KR101257943B1 - 발효액으로부터의 염기성 아미노산의 회수 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 염기성 아미노산을 생산하는 미생물 균주의 발효액으로부터의 염기성 아미노산의 회수 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 미생물을 발효액으로부터 분리하는 단계, 및 b) 단계 a)에서 수득된 발효액을 염 형태의 강산성 양이온 교환제의 단일 단계 또는 다단계 장치에 연속 로딩하고, 염기성 아미노산을 용출시킴으로써 단계 a)에서 수득된 수성 발효액으로부터 염기성 아미노산을 분리시키는 단계. 본 발명에 따르면, 단계 b)의 충전 공정 전, 수성 발효액의 pH는 4 내지 7.5의 범위이고, 전처리의 말기에 있어서 전처리된 양이온 교환제의 배출구에서의 pH 값이 4.5 내지 7의 범위인 방식으로, 양이온 교환 장치의 적어도 제1 단계가 수성 산으로 전처리된다.
염기성 아미노산, 발효액, 미생물, 양이온 교환제

Description

발효액으로부터의 염기성 아미노산의 회수 방법 {METHOD FOR RECOVERING A BASIC AMINO ACID FROM A FERMENTATION LIQUOR}
본 발명은 염기성 아미노산을 생산하는 미생물 균주의 발효액(broth)으로부터의 염기성 아미노산의 제조 방법에 관한 것이다.
염기성 아미노산, 예컨대 L-리신, L-히스티딘, L-아르기닌 및 L-오르니틴은 주로 미생물 발효 방법에 의해 생성된다 (예를 들어, 문헌 [Axel Kleemann et al., "Amino acids", in "Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry", 5th Edition on CD-ROM, 1997 Wiley-VCH] 및 그에 인용된 문헌; 문헌 [Th. Hermann, J. Biotechnol. 104 (2003), pp. 155-172] 및 그에 인용된 문헌; 문헌 [Pfefferle et al., Adv. Biochem. Eng./Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112] 및 그에 인용된 문헌; 및 문헌 [Atkinson et al., in Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd ed., Stockton Press, 1991, Chapter 20] 및 그에 인용된 문헌 참조).
이러한 발효 방법의 경우에, 목적하는 염기성 아미노산 및 사용된 미생물로부터 생성되는 생물량(biomass) 이외에, 다수의 부산물 및 불순물, 예를 들어 다른 아미노산, 기질 잔여물, 염, 세포 용해 생성물 및 다른 부산물을 포함하는 수성 발 효액이 주로 수득된다.
발효액으로부터의 염기성 아미노산의 제조 및 정제는 종종 강산성 양이온 교환제를 사용하여 수행된다 (예를 들어, 상기 문헌 [Th. Hermann; Atkinson et al.] 참조). 이러한 목적을 위해, 미생물 및 다른 불용성 구성성분 (생물량)을 제거하기 전 또는 후에, 염기성 아미노산이 2가 양이온으로서 존재하도록 강산, 예를 들어 황산을 사용하여 수성 발효액을 pH 2 미만으로 산성화한다. 그 다음, 산성화된 수성 발효액을 산 기가 염의 형태, 예를 들어 나트륨 또는 암모늄 염으로서 존재하는 강산성 양이온 교환제에 통과시고, 그 결과 염기성 아미노산의 2가 양이온이 이온 교환 수지에 흡착된다. 그 후, 불순물을 제거하기 위해 염기성 아미노산이 로딩(loading)되어 있는 양이온 교환제를 통상적으로 물로 세척한다. 이어서, 염기성 아미노산을 묽은 수성 염기, 예를 들어 수산화나트륨 용액, 암모니아수 또는 수성 암모늄 완충액으로 처리하여 용출시키는 동시에, 염 형태로 양이온 교환제를 재생시킨다. 이로써 생성된 용출액으로부터, 적절한 경우, 용출액을 산성화시킨 후, 통상적인 방식으로, 예를 들어 결정화에 의해 염기성 아미노산을 단리시킨다.
물론, 양이온 교환제에 염기성 아미노산의 2가 양이온이 로딩된 경우에 유출되는 액체(유출액)는 염 농도가 높으므로 고밀도 폐수 (HDWW)라 칭할 수 있다. 또한, 적절한 경우, 세척 단계가 연속적으로 수행되어 염이 로딩된 다량의 물이 생성된다(저밀도 폐수; LDWW). 이러한 폐수는 염 로딩을 감소시키기 위해 복잡한 폐수 처리를 거쳐야 한다. 별법으로는, 염분이 있는 폐수는 탈수될 수 있고, 생성된 농축액은 처분되거나 또다른 용도로 공급될 수 있다. 그러나, 두 방책은 장치에 대 한 추가 지출 및 높은 에너지 소비와 관련되어 있어, 발효 아미노산 제조의 비용에 대해 적지 않은 정도로 기여한다. 따라서, 염기성 아미노산을 포함하는 발효액의 양이온 교환제에 의한 후처리에서 생성되는 폐수의 양 및 염 로딩을 감소시키기 위한 많은 시도가 있었다.
문헌 [Hsiao et al., Biotechnology and Bioengineering Vol. 49 (1996) pp. 341-347]에는 양이온 교환제에서 생성되는 염분이 있는 유출액을 발효 매질로 재순환시켜 폐수의 양을 감소시키는 것이 제안되어 있다. 그 결과, 통상적으로 미생물 신진대사의 부산물로서 형성되는 발효 억제제가 발효 매질 중에 축적되는 위험 이외에, 이러한 경우 양이온 교환제의 결합 용량이 감소되어 폐수의 양을 감소시킴으로써 달성된 절감 비용이 더 많은 양이온 교환 장치의 비용에 의해 소비되는 것으로 밝혀졌다.
문헌 [I. Lee et al., Enzyme and Microbiol. Technol. 30 (2002) pp. 798-803]에는 리신 함유 발효액의 후처리시 염 로딩을 감소시키기 위해 통상적으로 사용되는 양이온 교환제 대신에 이온 배제 크로마토그래피를 사용하는 것이 제안되어 있다. 이러한 목적을 위해, 먼저 발효액 중의 고체 성분을 미세여과에 의해 제거한다. 생성된 수성 리신 함유 발효액을 등전점 (pH 9.74)으로 조정한 다음, 양이온 교환제에 통과시킨다. 발효액의 이온성 구성성분은 흡착되지 않기 때문에, 유출액 중에 회수된다. 그 다음, 아미노산을 물로 용출시킨다. 그러나, L-리신의 90％를 초과하는 높은 회수율은 단지 리신 함유 공급물의 비율이 낮고, 또한 관류량(through-flow rate)이 낮은 경우에 달성되는 것으로 나타났다. 따라서, 염 로 딩이 더 낮음에도 불구하고, 이러한 실시태양은 비경제적이다.
미국 특허 제4,714,767호에는 제1 컬럼의 로딩시 생성된 유출액의 최종 부분이 차후 분리의 로딩 작업으로 재순환되는, 복수의 직렬연결된 양이온 교환 컬럼의 장치에 의해 수성 발효액으로부터 염기성 아미노산을 분리하는 다단계 방법이 기재되어 있다. 또한, 제1 컬럼의 용출액의 최종 부분이 차후 분리의 용출 공정으로 재순환되는 것이 제안되어 있다. 이러한 방식으로 물의 양은 감소되지만 염 로딩은 감소되지 않는다.
유럽 특허출원 제1,106,602 A1호에는 강산성 양이온 교환제 상의 모의(simulated) 이동층 크로마토그래피에 의해 아미노산의 불순물 함유 수용액으로부터 아미노산을 분리하는 것이 기재되어 있다. 바람직한 실시태양에 따르면, 이를 위해 강산성 양이온 교환제를 갖고, 순차적 배열로 제1 탈착부, 추출부, 공급부, 라피네이트(raffinate)부 및 제2 탈착부를 포함하는 하나 이상의 직렬연결된 크로마토그래피 컬럼을 포함하는 장치가 사용된다. 아미노산을 분리하기 위해, 동시에 (i) 공급부를 통한, 아미노산 함유 공급물 용액, 및 (ii) 제1 탈착부를 통한, 염기성 용출제를 양이온 교환 물질과 접촉시키고, 적절한 경우, (iii) 제2 탈착부를 통해 수용액을 분리해 내고, (iv) 추출부를 통해 아미노산을 포함하며, 공급용액과 비교하여 불순물의 양이 적은 용액을 분리해 낸다. 염 로딩 및 폐수의 양의 감소에 대한 잇점은 명확하지 않다.
따라서, 본 발명의 기초를 이루는 목적은 상기한 종래기술의 단점을 극복하면서, 염기성 아미노산을 생산하는 미생물 균주의 발효액으로부터의 염기성 아미노산의 제조 방법을 제공하는 것이다.
놀랍게도, 이러한 목적이 우선, 대부분의 미생물을 발효액으로부터 분리시키고 (단계 a), 이어서 발효액을 염 형태의 강산성 양이온 교환제의 단일 단계 또는 다단계의, 일반적으로 직렬의 장치에 연속 로딩하고 염기성 아미노산을 용출시킴으로써, 생성된 수성 발효액으로부터 염기성 아미노산을 분리시키고(단계 b), 이때, 로딩 전 염기성 발효액의 pH가 4.0 내지 7.5, 특히 4.5 내지 7.2, 특히 4.6 내지 7의 범위이고, 적어도 양이온 교환 장치의 제1단계를, 전처리의 말기에 전처리된 양이온 교환제의 유출액의 pH가 4.5 내지 7.0의 범위가 되는 방식으로 수성 산을 사용하여 전처리하는 방법에 의해 달성됨을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 염기성 아미노산을 생산하는 미생물 균주의 발효액으로부터 염기성 아미노산을 제조하는, 본 명세서 및 청구 범위에 제시한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에는 여러 잇점이 있다. 우선, 본 발명의 방법으로 생성되는 염의 양 및 이로 인한 폐수의 염 로딩이, 발효액으로부터 염기성 아미노산을 분리하고 생성하는데 양이온 교환제가 사용되는 종래기술의 방법보다 더 낮다. 또한, 심지어 교환제에서의 높은 로딩 및 관류량에서도 일반적으로 95%를 초과하는 염기성 아미노산의 높은 수율이 달성된다. 발효액에서 선택되는 pH로 인하여, 양이온 교환제를 폐색하여 세척수의 필요량을 증가시킬 수 있는 불순물의 현저한 침전이 발생하지 않는다.
본 발명에 따라, 제1 단계에서는, 발효액에 존재하는 대부분의 미생물 및 적절한 경우, 다른 고체가 발효액으로부터 분리된다. 이러한 구성성분의 완전한 분리는 원칙적으로 필요한 것은 아니다. 그러나, 통상적으로 미생물을 포함하는 발효액 내에 존재하는 고체의 70% 이상, 특히 80% 이상이 단계 a)에서 분리된다. 바람직하게는, 생성된 수성 발효액은 세포 물질을 1 부피% 미만, 특히 0.6 부피% 이하로 포함한다.
미생물 및 다른 고체 구성성분의 분리는 통상적으로 미생물의 분리를 위해 케이크 여과, 심층(depth) 여과, 교차류(cross-flow) 여과를 비롯한 여과; 한외 여과 및 미세 여과와 같은 막 분리 방법; 원심분리 및 디캔팅(decanting); 히드로사이클론(hydrocyclone)의 사용; 상기한 방법의 조합 또는 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.
분리 전에, 예를 들어 통상적인 저온살균법, 예컨대 열 및/또는 고온 스팀을 도입함으로써 발효액에서 미생물을 불활성화시키는 것(발효액을 살균하는 것)이 유용함이 증명되었다. 이를 위해, 통상적인 열 교환기, 예를 들어 다관형(shell-and-tube) 열 교환기 또는 판형 열 교환기가 사용될 수 있다.
대부분의 미생물 및 적절한 경우, 다른 고체가 분리된 후 수득된 발효액은 통상적으로 4 내지 30 중량%, 종종 8 내지 20 중량%, 특히 10 내지 15 중량%의 염기성 아미노산 성분을 갖는다. pH는 종종 5 내지 7.5의 범위, 및 특히 6 내지 7의 범위이다. 따라서, 수성 브로스의 pH의 조정, 예컨대 종래기술에서와 같은 산성화는 생략될 수 있다. 그러나, 원칙적으로 예를 들어 미량의 산, 바람직하게는 pKa 가 4.5 미만인 산, 예컨대 포름산, 아세트산 또는 황산을 첨가함으로써, 상기 특정된 범위로 pH를 설정하는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 실시태양에서, 발효액의 pH는 바람직하게 4.0 내지 6, 특히 4.5 내지 5.5의 범위이다.
그 다음, 단계 b)에서는 양이온 교환 장치를 사용하여 생성 수성 발효액으로부터 염기성 아미노산을 분리한다. 본 발명에 따라, 단계 b)의 분리는 1회 이상의 전처리 단계, 염기성 아미노산이 강산성 이온 교환제에 흡착되는 차후 로딩 단계, 및 염기성 아미노산이 이온 교환제로부터 탈착되는 1회 이상의 용출 단계를 포함한다. 이러한 단계는 기재된 순서로 수회 반복될 수 있으며, 단계 사이에 물을 사용한 세척 단계가 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 양이온 교환 장치는 정지상으로서 1종 이상의 강산성 양이온 교환제를 포함하는 통상적인 이온 교환 컬럼의 형태인 직렬연결된(연속적으로 연결된) 단을 1개 또는 바람직하게는 1개 이상, 예를 들어 2, 3 또는 4개 이상, 최대 50개를 포함한다.
강산성 양이온 교환제로는, 원칙적으로 강산성 기, 일반적으로 술포네이트기를 갖는 모든 이온 교환 수지, 예를 들어 유기 이온 수지 또는 무기 이온 수지가 고려된다. 종종, 이들은 미립자이며, 보통으로 또는 고도로 가교된 유기 중합체이고, 종종 중합체 입자의 표면상에 다수의 강산성 기가 있는 폴리스티렌을 기재로 한다. 산성 기의 평균 개수는 통상적으로 이온 교환 수지의 1 내지 4 meq/ml 범위이다. 이온 교환 입자의 평균 입자 크기는 전형적으로 0.1 내지 1 ㎜의 범위이며, 이온 교환 장치의 치수에 따라서는 더 크거나 더 작은 입자 크기 또한 적합할 수 있다. 중합체 입자는, 예를 들어 겔상 또는 매크로다공성 구조일 수 있다.
이러한 이온 교환제는 공지되어 있으며, 일부가 아미노산의 정제용으로, 예를 들어 바이엘사(Bayer Aktiengesellschaft) 제조의 상품명 레바티트(Lewatit?) K 또는 레바티트? S, 예를 들어 레바티트? K 2629, 레바티트? S110, 레바티트? S110H, 레바티트? S1467, 레바티트? S1468, 레바티트? S2568, 레바티트? S2568H; 룀 앤드 하스(Rohm & Haas) 제조의 상품명 암베르제트(Amberjet?), 암베를리스트(Amberlyst?) 또는 암베를라이트(Amberlite?), 예를 들어 암베르제트? 1200, 암베르제트? 1500, 암베를라이트? 200, 암베를라이트? 250, 암베를라이트? IRV120, 암베를라이트? IR 120, 암베를라이트? IR 200C, 암베를라이트? CG 6000, 암베를리스트? 119 웨트(Wet); 다우 케미칼스(Dow Chemicals) 제조의 상품명 다웩스(Dowex?), 예를 들어 다웩스? 50X1-100, 다웩스? 50X2-100, 다웩스? 50X2-200, 다웩스? 50X2-400, 다웩스? 50X4-100, 다웩스? 50X4-200, 다웩스? 50X4-400, 다웩스? 50X8-100, 다웩스? 50X8-200, 다웩스? 50X8-400, 다웩스? 40X1-100, 다웩스? 40X1-100, 다웩스? 40X1-100, 다웩스? HCR-S, 다웩스? HCR-W2, 다웩스? MSC-1, 다웩스? 650C, 다웩스? G26, 다웩스? 88, 다웩스? 모노스피어(Monosphere) 88, 다웩스? 모노스피어 99K/320, 다웩스? 모노스피어 99K/350, 다웩스? 모노스피어 99Ca/320, 다웩스? 마라톤(Marathon) C, 다웩스? 032, 다웩스? 406, 다웩스? 437, 다웩스? C500ES, 다웩스? XUS 43518, 다웩스? XUS 40406.00; 미쯔비시사(Mitsubishi Corp.) 제조의 상품명 다이아이온(Diaion?), 예를 들어 다이아이온? SK1B, 다이아이온? SK1BS, 다이아이온? SK104, 다이아이온? SK112, 다이아이온? SK116, 다이아이온? 1-3561, 다이아이온? 1-3565, 다이아이온? 1-3570, 다이아이온? 1-3573, 다이아이온? 1-3577, 다이아이온? 1-3581, 듀올라이트(Duolite?) D 5427, 듀올라이트? D 5552 (유기 기재 양이온 교환제), 및 어드소르보스피어(Adsorbosphere?) SCX, 바커본드(Bakerbond?) SCX, 파르티실(Partisil?) SCX, 스피어리소르브(Spherisorb?) SCX, 수펠코실(Supelcosil?) LC3-SCX, 울트라실(Ultralsil?) SCX 및 조르박스(Zorbax?) 300 SCX (실리카 기재 양이온 교환제)으로 시판된다.
양이온 교환 장치는 배치식으로 작동될 수 있으며, 이때 1개 이상, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 직렬연결된(연속적으로 연결된) 정지상 이온 교환 고정층을 갖는다. 또한, 양이온 교환 장치는 연속식으로 작동될 수 있으며, 이때, 예를 들어 "실질(true) 이동층" 장치[참조: K. Tekeuchi J. Chem. Eng. Japan 11 (1978 pp. 216-220)], "연속 순환 환형(continuous circulating annular)" 장치 [참조: J.P. Martin, Discuss. Farraday Soc. 1949, p. 7], 또는 예를 들어 미국 특허 제2,985,589호, 국제 특허 공개 제01/72689호 및 문헌[G.J. Rossiter et al. Proceedings of AIChE Conference, Los Angeles, CA, Nov. 1991] 또는 문헌 [H.J. Van Walsem et al. J. Biochtechnol. 59 (1997) pp. 127-123]에 기재되어 있는 바와 같은 "모의 이동층" 장치의 구성성분일 수 있는 이온 교환층을 일반적으로 5 내지 50개, 특히 15 내지 40개를 갖는다.
본 발명에 따른 양이온 교환제를 산으로 전처리하기 전, 양이온 교환제는 그의 염의 형태, 즉 양이온 교환제의 강산성 기가 탈양성자화된 형태이며, 배위하여 상응하는 개수의 양이온에 전하 중성을 부여한다. 일반적으로, 양이온은 알칼리 금속 양이온, 특히 나트륨이온, 또는 특히 바람직하게는 암모늄 이온 (NH4 +)이다.
본 발명에 따라 약한 수성 산으로 전처리한 결과, 이러한 양이온의 일부가 용출되고 동등한 수의 산성 기가 재양성자화되어, 양이온 교환제 상에는 산성 기 뿐만아니라 염기성 기가 존재한다. 그 결과 염기성 아미노산에 대한 이온 교환제의 결합 용량이 증가되고, 이에 따라 이온 교환 장치의 용량이 증가되는 것으로 생각된다. 용출/재양성자화 공정은 전처리하는 동안 양이온 교환제에 흐르는 수용액의 pH를 통해 모니터링될 수 있다. 본 발명에 따라서, 유출액의 pH(25℃에서 측정됨)가 4.5 내지 7의 범위, 특히 5 내지 6.6의 범위일 때, 목적하는 전처리의 정도가 달성된다.
전처리를 위해, 원칙적으로 모든 공지된 수성 산의 묽은 용액이 사용될 수 있다. 물론, 이러한 산은 바람직하게 용출액으로부터 염기성 아미노산의 생성을 방해하지 않는 방식으로 선택된다. 산이 단리하려는 염기성 아미노산이 아닌 경우, 이러한 산은 양이온 교환제에 의해 흡착되지 않거나 단지 매우 미약한 정도로 흡착되는 것이 바람직하다. 적절한 것들은 무기산, 예컨대 황산, 염산, 질산 및 인산, 바람직하게 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 유기 카르복실산 예컨대, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 일반적으로 2 내지 4개의 카르복실기, 및 적절한 경우, 히드록시기를 갖는 폴리카르복실산, 예컨대 말레산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 시트르산 등, 히드록시카르복실산, 예컨대 락트산 및 글리콜산, 술폰산, 및 양성자화된 형태로 단리되는 아미노산, 예를 들어 전술한 염기성 아미노산의 1가 및 2가 양이온이다. 바람직한 산은 우선 pKa가 4 미만인 산, 특히 포름산 및 황산이고, 다음으로는 1가 양이온의 형태의 단리하려는 염기성 아미노산이다.
수용액 중 산의 농도는 통상적으로 1 내지 85 g/l, 특히 2 내지 40 g/l이다. 이것이 염기성 아미노산과 상이한 산인 경우, 목적하는 효과를 달성하기 위해 필요한 산의 양은 통상적으로 양이온 교환제의 0.01 내지 0.2 mol/l, 특히 0.02 내지 0.1 mol/l이다. 전처리에 사용되는 산이 염기성 아미노산, 예를 들어 단리하려는 염기성 아미노산인 경우, 산의 양은 바람직하게는 양이온 교환제의 0.3 내지 1.2 mol/l, 특히 0.5 내지 0.8 mol/l이다. 산 수용액의 양은 통상적으로 양이온 교환 장치 층의 총 부피의 0.7 내지 10배이다.
비유속(specific flow rate) SV, 즉 양이온 교환 장치에서 양이온 교환제의 총 부피(층 부피 BV)에 대한, 수성 산이 양이온 교환 장치를 통해 통과되는 평균 유량 V (부피 유량)의 비율은 덜 중요하며, 전형적으로 0.1 내지 5 h-1의 범위이다. 처리가 수행되는 온도는 전형적으로 10 내지 80℃, 특히 20 내지 70℃, 특히 30 내지 60℃이다. 처리는 산 수용액이 양이온 교환 장치의 컬럼(들)을 통해 기부에서 상부로 통과하는 상승 방식 뿐만 아니라, 산 수용액이 양이온 교환 장치의 컬럼(들)을 통해 상부에서 기부로 통과하는 하강 방식으로도 수행될 수 있다.
그 다음, 이렇게 전처리된 양이온 교환제는 생물량이 없는 수성 발효액을 양이온 교환 장치를 통해 통과시킴으로써 염기성 아미노산으로 로딩된다. 로딩은 하강 방식 뿐만 아니라 상승 방식으로도 수행될 수 있으며, 전자가 바람직하다. 로딩은 바람직하게는 0.1 h-1 내지 2 h-1 범위의 비유속으로 수행된다. 로딩은 바람직하게는 20 내지 70℃, 특히 30 내지 60℃ 범위의 온도에서 수행된다. 수성 발효액의 양은 통상적으로 수성 발효액 중의 염기성 아미노산이 60％ 이상, 특히 65％ 이상 흡착되도록 선택된다. 수성 발효액의 양은 일반적으로 층 부피의 0.5 내지 2배의 양이다. 흡착 정도에 따라, 양이온 교환 장치의 배출구에서 생성되는 유출액은 여전히 염기성 아미노산을 포함할 수 있기 때문에, 적절한 경우 pH의 조정 후, 유출액을 실시태양 A 또는 B에 따라 전처리에 사용할 수 있다. 그러나, 통상적으로 pH 조정은 필요하지 않다.
로딩 공정 후에 세척 단계가 이어질 수 있다. 이를 위해, 물, 예를 들어 공정수를 양이온 교환 장치에 통과시킨다. 세척수의 양은 이 단계에서 통상적으로 층 부피의 0.05 내지 0.3배이다. 생성된 세척수는 통상적으로 불순물을 포함하며, 폐기된다. 이는 또한 소량의 염기성 아미노산을 포함할 수 있으며, 그 다음 로딩시 생성되는 유출액과 합해질 수 있다.
로딩 단계, 또는 적절한 경우에 수행되는 세척 단계 후에, 염기성 아미노산의 용출이 이어진다. 이를 위해, 염기의 수용액(용출제)을 양이온 교환 장치에 통과시킨다. 그 결과, 염기성 아미노산이 탈착되고, 용출되며, 양이온 교환제가 재생된다. 즉, 양이온 교환제의 산성 기가 다시 염의 형태로 전환된다. 용출제 중 염기 농도는 통상적으로 1 내지 10 중량％, 특히 2 내지 8 중량％의 범위이다. 적절한 염기로는, 예를 들어, 암모니아, 알칼리 금속 수산화물 및 알칼리 금속 카르보네이트가 있으며, 수산화나트륨 용액 및 특히 암모니아가 바람직하다. 수성 염기의 양은 일반적으로 층 부피의 0.5 내지 3 배이다. 온도 및 유량에 대해서는 로딩과 관련하여 상기한 온도 및 유량이 적용된다. 용출은 상승 방식 뿐만 아니라 하강 방식으로도 수행될 수 있다. 용출은 바람직하게는 로딩 방향과 동일한 방향으로 수행된다.
용출 후, 적절하다면 존재하는 불순물을 제거하기 위한 추가의 세척 단계가 이어질 수 있다. 이를 위해, 물을 양이온 교환 장치에 통과시킨다. 이 단계에서 세척수의 양은 통상적으로 층 부피의 0.2 내지 1.3배이다. 세척 단계에서 생성되는 유출액은 염 로딩이 낮은 폐수로서 통상적인 폐수 처리 단계, 또는 다른 후처리 단계로 공급된다.
용출로 생성되는 용출액은 아미노산을 제조하기 위한 통상적인 방식으로 후처리된다. 일반적으로, 이를 위해, 예를 들어 통상적인 증발 장치에서 물을 제거함으로써 용출액을 농축한다.
이러한 방식으로 염기성 아미노산의 농축 수용액이 수득되며, 이로부터 염기성 아미노산이 예를 들어 염산의 첨가 후 침전 또는 결정화에 의해 히드로클로라이드로 단리될 수 있다. 이를 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌(예를 들어, 문헌 [Hermann, T. Industrial Production of amino acids by coryneform bacteria, J. of Biotechnology, 104(2003), 155-172])에 널리 기재되어 있다.
농축으로 생성되는 수성 응축액은 폐기되거나 공정으로 재순환될 수 있다. 예를 들어, 응축액은 차후 아미노산 분리시 염기성 아미노산의 용출 단계로 재순환될 수 있다. 바람직하게는, 이를 위해, 응축액은, 수성 염기로 용출된 후, 양이온 교환 장치에 통과시킨다. 생성된 유출액은 종종 소량의 염기성 아미노산을 여전히 포함하며, 통상적으로 차후 아미노산 분리의 용출로 재순환된다.
본 발명은 하기 두 개의 바람직한 실시태양을 참고로 보다 상세하게 기재된다.
본 발명의 바람직한 제1 실시태양(실시태양 A)에서, 양이온 교환제의 전처리를 위하여, pH가 4.5 내지 7.5의 범위인 단리될 염기성 아미노산의 수용액이 사용된다. 바람직하게는, 수용액 중 염기성 아미노산의 농도는 1 내지 85 g/l, 특히 2 내지 40 g/l의 범위이다. 목적하는 효과를 달성하기 위해 필요한 염기성 아미노산의 양은 통상적으로 양이온 교환제의 0.3 내지 1.2 mol/l, 특히 양이온 교환제의 0.5 내지 0.8 mol/l이다. 산 수용액의 양은 바람직하게 양이온 교환 장치의 총 층 부피의 0.7 내지 10배이다.
편리하게는, 염기성 아미노산의 수용액으로서, 비-흡착된 염기성 아미노산을 포함하는 선행하는 아미노산 분리로부터의 양이온 교환 장치의 로딩 유출액의 적어도 일부분이 사용된다. 다단계 양이온 교환 장치의 경우에서, 용액은 바람직하게 제1 단의 유출액의 적어도 일부, 예를 들어 50% 이상, 또는 총량을 포함한다.
물론, 실시태양 A에 따라 공정이 처음으로 수행될 때, 이러한 유출액은 아직 존재하지 않는다. 따라서, 양이온 교환 장치를 앞서 시동해야 한다. 이를 위해, 생물량을 분리한 후 수득되는 수성 발효액을 양이온 교환 장치, 즉 염기성 아미노산이 로딩된 양이온 교환제를 통해 통과시킨다. 생성된 유출액은 통상적으로 흡착된 염기성 아미노산을 포함하지 않고, pH가 상기-특정된 한도 내에 있다. 그 다음, 생성된 유출액은 양이온 교환 장치를 전처리하는데 사용될 수 있다.
도 1a 및 1b는 시동 공정의 바람직한 실시태양의 개별 유출액을 나타낸다. 우선, 생물량을 분리한 후 수득되는 발효액 FB를 양이온 교환 장치를 통해 통과시킨다(도식적으로 나타냄). 유출액의 제1 부분을 LDWW(저밀도 폐수)라 하며, 이는 이온 교환제의 "자유 부피"에 상응하고; 유출액의 제2 부분은 유출액 1(1)으로 수집된다. 이어서, 양이온 교환 장치를 다시 유출액 1(1)으로 충전한다. 유출액의 제1 부분을 LDWW로 분리하고, 제2 부분을 유출액 1(2)로 분리한다. 후속적으로, 발효액 FB로의 로딩을 수행하고, 유출액을 유출액 2(2)로 분리한다. 다음 단계에서, 양이온 교환 장치를 차례로 유출액 1(2), 유출액 2(2), 발효액 FB로 충전한다. 유출액 1(2)로 충전하는 동안에 배출구에서 LDWW 외에 HDWW 또한 생성된다. 이후, 암모니아수 (예를 들어, 6% NH3)로 용출을 수행한다. 염기성 아미노산을 포함하는 생성된 용출액 1은 증발 장치(나타내지 않음)에서 응축액 및 아미노산 농축물로 분리된다. 암모니아수(예를 들어, 6% NH3) (배출구에서 그로부터 다시 용출액 1(2)이 생성됨), 이어서 증발 단계의 응축액으로 다시 충전한다. 생성된 유출액은 용출액 2(2)라 하고, 다음 단계에서 이온 교환제에 통과시키는 암모니아수를 생성하는데 사용된다. 생성된 용출액 1(2)는 증발기 장치에서 응축액 및 아미노산 농축물로 다시 분리되고, 생성된 응축액을 이온 교환제(유출액: 용출액 2(3))에 다시 통과시킨다. 그 다음, 양이온 교환 장치를 정제하기 위해 물로 세척하고 LDWW로서 공급되는 유출액을 처리 또는 후처리 한다.
도 2는 실시태양 A의 바람직한 고안의 개별 유출액을 나타낸다. 우선, 시동 공정의 유출액 1 (또는 실시태양 A의 선행 공정의 유출액 1(n-1))을 양이온 교환 장치를 통해 통과시키고, LDWW, 이어서 HDWW로 공급되는 생성된 유출액을 처리 또는 후처리 한다. 그 다음, 시동 공정의 유출액 2(또는 실시태양 A의 선행 공정의 유출액 2(n-1))를 양이온 교환 장치를 통해 통과시킨다. 유출액을 유출액 1(n)으로 수집하고, 다음 단계에서 유출액 1(n+1)에 상응하는 아미노산 분리 시점에 공급한다. 그 후, 발효액으로부터 생물량을 분리한 후 수득된 수성 발효액 FB를 양이온 교환 장치를 통해 통과시킨다. 유출액을 유출액 2(n)으로 수집하고, 다음 단계에서 유출액 2(n+1)에 상응하는 아미노산 분리 시점에 공급한다. 그 후, 용출은 시동 공정 또는 선행 단계로부터 생성된 용출액 2(n-1)을 사용하여 수행되며, 이들은 6% 암모니아수로 구성된다. 이로부터 증발기 장치(나타내지 않음)에서 응축액 및 아미노산 농축물로 분리되는 용출액 1(n)이 생성된다. 응축액을 다음 단계에 공급한다. 추가 용출 단계로서, 시동 공정 또는 선행 단계의 응축액, 용출액 1(n-1)을 이온 교환제에 가하고 유출액을 용출액 2(n)으로 수집하며, 이는 후속 단계용 6% 강도 암모니아수로 구성된다. 그 다음, 양이온 교환 장치의 정제를 위해, 물로 세척하고, LDWW로 공급되는 유출액을 처리 또는 후처리한다.
본 발명의 바람직한 실시태양 B에서, 양이온 교환제의 전처리를 위하여, pKa 가 4 이하인 산의 묽은 수용액이 사용된다. 바람직한 산은 포름산, 인산, 염산, 및 특히 황산, 및 이들 산의 혼합물이다.
바람직하게는, 묽은 산 수용액의 산 농도는 1 내지 20 g/l의 범위이다. 목적하는 효과를 달성하기 위해 필요한 산의 양은 통상적으로 양이온 교환제의 0.01 내지 0.1 mol/l이다. 산 수용액의 양은 바람직하게는 양이온 교환 장치의 총 층 부피의 0.7 내지 2배이다.
실시태양 B의 바람직한 고안에서, 묽은 산 수용액으로 처리한 후, 90% 이상의 염기성 아미노산이 단일-양성자화된 형태로 존재하는 염기성 아미노산의 묽은 수용액으로의 처리를 수행한다. 이러한 용액의 pH는 통상적으로 4.5 내지 7의 범위이다. 바람직하게는, 수용액 중 염기성 아미노산 농도는 8 내지 70 g/l, 특히 8 내지 50 g/l의 범위이다. 염기성 아미노산의 수용액의 양은 바람직하게는 양이온 교환 장치의 총 층 부피의 0.1 내지 1배이다.
실시태양 B의 추가의 바람직한 고안에서, 우선 pKa가 4 이하인 산의 묽은 수용액의 일부만으로 처리를 수행한 다음, 염기성 아미노산의 90% 이상이 단일-양성자화된 형태로 존재하는 염기성 아미노산의 묽은 수용액을 사용하여 처리를 수행한다. 상기 언급한 농도 및 pH에 관하여 유사하게 적용한다. 염기성 아미노산의 수용액의 양은 바람직하게는 양이온 교환 장치의 총 층 부피의 0.1 내지 1배이다. 여기서 또한, 편리하게는, 염기성 아미노산의 수용액으로서, 비-흡착된 염기성 아미노산을 포함하는 선행하는 아미노산 분리로부터 양이온 교환 장치의 로딩의 유출액의 적어도 일부분이 사용된다. 염기성 아미노산의 수용액으로 처리한 후, 이어서 일반적으로 pKa가 4 이하인 산의 묽은 수용액의 잔류 양으로 처리한다.
실시태양 B의 양이온-교환 장치의 처리에서 생성되는 유출액은 일반적으로 폐수 처리에 공급된다. 폐수 및 용출액 및 응축액의 재생과 관련하여, 실시태양 A에서 전술한 것과 유사하게 적용한다.
본 발명의 방법은 원칙적으로 모든 염기성 아미노산, 특히 천연 아미노산, 예컨대 리신, 오르니틴, 히스티딘 또는 아르기닌의 단리에 적용가능하며, 특히 발효에 의해 생성되는 L-리신의 단리에 사용된다.
아미노산의 제조에 사용되는 발효 공정 및 미생물 균주의 유형이 본 발명의 방법에 있어서 아무런 제한을 가하지 않으며, 따라서 본 발명의 방법은 임의의 목적하는 발효액으로부터 염기성 아미노산을 단리하는데 적절하다.
일반적으로, 이러한 방법은 목적하는 염기성 아미노산을 생산하는 미생물 균주가 기질로서 1종 이상의 탄소원 (예를 들어, 당밀 및/또는 원당) 및 질소원 (예를 들어, 암모니아 또는 암모늄 술페이트와 같은 암모늄 염), 및 적절한 경우, 미네랄 및 미량 원소를 포함하는 발효 매질 중에서 배양되는 것이다. 이러한 기질 구성성분은 그 자체 또는 복합 혼합물의 형태, 예를 들어 옥수수 침출액으로 사용될 수 있다.
미생물 균주의 유형은 제조하고자 하는 아미노산의 유형에 따라 맹백하게 좌우된다. 일반적으로, 이는 목적하는 염기성 아미노산을 과잉생산하는 균주이다. 이는 L-리신 및 히스티딘의 경우에, 일반적으로 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 또는 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) 종의 균주이며, 아르기닌의 경우에는 바실루스 숩틸리스(Bacillus subtilis) 또는 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 종의 균주이지만, 최근에는 다른 종의 균주도 사용된다.
일반적으로, 발효는 발효액 중 염기성 아미노산의 함량이 50 내지 200 g/l, 특히 80 내지 150 g/l의 범위일 때까지 수행한다. 생물량, 즉 미생물 (생물건조량으로서) 및 생물 기원의 다른 불용성 구성성분 (예를 들어, 글루코오스원으로부터의 셀룰로오스 섬유)의 함량은, 통상적으로 3 내지 7 중량％의 범위이다. 또한, 발효액은 일반적으로 잔여량의 기질, 예를 들어 소비되지 않은 당 및 발효의 부산물, 예를 들어 산성 또는 중성 아미노산 또는 다른 염기성 아미노산, 펩티드 등을 추가로 포함한다.
발효 방법은 연속식 또는 배치 또는 공급배치(fed-batch) 방법의 배치식으로 수행될 수 있다. 일반적으로, 본 방법은 공급배치 방법, 즉, 대부분의 기질이 발효 과정 중에 미생물 함유 발효액으로 공급되는 방법에 의해 제조되는 발효액에 관한 것이다.
이러한 방법 및 적절한 미생물 균주는 예를 들어 서두에 인용한 종래기술 (특히, 문헌[Pfefferle et al.; Th. Herrmann] 참조), 및 국제 특허 공개 제95/16042호, 제96/06180호, 제96/16042호, 제96/41042호, 제01/09306호, 유럽 특허 EP-A 제175309호, 제327945호, 제551614호, 제837134호, 미국 특허 제4346170호, 제5305576호, 제6025165호, 제6653454호, 독일 특허 제253199호, 영국 특허 제851396호, 제849370호 및 제1118719호 (L-리신의 제조 방법); 유럽 특허 EP-A 제393708호, 영국 특허 제1098348호, 미국 특허 제3668072호, 제3574061호, 제3532600호, 제2988489호, 일본 특허 제2283290호, 제57016696호 (L-오르니틴); 미국 특허 제3902967호, 제4086137호, 영국 특허 제2084566호 (아르기닌); 미국 특허 제3875001호 및 제3902966호 (히스티딘)로부터 당업자에게 공지되어 있다.
이러한 발효를 기술적으로 수행 및 제어하기 위한 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 관련 문헌, 예를 들어 문헌 [Storhas (상기 참조); J.E. Bailey et al. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd ed. MacGraw-Hill 1986, Chapter 9]에서 찾을 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법의 바람직한 실시태양을 나타내는 하기 도면 및 실시예와 비교예에 의해 설명될 것이나, 이로써 본 발명이 제한되는 것으로 이해되어 서는 아니된다.
도 1a 및 1b는 실시태양 A의 시동 공정의 개별 방법 단계(도 1a: 로딩; 도1b: 탈착)를 나타낸 것이다.
도 2는 실시태양 A의 개별 방법 단계를 도식적으로 나타낸 것이다.
사용되는 약어
FB 발효액
HDWW 고밀도 폐수
LDWW 저밀도 폐수
ID 내부 지름
H 높이
Lys-HCl L-리신 모노히드로클로라이드
BV 층 부피 (장치 내 양이온 교환제의 부피)
SV 비유속 (1 [m3 Feed/(m3 resinh)]에서의 유속, 이하 단위는 [h-1]로 축 약함)
사용되는 물질
모든 실험을 코리네박테리움 글루타미쿰의 발효에 의해 그 자체로 공지되어 있는 방식으로 제조한 L-리신 함유 발효액을 사용하여 수행하였다. 발효액은 Lys-HCl의 함량이 110 내지 130 g/l이었으며, 생물량 (생물건조물질로서 계산됨)의 함량이 2.5 내지 3.5 중량％이었다. 염 함량은 3 내지 5 중량％이었다.
양이온-교환 장치
비교예 1 및 실시예 1, 2 및 6에서, 강산성 양이온 교환 수지 400 ml가 로딩된 치수 25 ㎜(ID)×1200 ㎜(H)의 원통형 컬럼을 양이온 교환 장치로 사용하였다. 양이온 교환제로서, 평균 입자 크기가 약 0.6 ㎜이며 전체 용량이 2 meq/ml 초과인 겔 유형의 술폰화 가교 폴리스티렌(바이엘사(Bayer Aktiengesellschaft) 제조의 레바티트(Lewatit?) S 1468)을 사용하였다. 양이온 교환 장치를 사용하기 전에 6 중량％ 강도의 수성 암모니아로 평형화하였다.
실시예 3 및 4에서는, 치수 33 mm(ID)×1000 mm(H)의 30개의 원통형 컬럼이 있는 "유사 이동층" 유형의 양이온 교환장치(미국 AST 제조의 "L 100 C" 유형)를 사용하였고, 이때 챔버는 강산 이온 교환제 총 18 l로 충전하였다(바이엘사(Bayer Aktiengesellschaft) 제조의 레바티트(Lewatit?) S 1468 유형).
실시예 5에서는, 양이온 교환 장치로서 강산성 양이온 교환 수지 600 ml로 충전되어 있는 치수 35 mm(ID)×900 mm(H)의 원통형 컬럼을 사용하였다(레바티 트(Lewatit?) S 1468).
실시예 7에 사용된 양이온 교환 장치는 각각 강산성 양이온 교환 수지 845 ml로 충전되어 있는 치수 35 mm(ID)×900 mm(H)의 9개의 직렬연결된 원통형 컬럼을 포함한다 (일본 미쯔비시사 제조의 "다이아이온(Diaion?) SK 1 B").
모든 양이온 교환 장치는 처음으로 사용하기 전에 6 중량％ 강도의 수성 암모니아로 평형화하였다.
비교예 1
리신 함량이 12.5 중량％이며 생물량 함량이 3 중량％인(생물건조량으로서) 발효액을 Lys-HCl 1g 당 진한 황산 0.7 g을 사용하여 pH 1.5로 산성화하였다. 이어서 산성화된 발효액을 45℃의 온도에서 양이온 교환 장치를 통해 통과시켰다. 생성된 유출액을 수집하고, HDWW로서 처리하였다. 그 다음, 양이온 교환 장치를 물로 세척하였다. 생성된 유출액을 LDWW로서 처리하였다. 후속적으로, L-리신을 Lys-HCl 1g 당 암모니아 0.305 g의 양으로 6 중량% 강도의 수성 암모니아로 용출시켰다.
실시예 1
발효액을 가열하고, 45 내지 70℃의 온도에서 증기-멸균시켰다. 그 다음, 세포괴(cell mass)를 원심분리 및 디캔팅의 조합에 의해 제거하였다. 수성 잔여물의 리신 농도는 12.5 중량%이었다. 상등액의 pH는 6.5이었다.
다음으로, 리신 함량이 0.36 내지 8.45% w/v이고, pH가 4.5 내지 7.5인 선행 하는 리신 단리의 예비 단계로부터의 5개의 상이한 유출액으로 구성된 리신 수용액 총 2040 ml를 50℃에서 양이온 교환 장치를 통해 상승 방식으로 통과시켰다. 전처리의 말기에서의 유출액 pH는 5.8이었다. 그 다음, 원심분리 후의 상등액 416 ml를 55℃에서 양이온 교환 장치를 통해 상승 방식으로 통과시켜 전처리하였다. 생성된 유출액을 전처리를 위하여 하기 실시예 중 하나에서 사용하였다. 후속적으로, 그로부터 하행하는 6 중량% 강도의 암모니아 수용액 600 ml를 사용하여 리신을 용출시켰다. 생성된 리신 수용액을 통상적인 방식으로 결정화시킬 수 있었다.
실시예 2
실시예 2의 방법은 실시예 1과 유사한 방식으로 수행되었으나, 실시예 1과 달리, 전처리를 위하여 리신 함량이 0.28 내지 3.3% w/v이고 pH가 6.3 내지 6.7인 선행하는 리신 단리의 예비 단계로부터의 3개의 상이한 유출액으로 구성된 리신 수용액 1248 ml를 양이온 교환 장치를 통해 상부에서 하부로 통과시키고, 이어서 원심분리의 상등액으로 후속적 로딩을 유사하게 하강 방식으로 수행하였다. 전처리의 말기에서 유출액의 pH는 6.5이었다.
실시예 3
발효액을 가열하고 45 내지 70℃에서 증기를 도입시켜 멸균하였다. 그 다음, 세포괴를 원심분리에 의해 분리하였다. 생성된 상등액의 리신 농도는 12.5중량%이었으며, pH는 7.2이었다.
전처리를 위하여, 리신 함량이 0.36 내지 8.45 중량% w/v이고, pH가 4.5 내지 7.5인 리신 수용액 55.1 l를 55℃에서 5.5 l/h의 유량으로 양이온 교환 장치를 통해 상부로 통과시켰다. 전처리의 말기에서 유출액의 pH는 5.8이었다. 후속적으로, 원심분리에서 수득된 상등액 9 l를 55℃에서 5.5 l/h의 유량으로 양이온 교환 장치를 통해 상부로 통과시켰다. 후속적으로, 6 중량% 강도의 암모니아 수용액 총 10.8 l를 사용하여 55℃에서 5.5 l/h의 유량으로 하향의 용출을 수행하였다.
실시예 4
실시예 4는 실시예 3과 유사한 방식으로 수행되었으나, 전처리를 위하여, 오직 선행하는 리신 단리의 예비 단계로부터의 3개의 상이한 유출액으로 구성된 리신 수용액 33.7 l를 리신 함량이 0.28 내지 3.3% w/v이고, pH가 6.3 내지 6.7에서 양이온 교환 장치를 통해 하향 통과시켰다. 전처리의 말기에서 유출액의 pH는 6.5이었다. 로딩은 원심분리 상등액 총 10.8 l를 사용하여 하향으로 수행하였다.
실시예 5
발효액을 가열하고 45 내지 70℃에서 증기를 도입시킴으로써 멸균시킨 다음, 원심분리기로 옮겼다. 이러한 방식으로, 여전히 세포 물질 0.5 부피%를 포함하는, 리신 함량이 118.3 g/l이고, pH가 6.7인 수성 리신 함유 상등액을 수득하였다.
40 내지 50℃에서, 비유속 SV = 1h-1로, 연속하여 0.44 중량% 강도의 황산 수용액 240 ml, pH가 5인 2,344 중량% 강도의 리신 수용액 500 ml, 그 다음 0.44 중량% 강도의 황산 수용액 180 ml를 양이온 교환 장치를 통해 통과시켰다. 유출액의 pH는 5.2이었다. 그 후, 상기 온도를 유지하면서 SV = 1h-1의 유속으로 수성 리신 함유 상등액 480 ml, 이어서 물 120 ml를 이온 교환제를 통해 통과시켰다. 유 출액을 분리해 내고, 다음 단계에서의 전처리를 위해 준비하였다. 그 다음, 55℃에서 SV = 1h-1로 4 중량% 강도의 암모니아 수용액 650 ml, 이어서 물 720 ml를 양이온 교환 장치를 통해 통과시켰다.
실시예 6
발효액을 가열하고 45 내지 70℃에서 증기를 도입시킴으로써 멸균시키고, 이어서 원심분리기로 옮겼다. 이러한 방식으로, 여전히 세포 물질 0.5 부피%를 포함하는, 리신 함량이 121 g/l이고, pH가 6.7인 수성 리신 함유 상등액을 수득하였다.
40 내지 50℃에서, 비유속 SV = 1.0로, 연속하여 0.44 중량% 강도의 황산 수용액 160 ml, pH가 5인 1.23 중량% 강도의 리신 수용액 350 ml, 이어서 0.44 중량% 강도의 황산 수용액 120 ml를 양이온 교환 장치를 통해 통과시켰다. 유출액의 pH는 5.2이었다. 그 후, 상기 온도를 유지하면서 SV = 1h-1의 유속으로 수성 리신 함유 상등액 320 ml, 이어서 물 80 ml를 이온 교환 장치를 통해 통과시켰다. 유출액을 분리해 내고, 다음 단계에서의 전처리를 위해 준비하였다. 그 다음, 55℃에서 SV = 1h-1로 4 중량% 강도의 암모니아 수용액 420 ml, 이어서 물 480 ml를 양이온 교환 장치를 통해 통과시켰다.
실시예 7
발효액을 가열하고, 45 내지 70℃에서 증기를 도입시킴으로써 멸균시키고, 이어서 원심분리기로 옮겼다. 이러한 방식으로, 여전히 세포 물질 0.5 부피%를 포함하는 리신 함량이 129.1 g/l이고, pH가 6.7인 수성 리신 함유 상등액을 수득하였 다.
40 내지 50℃에서, 유속 SV = 1 h-1로, 연속하여 0.66 중량% 강도의 황산 수용액 2300 ml, pH가 5인 0.882 중량% 농도의 리신 수용액 4800 ml, 이어서 0.66중량% 강도의 황산 수용액 1200 ml를 양이온 교환 장치를 통해 통과시켰다. 유출액의 pH는 5.2이었다. 그 후, 상기 온도를 유지하면서 SV = 1h-1에서, 수성 리신 함유 상등액 6200 ml, 이어서 물 1100 ml를 이온 교환 장치를 통해 통과시켰다. 유출액을 분리해 내고, 다음 단계에서의 전처리를 위해 준비하였다. 그 다음, 55℃에서 SV = 1h-1로 4 중량% 강도의 암모니아 수용액 6000 ml, 이어서 물 9100 ml를 양이온 교환 장치를 통해 통과시켰다.
결과를 표 1a 및 1b에 열거하였다. 리신 수율(%)를 하기식에 따라 계산하였다:
Figure 112007081794505-pct00001
식 중, mLys - HCl(용출액)은 용출액 중 Lys-HCl의 양 [g]이고; mLys - HCl(흡착)은 이온 교환제에 흡착된 Lys-HCl의 양 [g]이다.
실시예
 전처리를 위한
유출액
[수지의 리터
당 L]		 리신 공급량1 )
[수지의 리터당
Lys-HCl의 g]		 황산2 )
[g/g Lys-
HCl]
암모니아
[g/g Lys-
HCl] 		HDWW
[g/g Lys-HCl
용출액]		 리신 수율
[%]
C1 -- 210 0.7 0.305 20.5 97.5
1 5 270 - 0.33 11.8 97.5
2 3 150 - 0.6 12.7 97.8
3 3.1 270 - 0.13 11.8 97.5
4 1.9 150 - 0.24 12.7 97.8
1) 양이온 교환 수지 리터당 Lys-HCl의 중량부
2) 발효액을 산성화하기 위한 황산
실시예
 전처리를 위한
유출액
[수지의 리터
당 L]		 리신 공급
[수지의 리터당
Lys-HCl의 g]		 황산
[g/g Lys-
HCl]
암모니아
[g/g Lys-
HCl] 		HDWW
[ml/g (Lys-HCl 용출액)]		 리신 수율
[%]
5 0.83 105.8 0.029 0.4 13.2 96.8
6 0.88 107.6 0.029 0.39 12.2 97.3
7 0.63 110.9 0.027 0.28 10.8 97.5

Claims (20)

  1. a) 염기성 아미노산을 생산하는 미생물을 발효액으로부터 분리하는 단계, 및
    b) 단계 a)에서 수득된 발효액을 염 형태의 강산성 양이온 교환제의 단일 단계 또는 다단계 장치에 연속 로딩하고, 염기성 아미노산을 용출시킴으로써 단계 a)에서 수득된 수성 발효액으로부터 염기성 아미노산을 분리시키는 단계
    를 포함하며, 이 때 단계 b)에서 로딩하기 전, 수성 발효액의 pH가 4 내지 7.5의 범위이고, 양이온 교환 장치의 배출구에서, 수성산으로 전처리된 양이온 교환제의 pH가 4.5 내지 7의 범위가 되는 방식으로, 양이온 교환 장치의 적어도 제1 단계를 수성 산으로 전처리하는 것을 특징으로 하는, 염기성 아미노산을 생산하는 미생물 균주의 발효액으로부터의 염기성 아미노산의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 양이온 교환제를 pH가 4.5 내지 7의 범위인 염기성 아미노산의 수용액으로 전처리하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 염기성 아미노산의 수용액 중 염기성 아미노산의 농도가 1 내지 85 g/l 범위인 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 염기성 아미노산의 수용액으로서, 선행하는 아미노산 분리 단계로부터 양이온 교환 장치의 로딩 유출액의 적어도 일부분을 사용하는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 전처리에 사용되는 아미노산의 양이 처리되는 이온 교환제 리터 당 0.3 내지 1.2 몰인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 양이온 교환제를 pKa가 4이하인 묽은 산 수용액으로 처리하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 묽은 산 수용액의 산 농도가 1 내지 20 g/l의 범위인 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 처리에 사용되는 산 등가물의 양이 처리되는 이온 교환제 리터당 0.01 내지 0.1 몰인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 산이 황산, 포름산 또는 염산인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 묽은 산으로 처리한 후, 염기성 아미노산의 90% 이상이 단일-양성자화된 형태로 존재하는 염기성 아미노산의 묽은 수용액으로의 처리를 수행하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 염기성 아미노산의 묽은 수용액으로서, 선행하는 아미노산 분리 단계로부터 양이온 교환 장치의 제1단계 로딩 유출액을 사용하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 처리 전 이온 교환제의 산성 기가 암모늄 또는 나트륨 염 기의 형태로 존재하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 로딩 전 발효액의 pH가 산의 첨가에 의해 4.0 내지 6.0의 범위로 설정되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 염기성 아미노산을 수성 암모니아 또는 수산화나트륨 용액으로 용출하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 염기성 아미노산이 리신인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 양이온 교환 장치는 2~50개가 직렬연결된 양이온 교환 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 양이온 교환제를 30 내지 60℃ 범위의 온도에서 로딩하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 용출액으로부터의 결정화에 의한 염기성 아미노산의 단리 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 염기성 아미노산을 수성 암모니아로 용출하고, 용출액을 농축하고, 생성된 응축액을 차후 아미노산 분리 단계에서의 염기성 아미노산 용출에 전부 또는 부분적으로 재순환시키는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 로딩 및 용출을 하향으로 수행하는 것인 방법.
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