KR101240663B1

KR101240663B1 - 김치 유산균 및 열처리한 인삼배지를 이용하여 진세노시드 함량을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR101240663B1
Application number: KR1020110014777A
Authority: KR
Inventors: 이영경; 이영철; 홍희도; 최상윤; 신혜리
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2011-02-18
Publication date: 2013-03-11
Also published as: KR20120095234A

Abstract

본 발명은 김치 유산균 및 열처리한 인삼배지를 이용하여 진세노시드 함량을 증가시키는 방법에 대한 것으로서, 인삼을 포함하는 배지에 페디오코커스 속(Pediococcus sp .)을 추가한 후, 전처리하여 페디오코커스 속(Pediococcus sp .)의 생육을 증가시키고, 진세노시드 성분을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

김치 유산균 및 열처리한 인삼배지를 이용하여 진세노시드 함량을 증가시키는 방법{A METHOD OF INCREASING GINSENOSIDE USING KIMCHI LACTOBACILLUS AND HEAT-TREATED GINSAENG CULTURE MEDIUM}

본 발명은 김치 유산균 및 열처리한 인삼배지를 이용하여 진세노시드 함량을 증가시키는 방법에 대한 것이다.

진세노시드(Ginsenoside)는 인삼에 있는 사포닌을 일컫는 말이며, 사포닌은 화학적으로 배당체(glycoside)라 부르는 화합물의 일종이다. 이는 식물의 뿌리, 줄기, 잎, 껍질, 씨 등에 있는데 예전에는 비영양물질로 알려졌으나 최근 항암, 항산화, 콜레스테롤 저하효과가 밝혀지면서 생리활성물질로 각광받기 시작했다. 한방약에서는 강심제나 이뇨제로 사용되어 왔으며, 특히 인삼의 여러가지 유효성분중 주된 약리작용을 하는 것이 사포닌이다. 인삼 사포닌은 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 다른 특이한 화학구조를 가지고 있으며 약리효능도 특이하여 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 '진세노시드(Ginsenoside)'라 불린다.

진세노시드의 형태는 인체 내 흡수와도 밀접한 관련을 가진다. 인삼을 경구투여 했을 때 주요 사포닌의 흡수율은 매우 낮고, 진세노시드 Rb₁, 진세노시드 Rb₂는 위액에 의해 극소량만이 분해되어 장내에서 생물학적 이용 가능한 양은 진세노시드 Rb₁는 0.1-4.4%이며 진세노시드 Rb₂는 3.7%, 진세노시드 Rg₂는 1.9-18.4%로 당이 가수분해되어 분자량이 작을수록 이용률이 높은 것으로 나타났다(Leuconostoc fallax LH3이 생산하는 효소에 의한 Ginsenoside Rd의 Ginsenoside F₂ 로의 전환. 한국약용작물학회지, 16(3), 155-160). 한국인 98명의 장내 미생물에 의한 진세노시드 Rb₁ 대사 능력을 관찰한 결과에서 조사대상자의 20% 정도가 장에서 대사 능력이 없거나 다른 조사대상자와 비교하여 대사능력이 매우 떨어지는 것으로 나타났다(인삼과 건강. 도서출판 효일 대한민국. pp 33-47). 따라서 고분자 형태의 진세노시드에서 저분자 형태의 진세노시드로의 대사 능력은 개인에 따라 차이가 큰 것으로 볼 수 있다. 또한 실험 결과에 의하면 진세노시드의 최종 대사물질의 흡수율은 장내 미생물의 대사전환 능력에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다(Lee, J., Lee,E., Kim, D., Lee, J., Yoo, J., Koh,B(2009) ;Studies on Absorption, Distribution and Metabolism of Ginseng in Humans After Oral Administration. J.Ethnopharm., 122(1), 143-148). 또 다른 연구에서는 진세노시드 Rb₁을 흰쥐에 투여한 결과 혈액 중에서 진세노시드 Rb₁은 검출되지 않았고 진세노시드 Rb₁ 대사체인 화합물 K의 농도는 증가한 것으로 나타났다(김동현(2005); 인삼과 건강. 도서출판 효일 대한민국. pp 33-47). 따라서 최근에는 인삼을 장내 미생물 또는 유산균을 이용하여 발효하여 인삼 내 고분자 진세노시드를 저분자 진세노시드로 대사하여 인삼의 약리성분을 강화하는 방법 등이 사용되고 있다.

이와 관련하여, 홍삼추출물을 장내세균 (박테리오이드[Bacterioides]속 및 푸소박테리움[Fusobacterium]속) 및 유산균(비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 비피도박테리움 H-1 (KCCM 10493), 비피도박테리움 C-13 (경희대 약대김동현 교수실) 및 비피도박테리움 C-34 둥)을 이용하여 생물전환하는 방법이 개시되어 있다(한국 등록 특허 제 10-0688425호 참조). 한편, 유산균, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속세균 또는 accharomyses속세균을 홍삼 발효에 사용하여 수삼 사포닌의 생체 이용률을 증가시키는 방법도 개시되어 있다(한국 등록 특허 제 10-618171호 참조).

김치발효과정에 관여하는 유산균은 항균작용(Physicochemical Characteristics of Yogurt Prepared with Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi. Korean J. Food Culture. 20(3):337-340(2005)), 면역기능강화, 혈중 콜레스테롤 저하, 간 기능 항진작용, 항암작용, 항산화작용 등의 다양한 건강 증진 기능이 보고되고 있다. 최근에는 유산균 특징 중에 생균 활성제라는 기능적인 측면에 관심이 모아지고 있어 항균 활성이 있는 유산균에 대한 연구가 활발한 실정이다. 특히 김치에 함유된 유산균 중 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주는 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 헬리코박터피로리(Helicobacter pylori)등 의 균에 강한 항균 활성이 있는 것으로 알려져 있어 이에 대한 연구가 다양한 방법으로 진행되고 있다. 그러나 김치 유래 유산균인 페디오코커스 펜토사시우스를 발효시켜 진세노시드 함량을 증가시키는 방법은 알려진 바가 없다.

본 발명의 목적은, 김치 유래 유산균인 페디오코커스 펜토사시우스를 발효시켜 진세노시드의 함량을 증가 시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 일 구체예에서 인삼을 포함하는 배지상에서 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011(Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P) 유산균의 생육을 증가시키는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서 상기 구체예의 인삼은 70~100℃에서 전처리 한 것을 특징으로 하는 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 유산균의 생육을 증가시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서 상기 전처리 온도는 100℃임을 특징으로 하는 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 유산균의 생육을 증가시키는 방법을 제공한다.

일 구체예에서 인삼을 포함하는 배지상에서 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011(Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P) 유산균을 발효시켜서 진세노시드를 증가시키는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 인삼은 70~100℃에서 전처리 한 것을 특징으로 하는 진세노시드 성분을 증가시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 전처리 온도는 100℃임을 특징으로 하는 진세노시드 성분을 증가시키는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 70~100℃에서 전처리 한 인삼을 포함하는 배지상에 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011(Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P) 유산균을 발효시켜 진세노시드 Rh₂를 생성시키는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 전처리 온도는 100℃인 것을 특징으로 하는 진세노시드 Rh₂ 성분을 생성시키는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011(Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P)유산균을 제공한다.

본 발명에서, “진세노시드"는 이에 한정되지는 않으나, 하기 표 1에서 열거하는 것을 포함한다. 또한 이의 성분들 및 그의 약리학적 효능은 하기 표 1에서 보는 바와 같다.

진세노시드	약리작용
진세노시드 - Ro	항염증 작용, 혈소판 응집억제, 항트롬빈 작용 및 선용활성화 작용
진세노시드 - Rb ₁	중추억제 및 정신안정 작용, 중추성 섭식 억제작용, 공격성 행동억제, 진통작용, 항경련작용
진세노시드 - Rb ₂	당 및 지방대사 촉진, 항당뇨 작용, ACTH,cAMP, epinephrine유도 지방분해 억제작용, 질소대사 평형 유지작용
진세노시드 - Rc	진통작용, 코티코스테론 분비 촉진작용, PGI2 생성 촉진작용, 간, 혈청콜레스테롤,RNA 합성촉진작용
진세노시드 - Rd	부신피질 자극 호르몬, 코티코스테론 분비 촉진 작용, mesenchyme 세포증식 억제(신장사구체 비대억제)
진세노시드 - Re	부신피질 자극 호르몬, 코티코스테론 분비 촉진, 골수세포의 DNA,RNA, 단백질, 지질합성 촉진 작용
진세노시드 - Rf	통증억제 작용, 지질과산화 억제작용, 알코올유도 뇌발육 장해 방어작용
진세노시드 - Rg ₁	면역기능 증강작용, 혈소판 응집억제, 항트롬빈, 선용활성화 작용, 기업 및 학습기능 증진작용
진세노시드 - Rg ₂	혈소판 응집억제, 항트롬빈, 선용활성화 작용, 기억감퇴 개선, 평활근세포 증식억제작용
진세노시드 - Rg ₃	암세포전이 억제작용, 혈소판 응집억제 및 항혈전작용, 실험적 간 상해 억제작용, 혈관이완 작용, 항암제의 내성 억제작용
진세노시드 - Rh ₁	실험적 간 상해 억제 작용, 조양세포(F9 cells)분화촉진, 혈소판 응집억제 및 선용활성화 작용
진세노시드 - Rh ₂	암세포증식 억제작용, 암세포 재분화유도 촉진작용, 암세포 침윤 억제작용, 종양증식 억제작용(in vivo)
화합물 K	암세포 증식 억제, 암세포 재분화 유도 촉진, 암세포 침윤 억제, 종양증식 억제작용
20(S)-프로토파낙사디올	면역 조절 작용
20(S)-프로토파낙사트리올	면역 조절 작용

김치 유래 유산균인 페디오코커스 펜토사시우스에 의한 발효를 통하여 진세노시드 전환율을 증가시켰으며, 이의 효소활성 및 당대사 능력 측정을 통해 인삼의 진세노시드의 대사경로에 관한 정보를 수득할 수 있다.

도 1은 고성능 액체 크로마토그램을 통해 진세노시드 분획 변화를 나타낸 것으로, (A)는 11가지 진세노시드의 표준폼을 나타낸 것이고, (B)는 인삼발효 전의 진세노시드 분포를 나타것이며. (C)는 LY-011을 이용한 인삼 발효 후의 진세노시드 분포를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예1 : 진세노시드를 대사하는 균주의 선별

<김치로부터 균주의 동정>

배추김치국물을 취하여 멸균된 식염수에 십진법으로 희석하였다. 희석액을 비엘 평판(BL agar)배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 여기서 자란 콜로니 중 초콜렛색 환을 내포하는 30여종의 유산균 특이 콜로니를 분리하였다.

<인삼 진세노시드 균주의 선별>

분리된 유산균을 5°bx 인삼 추출액 배지에 접종하여 1차로 고농도에서도 생육가능한 균주를 선별하였다. 2차로는 균주가 자라난 인삼 추출액 배지는 부탄올 분획을 분리해 박막크로마토그램을 통해 진세노시드 대사 정도를 확인하였다. 박막크로마토피의 전개는 실리카겔 플레이트(60F_254,Merck, 독일)을 사용하였으며, 전개용매로는 클로로포름:메탄올:증류수를 65:35:10의 하층액을 사용하였다. 5% 황산으로 발색 후 10분간 105℃의 드라이 오븐에서 반응시켜 진세노시드 분포 변화를 관찰하였다(표 2).

균주 번호	진세노시드 대사 확인
LY-003	○
LY-004	X
LY-007	X
LY-008	X
LY-011	◎
LY-013	○
LY-018	X
LY-019	○
LY-022	X
LY-025	X
LY-026	X
LY-029	X
LY-031	○
LY-032	X

(X-대사미흡, ○-우수, ◎-매우 우수)

박막 크로마토그램을 통해 대사확인된 균주 중에서 대사가 가장 탁월하게 이루어진 LY-011 균주를 이용한 인삼 추출액 발효물에 대해서는 고성능 액체 크로마토그램(HPLC)를 통해 진세노시드 분획 변화를 확인하였다(도 1).

* HPLC 조건

	JASCO 　 HPLC 시스템
컬럼	Waters μ-Bodapak C₁₈
유속	1.6 mL/분
온도	35℃
이동상	아세토나이트릴, 물
검출기	UV 검출기 (Jasco, Japan), 　흡광도 203 nm

< LY -011의 균주 동정>

인삼 진세노시드 대사능을 확인한 미동정 균주의 특성은 그람염색 결과 음성, 카탈라아제 활성은 음성, 산생성에 의한 pH저하효과를 관찰하였다.

또한 16S RNA 염기서열 분석을 통해　페디오코커스 속(屬)의 펜토사시우스 (種)임을 확인하였다.

실시예 2: 페디오코커스 펜토사시우스를 통한 인삼분말의 발효

< 페디오코커스 펜토사시우스 LY -011의 발효 특성 확인>

엠알에스 액체 배지(MRS broth)(디프코사, 미국)의 pH를 1 N 염산과 1 N 수산화나트륨으로 6.0, 6.8 및 8.0으로 조정한 뒤 가압멸균기(메가사이언스, 한국)로121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 각각의 배지에 페디오코커스 펜토사시우스 LY-011(수탁번호 KCCM11088P)를 1%(v/w) 접종하여 37℃의 배양기(비전과학, 한국)에서 24시간 배양하면서 시간대별 pH 변화 및 흡광도 측정을 통해 균체 증식을 관찰하였다. 배양 6시간 후 배지의 멸균 전 초기 pH가 6.0 또는 6.8로 조정된 배지에서의 흡광도를 살펴본 결과 pH 8.0에서보다 균수의 증식이 많이 이루어짐을 확인하였다.

멸균한 엠알에스 액체 배지(MRS broth, 디프코사:미국, 5 mL)에 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 (Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P)을 1%(v/w) 접종하여 27℃, 37℃, 47℃의 항온조(제이알에스,한국)에서 24시간 배양하면서 시간대별 각각의pH 변화 및 흡광도 측정을 통해 균체 증식을 관찰하였다. 6시간째의 흡광도를 조사하였을 때, 37℃에서 배양한 배지의 흡광도 값이 가장 높게 나타나 3가지 온도대 중에서 가장 빠른 균수 증식이 이루어졌다.

이를 종합하였을 때 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011은 엠알에스 액체 배지에서 pH 조정이 없이, 37℃ 온도 조건에서 배양됨을 확인할 수 있었다.

<전처리 적용>

2009년에 구입한 금산산 4년근 인삼분말을 이용하여10%(w/v) 인삼분말현탁액 배지(30 g)를 제조하였다. 이 현탁액 배지를 멸균한 후에 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 (Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P)을 배지의 1%(w/v) 접종하여 진동 배양기에 넣고 37℃에서 140 rpm으로 20시간 동안 배양하였다.

인삼분말을 전처리(100℃, 1시간) 한 뒤 10%(w/v) 인삼분말현탁액 배지(30 g)을 제조하였다. 이 현탁액 배지를 멸균한 후에 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 을 배지의 1%(w/v) 접종하여 진동 배양기에 넣고 37℃에서 140 rpm으로 20시간 동안 배양하였다.

실시예 3. 발효에 따른 균수 증가의 확인

헤마사이토미터(Hemacytometer)로 측정한 결과, 전처리로서 증자처리를 하지 않은 인삼분말 현탁액 발효물의 생균수와 비교하여 증자처리 한 인삼분말로 만든 현탁액 발효물에서 생균수가 증가하는 경향이 있는 것으로 나타났다(표 4). 다만, 증자처리 온도를 70℃이하 및 100℃ 이상으로 했을 경우에는, 발효물의 생균수는 증가하지 않았다.

	발효물의 생균수(CFU/g)	비고
무처리	1.68 X 10⁹	584.52% 증가
증자처리	9.82 X 10⁹	584.52% 증가

*초기 생균수: 2.16 X 10⁶CFU/g

실시예4 . 진세노시드 함량 증가의 확인

진세노시드 Rg₃ 함량이 무처리 배지에서는 발효 전후 각각 76.82±4.02 에서 97.74±5.33 mg%로 다소 증가한 반면, 증자처리 배지에서는 발효 전후 각각 51.09±32.77 에서 103.40±9.31 mg%로 202% 가량 증가하였다. 또한 진세노시드 Rh₂의 함량이 발효 후 4.48±2.97 mg% 생성되었다. 발효 전후 진세노시드 함량 변화를 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)법 분석하여, 하기 표 5 및 표 6과 같은 결과를 얻었다.

성분명	무처리		증가율(%)
	대조군	발효후
	mg%	mg%
진세노시드Rb₁	634.06	663.67	105
진세노시드Rb₂+Rb₃	317.83	332.83	105
진세노시드Rc	435.02	498.05	114
진세노시드Rd	144.97	163.16	113
진세노시드Re	312.12	354.24	113
진세노시드Rf	94.70	122.37	129
진세노시드Rg₁	240.27	333.27	139
진세노시드Rg₂+Rh₁	61.93	65.01	105
진세노시드Rg₃ (S,R)	76.82	97.74	127
진세노시드Rh₂	0.00	0.00	0

성분명	증자처리		증가율(%)
	대조군	발효후
	mg%	mg%
진세노시드Rb₁	336.06	649.91	193
진세노시드Rb₂+Rb₃	167.58	323.76	193
진세노시드Rc	228.91	443.24	194
진세노시드Rd	84.16	168.93	201
진세노시드Re	167.49	322.91	193
진세노시드Rf	70.69	122.74	174
진세노시드Rg₁	134.01	256.43	191
진세노시드Rg₂+Rh₁	37.30	72.04	193
진세노시드Rg₃ (S,R)	51.09	103.40	202
진세노시드Rh₂	0.00	4.48	448

실시예 5: 진세노시드 대사관련 효소 활성 실험 및 당대사 실험

5-1. 진세노시드 대사관련 효소 활성 실험

페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 (Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P) 균액을 멸균한 감 액체 배지(GAM broth, 니슈사:일본, 30 mL)에 1%(v/w) 접종하여 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 균액을 원심분리기(한일과학산업㈜, 한국)에 넣고 4℃에서 3,000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 뒤 균체를 멸균한 감 액체 배지로 희석한 조효소액을 실험에 사용하였다.

1) 베타-디- 글루코시데이즈 (β-D- glucosidase ) 효소 활성 조사

0.1 M 인산완충제(pH 7.0) 0.3 mL 와 2 mM 펜타-나이트로페닐 베타-디-글루코파리노시드 (p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside, 시그마사: 미국, 0.2 mL) 효소액 0.1 mL를 혼합하여 37℃의 진동 항온조(도성과학, 한국)에서 10분 동안 반응시켰다. 0.5 N 수산화나트륨 0.4 mL를 가해 반응 종료시킨 후 증류수 1 mL를 가하고 분광광도계(세실 인스트러먼츠, 영국)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(Bae, E.A., Park, S.Y., Kim D.H(2000) ;Constitutive β-Glucosidases Hydrolyzing Ginsenoside Rb₁ and Rb₂ from Human Intestinal Bacteria. Biol . Pharm . Bull . , 23(12), 1481-1485).

2) 베타-디- 자이로시데이즈(β-D- xylosidase ) 효소 활성 조사

0.05 M 인산완충제 (pH 7.0) 0.3 mL와 2 mM 펜타-나이트로페닐 베타-디-자이로시데이즈 (p-nitrophenyl β-D-xylopyranoside) (시그마사,미국) 0.2 mL, 효소액 0.1 mL를 혼합한 후, 37℃의 진동 항온조에서 60분 동안 반응시켰다. 0.5 N 수산화나트륨 0.4 mL를 가해 반응 종료시킨 후 증류수 1 mL를 가하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(Shin, H.Y., Lee,J.H., Lee,J.Y., Han,Y.O., Han,M.J., Kim,D.H(2003) ;Purification and Characterization of Ginsenoside Ra-Hydrolyzing β-D-Xylosidase from Bifidobacterium breve K-110, a Human Intestinal Anaerobic Bacterium. Biol . Pharm . Bull ., 26(8),1170-1173).

3) 알파-엘- 아라비노시데이즈 (α-L- arabinosidase ) 효소 활성 조사

0.05 M 인산완충제 (pH 7.0) 0.3 mL와 2 mM -나이트로페닐 알파-엘-아라비노피라노시드/아라비노퓨라노시드 (p-nitrophenyl α-L -arabinopyranoside/arabinofuranoside) (시그마사, 미국) 0.2 mL, 효소액 0.1 mL를 혼합하여 37℃의 진동 항온조에서 에서 60분 동안 반응시켰다. 0.25 N 수산화나트륨 0.4 mL를 가해 반응 종료시킨 후 증류수 1 mL를 가하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(Bae, E.A., Park, S.Y., Kim D.H(2000) ;Constitutive β-Glucosidases Hydrolyzing Ginsenoside Rb₁ and Rb₂ from Human Intestinal Bacteria. Biol.Pharm.Bull . , 23(12), 1481-1485).

4) 알파-엘- 람노시데이즈 (α-L- rhamnosidase ) 효소 활성 조사

0.02M 인산완충제(pH 7.0) 0.3 mL 와 2 mM 나이트로페닐 알파-엘-람노피라노시드(p-nitrophenyl α-L-rhamnopyranoside)(시그마사,미국) 0.1 mL, 효소액 0.1 mL를 혼합한 후 37℃의 진동 항온조에서 60분 동안 반응시켰다. 0.2 N 수산화나트륨 0.5 mL를 가해 반응을 종료시킨 후 증류수 1 mL를 가하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 펜타-나이트로페놀(p-nitrophenol)을 사용하였다(장일성, 박종백, 김동현(1996);폴라보노이드배당체에 의한 Bacteriodes JY-6의 β-글루코시다제 및 α-람노시다제의 유도. 약학회지, 40(3), 335-339).

실험 결과, 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 (Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P) 균액에서 진세노시드 아글리콘의 3, 6번 위치에 결합되어 있는 베타-1,2,-글루코피라노실 그룹 (β-1,2- glucopyranosyl group)을 가수분해하는 효소인 베타-디-글루코시데이즈(β-D-glucosidase)( Su, J.H., Xu,J.H., Lu,W,Y., Lin,G.Q(2006) ;Enzymatic Transformation of Ginsenoside Rg₃ to Rh₂ Using Newly Isolated Fusarium proliferatum ECU2042. J. Molecular cataly . B: Enzymatic ., 38, 113-118; 박채규, 전병선, 양재원(2003) ;고려인삼의 화학성분. 식품산업과 영양, 8(2) ,10-23) 의 활성을 확인하였다(표 7).

효소명	효소활성
베타-디-글루코시데이즈(β- D-glucosidase)	+
베타-디-자이로시데이즈 (β - D-xylosidase)	-
알파-엘-아라비노피라노시데이즈(α-L-arabinopyranosidase)	-
알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)	-
알파-엘-람노시데이즈(α-L-rhamnosidase)	-

5-2. 당대사 실험

페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 (Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P) 균액을 멸균한 감 액체배지 (GAM broth) (니슈사, 일본)(30 mL)에 1%(v/w) 접종하여 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 균액을 원심분리기(한일과학산업㈜, 한국)에 넣고 4℃에서 3,000 rpm으로10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 뒤 균체를 멸균한 감 액체배지로 희석한 조효소액을 실험에 사용하였다.

시료 0.5 mL과 에슈쿨린(esculin), 트레할로스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose), 젠티비오스(gentiobiose), 소포로스(sophorose, 시그마사:미국) 또는 라미나리비오스(laminaribiose)(덱스트라,영국)을 용해한 기질 완충 용액 0.5 mL를 혼합한 후 60분 동안 37℃의 항온조에서 반응시켰다. 대조구로는 시료 0.5 mL을 기질 완충 용액 0.5 mL을 혼합 후 반응하지 않은 것으로 하였다. 시료와 대조구에 각각 포도당 산화효소/페록시데이즈 시약(glucose oxidase/peroxidase, 시그마사: 미국)와 옥타-디아니시딘 (o-dianisidine, 시그마사: 미국)를 혼합한 반응 시약 2.0 mL를 첨가한 후 30분 동안 37℃의 항온조에서 반응시켰다. 12 N 황산 2.0 mL를 첨가한 후 540nm에서 측정하였다(Dahlqvist 등, 1984). 표준시약으로는 1 mg/mL의 포도당 용액(시그마사, 미국)을 사용하였으며, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 mg/mL 농도로 희석하여 반응 시약 2.0 mL를 첨가한 후 30분 동안 37℃의 항온조에서 반응시켰다. 12 N 황산 2.0 mL를 첨가한 후 540 nm에서 측정하여 검량선을 작성하였다. 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 (Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P)에 의한 당대사 능력 측정은 생성된 포도당 함량(mg/mL) 로 나타내었다.

실험 결과, 페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011 (Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P)의 균액에서 베타-1,3-글루코피라노실 그룹을 이루는 라미나리비오스(laminaribiose)와 베타-1,6-글루코피라노실 그룹(β-1,6- glucopyranosyl group) 이루는 이당류 젠티오비오스(gentiobiose)에 대한 분해활성이 있음을 확인하였다(표 8).

이당류명	대사 활성
에슈큘린(Esculin)	+
트레할로스(Trehalose)	+
셀로비오스(Cellobiose)	+
젠티오비오스(Gentiobiose)	+
라미나리비오스(Laminaribiose)	+
소포로스(Sophorose)	-

이를 통해 진세노시드 Rb₁가 Rd와 F₂를 거쳐 화합물K로의 대사경로를 예상할 수 있었으며, 한편 진세노시드Rb₂ 는 화합물O를 거쳐 화합물Y로의 대사를 예상하였다.

한편, 진세노시드 Rc에서 화합물 Mb를 거쳐 화합물 Mc로 대사되는 경로를 예상할 수 있었으며 진세노시드Rg₃(S, R)는 Rh₂(S, R)을 거쳐서 20-(S,R)-프로토파낙사디올로 대사되는 경로를 예상하였다.

또한, 진세노시드Rf는 Rh₁ 을 거쳐 프로토파낙사트리올로 대사되는 것으로 예상할 수 있으며, 진세노시드Rg₁는 F₁으로 대사되는 것으로 예상하였다.

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11088P

20100730

Claims

페디오코커스 펜토사시우스 엘와이-011(Pediococcus pentosacues LY-011, 수탁번호: KCCM11088P) 유산균.
70~100℃에서 전처리한 인삼을 포함하는 배지상에서 제 1항의 유산균을 발효시켜서 진세노시드를 증가시키는 방법.
삭제
제 2항에 있어서,
상기 전처리 온도는 100℃임을 특징으로 하는 진세노시드 성분을 증가시키는 방법.
70~100℃에서 전처리 한 인삼을 포함하는 배지상에 제 1항의 유산균을 발효시켜 진세노시드 Rh₂를 생성시키는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 전처리 온도는 100℃인 것을 특징으로 하는 진세노시드 Rh₂ 성분을 생성시키는 방법.
70~100℃에서 전처리한 인삼을 포함하는 배지상에서 제 1항의 유산균의 생육을 증가시키는 방법.
삭제
제 7항에 있어서,
상기 전처리 온도는 100℃임을 특징으로 하는 유산균의 생육을 증가시키는 방법.