KR101263563B1 - 인터루킨―３２ 억제제를 유효성분으로 함유하는 알레르기 비염의 치료 또는 개선용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터루킨-32(interleukin-32: IL-32) 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 알레르기 비염(allergic rhinitis :AR)의 치료 또는 개선용 약학 조성물에 대한 것으로, IL-32는 알레르기 비염 환자에서 유의적으로 증가하며, IL-32 항체, IL-32 안티센스, IL-32 siRNA와 같은 IL-32 억제제는 알레르기 비염 환자의 염증을 치료하거나 개선하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인터루킨―３２ 억제제를 유효성분으로 함유하는 알레르기 비염의 치료 또는 개선용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating and preventing allergic rhinitis(AR) comprising interleukin―３２ inhibitor}

본 발명은 인터루킨-32(interleukin-32: IL-32) 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 알레르기 비염(allergic rhinitis :AR)의 치료 또는 개선용 약학 조성물에 관한 것이다.

알레르기 비염(allergic rhinitis :AR)은 알레르기 질병 중 흔하게 나타나며, 전 세계적으로 약 5억 명의 사람들이 고통받고 있다.

과민반응, 체외배출, 과다분비, 염증성 세포의 침윤 등은 상부 기관지의 심각한 만성 염증 상태의 특징이다. AR 환자들은 비만세포와 호산구의 활성화와 항원에 노출되어 나타나는 반응으로 염증성 매개체들이 방출되는 등의 Th2 면역시스템의 특징인 염증성 IgE 관련 반응을 나타낸다.

호산구는 선천면역에서의 효과세포로써, 기생충감염에 대한 면역반응에 중요한 작용을 하며, 알레르기 염증과 관련된 병리에 작용한다. 호산구의 염증부위로의 유입은 화학주성과 에오탁신과 인터루킨(IL)-5와 같은 신호의 활성화 반응으로 일어나게 되며, 이러한 과정은 매우 치밀한 과정들로 이루어지며 여러 사이토카인은 호산구의 기능에 영향을 미친다.

특히, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor : GM-CSF)는 조혈 세포에서 대식세포, 호산구 그리고 호중구의 성숙 활성화 관련 요인이며, GM-SCF 역시 전염증성 사이토카인이다.

한편, IL-32는 최근에 T 림파구, 자연 살해 세포, 상피 세포, 비만세포, 케라티노싸이트, 그리고 혈액의 백혈구로부터 사이토카인을 생성하며, 류마티스 관졀염 환자의 혈액에서 발견된다.

IL-32 유전 정보는 인간의 염색체 16p13.3에 있으며 8 액손으로 구성 된다. IL-32는 현재 알려진 사이토카인 패밀리에 상동관계와 무관하다. IL-32는 mRNA의 접합으로 인해 분자량 14.9에서 26.7 kDa에 이르는 단백질이 생성되며, 이로 인해 6종류의 아형(α, β, γ, δ, ε, 및 ζ) 으로 나뉜다.

이에, 본 발명자는 IL-32가 AR을 일으키는 원인 사이토카인인 것을 확인함으로서, 향후 IL-32에 대한 항체 및 재조합 단백질의 개발을 통해 직접적으로 IL-32를 억제하거나 혹은 신호 전달 체계를 억제할 수 있는 약제 개발을 통해 알레르기 비염을 치료하거나 개선하고자 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인터루킨-32 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 알레르기 비염의 치료 또는 개선용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 포유동물의 생물학적 샘플에서 인터루킨-32의 발현 프로파일을 검출하고 정상대조군과 비교하여 포유동물의 알레르기 비염 여부를 판정하는 단계를 포함하는 알레르기 비염의 진단방법을 제공하는 데에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 인터루킨-32(interleukin-32: IL-32) 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 알레르기 비염(allergic rhinitis :AR)의 치료 또는 개선용 약학 조성물이다.

여기서, 상기 인터루킨-32 억제제는 인터루킨-32 자체 억제제; 인터루킨-32의 발현을 억제할 수 있는 siRNA; 인터루킨-32에 특이적으로 결합하는 항체; 및 인터루킨-32에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 하나 이상인 것이 바람직하다.

본 발명에서 이용되는 IL-32의 발현을 억제할 수 있는 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이러한 스템-앤드-루프 구조는 인비트로(in vitro) 또는 인비보(in vivo)에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명에서 이용되는 IL-32에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 이러한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를들어, 융합 방법(Kohlerand Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991)에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.01 내지 10 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 이러한 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 비강흡입제, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

그리고, 본 발명의 일 구체예는 상기 인터루킨-32 억제제가 캐스페이즈-1(caspase-1)의 활성을 감소시키거나 비활성시키는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 일 구체예는 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor : GM-CSF) 억제제를 더 포함하는 것일 수 있다.

다른 일 구체예로서, 상기 약학 조성물은 알레르기 비염(AR)에서 증가되는 염증을 치료하거나 개선하는 것을 특징으로 할 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는 포유동물의 생물학적 샘플에서 인터루킨-32의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 인터루킨-32의 발현 프로파일과 비교하여 포유동물의 알레르기 비염 여부를 판정하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 알레르기 비염(AR)의 진단방법이다.

여기서, 상기 생물학적 샘플은 염증성 면역 관련 반응을 나타내는 포유동물로부터 얻어진 것이 바람직하다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명의 약학조성물은 IL-32 억제제를 함유함으로써 알레르기 비염 환자의 염증을 치료하거나 개선하는 데에 유용하게 사용될 수 있으며, 또 IL-32의 발현 프로파일을 분석하여 알레르기 비염의 진단에도 사용될 수 있다.

도 1은 알레르기 비염 환자와 정상인에서 IL-32 발현 분석 일례를 나타내는 것이고,
도 2는 혈장, 혈구, 및 임파선에서 전체 IgE, 호산구 수, ECP, 그리고 IL-1b의 수준을 측정한 일례를 나타내는 것이고,
도 3은 AR 집단에서 염증성 사이토카인의 수준이 증가하는 일례를 나타내는 것이고,
도 4는 정상 쥐(Normal); AR쥐 (Control); AR+IL-32 쥐(Control+IL-32)에서 측정한 사이토카인의 양 일례를 나타내는 것이고,
도 5는 IL-32가 EoL-1 세포에서 GM-CSF에 의해 발현되는 일례를 나타내는 것이고,
도 6은 GM-CSF가 caspase-1의 활성화를 경유로 하여 IL-32의 발현을 증가시키는 일례를 나타내는 것이고,
도 7은 EoL-1 세포에 IL-32 siRNA을 트렌스팩션한 후, IL-6, IL-8, TNF-a, and VEGF 의 생성을 사이토카인 측정법을 사용해서 측정한 결과의 일례를 나타내는 것이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다.

IL-32는 T 림파구, 자연살해세포, 단핵세포, 그리고 상피세포에 의해 생성되는 염증을 촉진하는 사이토카인이다. 그러나, 알레르기 비염 (AR)에서의 IL-32의 구체적인 메커니즘에 대한 알려지지 않았다.

본 발명자들은 AR 환자의 비강 점막에서 IL-32 단백질 및 mRNA의 유의한 증가를 검토하였다. 본 발명은 AR 환자의 임파선 조직, 코 점막 조직 그리고 혈장에서 건강한 정상과 비교하였을 때 IL-32의 발현이 유의하게 증가하는 것을 발견한 것이다. 본 발명자들은 α, β, γ 그리고 δ 형의 IL-32가 코 점막 조직에서 발현되는 것을 발견하였다. 특히, AR 환자 집단의 코 점막에서 IL-32 γ 단백질이 유의하게 증가하는 것을 보았다(도 1).

그리고, IL-32는 코 점막 조직의 염증성 사이토카인의 생산과 연관됐다. 즉, AR 환자의 코 점막 조직에서 IL-32의 생성은 염증, IL-1β, IL-18 그리고 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)와 연관이 있음을 확인하였다. 다시 말해서, IL-32는 코 점막 조직에서 IL-1β, IL-18, 그리고 GM-CSF와 상호 관계를 나타낸다(도 3 및 표 1). IL-32는 AR 동물 모델에서 IgE와 IL-4의 수준만큼 증가한다(도 4). 이것으로 IL-32는 AR의 염증과 중요한 역할임을 암시한다.

또한, AR을 가진 동물 모델에서 IL-32가 IgE 및 염증성 사이토카인의 수준을 상당히 증가시키고, IL-32의 발현은 호산구의 caspase-1의 활성화시키는 것으로 나타났다.

더욱이, EoL-1 세포에서 GM-CSF로 강하게 유발된 caspase-1의 활성을 경유하여 IL-32가 발현함을 발견하였다. 본 발명자들은 EoL-1 세포에서 GM-CSF에 의한 IL-32 mRNA의 전사(α, β, γ 그리고 δ)와 단백질 분비를 증명하였다(도 5). GM-CSF는 IL-32 단백질과 mRNA를 발현시키고(도 5), GM-CSF는 IL-6, IL-8, TNF-α, 그리고 VEGF의 생성을 자극한다(도 7). 또한, IL-32는 IL-8의 생산을 증가시켰다. 이것으로 본 발명자들은 GM-CSF가 IL-32와 같은 세포내 경로를 통해 염증 반응이 증가한다는 것을 알게되었다. 본 발명에서 GM-CSF와 IL-32은 EoL-1 세포에서 caspase-1 활성화와 IL-8의 생산을 증가시킨다.

더욱이, IL-32의 감소는 호산구에 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 확인하였다. 즉, EoL-1 세포에서 IL-32 siRNA로 인해 IL-32가 감소하였을 때, GM-CSF가 유발시키는 염증성 사이토카인의 생산이 어느 정도 감소한다(도 7). 그리고, Caspase-1 억제제는 GM-CSF 또는 IL-32로 유발되는 caspase-1의 활성을 감소시킨다.

이러한 특징들로 미루어보아 IL-32가 염증반응의 확산에 중요한 역할을 한다는 것을 예상할 수 있다. 그리고, GM-CSF는 AR 염증에 중요한 중재자임을 암시한다. 즉, IL-32는 AR모델에서 유의적으로 증가하고, 호산구에서 GM-CSF에 의해 유도된 caspase-1의 활성화를 경유하여 IL-32의 발현이 유도됨을 확인하였다. IL-32 발현의 정도가 염증의 임상학적 또는 조직학적 인자와의 연관성이 AR의 병인에서 중요함은 알 수 있고, IL-32가 염증반응의 악화에 있어 중요한 역할인자로 작용함도 예상할 수 있다.

그러므로, IL-32 억제제(조절제)와 GM-CSF 억제제가 AR 임상징후를 약화시키는데 효과적임을 예상할 수 있다.

상기와 같이, 본 발명자들은 IL-32가 AR을 일으키는 원인 사이토카인인 것을 구명한 후, 본 발명을 완성하였다. IL-32의 조절은 곧 AR을 예방하고 치료할 수 있는 새로운 바이오마커(biomarker)인 것이다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: IL -32는 AR 집단에서 코 점막조직, 임파선 조직, 그리고 혈장에서 유의하게 증가하면서 발현한다.

1. 실험대상

하기 표 1에서 보이는 것처럼 환자 65명 정상인 65명을 대상으로 분석하였다.

[정상 집단과 AR 집단에 대한 기본 특성]

표본	집단	성별	나이 (y), 평균±표준편차
임파선(Adenoid) (n=80)	정상 (n = 40)	26M, 14F	6.3±2.5
	AR (n = 40)	31M, 9F	7.4±3.1
코 점막(Nasal mucosa) (n=50)	정상 (n = 25)	13M, 12F	38.8±16.8
	AR (n = 25)	19M, 6F	34.2±15.0

F, 여성; M, 남성

2. 사이토카인 정량 ( ELISA )

IL-32α와 IL-32α/β는 제조사의 설명서에 따라 정량하였다(BioLegend Inc, CA, USA). IL-32(α/β/γ/δ) 역시 제조사의 설명서에 따라 정량하였다(YbdY biotech, Seoul, Korea). IgE, IL-1b의 생성량은 제조사의 설명서에 따라 정량하였다(R & D system Inc, Minneapolis, MN, USA). 조직 용해액의 단백질은 bicinchoninic acid protein assay method (Sigma, MO, USA)를 사용하여 정량하였다. 조직 용해액의 총 단백질에 대한 비율로써 사이토카인의 양을 나타내었다.

3. 역전사효소중합연쇄반응

총 RNA는 세포와 코점막에서 제조사의 설명서에 따라 분리하였다(easy-BLUETM RNA extraction kit, iNtRON Biotech, Korea). 총 RNA의 농도는 분광광도법을 통해 측정하였다. 총 RNA(2.5 ㎍)는 65℃에서 10분간 가열한 후 얼음 위에서 냉각시켰다. 각 샘플은 cDNA synthesis kit을 사용하여 cDNA를 합성했다(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). PCR은 다음의 프라이머를 사용하여 수행했다. human (h) IL-32α(5' CTG AAG GCC CGA ATG CAC CA 3', 5' CCG TAG GAC TTG TCA CAA AA 3'), IL-32β(5' CTG AAG GCC CGA ATG CAC CAG 3', 5' GCA AAG GTG GTG TCA GTA TC 3'), hIL-32γ(5' TGA CAT GAA GAA GCT GAA GGC 3', 5' CAT GAC CTT GTC ACA AAA GCT C 3'), hIL-32δ(5' TCT CTG ATG ACA TGA AGA AGC T 3', 5' GCA AAG GTG GTG TCA GTA TC 3'), 그리고 hGAPDH (5' CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG 3', 5' CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG 3') 들은 동량의 RNA를 정량하여 수행하였고, 서로 다른 실험 조건으로 PCR했다. 이후 샘플을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 후 브롬화에티듐으로 염색하여 시각화하였다.

4. 코 점막 조직의 면역조직화학적 분석

조직 샘플은 4% 포름알데히드로 즉시 고정한 후, 파라핀에 포매 하였다. 탈 파라핀과 탈수과정 후, 절편은 3 μg/ml 농도의 IL-32 항체 (YbdY biotech, Seoul, Korea)를 포함한 돼지혈청으로 블로킹했다. 이차항체인 anti-goat IgG- horse radish peroxidase를 추가하고 30분간 반응시켰다. 슬라이드는 다이아미노벤지딘 (DAB)으로 현상한 후, 헤마톡실린, 그리고 에오신으로 30초간 염색하였다. 절편은 두 명의 실험자들이 무작위로 선정했다.

5. 통계

임상 결과는 Mann-Whitney U 검사 법으로 집단간에 비교되었다. 실험은 적어도 3번의 실험으로부터 얻은 자료의 요약을 보여주며 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 각 처리된 군 사이에 비교되었고, t-테스트와 Tukey`s posthoctest와 함께 ANOVA에 의해 대조되었다. 통계 처리는 SPSS v12.00 (SPSS Inc.)를 사용하여 수행하였으며, P < 0.05의 결과는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

6. 결과

도 1은 알레르기 비염 환자와 정상인에서 IL-32의 발현을 분석한 결과이다. IL-32 아형들의 단백질, mRNA을 ELISA(A, C, D), 웨스턴블랏법(B, 위), 역전사효소중합연쇄반응법(B, 아래)을 통하여 AR 집단의 코 점막 조직에서 측정했다. (E)는 코 점막 조직에서 IL-32의 발현을 확인한 결과이다. 조직을 용해하여 측정한 IL-32 수준은 조직의 전체 단백질의 비율로 제시했다.

코 점막조직, 임파선 조직 그리고 혈장을 사용하여 IL-32의 여러 형태들을 분석한 결과, IL-32의 수준이 AR 집단의 모든 조직에서 정상 집단에 비해 유의하게 높게 측정되었다(도 1A, C, 및 D, P < 0.05).

western blot과 RT-PCR 측정법을 이용하여 코 점막 조직에서 IL-32의 여러 아형의 단백질과 mRNA 수준을 연구검토한 결과, 정상 집단에 비해 AR 집단의 IL-32 여러 유형들의 단백질과 mRNA 발현 수준이 증가하였다 (도 1B). IL-32α와 γ는 AR 집단의 코 점막조직에서 유의하게 단백질 수준이 상향 조절되었다. 면역조직 염색방법을 이용하여 AR 집단의 코 점막조직을 염색하였을 때 AR 집단의 코 점막 조직에서 IL-32의 높은 발현을 볼 수 있었다(갈색). 그에 비하여 정상 조직의 경우 IL-32의 발현이 적음을 알 수 있다(도 1E, 화살표). IL-32를 염색하여 염증 세포인 호산구 및 비만 세포가 IL-32 양성 세포인 것을 볼 수 있다(도 1E).

부가적으로, IL-32 정량값은 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색에서 염증과 유의적으로 연관성을 나타내었다(표 2, R = 0.543, P = 0.004).

[코 점막 조직에서 염증성 싸이토카인과 IL-32의 상관 관계]

요인	R 값	P 값
Inflammation	0.543	0.004
IL-1b	0.603	0.002
IL-18	0.559	0.005
GM-CSF	0.795	0.000

IL- 32의 발현은 생체 조직의 염증과 상관 있다. 상관 관계는 Spearman's rank 상관 계수를 사용하여 표현하였다. P < 0.005

도 2는 혈장, 혈구, 그리고 임파선에서 전체 IgE, 호산구 수, ECP, 그리고 IL-1b의 수준을 측정한 결과이다. 혈장에서 IgE를 측정했고, 말초혈액에서 호산구 수를 측정했으며, 임파선 조직에서 ECP와 IL-1b 를 측정했다. 또한, AR 등급은 AR과 정상 집단의 점수로 나타냈다. 조직을 용해하여 측정한 IL-1b와 ECP의 수준은 조직의 전체 단백질의 비율로 제시했다.

그 결과, 혈장의 IgE 수준, 말초 혈액 호산구 숫자, 그리고 IL-1b은 정상 집단에 비해 현저하게 AR 집단에서 높은 수준을 보인다(도 2, P < 0.05). 염증 중재자로, AR과 정상 집단에 대한 ECP를 점막 염증의 지표로 호산구의 탈과립을 평가하기 위해 측정되었다. ECP의 수준은 AR 집단에서 유의하게 증가하였다(P = 0.014). AR 집단과 정상 집단의 AR 진행 등급을 비교하였을 때 AR 집단이 유의하게 증가 하였다.

실시예 2: IL-32의 수준은 AR 집단 코 점막 조직의 염증성 사이토카인의 연 관돼 있다.

1. 사이토카인 정량 (ELISA)

IL-1β, IL-8, IL-18, 그리고 GM-CSF의 생성량은 제조사의 설명서에 따라 정량하였다(R & D system Inc, Minneapolis, MN, USA). 조직 용해액의 단백질은 bicinchoninic acid protein assay method(Sigma, MO, USA)를 사용하여 정량하였다. 조직 용해액의 총 단백질에 대한 비율로써 사이토카인의 양을 나타내었다.

2. 결과

도 3은 AR 집단에서 염증성 사이토카인의 수준이 증가하는 것을 나타낸다. 25명의 AR 환자와 25명의 정상인의 코 점막 조직에서 IL-1b, IL-18, 그리고 GM-CSF를 측정하였다. 모든 측정은 조직을 용해하여 측정한 IL-1b, IL-18, 그리고 GM-CSF의 수준은 조직의 전체 단백질의 비율로 제시했다.

AR 집단과 정상 집단을 비교하였을 때, IL-1β와 GM-CSF는 유의하게 증가 하나(도 3, P < 0.05), IL-18의 경우 두 집단 사이의 차이가 유의적이지 못했다. IL-32의 수준의 경우 IL-1b, IL-18, 그리고 GM-CSF 모두 코 점막 조직에서 유의성의 보였다(표 2, R = 0.603, P = 0.002 for IL-1b; R = 0.559, P = 0.005 for IL-18; R = 0.795, P = 0.000 for GM-CSF).

실시예 3: IL -32 주입한 AR 동물 모델에서 비강 IgE 및 염증성 사이토카인 수준 증가한다.

1. OVA 로 유도시킨 AR 동물 모델

병원체가 없는 조건의 6주령의 암컷 BALB/c 쥐 (Charles River Technology)를 이용하였다. 쥐의 관리 및 실험은 경희대학교의 동물복지위원회의 승인 후 실시했다. 그리고, 1일, 5일, 그리고 14일에 100 ㎍ ovalbumin (OVA) 와 20 mg aluminum hydroxide (Sigma)을 혼합을 복강주사를하여 민감하게 만들었다. 또한, 쥐에 10 일간 1.5 mg의 OVA 자극을 받기 전에 100 ng씩 human IL-32를 비강에 처리했다. OVA 자극 10분 후 비강을 긁는 증상의 수를 측정했다. 자극 7일 후부터 측정했다.

2. 사이토카인 측정 ( ELISA )

IgE, IL-4, IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-a, 그리고 VEGF의 생성량은 제조사의 설명서에 따라 측정했다(R & D system Inc, Minneapolis, MN, USA). 조직 용해액의 단백질은 bicinchoninic acid protein assay method (Sigma, MO, USA)를 사용하여 정량했다. 조직 용해액의 총 단백질에 대한 비율로써 사이토카인의 양을 나타냈다.

3. AR 코 점막 조직의 조직학적 분석

조직 샘플은 4% 포름알데히드로 즉시 고정한 후, 파라핀에 포매 하였다. 탈 파라핀과 탈수과정 후, 절편슬라이드를 헤마톡실린, 그리고 에오신 (H&E)으로 염색했다. 절편은 두 명의 실험자들이 무작위로 선정했다.

4. 결과

AR 동물 모델에서 IL-32의 조절 효과를 입증했다. OVA를 자극한 집단과 IL-32를 같이 자극한 두 집단에서 OVA를 자극 하지 않은 집단보다 비강을 긁는 수가 유의하게 증가 했다.

도 4는 싸이토카인 측정법을 이용하여 IgE, IL-1b, IL-4, IL-6, IL-18, 그리고 TNF-a를 측정한 결과이다. 모든 요인은 조직 용해액의 총 단백질에 대한 비율로써 사이토카인의 양을 나타냈다. 코 점막 조직을 H&E 염색했다. 화살표는 염증성 세포를 가리킨다. 정상 쥐 (n = 10); AR 쥐 (n = 10); AR+IL-32 쥐 (n = 10). (원형 확대 배율×400).

도 4에 나타난 바와 같이, IgE와 염증성 사이토카인 (IL-4, IL-1β, IL-6, IL-18, 그리고 TNF-α)이 OVA를 자극 하지 않은 집단에 비해 OVA를 자극한 집단과 IL-32를 자극한 집단에서 증가했다. IgE와 염증성 사이토카인의 수준이 OVA를 자극한 집단보다 IL-32를 자극한 집단에서 더 높게 나타났다. IgE, IL-4, IL-6, IL-8, 그리고 TNF-α는 OVA를 자극한 집단과 IL-32 집단을 비교 하였을 때 IL-32 집단에서 유의하게 증가했다(P < 0.05). IL-32와 OVA의 상승 효과로 OVA를 자극한 집단 보다 IgE와 염증성 사이토카인의 생성이 증가했다. OVA 자극 집단과 IL-32 집단의 코 점막에서 염증성 세포들의 수가 OVA를 자극하지 않은 쥐들에 비해 유의적으로 많은 것을 볼 수 있으나, OVA를 자극한 집단과 IL-32 집단에서는 염증성 세포들의 수는 유의적인 차이가 없었다(도 4).

실시예 4: IL -32는 human eosinophilic leukemia cell line ( EoL -1)에서 GM 의- CSF 에 의해 생성 증가한다.

1. 세포 배양

인간 EoL-1 세포는 RPMI 1640 배양액 (Gibco, BRL, USA)에 10% 소혈청 (FBS, JRH BIOSCIENCE, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

2. 사이토카인 측정 ( ELISA )

염증성 사이토카인 생성량은 제조사의 설명서에 따라 정량했다(R & D system Inc, Minneapolis, MN, USA). IL-32(α/β/γ/δ) 역시 제조사의 설명서에 따라 정량했다(YbdY biotech, Seoul, Korea).

3. Caspase -1 정량

Caspase-1 활성도는 caspase assay kit(R & D system)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 측정했다. 재조합 caspase-1 효소는 양성대조군으로 사용됐다.

4. 형질전환과 luciferase 분석

형질전환을 위해, 100 mm 배양디쉬에 EoL-1 세포를 분주했다. 이후 Lipofectamine™ 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 EoL-1 세포 내에 일시적으로 리포터 유전자 생성물질을 형질전환 했다. 48시간 후에 형질전환된 EoL-1 세포(5 x 10⁵)에 GM-CSF (10 ng/ml)로 자극했다. 자극 24 시간 또는 48시간 후에 세포를 수확하였고, 100 μl lysis buffer (Luciferase assay kit; Promega)로 분해시키기 전에 차가운 PBS로 세정했다. 이후 잘 흔들어 섞어준 다음 4℃ 에서 1분간 12000 × g로 원심분리 했다. 이후 얻은 상층액은 luciferase assay 하기 전에 -70℃에서 보관했다. 세포추출물 20 μl와 luciferase assay reagent 100 μl를 실온에서 혼합했다. luciferase 활성도를 측정하기 위해, luminometer(1420 luminescence counter, Perkin Elmer)를 제조사의 설명서에 따라 사용했다. 모든 형질전환관련 실험은 최소 3번 개별적으로 수행했으며, 유사한 결과를 얻었다. relative luciferase 활성도는 firefly luciferase 활성도와 renilla luciferase 활성도의 비율에 따라 값을 측정했다.

5. 역전사효소중합연쇄반응

총 RNA는 세포에서 제조사의 설명서에 따라 분리했다(easy-BLUETM RNA extraction kit, iNtRON Biotech, Korea). 총 RNA의 농도는 분광광도법을 통해 측정했다. 총 RNA (2.5 ㎍)는 65℃에서 10분간 가열한 후 얼음위에서 냉각시켰다. 각 샘플은 cDNA synthesis kit을 사용하여 cDNA를 합성했다(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). PCR은 다음의 프라이머를 사용하여 수행했다. human (h) IL-32α(5' CTG AAG GCC CGA ATG CAC CA 3', 5' CCG TAG GAC TTG TCA CAA AA 3'), IL-32β(5' CTG AAG GCC CGA ATG CAC CAG 3', 5' GCA AAG GTG GTG TCA GTA TC 3'), hIL-32γ(5' TGA CAT GAA GAA GCT GAA GGC 3', 5' CAT GAC CTT GTC ACA AAA GCT C 3'), hIL-32δ(5' TCT CTG ATG ACA TGA AGA AGC T 3', 5' GCA AAG GTG GTG TCA GTA TC 3'), 그리고 hGAPDH(5' CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG 3', 5' CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG 3')들은 동량의 RNA를 정량하여 수행하였고, 서로 다른 실험 조건으로 PCR했다. 이후 샘플을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 후 브롬화에티듐으로 염색하여 시각화했다.

6. 웨스턴 블랏 법

세포를 용해 시켜 얻은 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기 영동하고, nitrocellulose paper에 옮겼다. 그 후 membrane은 PBS-tween-20 (PBST) 용액에 5% skim mlik가 함유된 버퍼로 상온에서 1시간 동안 block한 뒤, 1차 항체 (anti-IL-32α/γ antibody, 1 ㎍/ml, YbdY biotech; anti-IL-32α/β antibody, 0.5 ㎍/ml, BioLegend Inc.) 와 반응시켰다. 그 후 PBST 용액으로 씻고, 2차 항체를 처리하고 1시간 반응시킨 후 ECL detection 용액으로 확인하였다(Amersham Bioseciences, Piscataway, NJ, USA).

7. 결과

호산구는 AR의 염증 반응에 중요한 역할을 하고, GM-CSF는 호산구를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 상술한 바와 같이, AR 집단에서 GM-SCF의 수준은 유의하게 증가하였다(도 3).

본 실험에서는 In vitro 모델에서 ELISA, luciferase assay, Western blotting, 그리고 RT-PCR을 수행하여 IL-32의 발현을 바탕으로 GM-CSF발현 조절 효과를 측정하였다. IL-8 생산은 GM-CSF의 테스트 지표이다. 본 실험에서는, GM-CSF (10 ng/ml)의 자극 후, IL-32의 생성 경로를 관찰하였다.

도 5는 IL-32가 EoL-1 세포에서 GM-CSF에 의해 발현된 결과를 나타낸다. (A)는 세포(5×10⁵)에 GM-CSF(10 ng/ml)를 처리하여 각기 다른 시간 동안 자극한 결과이다. (B 와 C)는 세포(5×10⁵)에 GM-CSF(1 및 10 ng/ml)을 처리하여 24 시간 자극하고, IL-32와 IL-8의 생성을 싸이토카인 측정법으로 측정한 결과이다. (D)는 pIL-32-Luc 활성을 luciferase assay를 통하여 측정한 결과이다. (E)는 세포(5×10⁶)에 GM-CSF(1 및 10 ng/ml)을 처리하여 4 시간 자극하고, IL-32 아형들을 역전사효소중합연쇄반응 방법을 통하여 분석한 결과이다. (F)는 세포 (5×10⁶)에 GM-CSF (1 및 10 ng/ml)를 처리하여 24 시간 자극하고, IL-32를 웨스턴블랏법을 통하여 분석한 결과이다. 결과는 대표적으로 실험의 3번 반복했다. *P < 0.01의 경우, 자극하지 않은 다른 세포와 상이한 것이다. (M, 지표 (marker); B(blank), 자극하지 않은 세포).

그 결과, GM-CSF를 처리하고 24h 후에는 IL-32의 생산이 증가하였고, GM-CSF를 처리하고 48~90h 후에는 감소하는 것을 볼 수 있었다(도 5A). GM-CSF 10ng/ml을 처리하였을 경우 IL-32의 생산이 유의하게 증가하였다(도 5B, P = 0.032). GM-CSF 또는 IL-32γ를 처리하였을때는 IL-8의 생산을 유의하게 증가시켰다(도 5C, P < 0.05).

본 발명자들은 GM-CSF가 IL-32의 발현에 대한 영향의 유무에 대해 다음 실험을 진행하였다. Reporter plasmid pIL-32-Luc(containing an IL-32 promoter region)은 Wuhan University의 Ying Zhu에게 제공받았다. 도 5D에 나타난 바와 같이, GM-CSF(10 ng/ml)의 경우 reporter gene의 활성이 유의하게 증가하였다(P = 0.01). 또한, GM-CSF는 IL-32(α, β, γ and δ)의 mRNA와 단백질을 발현한다(도 5E 그리고 F).

Caspase-1의 활성은 IL-1β, IL-18, 그리고 IL-32의 전염증성 사이토카인을 활성화한다. IL-32는 caspase-1의 활성 인자로 알려져 있다. caspase-1 assay와 western blot을 이용하여, GM-CSF의 증가가 caspse-1의 활성화에 영향을 미치는 지에 대한 여부를 실험하였다.

도 6은 GM-CSF가 caspase-1의 활성화를 경유로 하여 IL-32의 발현을 증가시킨 결과이다. (A 및 C)는 세포(5×10⁶) 에 caspase-1의 억제자(500 nM)를 처리한 후 1 시간 자극하고, GM-CSF 또는 IL-32를 같이 2 시간 자극하며, Caspase-1 활성을 colorimetric kit를 이용하여 측정한 결과이다. (B)는 Caspase-1을 웨스턴블랏법을 이용하여 분석한 결과이다. (D)는 세포 (5×10⁵)에 caspase-1 억제자(5, 50, and 500 nM)를 처리하여 1 시간 동안 자극하고, GM-CSF를 24 시간 동안 같이 자극g하며, IL-32의 생성을 싸이토카인 측정법으로 측정한 결과이다.

도 6에서,

Recom Cas-1 : 재조합 caspase-1

Cas-1 inhi : caspase-1 억제제

*P < 0.01 : 자극하지 않은 세포와 달랐다.

**P < 0.01 : GM-CSF를 자극했을 때와 달랐다..

^# P < 0.01 : IL-32를 자극했을 때와 달랐다.

이다.

도 6A와 6B를 보면, GM-CSF의 증가가 caspase-1을 활성화함을 알 수 있다. 즉, GM-CSF로 인해 caspase-1의 활성화가 증가하였고, 또한 caspase-1 억제자로 인해 IL-32는 억제되었다(도 6C). GM-CSF로 IL-32의 생산이 증가 하나, caspase-1 억제자 처리하면 감소(도 6D)하는 것을 확인할 수 있다.

한편, IL-32가 염증성 사이토카인의 상향조절 매개체인지에 대한 여부를 증명하기 위해, 본 발명자들은 EoL-1 세포에 siRNA(IL-32 pool, iNtRON Biotech, Korea)를 사용하여 IL-32를 격감하였다. 그리고, EoL-1 세포에 IL-32 siRNA를 트랜스팩션하고 GM-CSF를 24 h 자극하였다. 또한, RT-PCR과 western bolt을 이용해서 IL-32의 mRNA와 단백질을 측정하여 IL-32가 격감되었는지 확인하였다(도 7A 및 7B). 그리고, 세포 배양액에서 ELISA를 통하여 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, 그리고 VEGF의 단백질 수준을 측정하였다.

도 7은 EoL-1 세포에서 염증성 싸이토카인의 발현을 위한 IL-32의 본질적인 역할을 나타낸다. RNA와 단백질은 (A) 역전사효소중합연쇄반응법과 (B) 웨스턴블랏법으로 IL-32를 분석했다. (C)는 세포(5×10⁵)에 GM-CSF(10 ng/ml)를 처리하여 24 시간 자극하고, IL-6, IL-8, TNF-α, 및 VEGF 의 생성을 싸이토카인 측정법을 사용하여 측정한 결과이다. M, marker; 1, control siRNA; 2, IL-32 siRNA. *P < 0.01 는 control siRNA를 집어 넣을 세포와 유의적으로 달랐음을 의미한다.

그 결과, GM-CSF는 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, TNF-α 그리고 VEGF는 유의적으로 증가하였지만 IL-1β는 그렇지 않았다(도 7C, P < 0.05). 그러나. IL-32 siRNA의 경우 염증성 사이토카인의 생산이 유의적으로 감소(도 7C, P < 0.05)하였음을 확인할 수 있다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims (7)

1. 인터루킨-32(interleukin-32: IL-32) 억제제, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor : GM-CSF) 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고,
   상기 인터루킨-32 억제제는 인터루킨-32에 특이적으로 결합하는 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며,
   상기 인터루킨-32 억제제와 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 억제제가 캐스페이즈-1(caspase-1)의 활성을 감소시키거나 비활성시키는 것을 특징으로 하는 알레르기 비염의 치료 또는 개선용 약학 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 알레르기 비염(AR)에서 증가되는 염증을 치료하거나 개선하는 것을 특징으로 하는 알레르기 비염의 치료 또는 개선용 약학 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제

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