KR101262251B1 - 뇌졸중의 치료제 또는 진단제로서 프로테이나아제-3에 대한 단클론 항체의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌졸중의 치료제 또는 진단제로서 프로테이나아제-3에 대한 단클론 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

뇌졸중의 치료제 또는 진단제로서 프로테이나아제-3에 대한 단클론 항체의 용도{A use of proteinase-3 monoclonal antibody as therapeutic or diagnostic agent of stroke}

본 발명은 뇌졸중의 치료제 또는 진단제로서 프로테이나아제-3에 대한 단클론 항체의 용도에 관한 것이다.

허혈성 손상이 발생되면 뇌는 급성 염증과정과 만성 염증과정으로 반응하며 이는 주로 소교세포의 활성화, 염증매개물질들의 생성, 호중구, T 세포, monocyte/macrophage등의 염증성 세포들이 침윤한다. 일차적으로 수시간 이내에 말초 혈액으로부터 leucocytes 가 두뇌 실질부위로 침입하게 되며 이때 일차적으로 침투하게 되는 것이 호중구 (neutrophil)이다 (Jin et al. J Leukoc Biol . 87(5):779-789, 2010). 이러한 말초 호중구는 수시간 이내에 두뇌 조직으로 유도되고 혈관손상의 유도로 인한 blood brain barrier (BBB) 파괴, 기타 염증 세포의 이차 침입 및 두뇌 조직의 염증 반응 개시에 중요한 역할을 수행하며 것으로 보고되었다 ((Kitz R et al., J Endotoxin Res. 12(6):367-374, 2006; Scholz M et al. Med Res Rev. 27(3):401-416, 2007; Jin et al. J Leukoc Biol . 87(5):779-789, 2010).

허혈성 혈관질환의 허혈과 재관류로 인한 세포 손상 기전으로는 산소공급 차단에 의한 흥분성 세포손상, 활성 산소종의 증가, 세포사멸 신호전달경로 등이 있으며 급성기 및 만성기에서 이들의 작용기전이 다르므로 이들을 조절하기 위한 여러 전략들을 다각적으로 검토하여야 함. 예를 들어 급성기 손상의 차단을 위해서는 이온채널 차단, 미토콘드리아 기능 조절, 활성 산소종 차단, 세포사멸 기전 차단 등이 유용할 것이다. 이와 반대로 만성기의 손상 차단을 위해서는 염증 세포의 유입 억제, 후발성 세포 사멸 억제, 싸이토카인 억제, 교세포 활성화 등 중추 염증 반응 제어 등의 다른 기전이 치료제 개발을 위하여 고려되어야 한다.

실제 연구에서 1차(급성) 뇌손상 방지보다 2차(만성) 뇌손상 방지가 더욱 확실하고 장기간의 뇌손상 억제효과를 가짐이 밝혀졌다. 따라서 급성기의 손상 억제제는 일회성 효과만을 지니는 것에 비해 만성기 뇌손상 억제는 발병 후 손상 최소화 및 재활 전 과정에 걸쳐 효과를 발휘할 것으로 기대된다. 따라서 만성 염증성 신경 손상을 유발하는 반응의 개시, 유지, 확장 및 소멸 기전을 이해하는 것이 뇌졸중 치료제 개발의 핵심 기초 연구 분야이다. 염증성 손상 반응의 개시 및 유지에 혈관으로부터의 염증성 세포 침입 및 활성화가 매우 중요한 역할을 수행할 가능성이 제시되고 있으며 이는 궁극적으로는 중추내부에서의 염증반응 활성화로 이어진다.

허혈성 손상이 발생되면 일차적으로 수시간 이내에 말초 혈액으로부터 leucocytes 가 두뇌 실질부위로 침입하게 되며 이때 일차적으로 침투하게 되는 것이 호중구 (neutrophil) 이다 (Jin et al., 2010). 이러한 말초 호중구는 수시간 이내에 두뇌 조직으로 유도되고 혈관손상의 유도로 인한 BBB 파괴, 기타 염증 세포의 이차 침입 및 두뇌 조직의 염증 반응 개시에 중요한 역할을 수행할 것으로 생각되어졌다 (Yilmaz and Granger, 2008; Kriz, 2006). 현재까지 호중구성 matrix metalloproteinase 등에 의한 혈관 손상 반응, NADPH oxidase 및 myeloperoxidase 활성화에 의한 ROS 생성 및 cytokine chemokine 생성 등이 염증 반응의 조절 및 세포손상 조절에 중요할 것으로 제시되고 있으나 (Gidday et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol . 289(2):H558-68, 2005; Rosell et al. Stroke . 39(4):1121-1126, 2008), 이들의 조절에 의한 뇌졸중 조절 가능성에 대한 확실한 증거는 없는 상황이다. 또한 상기한 물질들의 약물 개발 타겟으로서의 특이성에 대해서도 많은 논란의 여지가 있다.

최근 CD47 넉아웃 마우스를 이용한 호중구의 infiltration 억제에 의해 뇌경색 부위의 감소와 뇌부종의 저하, BBB 손상 지표의 감소가 관찰되어 뇌졸중에서의 neutrophil 역할의 중요성에 관심이 집중되고 있다 (Jin et al. Exp Neurol. 217(1):165-170, 2009). 이러한 실험적 증거에도 불구하고 호중구 염증 반응의 조절에 중요한 역할을 담당할 것으로 사료되는 단백분해 효소에 관한 연구는 상대적으로 매우 미약하다 (Matayoshi et al. Brain Res. 1259:98-106, 2009; Shimakura et al. Brain Res. 858(1):55-60, 2000).

Protease-3 (PR3)는 호중구 elastase, cathepsin G등과 같은 호중구-유래된 세린 단백분해효소로서 일차적인 기능은 염증부위에서 extracellular 단백질을 분해하는 것이지만, 너무 과도하게 많아지거나 오랫동안 유지되는 등의 부적절한 단백질분해능력을 갖게 되면 인체에 해로운 효과를 나타낸다. 이들은 구조적으로 유사하지만 PR3는 ANCA (anti-neutrophil cytoplasmic antibldies)라는 autoantibody의 타겟 항원으로 세포주기 (Csernok et al. Clin Exp Rheumatol 26(3 Suppl 49):S112-117, 2008), 분화 (Dublet et al. J Biol Chem 280(34):30242-30253, 2005), 세포사멸 (Yang et al. Am J Pathol 149(5):1617-1626, 1996) 등에 영향을 미치는 다기능성 세린 단백분해효소로서 최근에는 면역기능을 조절하는 것으로도 알려져있다 (Sugawara S. Crit Rev Immunol. 2005;25(5):343-360, 2005). PR3는 soluble form도 있고 membrane-associated form도 있으며 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis)와 같은 전신 혈관질환에서 자가항원으로서도 작용하고 protease-activated receptor-2 (PAR-2)에 의해 dendritic cell 에서 외부로부터의 자극에 대해 danger/alarm 신호로서 작용한다. 산성환경에서 활성화되고 정상조건에서는 불활성화상태로 있다.

현재까지 연구된 약물들은 글루타민산 수용체 길항제, 항산화제, 칼슘 혹은 나트륨, 등의 이온 채널 차단제 등을 이용한 것이 대부분이며 효과적인 약물이 개발되지 못하고 있는 실정이다. 따라서 획기적인 아이디어 전환과 새로운 신개념의 치료제 타겟 발굴이 요구되고 있다. 많은 임상 및 비임상 시험들이 진행되었지만 뇌경색 감소 및 재발의 측면에서 유효성이 입증된 약물이 거의 없는 것이 현재 뇌졸중 시장이다. 현재까지 혈전용해제 t-PA를 제외하고 허혈성 뇌졸중 치료제는 없는 상태로서 2차적인 세포보호제 개발이 시급한 상황이다.

허혈성 혈관질환 치료제로써 세포 보호 기전을 가지는 물질들 중 임상시험 중인 것은 다수 있으나 치료제로서 사용되는 약물은 부재하다. 특히, 단백질 신약 혹은 항체 신약 등 바이오신약 개발 시도가 매우 미미한 분야로 이 분야에서 가능성 있는 타겟 및 바이오신약 후보 물질 연구개발이 매우 절실하다.

Proteinase-3 는 호중구에 다량으로 존재하는 단백분해 효소이고, 본 발명자들은 뇌졸중 동물 모델에서 PR3의 발현이 수 시간 내에 뇌조직중에서 수십배 증가하며 정제된 PR3 및 이에 대한 단 클론 항체를 이용한 연구를 통해 PR3가 뇌신경세포 손상 및 염증반응 개시에 중요한 역할을 수행할 가능성을 확인하였다. 이는 PR3 단세포군 항체가 뇌졸중 치료분야에서 효과적인 바이오 신약 후보가 될 것임을 나타내는 결과로 생각되어진다. PR3 단 클론 항체의 개선 및 약효 확인, 약리 작용 규명을 통해 세계 최초의 뇌졸중 치료 바이오 신약 개발 원천기술 확보가 가능할 것으로 기대된다.

본 발명은 호중구에 다량으로 존재하는 단백분해 효소인 proteinase-3 (PR3)에 대한 단클론 항체가 뇌졸중에서 뇌신경세포 손상 및 염증반응의 치료제로서의 결과를 제시한 것으로서 뇌졸중 치료분야에서 효과적인 바이오 신약 후보가 될 것이다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 새로운 뇌졸중 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 새로운 뇌졸중 진단제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 프로테이나아제-3에 대한 항체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로테이나아제-3는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 서열번호 1에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 또는 전좌 등과 같은 돌연변이를 통하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 단백질 범위에 포함된다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 항체를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 뇌신경세포 손상 및 염증반응을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 항체를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 항체가 고정된 고상 담체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 고상 담체는 기판, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼, 또는 다공질재인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 기판은 단백질 칩 등에 사용되고 있는 것 등일 수 있고, 예컨대 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판이나 유리 기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 금, 은 또는 알루미나 기판 등으로, 이들의 기판에 폴리머 등의 코팅을 실시한 것을 들 수 있다.

수지로서는, 예컨대 아가로스(agarose) 입자, 실리카입자, 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교한 입자,셀룰로오스파이버, 알릴덱스트란과 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교폴리머, 단분산계 합성폴리머, 단분산계 친수성폴리머, 세파로오스(Sepharose), 토요펄(Toyopearl) 등을 들 수 있고, 또한 이들의 수지에 각종 관능기를 결합시킨 수지도 포함된다.

본 발명의 고상 담체는, 예컨대 프로테이나아제-3의 정제, 및 프로테이나아제-3의 검출, 정량에 유용할 수 있다.

본 발명의 항체는, 자체 공지의 방법에 의해 고상 담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질이나 소정의 관능기를 본 발명의 항체에 도입하고, 계속해서 이 친화성 물질이나 소정의 관능기를 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 소정의 관능기는, 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다.

또한 본 발명은 프로테이나아제-3 단백질을 동물에 주사하여 면역화하는 단계; 및 상기 동물의 혈청으로부터 프로테이나아제-3 단백질에 대한 항체를 분리하는 포함하는 상기 본 발명의 프로테이나아제-3 단백질에 대한 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 호중구에 다량으로 존재하는 단백분해 효소로서 자가항원의 일원으로 연구되고 있는 proteinase-3 (PR3)에 대한 항체가 뇌졸중에서 뇌신경세포 손상 및 염증반응의 치료제로서의 결과를 제시한 것으로서 뇌졸중 치료분야에서 효과적인 바이오 신약 후보가 될 것으로 기대하고 PR3 단클론 항체의 개선 및 약효 확인, 약리 작용 규명을 통해 세계 최초의 뇌졸중 치료 바이오 신약 개발 원천기술 확보가 가능할 것이다.

본 발명은 뇌신경계질환인 뇌졸중의 동물모델에서 호중구의 침윤에 의해 증가되는 protease-3에 대한 단클론 항체를 주사하여 염증성세포의 활성화와 뇌신경세포 사멸을 억제할 수 있음을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 PR3 단클론 항체를 제조하여 항체의 특이성을 확인하고자 재조합 human PR3와 호중구로부터의 PR3 단백질을 사용하여 그 효과를 확인하였고 또한 endogenous PR3를 면역염색하여 확인하였다.

그 결과, 제조된 항체클론 중에서 4번과 27번은 재조합 human PR3와 commercial PR3 모두에 대해서 검출이 되었고, 32, 36, 38은 commercial PR3에 대해서 PR3 항체에 대해 반응을 보였다. 또한 이들 항체들을 이용해 THP-1 cells에서 면역염색하여 endogenous하게 합성된 PR3를 확인한 결과, PR3가 강하게 염색됨이 확인되었다 (도 1 참조).

이후, 본 발명자들은 흰쥐의 두뇌로부터 일차 배양한 소교세포에 PR3와 PR3 단클론 항체 그리고 aprotinin (1 mg/ml), leupeptin (1 mg/ml)과 같은 protease inhibitors를 처리하여 세포 내 활성산소종 (reactive oxygen species: ROS)를 H₂DCF-DA형광 dye를 이용하여 측정하여 소교세포 활성화에 대한 효과를 확인하였다.

그 결과 PR3에 의해 증가된 세포 내 ROS는 PR3 항체와 protease inhibitors인 aprotinin과 leupeptin에 의해 감소되는 것을 확인 (도 2 참조) 함으로써 PR3단클론 항체가 소교세포 활성을 억제할 수 있음을 확인하였다.

이후, 신경세포사멸에 대한 PR3 항체와 protease inhibitors의 효과를 확인하고자 소교세포에 PR3와 PR3 항체, protease inhibitors인 aprotinin, leupeptin을 처리하고 24 시간 후 conditioned media를 얻어 흰쥐 배자의 두뇌로부터 일차 배양한 신경세포에 처리하였다. 24 시간 후 신경세포 사멸을 MTT 어세이를 통해 분석하고 세포 내 ROS level은 H₂DCF-DA를 이용해 분석하였다. 그 결과, PR3가 처리된 conditioned media에 의해 신경세포에서는 ROS가 증가하고 이를 PR3 항체와 protease inhibitors에 의해 억제됨이 확인되었다.

또한 PR3에 의해 증가된 신경세포사멸은 PR3 항체와 protease inhibitors에 의해 억제됨이 확인 (도 3 참조)됨으로써 PR3는 소교세포를 활성화시켰고 이는 신경세포사멸을 유도했으며 PR3 항체가 신경세포사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명자들은 PR3에 의해 신경세포사멸과 소교세포의 활성이 확인됨에 따라 PR3 불럭킹에 의한 효과를 확인하고자, 300g의 SD 수컷 흰쥐를 이용해 PR3와 PR3 항체를 같이 striatum으로 microinjection하여 그 효과를 보고자 하였고 CD11b (소교세포 표지자)와 NeuN (신경세포 표지자) 항체를 이용하여 면역염색하였다. 그 결과, PR3에 의해 소교세포 활성과 함께 신경세포 사멸이 증가하였고 PR3 항체와 함께 injection된 동물의 striatum에서 소교세포 활성이 억제되고 그로 인해 신경세포사멸이 억제됨을 확인할 수 있었다. PR3 microinjection에 의해 뇌로 호중구infiltration이 일어나는지 확인하고자 호중구 마커인 myelinperoxidase (MPO)로 면역화학조직염색한 결과 PR3 microinjection 에 의해 MPO 염색이 증가되고 PR3 단클론 항체에 의해 증가된 MPO 염색이 감소됨을 확인함으로써(도 4 참조) PR3는 뇌에서 소교세포를 활성화시키고 신경세포사멸을 유도하며 호중구 infiltration 이 증가되었고 PR3 항체 microinjection에 의해 소교세포 활성과 신경세포사멸이 억제되고 호중구 infiltration 또한 억제됨이 확인되었다.

이후, 300g의 SD 수컷 흰쥐를 이용해 중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion, 이하 'MCAo'라고도 함)을 시행하여 뇌졸중 모델을 만들고 PR3 단클론 항체를 뇌의 선조체(striatum)로 microinjection 하여 뇌를 section하고 호중구 infiltration, 소교세포 활성 그리고 신경세포 사멸에 대한 효과를 각각의 항체인 MPO (Myeloperoxidase; 호중구 마커), NeuN (신경세포 마커), Iba1 (소교세포 마커), GFAP (성상세포 마커) 항체를 이용하여 면역조직염색법을 통해 확인하였다. 그 결과 striatum (선조체) 부분에서 MCAo군에 비해 PR3 단클론 항체를 microinjection 한 군에서 호중구 마커인 MPO가 감소되어 있었고 Iba1의 염색과 GFAP 염색 또한 감소됨을 확인(도 5 참조)함으로써 PR3 항체가 MCAo 동물모델에서 호중구의 침윤을 억제하고 소교세포 활성을 억제하고 이로써 신경세포사멸이 억제됨을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 MCAo에 의한 호중구의 침윤에 의해 PR3가 증가됨을 확인한 바있고 이에 PR3가 호중구가 아닌 뇌조직에서 증가되는지를 확인하고자 배양한 소교세포와 신경세포에 MCAo와 비슷한 in vitro 조건으로 oxgen deprivation, glucose deprivation, oxygen-glucose deprivation (OGD)을 실시하였고 PR3 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 신경세포와 소교세포에서 OGD 자극에 의해 세포에서 PR3 유전자가 증가되어 있음을 확인(도 6 참조) 함으로써 뇌졸중 동물 모델에서 증가되는 PR3가 호중구 외에도 신경세포와 소교세포에서도 증가할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이후, MCAo에 의한 호중구의 PR3의 증가가 호중구가 아닌 뇌조직에서 증가되는지를 확인하고자 배양한 소교세포와 신경세포에 MCAo와 비슷한 in vitro 조건으로 oxgen deprivation, glucose deprivation, oxygen-glucose deprivation (OGD)을 실시하였고 PR3 단백질의 발현을 웨스턴 블럿팅을 통해 확인하였다. 그 결과 소교세포에서 OGD 자극에 의해 PR3 단백질이 증가되었고 신경세포에서는 OGD 자극에 의해 세포에서의 발현과 함께 세포 밖으로 분비도 증가함을 확인(도 7 참조)함으로써 뇌졸중 동물모델에서 증가되는 PR3가 호중구 외에도 신경세포와 소교세포에서도 증가할 수 있음을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해, 본 발명자들은 MCAo 시행 후 호중구의 침윤으로 증가되는 proteinase-3에 의해 소교세포 활성화와 함께 신경세포 사멸이 유도되고 이를 PR3 단클론 항체가 억제할 수 있음을 증명하였다.

상기 결과를 바탕으로 본 발명은 proteinase-3 단클론 항체가 뇌졸중의 치료제로서 개발될 수 있음을 제공한다.

본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 호중구에 다량으로 존재하는 단백분해 효소인 proteinase-3 (PR3)에 대한 항체가 뇌졸중에서 뇌신경세포 손상 및 염증반응의 치료제로서의 결과를 제시한 것으로서 뇌졸중 치료분야에서 효과적인 바이오 신약 후보가 될 것으로 기대하고 세계 최초의 뇌졸중 치료 바이오 신약 개발 원천기술 확보가 가능할 것으로 생각된다.

도 1은 PR3 단클론 항체를 제조하여 항체의 특이성을 확인하고자 재조합 human PR3와 호중구로부터의 PR3 단백질을 사용하여 그 효과를 확인하고, endogenous PR3를 면역염색하여 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 microglia에서 PR3에 의해 증가된 ROS에 대해 PR3 항체와 protease inhibitor의 효과를 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 신경세포사멸에 대한 PR3 항체와 protease inhibitor의 효과를 확인한 결과를 나타낸 그림으로, 도 3a는 신경세포에 PR3와 PR3 항체, protease inhibitors를 처리한 microglia로 부터 얻은 conditioned media를 처리한 후 ROS 측정한 결과를 나타내고, 도 3b는 신경세포에 PR3와 PR3 항체, protease inhibitors를 처리한 microglia로 부터 얻은 conditioned media를 처리한 후 세포사멸 측정한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 PR3에 의한 교세포 활성화, 신경세포 사멸, 호중구 침윤에 대한 PR3 항체를 사용하여 면역염색한 결과를 나타낸 사진으로, MPO (myeloperoxidase; 호중구에 대한 마커), NeuN(뉴런에 대한 마커), Iba1(소교세포에 대한 마커), GFAP(성상세포에 대한 마커)
도 5는 뇌졸중의 동물 모델로부터 호중구 침윤, 교세포 활성화 그리고 신경세포 사멸에 대한 PR3항체 사용의 면역염색 결과를 나타낸 사진으로, MPO (myeloperoxidase; 호중구에 대한 마커), NeuN(뉴런에 대한 마커), Iba1(소교세포에 대한 마커), GFAP (성상세포에 대한 마커)
도 6은 배양한 신경세포와 microglia에서 OGD에 의한 PR3 발현 증가에 관한 결과로서 RT-PCR을 시행한 결과를 나타낸 그림으로, 도 6a는 A : 일차배양한 신경세포에서 oxygen deprivation, glucose deprivation, oxygen-glucose deprivation에 의한 PR3 유전자 발현에 대한 결과를 나타낸 것이고, 도 6b는 일차배양한 microglia에서 oxygen-glucose deprivation에 의한 PR3 유전자 발현에 대한 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 배양한 신경세포와 microglia에서 OGD에 의한 PR3 발현 증가에 관한 결과로서 Western blotting 을 시행한 결과를 나타낸 그림으로, 도 7a는 일차배양한 신경세포에서 oxygen deprivation, glucose deprivation, oxygen-glucose deprivation에 의한 PR3 단백질 발현에 대한 결과를 나타낸 것이고, 도 7b는 일차배양한 microglia에서 oxygen-glucose deprivation에 의한 PR3 단백질 발현에 대한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용은 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

제조예 : PR3 단클론 항체 제조

PR3 단클론 항체는 mouse-anti-human monoclonal antibody로서 다음과 같은 방법으로 만들어졌다. 우선, E.coli에서 발현된 recombinant human PR3 단백질이 antigen으로서 사용되었다. Human PR3 cDNA (Genebank accession no. NM002777)가 RT-PCR을 통해 THP-1 세포에서부터 clone되었고 mature human PR3 생성물은 EcoRI과 XbaI으로 잘라서 pPROE_X ^TMHTa 플라스미드(Invitrogen Life technologies corporation, Carlsbad, CA)에 넣어서 huPR3/pPROE_X ^TMHTa 를 만든다. 이렇게 만들어진 huPR3/pPROE_X ^TMHTa 컨스트럭트를 단백질 발현을 위해 DH5a 세포 (Real Biotech Corp., Taiwan)에 trnasfomation시킨다. 이것을 cobalt chelate 친화 크로마토그래피(GE Healthcare Bio-sciences Corp., Piscataway, NJ)에 의해 정제하고 N-말단의 6개 히스티딘은 TEV protease에 의해 제거시킨 후, 단백질은 FPLC를 사용하여 superdex 75 HR 10/30 gel filtration(GE Healthcare Bio-sciences Corp., Piscataway, NJ)에 의해 한번 더 정제한다. His⁶-tag 이 제거된 rhuPR3 단백질은 20~ 30 kDa정도의 분자량으로 SDS-PAGE에 의해 나타난다.

정제된 recombinant huPR3 단백질은 female BALB/c mice 에 subcutaneous injection에 의해 면역화하는데 사용하고 2주 간격으로 Freund's complete adjuvant와 rhuPR3 (30 ug/mouse)가 두 번의 면역화로 사용된다. 마우스 혈청의 titer는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 결정된다.

재조합 인간 PR3와 인간 호중구 PR3를 혼합하여 Western blotting을 시행하여 특이성을 결정하였고 이로부터 클론 4, 27, 32, 36 그리고 38을 얻었고 본 발명에 사용하였다.

실시예 1: 소교세포의 활성과 신경세포 사멸에 있어서 PR3 항체와 protease inhibitor의 효과

흰쥐의 두뇌로부터 일차 배양한 소교세포에 PR3와 상기와 같은 방법으로 제조된 PR3 단클론 항체 그리고 aprotinin (1 mg/ml), leupeptin (1 mg/ml)과 같은 protease inhibitors를 처리하여 소교세포 활성화에 대한 효과를 하기의 방법으로 조사하였다.

<1-1> 흰쥐 배자의 두뇌로 부터 소교세포 배양

태어난 지 2 일된 흰쥐의 두뇌로 부터 대뇌피질을 분리하여 소교세포를 배양하여 PR3 항체와 aprotinin (1 mg/ml), leupeptin (1 mg/ml)과 같은 protease inhibitors에 대한 효과를 ROS level 변화로 확인하였다. 자세하게는 흰쥐 두뇌의 일차 미세아교세포 배양은 다음과 같이 시행하였다.

태어난 지 2일 된 흰쥐의 대뇌피질을 분리하였고 이를 0.1% 트립신을 이용하여 dissociation한 후 세포를 poly-D-lysine이 코팅된 T-75 플라스크에서 배양하였다. 10% FBS가 함유된 배지에서 배양하고 미세아교세포를 얻기 위해서 confluent한 성상세포를 250 rpm으로 두 시간 진탕하여 세포를 수거하고 이를 poly-D-lysine이 코팅된 배양용기에서 배양한 후 다음날 실험에 적용하였다. 배양한 소교세포에 PR3항체 1, 5 mg/ml, aprotinin (1 mg/ml), leupeptin (1 mg/ml)를 처리하고 1시간 후에 PR3 500 ng/ml 의 농도로 처리한 후 1시간 후 배지를 제거하고 PBS에 ROS 측정용 시약인 50 mM H₂DCF -DA를 처리하여 ROS 변화를 측정하였고, 실험은 최소한 3회 반복하였다.

세포 내 ROS 측정방법은 다음과 같다. Total ROS의 양을 측정하기 위해 50 uM의 H₂DCF-DA를 가하였고 20 분간 배양한 후 나타나는 형광의 강도를 ELISA Reader (Molecular device, Spectramax Gemini EM) 를 이용하여 excitation 485nm emission 530 nm에서 측정하였다. H₂DCF-DA는 형광을 나타내지 않는 시약으로서 세포로 들어가서 ROS를 만나면 diacetate가 떨어져 나가고 DCF(dichlorofluorescence)로서 형광을 나타내는 시약이다.

그 결과, 소교세포에서 PR3에 의해 증가된 세포내 ROS는 PR3항체와 protease inhibitors에 의해 억제됨이 확인되었다 (도 2).

<1-2> 신경세포사멸에 대한 PR3 항체와 protease inhibitor 의 효과 ( in vitro )

소교세포에 PR3와 PR3 항체, protease inhibitor를 처리한 후 24 시간 뒤에 얻은 conditioned media를 일차배양 한 신경세포에 처리하여 ROS 생성과 세포사멸에 대한 효과를 조사하였다. 흰쥐 두뇌의 일차 신경세포 배양은 다음과 같은 방법으로 시행하였다. 임신 18일째 흰쥐의 복강으로부터 태자를 수거하였고 태자의 두뇌를 적출하여 대뇌피질 부위를 분리하였다. 이를 트립신으로 분해하여 single cell을 얻었고 B27이 함유된 Neuro Basal Medium(NBM)을 이용하여 세포를 배양하여 연구에 사용하였다. 신경세포의 독성을 측정하기 위해 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)시약을 이용하여 생성된 formazan을 측정하였고 세포내 ROS 측정은 H₂DCF-DA를 사용하였다.

그 결과, PR3가 처리된 소교세포로부터 얻은 conditioned media는 신경세포에서 ROS를 증가시켰고 이를 PR3 단클론 항체와 protease inhibitors가 억제함을 확인하였고 또한 PR3가 처리된 소교세포로부터 얻은 conditioned media는 신경세포에서 세포사멸을 유도하였고 PR3 단클론 항체와 protease inhibitors가 이를 억제함을 확인하였다 (도 3).

실시예 2: PR3 단클론 항체에 의한 신경세포 사멸에 대한 효과 ( in vivo )

300g의 SD 수컷 흰쥐를 이용해 stereotaxic surgeryd와 middle cerebral artery occlusion (MCAo)을 시행하여 뇌를 section하여 PR3 단클론 항체에 의한 호중구 infiltration, 소교세포 활성, 신경세포 사멸에 대한 효과를 하기의 방법으로 조사하였다.

<2-1> PR3 항체의 microinjection 에 의한 신경세포 사멸에 대한 효과 ( in vivo ) : 면역조직화학적 검색

striatum으로 0.5ug PR3와 1.5 ug PR3 단클론 항체를 microinjection 한 후 24 시간째 뇌를 고정하여 striatum에서의 신경세포 사멸, 소교세포 활성, 성상세포 활성 그리고 호중구 infiltration을 NeuN (신경세포 마커), CD11b (소교세포 마커), GFAP (성상세포 마커), MPO (호중구 마커) 항체를 이용하여 면역 조직화학적으로 염색하였다.

Stereotaxic surgery를 위해서 300 g 의 SD 수컷 흰쥐를 준비하여 Rompun/ketamine (1:2, 2 ml/kg, i.p.) 으로 마취하였고, stereotaxic frame (Stoelting, Wood Dale, IL)에 마취된 쥐를 놓고 ear bar로 고정하였다. Proteinase-3 (1.5 ul; 0.5 ug)와 PR3 단클론 항체 (3.5 ul ; 1.5 ug) 0.5 ul/minute 속도로 striatum (anterior (A), + 0.7; lateral (L), + 2.1; ventral (V), - 5.0)에 microinjection 하였고 PBS injection한 대조군과 비교하였다. 면역조직화학적 방법은 다음과 같이 실시하였다.

흰쥐를 마취하고 심장 박동이 멈추기 전 perfusion을 실시하여, 멸균한 PBS로 뇌를 포함한 모든 조직에서 혈액이 남아있지 않도록 씻어주고 곧바로 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS를 넣어 몸이 굳어진 것을 확인하면 즉시 머리를 열어 뇌를 꺼냈다. 적출한 뇌를 4% PFA in PBS solution에 담가 4℃에서 2시간 동안 고정한 후, 멸균된 15% sucrose에 16시간 놓아두었다. 다음날 미리 70℃에 넣어 두었던 iso-pentane에 20초 정도 soaking 후 section하기 전까지 70℃에 보관하였다. 조직절편은 coronal 방향 (두께 40 μm)으로 microtome (microme, Walldorf, Germany)을 이용하여 실시하였다. 잘라진 조직절편은 poly L-lysine 코팅된 슬라이드 (ESCO, New Hampshire, U.S.A)에 올렸고 슬라이드에 올려진 뇌조직을 고정하기 위하여 4% PFA in PBS에 15분 동안 놓아둔 후, PBS-Triton X-100 (PBST)로 5분 정도 3번 반복하여 씻어주었다. 10% normal horse serum (Lfe Tech., Califonia, U.S.A.) in PBST로 2시간 동안 blocking을 하고 곧바로 1차 항체 (MPO, NeuN, CD11b, GFAP)를 4℃에서 오버나잇으로 반응시켰다. 다음날 PBS-Triton X-100 (PBST)으로 10분 정도 3번 반복하여 씻어낸 후 형광이 붙어있는 2차 항체를 1 시간 동안 붙였다. PBS-Triton X-100 (PBST)으로 10분 정도 3번 반복하여 씻어낸 후, 20 ul 마운팅 용액을 떨어뜨린 뒤 커버-슬립을 덮고 형광현미경으로 관찰하여 단백질의 발현양상을 확인하였다.

그 결과, 대조군에 비해 PR3 에 의해 소교세포 활성과 함께 신경세포 사멸이 증가했었고 PR3 항체와 함께 microinjection된 동물의 striatum에서 소교세포 활성이 억제되고 그로 인해 신경세포사멸이 억제됨을 확인하였고, PR3 단클론 항체 microinjection에 의해 호중구 infiltration이 억제됨이 확인되었다 (도 4). 이러한 실험에 사용한 동물은 군당 최소한 5 마리였다.

따라서, 뇌신경질환에서 증가된 PR3는 소교세포 활성과 신경세포 사멸을 유도하고 이는 PR3 단클론 항체가 억제할 수 있음을 확인하였다.

<2-2> MCAo 동물모델에서 PR3 항체의 microinjection 에 의한 신경세포 사멸에 대한 효과 ( in vivo ) : 면역조직화학적 검색

뇌졸중의 동물모델로서 Middle cerebral artery occlusion (MCAo) 수술하였고 그 방법은 다음과 같다. 10 주된 300 g SD 수컷 흰쥐를 준비하여 Rompun/ketamine (1:2, 2 ml/kg, i.p.)으로 마취하였다. 오른쪽 common carotid artery 로부터 external carotid artery (ECA) 와 internal carotid artery (ICA)를 노출시켰다. ECA는 묶고 lingual 와 maxillary branches는 잘랐다. ICA 는 pterygopalatine branch를 따라 노출시켰고, 4-0 nylon suture를 ECA stump를 따라 ICA로 삽입하여 middle cerebral artery를 blocking하였다. 1.5시간 허혈 후 nylon suture를 빼고 24시간 재관류 후 실험에 사용하였다. 수술 동안 동물은 37 ℃ ± 1℃를 유지하였다.

MCAo시행 후 PR3 항체에 의한 호중구 infiltration, 소교세포 활성, 신경세포사멸에 대한 효과를 확인하고자 호중구 마커인 MPO, 신경세포 마커인 NeuN, 소교세포 마커인 Iba1, 소교세포 마커인 GFAP를 이용하여 실시예 2-1의 방법으로 면역 조직화학적으로 염색하여 발현 여부를 검색하였다. 실험에 사용한 동물은 군당 최소한 5 마리였다.

그 결과, 대조군에 비해 MCAo에 의해 소교세포 활성과 함께 신경세포 사멸이 증가했었고 PR3 항체와 함께 microinjection된 동물의 striatum에서 소교세포 활성이 억제되고 그로 인해 신경세포사멸이 억제됨을 확인하였고, PR3 단클론 항체 microinjection에 의해 호중구 infiltration이 억제됨이 확인되었다 (도 5).

따라서, 뇌졸중과 같은 뇌신경질환에서 PR3가 증가되는데, 이때 증가된 호중구 infiltration , 소교세포 활성, 신경세포 사멸을 PR3 단클론 항체가 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: OGD 에 의한 PR3 발현 ( in vitro )

PR3가 호중구가 아닌 뇌조직에서 증가되는지를 확인하고자 배양한 microglia와 신경세포에 MCAo와 비슷한 in vitro 조건으로 oxgen deprivation, glucose deprivation, oxygen-glucose deprivation (OGD)을 실시하였고 PR3의 발현을 다음과 같이 조사하였다.

<3-1> OGD 에 의한 PR3 유전자의 발현

본 발명자들은 MCAo에 의한 호중구의 침윤에 의해 PR3가 증가됨을 확인한 바있고 MCAo시행 후 호중구 infiltration이 증가되는 것보다 증가되는 PR3양이 더 많은 것을 확인한 바 있어 이에 PR3가 호중구가 아닌 뇌조직에서 증가되는지를 확인하고자 배양한 소교세포와 신경세포에 MCAo와 비슷한 in vitro 조건으로 oxgen deprivation, glucose deprivation, oxygen-glucose deprivation (OGD)을 실시하였고 PR3 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. Reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) 방법은 다음과 같다. 배양된 microglia와 신경세포에 oxgen deprivation, glucose deprivation, oxygen-glucose deprivation (OGD) 자극을 주고 3 시간 주고 24시간 재관류 한 후 total RNA를 Trizol을 이용하여 분리하였다. RNA로부터 superscript II 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였고, PR3와 GAPDH 프라이머 세트(PR3 Forward 5'-GAA CTG AAC GTC ACG GTG GT-3'(서열번호 2), Reverse 5'-CGA ATC ACG AAG GAG TCC AC-3'(서열번호 3); GAPDH 5'-GTG AAG GTC GGT GTG AAC GGA TTT-3'(서열번호 4), Reverse 5'-CAC AGT CTT CTG AGT GGC AGT GAT-3'(서열번호 5))를 이용하여 polymerase를 이용하여 PCR 기계로 증폭하였다. 1%의 agarose gel에 전기 영동하여 증폭된 유전자를 분석하였고 Image J 프로그램을 이용하여 정량하였으며 실험은 최소한 3회 반복하였다.

그 결과 신경세포와 소교세포에서 OGD 자극에 의해 세포에서 PR3 유전자가 증가되어 있음을 확인(도 6)함으로써 뇌졸중 동물모델에서 증가되는 PR3가 호중구외에도 신경세포와 microglia에서도 증가할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<3-2> OGD 에 의한 PR3 단백질의 발현

MCAo에 의한 호중구의 PR3의 증가가 호중구가 아닌 뇌조직에서 증가되는지를 확인하고자 배양한 microglia와 신경세포에 MCAo와 비슷한 in vitro 조건으로 oxygen-glucose deprivation (OGD)을 실시하였고 PR3 단백질의 발현을 Western blotting을 통해 확인하였다. Western blot 방법은 다음과 같다.

배양된 소교세포와 신경세포에 oxgen deprivation, glucose deprivation, oxygen-glucose deprivation (OGD) 자극을 3 시간 주고 24시간 재관류 한 후 세포로 부터 단백질을 추출하여 BCA 단백질 정량법을 이용하여 단백질 양을 정량하였다. 30 mg의 단백질을 얻어 샘플 버퍼를 넣고 이를 10 %의 SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 전기영동하였다. 배지로 분비된 PR3 단백질을 확인하고자 재관류 후 배지를 모아 3배의 아세톤을 넣고 24시간 -20℃에서 24시간 배양 후 4000 rpm에서 원심분리하여 단백질을 얻어 전기영동한다. 전기영동한 단백질을 나이트로셀루로스막에 전기적으로 transfer하였고, blot을 5 % 탈지분유를 이용하여 blocking하였다. 일차항체로서 PR3를 가하고 4℃에서 오버나잇으로 반응시켰다. HRP (horse radish peroxidase)가 붙어있는 이차 항체를 1시간 동안 가하였다. PBS로 10분씩 세번 세정하고 마지막 세정 후에 Enhanced chemilumnescence (ECL)법을 이용하여 LAS-3000기기를 이용하여 단백질 발현 양을 확인하였고 Image J 프로그램으로 정량하였다. 이 실험은 최소한 3회 시행하였다.

그 결과 소교세포에서 OGD 자극에 의해 PR3 단백질이 증가되었고 신경세포에서는 OGD 자극에 의해 세포에서의 발현과 함께 세포 밖으로 분비도 증가함을 확인 (도 7)함으로써 뇌졸중 동물모델에서 증가되는 PR3가 호중구 외에도 신경세포와 microglia에서도 증가할 수 있음을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해, 본 발명자들은 MCAo 시행 후 호중구의 침윤으로 증가되는 proteinase-3에 의해 소교세포 활성화와 함께 신경세포 사멸이 유도되고 이를 PR3 단클론 항체가 억제할 수 있음을 증명하였다.

상기 결과를 바탕으로 본 발명은 proteinase-3 단클론 항체가 뇌졸중의 치료제로서 개발될 수 있음을 제공한다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A use of proteinase-3 monoclonal antibody as therapeutic or diagnostic agent of stroke <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 256 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala His Arg Pro Pro Ser Pro Ala Leu Ala Ser Val Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Gly Ala Ala Arg Ala Ala Glu Ile Val Gly Gly His 20 25 30 Glu Ala Gln Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Ser Leu Gln Met Arg 35 40 45 Gly Asn Pro Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile His Pro Ser 50 55 60 Phe Val Leu Thr Ala Pro His Cys Leu Arg Asp Ile Pro Gln Arg Leu 65 70 75 80 Val Asn Val Val Leu Gly Ala His Asn Val Arg Thr Gln Glu Pro Thr 85 90 95 Gln Gln His Phe Ser Val Ala Gln Val Phe Leu Asn Asn Tyr Asp Ala 100 105 110 Glu Asn Lys Leu Asn Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Asn Leu Ser Ala Ser Val Thr Ser Val Gln Leu Pro Gln Gln Asp Gln 130 135 140 Pro Val Pro His Gly Thr Gln Cys Leu Ala Met Gly Trp Gly Arg Val 145 150 155 160 Gly Ala His Asp Pro Pro Ala Gln Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr 165 170 175 Val Val Thr Phe Phe Cys Arg Pro His Asn Ile Cys Thr Phe Val Pro 180 185 190 Arg Arg Lys Ala Gly Ile Cys Phe Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile 195 200 205 Cys Asp Gly Ile Ile Gln Gly Ile Asp Ser Phe Val Ile Trp Gly Cys 210 215 220 Ala Thr Arg Leu Phe Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Tyr Val 225 230 235 240 Asp Trp Ile Arg Ser Thr Leu Arg Arg Val Glu Ala Lys Gly Arg Pro 245 250 255 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaactgaacg tcacggtggt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgaatcacga aggagtccac 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgaaggtcg gtgtgaacgg attt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cacagtcttc tgagtggcag tgat 24

Claims (8)

1. 프로테이나아제-3에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 프로테이나아제-3는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물.
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 뇌신경세포 손상 및 염증반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물.
5. 프로테이나아제-3에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 프로테이나아제-3는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 조성물.
7. 삭제
8. 삭제

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