노입자를 이용한 암세포의 광열치료법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포질 감응형 유기 고분자 나노입자를 이용한 암세포 광열치료법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 나노물질 자체의 독성이 없고 생물학적 도펀트, 예를 들어, 양성자, 활성산소종, 산화 환원력을 갖고 있는 생체 분자 등이 풍부한 환경에서 광 감응성을 가짐으로써 근적외선 부근의 광 조사를 통해 광열 효과를 나타내어 암세포를 특이적으로 제거할 수 있다.

Description

유기 고분자 나노입자를 이용한 암세포의 광열치료법{Photothermal ablation of cancer cells using organic nanoparticles}

본 발명은 나노물질 자체의 독성이 없고 생물학적 도펀트, 예를 들어, 양성자, 활성산소종, 산화 환원력을 갖고 있는 생체 분자 등이 풍부한 환경에서 광 감응성을 가짐으로써 근적외선 부근의 광 조사를 통해 광열 효과를 나타내어 암세포를 제거할 수 있는 갖는 유기 고분자 나노입자를 이용한 암세포의 광열치료법에 관한 것이다.

암의 광열치료법은 최근에 각광받고있는 효과적인 새로운 암 치료법 이다. 기존의 암 치료법은 크게 세가지 방법이 있는데, 첫 번째는 물리적으로 암을 수술적으로 잘라내는 것이다. 이 방법은 눈에 보이고 만져지는 암은 제거할 수 있었으나 작은 암이나 암의 전이를 막을 수 없다. 두 번째로는 화학적으로 항암제를 이용한 치료법이다. 세 번째는 방사선치료로, 암이 있는 부위에 방사선을 집중 조사함으로 암을 제거하는 것으로 수술로 제거할 수 없는 암에 대해 큰 효과가 있고 여러 분야에서 연구가 진행 중에 있다. 현재 이들 3가지 방법을 단독으로 또는 함께 사용하여 암을 치료하고 있으며 각 분야마다 지속적인 발전을 거듭하여 이에 관련된 논문이 세계에서 계속하여 발표되고 있는 실정이다. 그러나 아직도 암은 여전히 두려움의 존재이며 완치율이 50% 정도이다. 수술은 대부분의 경우 전신마취를 동반한다는 어려움이 있으며, 수술의 상처가 몸에 남게 되고 더욱이 퍼진 경우는 수술이 도움이 되지 못한다. 항암치료는 환자를 대상으로 사용되고 있는 것은 약 40여 종이며 이들은 암세포에 작용하여 암세포의 증식을 억제하지만 동시에 정상세포에도 작용한다는 단점을 가지고 있다. 대부분의 항암제 치료를 하면 손톱 발톱의 성장이 느려지고 머리털이 빠지며, 점막의 손상이 일어나 입이 헐뿐 아니라 위장관 점막도 헐어 설사 복통이 있고 조혈세포가 손상되어 백혈구 적혈구 혈소판이 감소한다. 방사선치료는 방사선의 특성상 직진하는 특성이 있어 방사선을 조사하면 방사선이 암에 도달하고 나서 암세포에 손상을 주지만 암을 통과한 방사선이 정상세포에도 손상을 주어 이 역시 인체에 유해한 악영향을 남긴다.

그러나 광열 치료법은 암 세포는 정상세포에 비해 열에 약함을 이용하여, 암세포가 위치한 국소적인 위치에 광 감응물질을 위치시킨 뒤, 외부에서 자극을 주어 열을 발생시켜 암세포만을 선택적으로 사멸시키는 방법이다. 이는, 순수한 발열효과를 이용하므로 기존의 부작용을 최소화할 수 있음을 예상할 수 있다.

이러한 광열 치료법을 위한 광 감응물질로는 금 나노입자, 나노 다공성 실리카, 탄소 나노튜브 혹은 자성을 띄고있는 산화철 등이 사용되어왔었다. 이러한 나노물질을 사용한 광열 치료법은 기존의 암 치료법에 비해 자극이 적어 부작용이 적으며, 효과적이긴 하나 나노물질 자체가 독성을 갖고 있으며, 나노물질이 암세포가 아닌 정상세포 근처에 있을 때 외부자극이 가해지면, 정상세포 또한 사멸을 시킬 수 있는 부작용이 있다.

본 발명의 목적은 나노물질 자체의 독성이 없으면서도 광 감응성을 가지고 있어 광열치료를 통해 암세포를 선택적으로 제거할 수 있는 유기 고분자 나노입자를 이용한 암세포 광열 치료 시스템을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 내 도핑에 의해 600 내지 1100 nm의 파장 영역에서 흡광을 갖는 고분자 나노입자를 포함하는 광열 요법 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 광열 요법 치료용 조성물; 및

600 내지 1100 nm 파장 영역의 광선을 조사하는 장치를 포함하는 종양 치료용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 인간을 제외한 동물에 본 발명의 광열 요법 치료용 조성물을 투여하는 단계; 및

600 내지 1100 nm 파장 영역의 광선을 조사하는 단계를 포함하는 종양의 광열 치료방법을 제공한다.

본 발명은 콜로이드 안정성이 좋고, 세포내 환경에서 pH 및 활성산소종 혹은 산화 환원력을 갖고 있는 생체 분자 하에서 근적외선 부근의 흡광을 나타내어 암세포만을 효과적으로 제거할 수 있는 수용성 고분자 나노입자를 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 수용성 폴리아닐린 나노입자에 기반을 둔 유기 광열 제제의 제조 및 NIR 레이저 조사에 의한 상피암세포의 광열 제거를 위한 용도를 도식화한 것이다.
도 2는 젤 투과 크로마토그래피에 의한 합성 에멀랄딘 염기 상태의 폴리아닐린 나노입자의 분자량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 a)는 클로로포름(하부층) 및 물(상부층)에서 본 발명의 에멀랄딘 염기 폴리아닐린 나노입자(Emeraldine Base Polyaniline Nanoparticle, EBPANP)(왼쪽) 및 에머랄딘 염기(EB)(오른쪽)의 분산성 실험, b)는 EBPANP의 SEM 이미지(스케일 바: 200 nm), c)는 EBPANP의 크기 분포, d)는 에머랄딘 염 폴리아닐린 나노입자(Emeraldine Salt Polyaniline Nanoparticle, EBPANP) 및 ESPANP 상태를 나타내는 흡광 스펙트럼과 사진(내부), e)는 순수 물, EBPANP, 및 ESPANP에 대한 NIR 레이저 조사의 광열 효과(808 nm, 2.45 W/cm², 3분 동안 실시)를 나타낸 것이다.
도 4는 폴리아닐린 함량에 따른 본 발명 나노 입자(EBPANP)의 크기 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 pH의 PBS에 도핑된 본 발명 나노 입자(EBPANP)의 흡광 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 활성산소종에 도핑된 본 발명 EBPANP의 도핑 효율성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 다양한 pH의 PBS 도핑 후 본 발명 나노 입자(ESPANP)의 크기 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 PANP-EB 및 PANP-ES의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9의 a)는 배양 배지에서 EBPANP, 배양 배지에서 A431 세포, EBPANP와 함께 배양한 A431 세포(ES PANP로 전이), 및 자유 배지의 광학사진도이고, b)는 배양 배지에서 EBPANP 처리된 A431 세포(ESPANP로 전이) 및 유리 EBPANP의 흡광 스펙트럼이고, c)는 5분 동안 NIR 레이저 조사(808 nm, 2.45 W/cm²) 후 EBPANP 처리된 A431 세포(왼쪽) 및 미처리된 대조군 세포(오른쪽)의 현미경 사진도(스케일 바: 200 mm)이다.
도 10은 열화상 카메라를 이용하여 측정한 본 발명의 EBPANP의 고열 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 EBPANP 처리 시 A431 세포 생존능을 MTT 분석방법으로 측정한 결과이다.
도 12는 우태아혈청 함량 별 본 발명의 EBPANP의 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은 A431 용해물을 본 발명의 EBPANP에 처리한 경우 EBPANP의 최대 흡광을 갖는 영역의 전이 여부를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 EBPANP를 주사한 종양에서의 NIR 흡광도를 나타낸다.
도 15의 a)는 본 발명의 EBPANP 처리 및 NIR 조사 후; b) 미처리 대조군의 종양-조직 부분의 조직학 실험 결과이며, 스케일 바는 1 mm(저배율 확대도, 왼쪽) 및 500 mm(고배율 확대도, 오른쪽)이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 세포 내 도핑에 의해 600 내지 1100 nm의 파장 영역에서 흡광을 갖는 고분자 나노입자를 포함하는 광열 요법 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 "세포 내 도핑에 의해 600 내지 1100 nm의 파장 영역에서 흡광을 갖는 고분자 나노입자"란 고분자 나노입자가 세포 내에 도입된 경우 세포 내에 존재하는 도펀트에 의해 도핑되어 600 내지 1100 nm의 파장 영역에서 흡광을 가짐을 의미한다. 상기 고분자는 세포 외에서는 상기 파장 영역에서 흡광을 나타내지 않아 세포 내 도펀트를 함유하는 암세포만을 특이적으로 제거하고, 정상세포, 혈관 등에는 부작용을 일으키지 않게 된다. 따라서, 기존의 광열 치료 시 광열제의 암세포 또는 암 조직으로의 직접 투여뿐만 아니라 주사제를 이용한 혈관 투여를 통해서도 주입이 가능하고, 600 내지 1100 nm의 파장 범위의 광선 조사를 통해 정상세포, 혈관 파괴 없이 암세포만을 특이적으로 제거할 수 있다.

상기 세포 내 도핑에 의해 600 내지 1100 nm의 파장 영역에서 흡광을 나타내는 고분자 나노입자는 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리(1,4-페닐렌비닐렌)(poly(1,4-phenylenevinylene)), 폴리(1,4-페닐렌 설파이드)(poly(1,4-phenylene sulfide)), 폴리(플루오레닐렌에티닐렌)(poly(fluorenyleneethynylene)) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 고분자 나노입자는 상기 고분자 코어와 친수성 쉘로 이루어진 구조를 가질 수 있다.

상기 친수성 쉘은 상기 고분자 코어의 외부에 위치하여 높은 수용성을 나타내어 본 발명의 고분자 나노입자의 분산성을 높일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 친수성 쉘은 폴리옥시에틸렌 쉘로서 고분자의 유기상과 폴리옥시에틸렌-스테아레이트 수용 상의 유화를 통해 고분자의 외각을 둘러싸는 코어-쉘 구조로 형성될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 고분자 나노입자는 폴리아닐린 나노입자일 수 있다. 상기 폴리아닐린 나노입자는 에머랄딘 염기 상태의 폴리아닐린(polyaniline emeraldine base) 코어와, 폴리옥시에틸렌 쉘로 구성된 구조를 갖는 입자인 것을 특징으로 한다.

상기 폴리아닐린은 생체적합하고, 세포 증식을 연구하기 위한 전기활성소재로서 주로 사용된다. 폴리아닐린의 주요 장점은 전자 이동을 유도하고, 여기-에너지 수준을 감소시키는 원자가 밴드 및 전도성 밴드 간의 밴드 간 갭 상태를 발생하는 양자화를 위한 도펀트(예를 들어, 강산, 루이스산, 전이금속, 알칼리 이온)라는 것이다. 따라서, 폴리아닐린의 광학-흡광 피크는 도핑 과정 동안 에머랄딘 염기(emeralidine base, EB)가 에머랄딘 염(emeralidine salt, ES)으로 전이되면서 근적외선 영역으로 적색 이동한다. 폴리아닐린에 의한 근적외선의 흡광은 암 세포 제거를 위해 이용될 수 있는 상당한 함량의 열 에너지를 발생한다(도 1 참조).

본 발명의 고분자 나노입자의 제조방법은 통상의 고분자 중합을 통해 제조될 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.

일 구체예에 따르면, 폴리아닐린 나노입자는 HCl과, 산화제로 암모늄 퍼설페이트를 사용하여 양자화된 아닐리니움 염을 이용하여 합성한다. 화학적 산화중합을 통해 진녹색 침전물(ES)이 생기며, 과량의 탈이온수를 이용하여 세척하여 정제한 합성 ES는 NaOH로 재도핑하여 유기 상(예를 들어, 클로로포름)에서 폴리아닐린의 용해성을 증가시키고, 상기 유기 상을 폴리옥시에틸렌-스테아레이트를 함유하는 수용 상에 부가하여 포화시키고, 유화시켜 균일한 나노입자 크기를 얻는다(EB 상태). 재도핑 동안, 합성된 중합체 분말은 자주색(EB)으로 변한다. 상기로부터 합성된 폴리아닐린 EB의 분자량은 1,000 내지 1,000,000Da일 수 있다.

EB 상태(EBPANP)에서 폴리아닐린 나노입자는 외부의 폴리옥시에틸렌 사슬로 인해 높은 수용성을 나타낸다.

본 발명의 고분자 나노입자는 부드러운 표면을 갖는 입자 상태이고, 고분자의 함량 의존적으로 나노입자의 크기가 증가한다. 바람직하게는, 1 nm 내지 1 ㎛, 보다 바람직하게는, 10 nm 내지 200 nm의 직경을 갖는 입자인 것이 좋다. 상기 범위를 벗어날 경우, 수용 환경에서 불안정하여 암의 광열 치료에 적용하기 어렵다.

또한, 본 발명의 고분자 나노입자는 세포질 내부 특히, 미토콘드리아에서 발생하는 생물학적 도펀트, 예를 들어, pH; 활성산소종, 활성질소종, 과산화 수소, 알칼리 금속 이온, 또는 자유 라디칼 등의 산화물질; 또는 산화 환원력을 갖고 있는 생체 분자 중 적어도 하나에 의한 도핑을 통해 광 감응성을 가질 수 있다. 또한, 생물학적 도펀트의 농도 의존적으로 600 내지 1100nm의 파장 영역에서 흡광도가 증가하는 광 감응성을 갖는다.

상기 pH 범위는 고분자 나노입자의 종류에 따라 다양한 범위에서 도핑이 일어날 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예를 들어, 1 내지 7 일 수 있다. 보다 구체적으로 1 내지 3일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 에머랄딘 염기 상태의 폴리아닐린 나노입자는 세포질 내부에서 에머랄딘 염 상태로 전이되면서 짙은 자주색에서 녹색으로 변하며, 600 내지 1100 nm의 파장 영역에서 흡광도가 증가하는 광 감응성을 갖는다. 상기 에머랄딘 염기 상태의 폴리아닐린 나노입자는 콜로이드 분산성이 좋은 특징이 있다. 일 구체예에 따르면, 15일까지 콜로이드 분산성을 유지한다.

상기 본 발명의 고분자 나노입자는 600 내지 1100 nm의 파장 범위의 레이저를 조사할 경우, 높은 온도 상승을 나타낸다.

일 구체예에 따르면, 순수 물의 경우 6.6 ℃인데 반해, 본 발명의 에머랄딘 염기 상태의 폴리아닐린 나노입자는 54.8 ℃의 온도 상승을 유발한다. 동시에 푸른색(순수 물)이 짙은 붉은색(ES 상태의 폴리아닐린 나노입자)으로 색 변화가 관찰되며, ES 상태의 폴리아닐린 나노입자는 600 내지 1100 nm의 파장 범위의 레이저를 조사한 후에도 콜로이드 안정성을 유지한다.

따라서, 상기 에머랄딘 염기 상태의 폴리아닐린 나노입자는 혈액이나 정상 조직에서는 광 감응성이 없는 에머랄딘 염기 상태의 폴리아닐린 나노입자로 존재하다가 정상 세포에 비해 비교적 산성 조건이면서도, 생물학적 도펀트가 다량 존재하는 암세포의 세포질 내로 이동한 경우에는 광 감응성의 에머랄딘 염 상태로 전이되어 600 내지 1100 nm의 파장 범위의 광선이 조사될 경우, 온도 상승을 통해 암세포만을 효과적으로 제거할 수 있는 것이다.

본 발명의 광열 요법 치료용 조성물에 있어서, 고분자 나노입자는 총 조성물 1mL 당 1 ng 내지 1 g, 보다 구체적으로는 100 ng 내지 20 mg의 농도로 포함될 수 있다. 상기 범위 내일 경우, 조성물이 안정적으로 존재하기 때문이다.

또한, 본 발명의 광열 요법 치료용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 광열 요법 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조영제 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 광열 요법 치료용 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.

또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 광열 요법 치료용 조성물; 및

600 내지 1100 nm 파장 영역의 광선을 조사하는 장치를 포함하는 종양 치료용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 광열 요법 치료용 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 또는 자궁경부암 등을 치료하는데 이용될 수 있으므로, 종양 치료를 위한 키트에 포함될 수 있다.

상기 광선은 레이저 빔인 것이 좋다.

본 발명은 또한 인간을 제외한 동물에 본 발명의 광열 요법 치료용 조성물을 투여하는 단계; 및

600 내지 1100 nm 파장 영역의 광선을 조사하는 단계를 포함하는 종양의 광열 치료방법에 관한 것이다.

본 발명의 종양의 광열 치료방법은 인간을 제외한 동물의 종양 표면에 본 발명의 광열 요법 치료용 조성물을 도포하거나, 직접 종양에 본 발명의 광열 요법 치료용 조성물을 주사하거나, 혈관 주사한 후, 600 내지 1100 nm 파장 범위의 광선을 조사하여 종양 세포의 사멸을 통해 종양을 제거하는 방법이다.

상기 광선은 레이저 빔인 것이 좋으며, 광선 조사는 바람직하게는 1 mW/cm² 내지 100 W/cm²에서, 보다 구체적으로는 10 mW/cm² 내지 10 W/cm²에서 10초 내지 30 분간 실시하는 것이 좋다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<제조예 1> 폴리아닐린의 합성(에머랄딘 염기, EB)

폴리아닐린, 에머랄딘 염기(EB)는 과량의 HCl 하에서 화학적 산화 중합을 통해 합성하였다. 아닐린 단량체(0.2 mol)를 1M HCl 수용액(300 mL)에 첨가하였다. 계속해서, 산화제로 1M HCl 수용액(200 mL)에서 제조된 암모늄 퍼설페이트 용액(0.05 mol)을 방울씩 첨가하여 4℃에서 6시간 동안 중합 과정을 수행하였다. 진녹색의 침전된 중합체 염(ES)은 여과하여 반응 용기로부터 얻고, 1M NaOH 용액(500 mL)에 재분산 시켰다. 그 후, 탈양자화된 EB를 여과하고, 아세톤(500 mL)에서 재분산시켰다. 마지막으로, 여과 및 진공 오븐에서 48시간 동안 건조 후 EB 미세 분말을 얻었다.

젤 투과 크로마토그래피(Acme 9200 GPC, Young Lin Instrument Co., Ltd.)를 이용하여 합성된 EB의 분자량을 측정한 결과, 5200 Da였다(분산도:1.1; 도 2 참조).

<실시예 1> 수용성 폴리아닐린 나노입자(PANP-EB)의 제조

수용성 폴리아닐린 나노입자(PANP-EB)를 제조하기 위해, 상기 제조예 1에서 제조한 10 mg의 EB 분말을 4 mL의 클로로포름에서 용해시켰다. 이 유기 상을 20 mL의 600 mg의 폴리옥시에틸렌-스테아레이트를 함유하는 수용 상에 부가하였다. 유기 및 연속 상의 상호 포화 후, 상기 혼합물은 초음파기(Sae Han SH-2100, Korea)로 190 W에서 10분 동안 유화시켰다. 유기 용매를 증발시킨 후, 원심분리(15,000 rpm, 30분)하여 PANP-EB를 정제하고, 침전된 PANP-EB는 이후 이용할 때까지 수상에서 분산시켜 두었다.

제조된 PANP-EB의 흡광도는 흡광 스펙트로미터(Mecasys UV-2120, Korea)에서 얻었다. 크기 및 제타-포텐셜은 레이저 스캐터링(ELS-Z, Otsuka Electronics, Japan)에서 측정하였고, PANP-EB의 특징적인 밴드는 Fourier-transform infrared spectroscopy(FT-IR, Varian, Excalibur™, USA)에서 확인하였다.

또한, 수용성 폴리아닐린 나노입자(PANP-EB)가 성공적으로 형성되었는지를 확인하기 위해, SEM 및 AFM 측정을 실시하였다. 샘플은 기질이 처리된 피라냐(piranha) 상에서 1㎕의 PANPs-EB 용액(0.1mg/mL)을 떨어뜨려 제조하였다. 그 후, 상기 샘플은 진공 건조 오븐을 사용하여 완전히 건조하였다. SEM 측정은 JEOL JSM-6500F에서, AFM 측정은 PSIA XE-100에서 실시하였다.

EB 상태의 폴리아닐린 나노입자(EBPANP)는 외부의 폴리옥시에틸렌 사슬로 인해 높은 수용성을 나타냈다(도 3a). 주사전자현미경 측정 결과, EBPANP는 부드러운 표면과 구형을 나타냈고(도 3b), 10 mg의 폴리아닐린을 공급한 경우, 크기가 115.6±16.3 nm인 단분산성을 나타냈다(도 3c).

또한, 폴리아닐린 함량을 증가하면, PANP의 크기는 50 mg의 폴리아닐린 경우 307.8±32.4 nm에서 100 mg의 폴리아닐린의 경우 412.7±36.2 nm로 증가하였다(도 4 참조). 그러나, 이들 나노입자들은 상대적으로 컸고, 광열 적용을 위한 수용 상에서는 매우 불안정하였다.

산성 및 활성산소종에 대한 PANP의 민감도를 조사하기 위해, 다양한 pH 값 하에서 이들의 광학적 특징과 콜로이드 안정성을 평가하였다.

PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)에서 EBPANP의 흡광 스펙트럼에서, 벤젠 고리의 p-p* 전이는 435 nm에서 관찰되었고, 퀴노이드 및 벤젠노이드 고리 간의 전하 전이는 580 nm에서 관찰되었다(도 3d 및 도 5 참조). PBS(pH 1, ESPANP로 전이)으로 EBPANP를 도핑하는 경우, 응집이나 침전 없이 PANP의 색이 짙은 자주색에서 녹색(ESPANP)으로 변하였다(도 3d 내부 사진 참조). 또한, 퀴노이드 및 벤젠노이드 고리 간의 전하 전이를 위한 주요 흡광 피크는 증가된 전자 전달 효과에 의해 적색 이동하였다. ESPANP의 p-p* 전이는 EBPANP(430 nm)의 것과 유사하지만, 퀴노이드 및 벤젠노이드 고리 간의 전하 전이는 근적외선 영역(810 nm)에서만 관찰되었다. pH 값(pH 1까지)에서의 이러한 감소와 더불어, 810 nm에서 ESPANP의 흡광도는 EBPANP에 대해 관찰되는 것에 비해 대략 187% 정도 증가하였다(pH 7.4);

(ABS_{ESPANPs(pH1) -} ABS_{EBPANPs(pH7.4)}/ABS_{EBPANPs(pH7.4)}×100

결과적으로, ESPANP는 810 nm에서 근적외선 레이저 조사를 이용한 광열제로서 적당하며, 혈액이나 정상 조직을 손상시키지 않는다. 그러나, 극히 낮은 pH 조건(pH 3 미만)은 살아있는 암 세포에서는 생성하기 어렵다. 양자, 알칼리 이온 및 활성산소종 같이 살아있는 암세포에서 많은 잠재적 도펀트들은 미토콘드리아로부터 생성되기 때문에 활성산소종들을 처리한 후 PANP의 흡광 스펙트럼을 조사하였다. 이를 위해, 잠재적 도펀트로서 활성산소종들과 함께 EBPANP를 처리하여 EBPANP로부터 ESPANP를 형성하기 위한 도핑 과정의 효율성을 확인하였다(도 6 참조).

하이드록실 라디칼의 경우, 활성산소종들의 농도가 증가함에 따라 흡광 비율(l810/l580)은 증가하였다. 그러나, 과산화수소의 경우에는 의미있는 변화는 없었다. 산화적 스트레스의 정도는 중요할 것이다. 무엇보다도, 제조된 PANP는 생물학적 도펀트(산성 환경 및/또는 미토콘드리아에서 유래한 활성산소종들)에 의해 도핑될 것이고, 강한 근적외선 흡광을 나타낼 것이다. 그리하여 생물학적 도펀트(세포내 양자 및 활성산소종들)에 의한 집중 도핑에 의해 형성된 ESPANP는 광열 효과에 의해 암 세포를 제거할 것이다.

PBS(pH 1) 로 도핑 후 ESPANP(121.3±23.4 nm)의 수력학적 크기는 EBPANP에 비해 유의적으로 다르지는 않았으며(도 7 참조), ESPANP (pH 1, 17.63.4 mV)의 제타 포텐셜은 EBPANP (pH 7.4, 13.63.7 mV)과 유사하였다. 또한, 15일까지 ESPANP가 콜로이드 분산성을 유지함을 관찰하였다. PANP의 폴리아닐린 코어의 도핑 후, 외각 폴리옥시에틸렌 쉘은 여전히 입체 장애를 제공하였다. 또한, PANP(EB 및 ES 상태 둘 다)의 화학 구조는 FT-IR 스펙트럼을 통해 확인하였다(도 8 참조):

1148 cm^-1 (N=Q=N 진동수: 퀴노이드 고리의 스트레칭 진동수), 1330 cm^-1 (방향족 C-N 스트레칭), 1467 cm^-1 (벤젠노이드 고리의 C=C 및 C=N 스트레칭), 및 1563 cm^-1 (퀴노이드 고리의 C=C 및 C=N 스트레칭)

PANP의 고열 가능성을 조사하기 위해, NIR 레이저 조사 시 발생된 열량을 평가하였다.

도 9c에 나타난 바와 같이, ESPANP 용액에 대한 NIR 조사는 순수 물에 대해서 관찰된 것(6.6 ℃)에 비해 더 큰 온도 상승(54.8 ℃)을 일으켰다.

IR 카메라에 기록된 열 이미지는 고열 효과를 확인한 결과, 푸른색(순수 물)에서 짙은 붉은색(ESPANP 용액)으로의 특징적인 색 변화가 관찰되었다(도 10 참조).

또한, ESPANP의 콜로이드 안정성은 NIR 조사 후에도 유지되었다.

<실시예 2> 에머랄딘 염기 상태의 폴리아닐린 나노입자의 인 비트로 광열-제거능 평가

EBPANP의 ESPANP로의 전이가 암세포에서 발견되는 양성자화 제제로서 생물학적 도펀트(예를 들어, 양성자 및 활성산소종)에 의해 유도되는지를 측정하기 위해 상피암세포주인 A431 세포를 사용하여 EBPANP의 인 비트로 광열-제거 능력을 평가하였다.

(MTT 분석에 의한 세포 생존능 측정)

농도별로 PANP가 처리된 A431 세포의 세포 생존능을 평가하였다. 세포 생존능은 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)의 미토콘드리아 산화를 기초로 한 비색 분석에 의해 정량화하였다.

구체적으로 설명하면, A431 세포는 96-웰에서 10⁴ cells/200 ㎕의 밀도로 수확하고, 5% CO₂ 분위기 하에서 37℃에서 배양하였다. 상기 세포는 PANP-EB와 24시간 동안 배양한 후, 100㎕의 PBS(pH 7.4, 1mM)로 세척하고, 신선하게 제조된 10 ㎕의 MTT를 처리하고 4시간 동안 배양한 다음, 100㎕의 DMSO를 처리하였다. 24시간 후, 플레이트는 575 nm의 흡수 파장 및 650 nm의 기준 파장을 사용하여 Enzyme-Linked Immunosorbent assay(ELISA, Spectra MAX 340, Molecular devices, USA)을 통해 분석하였다.

성장 및 증식의 유의적인 억제는 10 mg/mL 농도까지의 PANP에서는 관찰되지 않았다(도 11 참조). 배양 배지(Dulbecco modified Eagle medium)에서, EBPANP는 짙은 자주색을 나타냈고(도 9a), 흡광 스펙트럼에서 p-p* 전이가 관찰되었다(도 9b). 그러나, EBPANP를 A431 세포에 처리한 경우, 그들은 녹색으로 바뀌었고(도 9a), 주요 흡광 피크는 NIR 영역으로 이동하였다(도 9b). EBPANP가 처리된 A431 세포는 도핑 과정에 따른 밴드-갭 에너지의 감소로 인해 흡광 스펙트럼에서 상당한 적색이동을 나타냈다(545 nm에서 >700 nm까지)(도 9b).

반대로, 우태아혈청 용액(75%까지의 FBS 농도를 포함)에서 EBPANP는 유사한 이동을 일으키지 않았다(도 12 참조).

또한, EBPANP는 A431 세포 용해물로 처리 시 ES 상태로 전이될 수 없음을 확인하였다(도 13 참조).

이들 결과뿐만 아니라 EBPANP가 이 암세포주의 세포내 환경에서 생물학적 도펀트(예를 들어, 양성자 및 활성산소종)에 의해 효과적으로 도핑되었음을 입증하였다.

(NIR 레이저 조사를 이용한 암 세포의 인 비트로 광열 제거 실험)

EBPANP가 NIR 레이저 조사(λ=808 nm, 2.45W/cm², 5분 동안 실시)에 의해 A431 세포의 광열 제거를 촉진할 수 있는지를 조사하였다.

이를 위해, 상피암세포주인 A431 세포는 American Tissue Type Culture (ATCC, Rockville, MD)로부터 얻은 후 배양하였다. 웰의 바닥에 박막 유리 커버 슬라이드가 있는 24-웰 플레이트에서 37℃에서 24시간 동안 A431 세포(10⁵ cells/well)와 500㎕의 PANP-EB를 배양하였다. PBS로 세포를 세척하고, 1 mL의 페놀 레드를 뺀 DMEM (Gibco^®)를 각 웰에 첨가하였다.

레이저 조사 실험을 위해, NIR coherent diode laser(808 nm, 2.45 W/cm², UM30K, Jenoptik)에 10분 동안 세포를 노출시켜 광열 세포 손상을 유도하였다. 살아있는 세포의 분포는 트리판 블루로 5분 동안 세포 염색한 후 광학 시스템 현미경(BX51, Olympus)을 이용하여 관찰하였다.

도 9c에 나타난 바와 같이, 트리판 블루로 염색하여 측정했을 때와 같이(붉은색 동그라미, 왼쪽), EBPANP는 상당한 세포 파괴를 중재하였다; 그러나, A431 세포는 EBPANP 부재 시 NIR 조사에 의해 손상을 입지는 않았다(도 9c, 오른쪽).

<실시예 3> 에머랄딘 염기 상태의 폴리아닐린 나노입자의 인 비보 광열-제거능 평가

인 비보에서 에머랄딘 염기 상태의 폴리아닐린 나노입자의 암세포에 대한 광열-제거능을 평가하였다.

A431 상피암세포는 5% CO₂ 분위기 하에서 10% 우태아혈청(FBS, Gibco^®) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(PS, Gibco^®)이 첨가된 DMEM (Gibco^®)에서 배양하였다. 5-8주령된 수컷 BALB/c-누드 마우스는 Institute of Medical Science (University of Tokyo)로부터 얻었다. 50㎕의 PBS(pH 7.4, 1mM)로 현탁시킨 후 수집된 A431 세포(5×10⁶ cells)는 Institute of Medical Science(University of Tokyo)로부터 얻은 5-8주령된 수컷 BALB/c-누드 마우스의 근위 대퇴부에 피하주사하였다. 모든 실험은 국제실험동물관리평가인증협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC) International)의 승인 하에서 실시하였다.

시간별 나노입자 축적을 이미지화 하기 위해, A431 세포를 근위 대퇴부에 이식한 후 종양이 자랄 때, 300㎕의 EBPANP(10mg/mL의 농도)를 마우스 종양 부위에 주사하였다. 나노입자의 축적은 eXplore Optix system (ART Advanced Research Technologies, Montreal, Canada)에서 동물 플레이트 상에 각 마우스를 위치시켜 이미지화 하였다. 레이저 전원 및 카운트 시간 셋팅은 0.1 μW에서 최적화하였고, temporal point spread function (TPSF) integration time은 0.04 second per point로 셋팅하였다. 방출 파장 스캔을 생성하기 위해 여기 및 방출 스팟은 관심 있는 부분에 대해 0.5 mm 스텝에서 raster-scanned 하였다. Pulsed laser diode (734 nm)는 PANP를 여기하는데 사용하였다. 시간별 PANP-EB의 흡광은 종양 부근의 NIR 흡광도를 측정하여 확인하였다.

접종 후 2주째에, 이종이식된 마우스를 마취시키고, 300 ㎕의 PANP-EB(10mg/mL의 농도)를 종양 부위에 주사하였다. 6시간 후, 종양 부위를 NIR coherent diode laser(808 nm, 2.45W/cm²)로 10분 동안 노출시켰다. 이 후, 마우스를 희생시키고, 종양을 절단하여 염수 용액을 이용하여 고정하였다. 조직학적 평가는 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin, H&E) 염색을 이용하여 수행하였다. 조직은 알코올 농도를 높이면서 탈수시킨 후 파라핀에 끼우고, 자일렌에서 제거되었다. 슬라이스(두께=10 ㎛)를 글래스 슬라이드에 고정하고, 핵을 염색하고, 슬라이드는 헤마톡실린이 채워진 컨테이너 내에 10분 동안 2회 위치시켰다. 조직은 물로 10분 동안 세척하여 헤마톡실린을 제거하고, 세포질은 에오신으로 염색하고, 상술한 바와 같은 방식으로 탈수시켰다. 염색된 모든 조직 부분은 광학현미경(Olympus BX51, Japan) 및 Olyvia software를 이용하여 분석하였다.

인 비보 및 엑스 비보 흡광 이미지 둘 다 EBPANP가 주사된 종양에 의해 NIR 선(730 nm)의 강한 흡광을 나타냈다(도 14 참조).

도 15에 나타난 바와 같이, EBPANP 처리된 종양의 조직학 실험 결과(도 15a), 미처리 대조군과 비교하여 혈관 손상뿐만 아니라 심각한 세포 손상(염색체 농축 및 핵용해)을 나타냈다(도 15b). NIR 선에 노출 시 PANP에 의해 생성된 광열 에너지는 세포 성장 및 증식을 위해 필요한 DNA 및/또는 RNA 합성을 차단하는 세포 성분들의 붕괴를 유도할 것이다. 특히, 광열 처리는 단백질을 분해하고, 세포골격 필라멘트의 탈중합을 유발한다. 이들 과정은 또한 세포 사멸을 유도할 수 있다.

상기 결과로부터 폴리아닐린 나노입자 및 NIR 선의 병합 처리는 매우 효과적이고 실현 가능한 광열-제거 종양 치료법임을 알 수 있었다.

Claims (13)

1. 세포 내 도핑에 의해 600 내지 1100 nm의 파장 영역에서 흡광을 가지며, 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리(1,4-페닐렌비닐렌)(poly(1,4-phenylenevinylene)), 폴리(1,4-페닐렌 설파이드)(poly(1,4-phenylene sulfide)), 폴리(플루오레닐렌에티닐렌)(poly(fluorenyleneethynylene)) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 고분자로부터 제조된 고분자 나노입자를 포함하는 광열 요법 치료용 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   고분자 나노입자는 고분자 코어와 친수성 쉘로 이루어진 것인 광열 요법 치료용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   고분자 나노입자는 1 nm 내지 1 ㎛의 직경을 갖는 입자인 광열 요법 치료용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   고분자 나노입자는 세포질 내 pH; 활성산소종, 활성질소종, 과산화 수소, 알칼리 금속 이온 및 자유 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 산화물질; 또는, 산화 환원력을 갖고 있는 생체 분자 중 적어도 하나에 의한 고분자의 도핑에 의해 광 감응성을 갖는 광열 요법 치료용 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   고분자 나노입자는 총 조성물 1mL 당 1 ng 내지 1 g의 농도로 포함되는 광열 요법 치료용 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 광열 요법 치료용 조성물.
   
8. 제1항의 광열 요법 치료용 조성물; 및
   600 내지 1100 nm 파장 영역의 광선을 조사하는 장치를 포함하는 종양 치료용 키트.
   
9. 제8항에 있어서,
   광선이 레이저 빔인 종양 치료용 키트.
   
10. 인간을 제외한 동물에 제1항의 광열 요법 치료용 조성물을 투여하는 단계; 및
    600 내지 1100 nm 파장 영역의 광선을 조사하는 단계를 포함하는 종양의 광열 치료방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    투여는 상기 광열 요법 치료용 조성물을 혈관 주사하여 실시하는 종양의 광열 치료방법.
    
12. 제10항에 있어서,
    광선이 레이저 빔인 종양의 광열 치료방법.
    
13. 제10항에 있어서,
    광선 조사는 1 mW/cm² 내지 100 W/cm²에서 10초 내지 30 분간 실시하는 종양의 광열 치료방법.

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