KR101260894B1 - 히스티딘을 포함하는 펩타이드 유사체 및 항바이러스제 또는 항암제로서의 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히스티딘을 포함하는 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염에 관한 것이고, 또한 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스제 또는 항암제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염은 NF-κB 의 활성을 조절하는 능력이 뛰어나고 독성이나 부작용이 적으며, NF-κB 와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약제 조성물로 이용될 수 있다.

펩타이드 유사체, 항바이러스, 항암, NF-κB

Description

히스티딘을 포함하는 펩타이드 유사체 및 항바이러스제 또는 항암제로서의 이의 용도{Peptide derivatives including histidine and use thereof as anti-virus agents or anti-tumor agents}

본 발명은 히스티딘을 포함하는 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염에 관한 것이고, 또한 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 감염 및 종양성 질병의 치료에 사용할 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Herpesvirus는 대표적인 double-stranded DNA 바이러스로서, Herpes simplex virus (HSV-1, HSV-2), Varicella Zoster virus (VZV), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), Kaposi's sarcoma-associated virus (KSHV) 등이 있다. 이들의 감염은 주로 면역 약화된 숙주세포(immunocompromised host cell)에 잠복감염 (persistent infection)을 하여 잠복기 (latent cycle) 상태로 존재하다가 여러 가지 외부 자극에 대해 용해 활성기 (lytic reactivation)를 거쳐 바이러스 입자 (virion)를 생산하여 감염을 더욱 확산시키게 된다. 이 때 바이러스의 감염 시에 숙주세포 내에서는 nuclear factor-kappaB (NF-κB ) 라는 전사인자가 활성화되게 되는데, 바이러스는 이를 이용하여 바이러스 유전자의 복제와 바이러스 단백질의 발현을 유도하게 된다. (Santoro MG et al ., EMBO J. 22(11)：2252-2560, 2003; Hiscott J. et al ., Oncogene, 25 : 6844-6867, 2006) 따라서 NF-κB 의 조절을 통하여 바이러스 감염을 치료 및 예방할 수 있으며, NF-κB 의 조절물질은 항바이러스제로 유용하게 작용할 수 있다.

종래에는 resveratrol이나 aspirin과 같은 물질들을 사용하여 항바이러스 기전의 하나로 NF-κB 활성을 조절하는 연구가 수행되었으며,(Faith SA. et al., Antiviral Research, 72: 242-251, 2006), NF-κB 활성 조절물질들이 효과적으로 항바이러스제로 기능할 수 있음을 입증하였다.

또한, NF-κB 는 세포의 생존을 촉진하는 유전자의 발현을 유도하는 전사인자로서 암세포에게 항생제 저항성 (Chemoresistance) 을 부여하므로, 항암물질들의 target으로 알려져 있으며, 세포생존에 필수적인 PI3-kinase 및 PDK 와 Akt kinase 등이 NF-κB 단백질의 활성화를 조절하는 새로운 방법을 탐색하여 항암후보 물질들이 스크리닝 되고 있다.

공개특허 제 2001-005759호에서는 X1 -His-Gly-X 2 -His-Gly-Val-X 3(X 1 은 아무것도 포함하지 않거나, His-Gly-Val-Ser-Gly-, Gly-Val-Ser-Gly-, Val-Ser-Gly-, Ser-Gly-, Pro-Ser-Leu-Thr-Gly-, Phe-Ile-Val-Ser-Ala-, Thr-, Leu-Ala-Ser-Leu-, Cys-Val-Val-Thr-Gly-, Ile-Ser-Gly-, Cys-Gly-, Ile-Val-Ala-Arg-Ile-, Phe-Gly-, His-Gly-Asp-Ser-Gly-, Ser-Gly- 및 Tyr-Ala-Met-Ser-Gly-으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 펩티드이고;X 2 는 펩티드 결합이거나, -Gln-, -Phe-, -Asp-, -Ser-, -Asn-, -Ala-,-Gln-Asn-, -Ala-Val- 및 -Ser-Asp-Gly-으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 펩티드이며; 및, X 3 는 아무것도 포함하지 않거나, -His-Gly, -His, -Tyr-Asp, -Phe-Val,-Pro, -Gln-His-Gly, -Leu-Ala, -Asp, -Pro-Leu, -Met 및 -Phe-Ile으로 구성되는 그룹으로부터 선택됨)의 구조를 가지는 자연산(natural origin) 면역조절물질인 알로페론을 개시하고 있으며, 상기 알로페론은 인간 및 동물 면역체계의 항바이러스, 항균, 항암활성을 특이적으로 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

현재까지 항바이러스 또는 항암효과를 가지는 물질들의 개발이 지속적으로 이루어지고 있으나, 인체에 독성이 없으면서도 효율적으로 항바이러스 및 항종양 효과를 나타내는 물질의 선별 및 이의 적용에 관하여 많은 연구가 필요하다.

이에 본 발명자들은 NF-κB 활성의 조절을 통하여 항바이러스제 또는 항암제로 기능할 수 있는 생리활성물질을 규명하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 알로페론과 유사한 구조를 가지는 펩타이드 유사체를 제작하고, 이들 펩타이드 유사체가, NF-κB 활성을 조절하며, 바이러스 초기 단백질의 발현을 억제함으로서 항바이러스 활성을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 히스티딘을 포함하는 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염을 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염은 NF-κB 의 활성을 조절하는 능력이 뛰어나고 독성이나 부작용이 적으며, 항바이러스, 항암등 NF-κB 와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약제 조성물 등의 제조에 이용될 수 있다.

본 발명의 화학식 Ⅰ은 다음과 같다.

[화학식 Ⅰ]

X1-His-X2-X3-His-Gly-X4,

상기 식에서,

X1 은 존재하지 않거나 적어도 한 개의 아미노산 또는 alkyl 또는 aryl기를 포함하는 적어도 한 개의 아미노산을 나타내고,

X2 는 베타-아미노산, 감마-아미노산, D-form 아미노산, 또는 N-methyl 아미 노산을 포함하는 한 개의 아미노산을 나타내며,

X3 는 존재하지 않거나 L-form 아미노산, D-form 아미노산 또는 N-methyl 아미노산을 포함하는 적어도 한 개 이상의 아미노산을 나타내며,

X4 는 L-form 아미노산, D-form 아미노산 또는 N-methyl 아미노산을 포함하는 적어도 한 개 이상의 아미노산을 나타낸다.

본 발명에 따른 히스티딘을 포함하는 화학식Ⅰ로 표시되는 펩타이드 유사체는 바람직하게는 X1-His-β-Ala-X3-His-Gly-X4, 가장 바람직하게는, Gly-His-β-Ala-Gln-His-Gly-Val이다.

본 발명의 화학식 Ⅱ는 다음과 같다.

[화학식 Ⅱ]

X1-His-X2-His-Gly-D-Val-X3,

상기 화학식 Ⅱ에서,

X1 은 존재하지 않거나 적어도 한 개의 아미노산 또는 alkyl 또는 aryl기를 포함하는 적어도 한 개의 아미노산을 나타내고,

X2 는 베타-아미노산, 감마-아미노산, L-form 아미노산, D-form 아미노산, 또는 N-methyl 아미노산을 포함하는 적어도 한 개의 아미노산을 나타내며,

X3 는 존재하지 않거나 베타-아미노산, 감마-아미노산, L-form 아미노산, D-form 아미노산 또는 N-methyl 아미노산을 포함하는 적어도 한 개 이상의 아미노산 또는 ester 또는 amide로 연결된 alkyl, aryl, heteroaryl기를 나타낸다.

본 발명에 따른 히스티딘을 포함하는 화학식로 표시되는 펩타이드 유사체는 바람직하게는 Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-D-Val이다.

본 발명은 또한 상기 화학식Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 의 활성 조절물질을 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드 유사체는 하기 표 1에 개시된 구조식을 가지는 물질이 될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 유사체 및 그의 구조

본 발명의 펩타이드 유사체	구조
1 G-H-G-(Me)Q-H-G-V-NH2
2 G-H-(Me)G-Q-H-G-V-NH2
3 G-H-(b)A-Q-H-G-V-NH2
4 G-H-G-Q-H-G-(D)V-NH2
5 G-H-G-(D)Q-H-G-V-NH2
6 G-H-(b)A-Q-H-G-(D)V-NH2

Luciferase reporter assay를 통한 NF-κB 활성을 비교한 결과, 하기 화학식 Ⅲ로 표시되는 알로페론(대조군)을 농도별로 처리하였을 때보다 본 발명에 따른 펩타이드 유사체들을 각각의 농도로 처리할 경우, 펩타이드 유사체 M-13과 M-15가 대조군에 비해서 NF-κB 활성이 높은 것을 확인하였으며, 따라서 이에 따라 항바이러스 효능 또한 이와 비례하여 높을 것을 알 수 있다.(도 1)

[화학식 Ⅲ]

H-G-V-S-G-H-G-Q-H-G-V-H-G(분자량 1265)

본 발명에 따른 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염은 NF-κB 의 활성을 조절할 수 있기 때문에, NF-κB 관련 질병의 예방 및 치료물질로 기능할 수 있으며, 보다 구체적으로 항바이러스제 또는 항암제로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 화학식Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염을 유효성분으로 함유하는 항바이러스제 또는 항암제를 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드 유사체의 시험관내 항바이러스 효능을 검사하기 위하여 BCBL-1 cells 를 대상으로 하여 초기 바이러스 단백질의 하나인 K8의 발현 정도를 실험하였다. 본 발명의 일실시예에서 제조한 NF-κB 활성화 능력이 가장 우수했던 펩타이드 유사체 M-13을 처리했을 경우, 알로페론(화학식 Ⅲ)과 비교해 보았을 때 바이러스 단백질의 발현을 확실하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었으며, 따라서 본 발명에 따른 펩타이드 유사체가 기존의 알로페론(화학식 Ⅲ)에 비하여 항바이러스 효과가 동등하거나 우수함을 알 수 있다.(도 2)

본 발명은 상기 화학식Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염을 유효성분으로 함유하는 세포독성이 적은 NF-κB 관련 질병 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에 따른 화학식Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드 유사체를 암호화하는 핵산염기서열, 상기 염기서열을 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주세포가 본 발명의 범주에 포함됨은 당업자에게 자명한 사실이다.

본 발명에 따른 화학식Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염은 NF-κB 의 활성을 조절하는 능력이 뛰어나고 독성이나 부작용이 적어, NF-κB 활성 조절물질로 작용할 수 있으며, 항바이러스제, 항암제등 NF-κB 와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약제 조성물의 제조에 이용될 수 있다.

본 발명은 히스티딘을 포함하는 펩타이드 유사체 및 이들의 수화물 또는 염 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 감염 및 종양성 질병의 치료에 사용할 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 펩타이드 유사체의 합성 및 정제

각각의 펩타이드 유사체들은 표준화된 Fmoc-법을 이용한 고상법 (Wellings, D. A., and Atherton, E., Methods Enzymol., 289 :44-67,1997)으로 고상 합성기(Model CCS-1200V manufactured by Eyela, Japan)를 사용하여 합성하였다. 히스티딘과 글루타민의 잔기는 각각 trityl기로 보호된 것을 사용하였다. 수지(Rink Resin) 50 mg을 반응용기(reaction vessel)에 넣은 후에 DMF(Dimethylformamide)10㎖로 수지를 스웰링(swelling)시켰다. 25% 피페리딘/DMF를 사용하여 수지의 Fmoc 기를 제거한 다음, DMF 및 DCM(Dichloromethane)을 사용하여 수지를 씻어내었다. 수지에 대해 3 당량에 해당하는 아미노산, 3 당량에 해당하는 HOBT(1-Hydroxybenzotriazole) 및 3 당량에 해당하는 DIC(1,3-Diisopropylcarbodiimide)를 바이알 용기에 넣고 DMF(Dimethylformamide)10㎖로 녹이고, 3 당량의 DIPEA (diisopropyl ethylamine)을 가한 다음, 수지가 들어 있는 반응 용기에 첨가하여 1시간 반응시켰다. 여러 개의 아미노산을 붙여나갈 경우, Fmoc 기를 제거하고 아미노산 유도체를 coupling하는 상기의 과정을 연속해서 실행시켜 아미노산을 차례로 결합시킨 다음, 맨 마지막 아미노산의 N-말단에 붙어있는 Fmoc 기를 25% 피페리딘/DMF를 사용하여 제거하였다. 히스티딘이나 글루타민 잔기에 붙어있는 보호기(protecting group)를 제거하고, 합성된 펩타이드를 수지로부터 분리하기 위하여 90% TFA(Trifluoro acetic acid)/DCM 20㎖를 넣어 4시간 동안 반응시킨 후, 고체 수지를 걸러내고 반응액을 둥근 플라스크에 넣어 증류시켰다. 용매가 0.5 mL 정도로 농축되면 에테르 (diethyl ether) 10㎖를 적가하여 침전을 생성시킨 다음, 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 흰색 고체를 얻어내고, C-18 컬럼을 이용한 역상 HPLC(영린, 이동상:아세토나이트릴, 고정상:C-18 레진, 유속:1ml/min) 를 수행하여 정제하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoracetic acid)을 포함한 아세토니트릴/물 혼합용매를 사용하여 1㎖/분의 유속으로 30분간 수행하여 용리액 중 목적 펩타이드만이 검출된 분획들을 모아 동결건조하여 M1 내지 M19의 화합물들을 각각 수득하였다.

합성된 펩타이드 또는 유사체 및 그의 구조

합성 펩타이드 또는 유사체	구조
M1 H-G-V-S-G-H-G-K-H-G-V-H-G-NH2
M2 H-G-V-S-G-H-G-Q-H-G-V-H-G-NH2
M3 Decanoyl-G-H-G-Q-H-G-V-NH2
M4 Lauryl-G-H-G-Q-H-G-V-NH2
M5 Nicotinoyl -G-H-G-Q-H-G-V-NH2
M6 Benzoyl-G-H-G-Q-H-G-V-NH2
M7 G-H-G-Q-H-G-V-NH2
M8 G-H-G-Q-H-G(Me)-V-NH2
M9 G-H-G-Q(Me)-H-G-V-NH2
M10 G-H-G(Me)-Q-H-G-V-NH2
M11 G(Me)-H-G-Q-H-G-V-NH2
M12 G-H-G-Q-H-(b)A-V-NH2
M13 G-H-(b)A-Q-H-G-V-NH2
M14 (b)A-H-G-Q-H-G-V-NH2
M15 G-H-G-Q-H-G-(D)V-NH2
M16 G-H-G-Q-(D)H-G-V-NH2
M17 G-H-G-(D)Q-H-G-V-NH2
M18 G-(D)H-G-Q-H-G-V-NH2
M19 G-(D)H-G-(D)Q-(D)H-G(D)V-NH2

< 실험예 1> 시험관내 항바이러스 활성 검사

1-1. 실험방법

1×10⁵ 의 293 cell (The American Type Culture Collection, ATCC CRL-1573) 12 시간동안 안정화시킨 후, 혈청(serum)과 항생제가 없는 배지로 교체해 둔다. 2 ㎕의 oligofectamin (Invitrogen)과 1 ㎍의 pNF-κB /Luc (firefly luciferase expression vector)를 섞어주고 실온에서 20분 동안 혼합시킨다. 이 혼합물을 293 cell의 배지에 섞어주고 12～18 시간동안 배양한 후, 대조군으로서 화학식 Ⅲ의 알로페론을 농도별로 처리하고, 실시예 1의 펩타이드 유사체 물질 M1 내지 M19를 200 ng/ml로 처리하여 24 시간동안 다시 배양시켰다. Luciferase reporter assay system (Promega)을 이용하여 luminometer로 형광값을 측정하고 이를 비교하였다.

[화학식 Ⅲ]

H-G-V-S-G-H-G-Q-H-G-V-H-G(분자량 1265)

1-2. 실험결과

화학식 Ⅲ의 알로페론을 농도별로 처리하였을 때와, 본 발명에 따른 펩타이드 유사체들을 각각의 농도로 처리해 주었을 때 luciferase reporter assay를 통한 NF-κB 활성은 도 1에 도시하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 펩타이드 유사체 물질들 중 M-13과 M-15가 대조군에 비해서 NF-κB 활성이 높은 것을 확인하였으며, 따라서 항바이러스 효능 또한 이와 비례하여 우수할 것을 알 수 있다.

<실험예 2> 시험관내 항바이러스 효능 검사

2-1. 실험방법

BCBL-1 cells (HHV8-infected B 림프종 세포주, E. Cesarman and Y. Chang et al., Blood, 86 : 2708-2714, 1995, 동국대학교 생명과학부 서태근 교수 제공)을 50 nM Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 2% SDS, and 5% b-mercaptoethanol이 포함된 용액으로 세포를 용해시킨다. 세포 추출물 (lane 당 30 ㎍의 단백질)을 12% SDS-PAGE에 loading한 후, 이를 nitrocellulose membranes (Millipore)에 transfer한다. 5% skim milk (0.1 % Tween-20 PBS)로 1 시간동안 blocking 한 후, membrane은 anti-K8 항체 (1:4000) 혹은 anti-human β-actin 항체 (1:4000, Cell signaling)로 일차 항체를 4℃에서 12 시간 이상 반응시킨다. 그리고 이를 다시 이차 항체인 anti-rabbit 혹은 anti-mouse IgG horseradish peroxidase (1:6000, Cell signaling)로 실온에서 1 시간동안 반응시킨 후, chemiluminescence detection kit (ECL, Amersham Biosciences)를 이용하여 밴드를 확인한다. 실험군은 HHV8가 감염된 BCBL-1 cell이 잠복기 상태인 ‘Control 군’(lane 1)과 잠복기 상태일 때 알로페론(화학식 Ⅲ) 또는 본 발명에 따른 펩타이드 유사체 (M-13)를 처리한 'Alloferon 군‘ (lane 2), 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA)로 용해 재활성을 유도한 ‘TPA 군’(lane 3), 바이러스가 TPA에 의해 용해 재활성화 되기 이전에 알로페론(화학식 Ⅲ) 또는 본 발명에 따른 펩타이드 유사체 (M-13)를 전처리한 ‘Alloferon pretreatment 군’ (lane 4), TPA와 알로페론(화학식 Ⅲ) 또는 본 발명에 따른 펩타이드 유사체 (M-13)를 동시에 처리한 ‘TPA/Alloferon cotreatment 군’ (lane 5), TPA 처리에 의해 용해 재활성화를 먼저 유도한 후 알로페론(화학식 Ⅲ) 또는 본 발명에 따른 펩타이드 유사체 (M-13)를 후처리한 ‘Alloferon posttreatment 군’ (lane 6)으로 나누어 바이러스 단백질의 하나인 K8의 발현 정도를 band로 확인해 보았다.

2-2. 실험결과

HHV8 감염된 B 림프종 세포주에서 잠복기와 용해 재활성이 유도되었을 때 본 발명의 펩타이드 유사체 처리에 의해 초기 바이러스 단백질의 하나인 K8의 발현 정도를 비교해 보았다. 이 때 알로페론 또는 본 발명의 펩타이드 유사체 (M-13)에 의해 바이러스 단백질의 발현이 감소되는 경향을 확인할 수 있었는데, 이에 대해 NF-κB 활성화 능력이 가장 우수했던 펩타이드 유사체 M-13을 처리했을 경우, 알로페론(화학식 Ⅲ) 과 비교해 보았을 때 바이러스 단백질의 발현을 확실하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 펩타이드 유사체 M-13이 기존의 알로페론(화학식 Ⅲ)에 비하여 항바이러스 효과가 동등하거나 우수함을 알 수 있다.(도 2)

도 1은 종래의 알로페론을 농도별로 처리한 대조군과, 본 발명에 따른 M1 내지 M19 펩타이드 유사체들을 일정 농도로 처리해 주었을 때 293 cell에서 luciferase reporter assay를 통한 NF-κB 활성을 측정한 도이며,

도 2는 HHV8 감염된 B 림프종 세포주에서 잠복기와 용해 재활성이 유도되었을 때 종래의 알로페론 또는 본 발명의 펩타이드 유사체 M-13 처리에 의해 초기 바이러스 단백질의 하나인 K8의 발현 정도를 나타낸 것이다.

Claims (12)

1. 하기 화학식Ⅰ로 표시되는 펩타이드 유사체 또는 이들의 수화물 또는 염:

   [화학식 Ⅰ]

   Gly-His-β-Ala-Gln-His-Gly-Val
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드 유사체 또는 이들의 수화물 또는 염:

   [화학식 Ⅱ]

   Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-D-Val
6. 제1항 또는 제5항에 따른 펩타이드 유사체 또는 이들의 수화물 또는 염을 유효성분으로 함유하는 NF-kB의 활성 증진 물질.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제

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