KR101239175B1

KR101239175B1 - Ｂｌｃ 파우더를 함유하는 사료의 제조방법

Info

Publication number: KR101239175B1
Application number: KR1020090080464A
Authority: KR
Inventors: 최영태
Original assignee: 박헌경
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2013-03-06
Also published as: KR20110022939A

Abstract

BLC 파우더를 함유하는 사료를 제조하는 방법이 제공된다. BLC 파우더의 유방암에 대한 제암력은 47%, 자궁암 헬라 세포에 대한 제암력은 49%으로 확인된다.

Description

ＢＬＣ 파우더를 함유하는 사료의 제조방법{METHOD FOR MANUFACTURING FODDER WITH ＢＬＣ POWDER}

본 발명은 사료 제조 방법에 관한 것으로 구체적으로는 BLC 파우더를 함유하는 사료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

유방암은 최근 세계적으로 증가 추세에 있으며, 미국의 경우 여성암 중 첫 번째로 많은 암으로, 미국 여성이 평생 살아가는 동안에 9명에서 1명꼴로 유방암이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 우리나라는 불과 몇 년 전의 통계에 의하면 50여개국 중에서 끝에서 두 번째로 유방암의 발생빈도가 낮다고 보고 된 적이 있지만, 1992년 서울대학교 예방의학교실에서 실시한 조사에 의하며, 여성인구 10만 명당 5.7명으로 매년 1150명의 새로운 유방암 환자가 발생되는 것으로 추정되고 있다고 보고 된 적이 있고, 2001년 보건복지부와 국립 암 센터가 실시한 한국 중앙 암 등록사업 결과 유방암은 16.1%로 처음으로 다발성 1위가 되었다.

암의 유형이 점차 서구화되어가고 있는 이유를 많은 전문가들은 식습관의 변화에 중점을 두고 있다. 실제로도 유방암은 농촌지역에 거주하는 여성에서보다 비교적 부유한 생활을 하고 있는 도시 여성에서 많은 것으로 보고되고 있고, 육류와 지방 섭취가 많은 서구에서는 높은 데 비해 영양 섭취를 주로 곡류와 야채에 의존하는 동양인들은 낮게 나타났다. 서구인들 사이에서도 야채와 과일을 많이 먹는 집단은 적게 먹는 집단에 비해 대장암과 유방암이 적게 발생하는 것으로 조사되었다.

암 연구자들은 이런 연구 결과에 비춰 식품 속에는 암 예방 물질이 포함되어 있다는 확신 아래, 식품연구에 매진함으로써 식품 속의 암 예방 물질들을 속속 찾아내 그 기능을 밝혀내는 성과를 쌓아가고 있다. 암 예방 성분이 다량 들어 있는 식품을 적절하게 섭취함으로써 암을 예방할 수 있는 길을 열어나가고 있는 것이다.

예를 들어, 하루나 이틀의 짧은 기간에 끝나는 암의 개시 단계에 작용하는 암 예방 성분으로는 녹차의 떫은 맛과 관련된 카테킨류의 하나인 이지시지(EGCG), 토마토의 붉은 색소인 리코펜, 마늘의 향 성분인 알릴 설파이드, 브로콜리의 향 성분인 설퍼라판등을 꼽을 수 있다.

최근 천연물에서 추출한 여러 가지 물질의 화학적 예방효과에 관한 연구내용이 많이 보고 되고 있다. 다양한 암세포주에서 이러한 천연물질들은 세포에서 세포고사 기전의 활성화와 관계가 있고, 특히 세포고사 기전에 p53의 관여 여부는 여전히 관심의 대상이다. BLC는 학명으로 Sargassum fulvellum으로 짙은 황갈색을 하고 한국의 전해안에서 볼 수 있다. 식용으로 이용되는 모자반류의 대표적인 종류로, 흔히 시장에서 팔고 있는데, 근래에 식용 이외에도 육성돈의 사료나 참전복의 배합사료 첨가제로 응용되는 등 다양한 방법으로 사용되고 있다. 또한 항혈액응고, 항세균성, sarcoma-180에 대한 항암 효과 등이 관찰되어 유효한 생물학적 특징이 많은 것으로 보고되고 있다. 괭생이 모자반은 특히 그 효과가 더욱 뛰어나다. BLC/HEN Egg는 이러한 BLC를 사료로 사용한 닭이 생산한 달걀이다.

주요 국내의 항암제는 미국 BMS에 의한 난소암 택솔 IMD의 피부암 MG1114 NCI에 의한 조직암 엔도스테틴 IMR의 라미부틴 영국 CRC에 의한 위암 가시 불가사리 국내 난소 유방암 제넥솔 위암 선프라 대장암 하이루비신 폐암 그린스테틴 피부암 와송 간암 혈구암 그래디친 등이 시판되거나 개발 도중에 있다.

이들 항암제는 제암율이 12~52% 독성부작용은 15~72% 소화순환계 대사율은 그래디친을 제외하고 26~73% 수준이다.

상기에서 언급된 이슈를 해결하기 위해, 본 발명은 이하에서 설명된 구조를 사용한다. 이외에, 괄호 내의 참조 부호, 보충 설명 등은 본 발명의 이해를 돕기 위해, 이후에 설명된 실시예에 부합함을 나타내며, 본 발명에 어떤 제한도 가하지 않는다.

BLC를 함유하는 파우더를 제조하여 그 항암효과를 실험으로 확인하고, BLC 파우더를 함유하는 사료를 제조하고 또한 이를 이용하여 항암계란을 제조(이는 대한민국 경상북도 영주시 삼원농장에서 시행)한다.

본 발명의 한 관점에 따르면, BLC 파우더를 함유하는 사료의 제조방법이 제공된다.

먼저, 건조한 BLC를 세절분쇄하고, 70%의 에탄올을 가하여 약 90℃에서 7시간 환류 추출하여 추출액을 생성하는 단계, 상기 추출액을 회수하여 3000rpm에서 15분간 원심분리하고, 그 여액을 회전 진공 증발기로 농축하는 단계, 에탄올 추출물(E-Ex)을 검액하고, 탈수분하여 생성된 에센스 파우더에 조각자(Gled koraiensis) 35% 파우더를 첨가하여 BLC 파우더를 생성하는 단계 및 상기 BLC 파우더에 증류수를 가하여 음수용액을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 BLC 파우더의 유방암에 대한 제암력은 47%, 자궁암 헬라 세포에 대한 제암력은 49%이다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 제 1 항의 사료를 닭에게 20-40일간 음수용 으로 1일 150-250ml를 투여하여 얻어지는 계란이 제공된다. 이 계란의 유방암에 대한 항암효과는 76%, 자궁암 헬라 세포에 대한 항암효과는 79%으로 나타난다.

본 발명의 상기한 목적 및 다른 목적, 특징, 측면 및 장점은 첨부된 도면을 참조하는 경우 본 발명의 이하의 상세한 설명으로부터 더욱 명백하게 될 것이다.

발명자의 실험에 의하면 BLC와 BLC/HEN Egg에 의한 유방암 세포의 세포고사 과정은, 백스를 증가시키고 Bcl-2를 감소시켜 DNA 복구에 관련된 고사기재(death substrate)인 PARP의 분열을 통해 일어나며 BLC 400㎍/㎖의 농도와 BLC/HEN Egg 100㎍/㎖ 농도에서 사람의 유방암 세포 성장 억제효과가 각각 62%와 25%로 높게 나타나는 것이 MTT 평가 법에 의해 확인되었다.

BLC 주요성분중 포릭산, 바이오틴, 이노시톨, 아스팔틱산, 알라니은 뇌세포 활성 항생작용 유해세균 세포층 페프트그리칸의 용해기능, 혈구생성, 암세포 억제활동을 가지고 있으며, BLC 에탄올 추출액이 0.6% 암세포 헬라(Hela) 세포의 생존률을 나타내게 됨으로써 높은 항암력이 검증된 바 (최영태 출원: 2003. 1. 13, 모자반으로부터 추출한 생약성분으로 된 항암제) 있다.

[실험 1]

해조 갈조류 모자반과에 속하는 1년생 BLC(Sargassum fulvellum)로부터 주성분 폴릭 산(Folic Acid)의 수종 성분을 추출한 에탄올-추출물의 헬라(Hela) 세포에 대한 항암효능을 조사하였다.

본 실험에 사용된 BLC는 건조한 것을 구입 세절분쇄한 다음 80g에다 70% 에탄올을 가하여 약 90℃에서 7시간 환류 추출한 뒤 그 상등액을 회수하여 3000rpm에서 15분간 원심분리한 다음 그 여액을 회전 진공 증발기(rotary vaccum evaporate)로 농축하고 이를 에탄올 추출물(E-Ex) 검액으로 하였으며, 탈수 분하여 이 65% Essence 파우더에다 조각자(Gled koraiensis) 35% 파우더를 첨가하여 ATR BLC 파우더로 사용하였다.

매질(Medium)은 D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 파우더)을 3차 증류수에 녹여 여과한 후 10% 세럼(serum)을 첨가하여 사용하였으며 그 조성은 도 11과 같이 하였다. 안티마이코틱(Antimycotic)을 여과하여 미생물 오염을 막았으며 그 조성은 도 12와 같이 하였다. 암세포의 세척에는 PBS(phosphate buffered solution)를 고압소독하여 사용하였으며 그 조성은 도 13과 같이 하였다.

트립신(Trypsin 0.5%10×solution) 용액 20㎖를 PBS 980㎖에 섞어 여과후 세포를 수집하였다. 이소톤 III 용액(Isoton III balanced eletrolyte solution)을 카운트 버퍼(Count buffer)로 하여 세포수를 카운트하였으며 크리스털 바이올렛 파우더(Crystal violet 파우더) 0.6g을 D.W. 100㎖에 섞어 0.6% 스톡용액(Stock solution)으로 하고 다시 이를 작업용액(Working solution)으로 하여 세포고정(Cell fixation) 및 염색(염색)을 하였으며 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 검액 용해제로 하였다. 암세포주 헬라 세포은 온도 37℃, 습도 100％, CO₂ 농도 10%를 유지하였다. 실험용기는 24-웰 플레이트(plate)로 하였다.

BLC 에탄올 추출물 (E-Ex) 1.2g을 D.D.W. 19.0㎖ 및 DMSO 1.0㎖로 희석하여 최종농도가 57㎍/㎖가 되도록 하여 검액으로 사용하였다. 검액투여 전일 24-웰 플레이트에 세럼 10% D-MEM을 각 웰마다 10㎖씩 넣은 다음 배양 중의 암세포를 트립신 처리한 후 수집하여 세포 카운터로 암세포 농도를 계산하였다.

D-MEM 농도별로 희석하여 암세포수를 달리하여 각각의 웰에 플레이팅(Plating)하였으며 카운트 방법은 8회 측정하여 최고치와 최저치를 제외한 나머지의 평균을 산정하였다.

검액투여 6일후 매질을 모두 제거하고 크리스털 바이올렛(Crystal violet)로 3분간 염색 건조시킨 후 해부현미경으로 클로니(Colony) 수를 계산하고 플레이팅한 세포수와 비교하여 생존율을 계산하였다.

그 결과, 미디어(Media) 1㎖ 기준 항종양 모자반 검액 농도 50㎍, 200㎍, 400㎍, 800㎍, 1600㎍에 따른 1차(95. 12. 28), 2차(96. 1. 8), 3차 (96. 1. 23), 4차 (96. 3. 12) 시험결과 암세포의 평균생존율을 대조군과 비교한 결과가 65.13%, 87.69%, 48.65%, 12.96%, 0.59%로 각각 나타났다.

최저치는 1600㎍/㎖ 농도 검액 첨가시 0.6%로 시험검액중 가장 우수한 항암력 효과를 나타내었다.(도 14, 도 15 및 도 16 참조) 제암력은 99.4%로 검증되었다. 상 동일조건 1600㎍/㎖농도 검액시 검액종류가 HR(Halocynthia Roretzi)인 경우 생존율이 11.72% AP(Aster Pectinifera)인 경우 생존율이 25.47%여서 제암력은 AP에 비해 HR이 높았다.

모자반 추출검액 1.2g을 D.D.W. 19.0㎖가 되도록 DMSO 1.0㎖로 희석하여 1 차 최종농도가 57㎍/㎖가 되도록 제조한 1차 검액을 2차 검액 1600㎍/㎖로 제조하여 첨가하였을 때 투여결과 6일후 표준 100% 기준대비 암세포 헬라 cell의 생존율은 0.6%였으므로 제암력은 99.4%로 검증된 것이다.

항암제인 니트로 프로피오 페논 및 아미그달린 카르복시 에티 게르마늄 등의 화합물은 5% 내외의 생존일수 연장 등의 제암효능 있음이 검증되고 있으며 BMS사가 개발한 택솔 그래스태틴 엔도스태틴 CRC가 개발중인 가시불가사리 라미부틴 캄토테신 선프라 하이루비신 MG1114 및 제넥솔 등은 인체장기 피부암 등에 일정비율의 제암력은 인정되고 있다. 모자반의 주요성분인 포릭산은 주효소 저해기능 및 분열대사 효소 억제기능이 검증되고 있으며 HCA 발암변이유발소 억제기능 있음이 검증된 바 있다.

리나룰(Linalool)은 L-(3H) 글루타메이트(glutamate)가 중앙 신경계 막(Central Nervous System membrances)에 바인딩(binding)됨을 억제하며 암세포 성장을 억제함이 검증된 바 있다. 모자반 주요성분인 로비플루빈(Riboflavin)은 후두암 인두암, 바이오틴(Biotin)은 난소암 췌장암 뇌신경암, 제라니올(Geraniol)은 폐암 피부암 세포성장 억제력 있음이 검증된 바 있다. 일본 연안 150종 해조 추출물이 항종양 작용있음이 검증된 바 있다(Nakazawa 1974, 1976-a, 1976-b).

본 명세서에서는 추가로, 본 발명의 사료를 이용하여 사육된 가축이 생산한 물질이 가지는 항암효과에 대한 실험결과를 아래와 같이 명시한다.

[실험 2]

실험 2은 유방암에서 BLC 파우더와 BLC/HEN Egg 파우더의 항암효과를 입증하 는 것이다.

ATT (USA)에서 분양받은 사람의 유방암세포주인 MCF-7 세포 라인을 이용하여 BLC 파우더와 BLC/HEN Egg 파우더의 유방암에 대해 항암효과 시험을 실시하였다. MTT 평가, Hoechst 33258 염색, DNA 분열 평가, 플로우 세포형태(Flow cytometry), 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

BLC와 BLC/HEN Egg를 MCF-7 세포에 처치 후 증식과정을 관찰하기 위한 MTT 평가 시험에서, BLC와 BLC/HEN Egg를 12.5㎎/㎖에서400㎎/㎖까지 다양한 농도로 72시간동안 처치하였을 때 유방암세포의 증식이 농도 의존적으로 감소되는 것이 관찰되었다.

유방암세포 증식의 감소가 세포고사(apoptosis)에 의한 것인지 아니면 세포 주기 어레스트(arrest)에 의한 것인지 알아보기 위하여, BLC와 BLC/HEN Egg를 48시간동안 처치하고 Hoechst 33258 염색을 실시하였을 때 유방암 세포핵의 분절 및 응축을 관찰할 수 있었다. 또한 DNA 분열 평가 결과, BLC와 BLC/HEN Egg에 의한 레더(ladder) 형성이 관찰되었고, 플로우 세포형태 관찰(flow cytometry)을 통하여 세포 주기의 변화를 관찰하였을 때에는 Sub-G1 형상(phase)이 증가하는 것으로 보아 BLC와 BLC/HEN Egg가 세포고사를 통하여 유방암세포의 증식을 감소시키는 것으로 사료되었다.

BLC와 BLC/HEN Egg에 의한 유방암세포의 세포고사과정은, 박스(Box)를 증가시키고 Bcl-2를 감소시킴으로써 DNA 복구에 관련된 고사 상태(death substate)인 PARP의 분열(cleavage)를 통해 유도되는 것으로 사료된다.

이하, 실험 2의 내용을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 BLC와 BLC/HEN Egg를 48시간동안 처치하고 Hoechst 33258 염색을 실시하였을 때, 유방암 세포핵의 분절 및 응축 현상이 있었으며, DNA 분열에서는 BLC와 BLC/HEN Egg에 의한 래더 형성이 관찰되어, BLC와 BLC/HEN Egg가 유방암세포의 세포고사(cell death, apoptosis)를 통하여 유방암 증식을 감소시키는 데 관한 것이다.

ATCC(USA)에서 분양받은 인체의 유방암 세포주인 MCF-7 세포 라인을 이용하여 BLC 파우더와 BLC와 BLC/HEN Egg 파우더의 유방암에 대해 항암효과(Killing ratio％)를 검증 실험하였으며 MTT 평가, Hoechst 33258 염색, DNA 분열 평가, 플로우 세포형태, 및 웨스턴 블로팅을 실시하였다.

시험물질인 BLC 파우더, BLC/HEN Egg 파우더는 (사) 동해환경연구소에서 제조되었으며 밀봉 및 냉장보관되어 있었다. 상온에서는 안전성 및 균질성을 가지고 있으며 연갈색의 분말이다.

[MTT 평가를 이용한 세포 생존력 혹은 성장 변화 측정]

멀티웰 판상에 1×10⁵세포/㎖ 의 MCF 7세포를 파종한 후 세포 생존력 평가의 경우 세포가 80~90％, 성장 평가의 경우 50％가량의 합류에 도달하면 농도별로 희석된 물질을 각 웰에 처치하여 세포 생존력 평가는 24시간, 성장 평가의 경우 12, 24, 48, 72시간 처치한 후 37℃ 휴미디파이된(humidified) CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 물질 처치 시간이 끝나기 4시간 전 MTT 스톡 솔루션(5㎎/㎖ in PBS)을 각 웰에 10％ (vol/vol) 첨가한 후 4시간 인큐베이션 하였다. 물질 처치 시간이 끝나면 배지를 제거하고 각 웰 200㎕의 DMSO를 첨가하여 보라색 형성물을 용해시킨 후 ELISA 판독기로 550㎚에서 흡광도를 측정하여 무처치군에 비한 세포 생존력 혹은 성장의 비율을 산출하였다.

[Hoechst 33258 염색]

세포가 어팝토시스될 때의 중요한 형태학적 변화인 핵 멤브런스 블러빙(nuclear membrance blebbing)과 핵 응축(nuclear condensation), 어팝토틱 몸체(apoptotic body)를 DNA에 특이적으로 염색되는 Hoechst 33258 시약을 이용하여 관찰하였다.

MTT 평가에서와 마찬가지로 1×10세포/㎖의 MCF 7 세포를 35㎜ 접시에 파종한 후 세포가 80~90％의 합류에 도달하면 MTT 평가에서 얻은 농도의 물질을 접시에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나면 PBS로 3회 세척하고 4％ 용액(paraformaldehyde solution)으로 30~60분 고정한 후 1㎍/㎖의 Hoechst 33258 용액을 첨가하여 30~60분 염색하였다. 염색이 끝나면 PBS로 3회 세척한 후 현미경(fluorescence microscope)에 UV 필터를 적용하여 관찰하였다.

[DNA 분열 평가]

100mm 접시에 세포를 파종하여 물질을 처치하고 24시간이 경과하면 RNaseA(100 ㎍/㎖)가 첨가된 버퍼(lysis buffer)를 넣고 3시간 동안 56℃ 오븐에서 인큐베이션하였다. 고무(Rubber policeman)으로 리세이트(lysate)를 수거하여 2㎖ 튜브로 옮긴 후 NaCl을 최종농도 1M이 되도록 첨가하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하 였다. 인큐베이션이 끝나면 리세이트를 15000rpm으로 30분간 원심분리 한 후 페놀/클로로폼/이소아밀 알코올 혼합물(phenol/chloroform/isoamyl alcohol mixture)(1 volume)을 처리하여 상층액 중의 nucleic acid를 추출하였다. 추출한 nucleic acid 에 3M 소듐 아세테이트(sodium acetate)가 첨가된 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)을 첨가한 후 -70℃에서 15분 인큐베이션하여 프리시피테이션시킨 후 15~20분 15000g로 센트리퓨즈하였다. 필렛(Pellet)이 형성되면 상층액을 버리고 70％ 에탄올로 세척한 후 건조시켰다. TE 버퍼를 첨가하여 필렛을 녹인 후 스펙트로포토미터로 정량하고 1.5％ 아카로스 젤(agarose gel)을 이용하여 전기영동 한 다음 에치디움 브로마이드 스테이팅(ethidium bromide 염색)으로 영상화하여 UV 기기(transilluminaor)를 통해 관찰하고 사진 촬영하였다.

[세포 주기 측정]

DNA 분열 평가와 같은 방법으로 세포를 배양한 후, 트립신 처리하여, 세포를 수거한 다음, 얼음냉각된 PBS를 이용하여 2회 세척해준 후 70％ 에탄올로 -20℃에서 30분 이상 고정시켰다. 고정된 세포들은 다시 ice-cold PBS로 세척하고 O㎍/㎖의 PI(propidium iodide)를 100㎍/㎖ 의 RNase A와 함께 30분동안 인큐베이션시킨다. 팍스칼리버(FACSCalibur)를 이용하여 세포주기를 측정하여 세포주기의 어레스트 여부를 확인하였다.

[웨스턴 블로팅 분석(Western blot analysis)]

DNA 분열 평가와 같은 방법으로 세포를 배양한 후, 라이시스 버퍼(lysis buffer) (20％ SDS, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 10mM iodoacetoamide, 1mM leupeptin, 1mM antipain, 0.1mM sodium orthovanadate, 5mM sodium fluoride)를 첨가하여 세포를 라이시스시킨다. 세포(lysate)를 프루브(prove sonicator)로 초음파처리한 후 DC 프로틴 평가 kit (Bio-Rad, USA)로 정량한 수 12.5％ 젤 (polyacrylamide gel)로 영동하여 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrance)에 이동시킨 후 p53, PARP, Bcl 군 등 세포고사와 단백질에 대한 항체를 반응시키고, 그에 해당하는 2차 항체를 반응시킨 후 케미루미니슨트 검출 리에이전트(chemiluminescent detection reagent)를 이용하여 X-ray 필름에 노출시켜 현상하였다.

시험결과는 다음과 같이 나타났다.

[MTT 평가를 이용한 세포 생존력 혹은 성장 변화 측정]

BLC 파우더와 BLC/HEN Egg 파우더를 EtOH을 사용하여 스톡을 만든 후, 농도별로 배지에 희석하여 사람의 유방암세포에서 72시간동안 성장 억제효과를 확인하였다. MCF-7 세포에 BLC와 BLC/HEN Egg 파우더를 각각 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 400㎍/㎖를 처치하였을 때, 유방암세포의 증식이 농도 의존적으로 감소되는 경향이 도 1과 같이 관찰되었다. 또한, BLC 400㎍/㎖의 농도와 BLC/HEN Egg 100㎍/㎖ 농도에서 사람의 유방암 세포의 성장 억제효과가 각각 62%와 25%로 가장 높았다.

BLC의 경우, BLC/HEN Egg와 달리 100㎍/㎖ 이상의 농도에서는 세포성장 억제 효과가 100㎍/㎖과 비슷하였으므로 100㎍/㎖이 가장 유방암 세포 성장억제에 가장 효과적인 것으로 사료된다. 또한 100㎍/㎖의 농도에서 두 물질 모두 세포독성이 관 찰되지 않아 BLC와 BLC/HEN Egg의 유방암 성장 억제에 있어 유효농도로 결정하고 다음의 실험을 진행하였다.

(2) Hoeechst 33258 염색

BLC와 BLC/HEN Egg가 사람의 유방암 세포에서 어떠한 기전으로 성장을 억제하고 세포의 분아(proliferation)이 감소하였는지를 알아보기 위하여, BLC와 BLC/HEN Egg를 100㎍/㎖의 농도에서 48시간동안 처치한 후, Hoeechst 33258 염색을 실시하여 세포의 형태(morphology)를 관찰하였다.

대조군과 비교하여 보면 BLC와 BLC/HEN Egg를 처치한 세포에서 유방암 세포의 분아가 줄어들었고, 도 2에서 보여지듯이 세포고사가 유도된 세포에서는 세포고사의 특징적인 현상인 핵산 분절 및 응축을 유도되는 것을 관찰할 수 있었다 (화살표가 이러한 현상을 보여주고 있다). 따라서 BLC와 BLC/HEN Egg는 사람의 유방암 세포에서 세포의 사멸을 유도하여 생리활성이 저해되면, 이를 통해 유방암 세포의 증식을 억제할 것으로 가정하게 되었다.

(3) DNA 분열 평가

사람의 유방암 세포가 BLC와 BLC/HEN Egg에 노출되었을 때 세포고사를 유도하는지 확인하기 위하여 DNA 래더링을 수행하였다.

도 3에서 볼 수 있는 것처럼, BLC와 BLC/HEN Egg를 100㎍/㎖의 농도로 48시간 동안 MCF-7 세포에 처치하였을 때, DNA 분열를 특징적으로 관찰할 수 있는 래더를 형성하였다. 무처치 대조군과 비교해보면, BLC를 처치하였을 때가 BLC/HEN Egg를 처치하였을 때보다 래더를 더 유의적으로 형성함으로써, MTT 평가 결과와 마찬 가지로 BLC가 BLC/HEN Egg보다 사람의 유방암 세포에서 세포고사에 좀 더 효과적인 것인 것으로 사료되었다.

[세포 주기 측정]

이와 같은 결과들을 바탕으로, BLC와 BLC/HEN Egg는 유방암 세포에 특이적으로 증식을 억제능이 있는 활성성분을 가지고 있다고 사료되어, MCF-7 세포에서 세포고사의 정량적인 수치를 알아보기 위하여 PI 염색 후 팍스캔(FACScan) 시험법으로 세포사멸의 정도와 세포성장 억제 요인 중의 하나인 세포 주기 어레스트를 동시에 알아보고자 하였다. MCF-7 세포를 MTT 평가의 결과에서 설정한 유효농도인 100㎍/㎖를 48시간동안 처치한 후 실험하였다.

도 4를 보면, 무처치 대조군에 비하여 BLC를 100㎍/㎖을 처치하였을 때, sub-G1 phase (％ Apoptosis)가 약 60%까지 증가하였으며 BLC/HEN Egg를 100㎍/㎖의 농도로 처리한 경우에는 약 20％까지 sub-G1 phase가 증가하여 세포고사가 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 BLC는 같은 농도에서 BLC/HEN Egg보다 팍스캔의 결과에서 세포고사의 정량적인 수치가 더 높게 관찰되어 이전의 MTT 평가의 결과와 일치함을 알 수 있다. 즉, BLC가 BLC/HEN Egg보다 인비트로(in vitro) 검색법에서는 유방암의 성장억제 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

[웨스턴 블로팅 분석(Western blot analysis)]

BLC와 BLC/HEN Egg의 사람의 유방암 세포인 MCF-7의 세포고사를 유도하는 메커니즘을 알아보기 위하여, 세포고사에 대한 여러 단백질의 변화를 웨스턴 블로팅을 통하여 관찰하였다.

최근에 세포고사에 의한 세포 사멸기작에서 카스페이스(caspase)로 이름 붙여진 ICE(interleukin-1-b-converting enzyme family cystein protease)가 사멸 과정의 증심적 역할을 하고 이 효소가 PARP(poly (ADP-ribose)polymerase) 같은 기질을 분해하는 것으로 알려져 있다. 도 5를 보면 BLC와 BLC/HEN Egg는 PARP 기질을 분해시켜 세포사멸로 이끌어 가는 것이 관찰되었다. 세포 사멸을 조절하는 세포 안팎의 여러 가지 인자들이 밝혀져 있는데, 그 중에서 Bcl-2 군 단백질들은 세포 사멸을 촉진하거나 (Bad, Bax) 억제하는 것 (Bcl-2, Bcl-XL)으로 알려져 있으며, 이 단백질들이 서로 어떻게 결합하는가에 따라 세포 사멸을 억제 또는 촉진한다고 밝혀져 있다. BLC와 BLC/HEN Egg는 세포사멸을 촉진하는 백스(Bax) 단백질의 발현을 증가시키고 동시에 세포사멸을 Bcl-2 단백질의 발현을 감소시켰따. 따라서 이러한 Bcl-2 군 단백질의 조절로 인한 시토그롬(cytochrome) C의 방출과 다운스트림 카스페이스(downstream caspase)의 활성화를 유도하여 세포사멸 기작이 일어날 것으로 판단되었다.

그리고, p53 유전자는 세포가 무제한으로 증식하는 것을 막는 인체의 대표적 암 억제 유전자이다. 발암물질 등이 세포내로 침투하면, 그로 인한 위험이 제거될 때까지 세포 분열을 억제함으로써 정상세포가 암 세포로 변하지 못하게 하는 것이 p53 유전자의 중요 임무이다. 그러므로 p53 유전자의 기능에 이상이 생기면 암 발생 위험이 높으며, 특히 유방암 난소암 간암 등은 p53 유전자와 매우 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 BLC와 BLC/HEN Egg에 의한 유방암에서의 p53 발현정도를 관찰하는 것이 중요하다. 도 5에서 p53은 세포에서 100㎍/㎖ 농도의 BLC와 BLC/HEN Egg를 처치하였을 때와 두 물질 모두 시간 의존적으로 대조군에 비해 발현을 증가시키는 것이 관찰되었으므로, BLC와 BLC/HEN Egg는 세포고사 이외에 p53 단백질을 증가시켜 사람의 유방암 세포증식을 억제시키는 것으로 사료된다.

실험결과는 다음과 같이 분석될 수 있다.

BLC는 모자반으로 불리는 갈조식물 모자반목 모자반과의 바닷말을 열수추출법으로 1.5시간동안 가열하여 제조한 물질이고, BLC/HEN Egg는 모자반을 사료로 섭취한 닭이 생산한 계란이다. 따라서, 이번 실험에서 BLC와 BLC/HEN Egg가 인비트로 시험법에서 유방암 증식 억제에 대한 생리활성을 평가하였다. 그 결과 BLC와 BLC/HEN Egg는 사람의 유방암세포인 MCF-7 세포 라인에서 농도 의존적으로 세포 성장을 감소시켰다. BLC의 경우 100㎍/㎖를, BLC/HEN Egg의 경우 400㎍/㎖을 처치하였을 때 세포의 생존율을 가장 유의적으로 저하시키는 것을 관찰할 수 있었다.

이러한 사람의 유방암 세포 증식의 감소는 BLC와 BLC/HEN Egg가 유방암 세포의 핵을 분절 또는 응축시키는 특징을 보이는 세포고사와 관련이 있는 것을 DNA 분열 평가의 결과에서 래더 형성과 Sub G1 상의 증가를 통해 관찰할 수 있었다. 세포고사의 조절에 중요한 역할을 담당하고 있는 미토콘드리아에 대한 최근 보고서에 의하면 미토콘드리아의 기능조절은 세포질로 방출되는 시토크롬 C와 같이 카스페이스 활성인자(caspase activators), 막전위차의 변화, 그리고 Bcl-2 군 단백질 등이 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 BLC와 BLC/HEN Egg가 세포고사에 관련된 Bcl-2 군 중 백스를 증가시키고 Bcl-2를 감소시킴으로써 DNA 복구에 관련된 고사기재(death substarate)인 PARP의 분열를 통해 세포고사를 유도하는 것으로 사 료된다. 또한 BLC와 BLC/HEN Egg는 암 억제 유전자인 p53의 증가를 유도함으로써 유방암 세포의 증식을 억제하였다.

[실험 3]

실험 3에서는 유방암 세포를 이식한 누드마우스에서 BLC 파우더와 BLC/HEN Egg 파우더의 항암효과를 시험한다.

사람의 유방암세포주인 MCF-7 세포 line (ATCC (USA))을 BALB/cAnNCrjBgi-nu 마우스 ((주)오리엔트)에 이식하는 MCF-7 제노그래프트(Xenograft) 평가를 이용하여 BLC 파우더와 BLC/HEN Egg 파우더에 대한 유방암의 항암효과 시험을 실시한 결과 다음과 같았다.

(1) 시험 전 기간동안 폐사한 개체는 없었다. 그리고 시험물질에 의해 발생한 것으로 사료되는 어떠한 임상증상도 관찰되지 않았다.

(2) 시험 전 기간동안 체중 증감율에서는 용매대조군과 시험물질 투여군을 비교해 보았을때 유의적인 변화가 관찰되지 않았다.

(3) BLC와 BLC/HEN Egg를 투여 후 튜머(tumor) 증식과정을 28일 동안 관찰한 결과, 세포만 이식한 무처치 대조군에 비하여 MCF-7는 약 40％ LC/HEN Egg는 약 70％의 유방암세포 증식을 감소시키는 것으로 관찰되었다.

시험물질은 (사)동해환경연구소에서 공급된 BLC 로서 밀봉, 냉장보관된 연갈색의 분물이 사용되었다.

실험동물은 (주) 오리엔트가 공급하는 암컷 6주령의 28마리의 BALB/cAnNCrjBgi-nu 마우스가 사용되었고, 본 시험에 사용된 BALB/cAnNCrjBgi-nu 마우스는 지금까지 MCF-7 제노크래프트 시험법을 이용한 항암시험에 많이 사용되어 왔기 때문에 비교할 많은 생리, 해부 및 독성학적 기초자료가 있어서 선택하였다. 실험실에 순화시키는 기간을 약 1주일 두었으며, 그 기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 제공하였다.

사육조건에 있어서, 환경조건은 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 환기 회수 10-12회/hr, 조명시간 12시간(07:00-19:00), 조도 150-200 lux로 설정된 서울대학교 수의과대학 실험실 (85동 727호)내 헤파 필터가 장착된 Ml rack에서 실시하였다.

순화기간 및 시험기간 중에 폴리카보네이트 MI 케이지 (26×42×18㎝, 명진기계제작)에서 7마리/사육상자로 사육하였다. 사육상자에는 시험번호, 동물번호 및 투여량을 기입한 태그를 붙였다.

순화기간 동안 사료는 고압증기멸균된 실험동물용 고형사료 ((주)퓨리나)를 자유 섭취시키며, 음수는 고압증기멸균된 상수도를 자유 섭취시켰따. 시험기간 동안은 (사) 동해환경연구소가 제공한 BLC 파우더와 BLC/HEN Egg 파우더를 각각 2000ppm, 4000ppm의 용량으로 AIN-76A Diet와 배합하여 사료를 자유 섭취시키며, 음수는 고압증기멸균된 상수도를 자유 섭취시켰다.

임상적용 예상경로인 경구투여를 선택하였고, 투여회수 및 투여기간은 자유섭취로 하였다. 시험군 구성은 도 6과 같이 하였다.

2004년 12월 29일에 통계청이 발표한 자료에 의하면 국민 1인당 하루 달걀 소비량은 28.8g이라고 한다. 달걀의 무게는 종류에 따라 다양하지만 평균 60g으로 하루에 1인당 달걀을 1/2개를 소비하는 것과 같다. 따라서, 이 실험에서는 평균 달걀소비량의 2배인 60g을 하루 투여량으로 설정하고 유방암 발병률이 높은 중년 여성의 평균 몸무게인 60Kg으로 환산하여 BLC/HEN Egg의 하루 투여 용량을 1000mg/Kg/day (4000ppm)으로 산정하였다. 그러나 BLC/HEN Egg보다 항암효과가 높아서 BLC/HEN Egg 투여량의 절반인 500mg/Kg/day(2000ppm)로 설정하였다. 이와 같은 투여 용량을 근거로 도 7과 같은 사료 구성을 만들었다. 예비실험결과, 누드마우스의 일일 사료 섭취량은 약 5g이었고, 평균체중은 약 20g이었다.

BLC 파우더와 BLC/HEN Egg 파우더를 처치 전에 체중을 측정하여 군간 체중차이가 없게 무작위법으로 군분리를 실시하였다. 마우스는 꼬리에 유성매직으로 표시하여 식별하였으며, 각 군 및 사육상자의 식별은 사육상자 전면에 시험번호, 시험물질명, 군명 그리고 동물번호 등을 기재한 사육상자 태그를 부착하여 판별하였다.

시험과정은 다음과 같다.

실험동물이 준비된 후 7일 동안 순화기관을 거친 후 시험물질을 투여하였다. 시험물질 투여 28일 후 10⁸ cells/ml의 사람의 유방암세포를 각 마우스에 0.3g을 주입하였다. 세포 주입 1주일 전부터 1주일 후까지 세포의 성장을 유도하기 위하여 17g

-estradiol (E2)을 0.18(mg/animal/day) 투여하였다. 세포주입 후 28일간 시험물질을 계속 투여하면서 관찰하고 그 동안 일주일에 한 번씩 종양의 부피와 시험동물의 체중을 측정하였다.

시험이 종료된 후 부검하였다. 부검 시, 종양에 있는 액체나, 지방을 깨끗이 분리한 다음, 무게를 측정하고, 10％ 포르말린에 고정한 다음 통상적인 방법을 거쳐 조직표본을 제작하고 병리 조직학적 검사를 실시하였다. 시험 중 측정된 시험동물의 체중 등에 관한 자료의 통계학적 분석을 위하여 원웨이 아노바(one-way ANOVA) 를 실시하여 p=0.05 수준에서 군간 유의성을 검정하였고 유의성이 인정되면, 두넷 테스트(Dunnett's t-test)를 실행하여 대조군과 시험군간의 통계학적 유의성을 검정하였다. (p<0.05).(도 8 참조)

시험결과를 설명한다. 먼저 도 9를 참조하여 체중의 변화를 살펴보면, 시험 전기간동 BLC와 BLC/HEN Egg 투여군은 대조군에 비해 어떠한 유의적인 체중의 변화도 관찰되지 않았고, 전체적으로는 체중의 증가가 관찰되었다.

튜머 크기의 변화를 살펴보면, MCF-7 세포를 마우스에 이식하기 전 28일동안 BLC와 BLC/HEN Egg를 각각 2000ppm, 4000ppm를 섭취시킨 후 29일 째 되는 날 사람의 유방암 세포인 MCF-7 세포를 이식하였다. 그리고 29일부터 56일까지인, 세포이식 후 28일 동안 동량의 BLC와 BLC/HEN Egg를 투여하고 육안적으로 관찰되는 튜머의 부피를 다음의 공식에 대입하여 산출하였다.

튜머 Volume=π×D×d² (D: 튜머의 큰 지름, d: 튜머의 작은 지름)

그 결과, 튜머의 피부가 이식 후 1주일까지는 비슷한 양상으로 증가하다가 이식 후 2주부터 시험 종료 시점인 4주까지 대조군과 비교하여 BLC와 BLC/HEN Egg 투여군의 튜머 부피가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 인비트로 시험법과 는 다르게 BLC/HEN Egg 투여군이 BLC 투여군보다 튜머 부피의 억제 효과가 높았다. 그 이유는 투여용량 설정이유에서 언급한 것처럼 모자반과 달걀의 섭취율을 토대로 한 두 시험물질의 투여 용량이 인비트로 시험법과는 다르게 2배의 차이가 있었기 때문이라고 판단된다.

MCF-7 세포를 이식한 28일 후 마우스를 부검하여 튜머의 무게를 측정하였다. 도 10의 결과에서 알 수 있듯이, 튜머의 무게는 튜머의 부피와 비슷한 양상으로 BLC를 처치한 군에서는 약 40％ BLC/HEN Egg를 처치한 군에서는 약 70％의 종양무게 감소율을 보였다. 그리고 이 결과에서도 앞의 튜머의 부피 결과와 마찬가지로 BLC/HEN Egg를 처치한 군이 BLC를 처치한 군보다 튜머의 무게가 적게 관찰되었다. 이러한 결과는 튜머의 크기를 관찰한 결과에서도 확인 할 수 있었다.

이 시험에서는 사람의 유방암 세포인 MCF-7 세포를 알비노 계통의 털 없는 마우스인 BALB/cAnNCrjBgi-nu 마우스에 이식하고, BLC와 BLC/HEN Egg를 사료에 혼합하여 제공한 후 유방암 세포의 증식에 어떠한 영향을 미치는지를 실험하였다. 이 마우스는 면역반응에 따를 흉선의 역할을 연구하는 데 중요할 뿐 아니라 다른 종에 속하는 동물의 종양을 이식하는 연구에도 중요하게 사용되고 있다.

시험 시간동안 각 군의 체중의 변화는 상호간의 유의성이 관찰되지 않고 정상적인 증가를 보였다. 그러나 매주 측정된 튜머의 부피는 1주까지는 비슷하게 성장하다가, 2주부터 대조군과 비교하여 BLC와 BLC/HEN Egg군에서 각각 약 40％와 70％의 튜머 무게의 감소가 관찰되었다. 세포 이식 후 28일 후 부검하였을 때 튜머의 무게 또한 비슷한 양상으로 감소하였다.

이 결과들은 BLC와 BLC/HEN Egg이 사람의 유방암 세포의 성장을 억제한다는 면에서 인비트로 시험법의 결과와 동일하다. 따라서 BLC와 BLC/HEN Egg는 인비트로 시험법의 항암효과 결과처럼 MCF-7세포를 이식한 인비트로 시험법에서도 사라의 유방암에서 항암효과가 있는 것으로 결론지을 수 있다.

[실험 4]

실험 2,3의 동일 시험 물질, 재료 및 방법으로 제2의 발명권자 연구소 시험 결과에 의하면 ㉮BLC 파우더 및 ㉯BLC/HEN Egg 파우더에 대한 ①유방암 및 ②헬라 Cell에 대한 함암효과가 ㉮①의 경우 47%, ㉮②의 경우 40%, ㉯①의 경우 76%, ㉯②의 경우 79％임이 확인되었다.

BLC와 BLC/HEN Egg를 투여한 후 유방암 증식과정을 28일동안 검증한 결과 MCF-7세포만 이식한 무처치 대조군에 비해 BLC는 약 47%, BLC/HEN Egg는 약 76% 유방암 세포증식을 저지하는 사실이 확인되었다.

본 실험에서는 (사) 동해연구소에서 공여 받은 BLC와 BLC/HEN Egg의 사람유방암세포와 그 세포를 이식한 누드마우스에서 항암시험을 시행하였다. 인비트로 시험결과에서 BLC와 BLC/HEN Egg는 Bcl2/Box 단백질을 조절하여 농도 의존적으로 MCF-7세포의 증식을 억제시켰다. 그리고, 인비트로 시험 결과에서는 BLC 2g/Kg 와 BLC/HEN Egg 4g/Kg이 포함된 사료를 섭취시켰을 때 대조군에 비하여 튜머 크기 가 유의적으로 감소하는 것으로 보아 BLC와 BLC/HEN Egg를 식품으로 섭취할 경우, 유방암의 예방과 치료에 효과적으로 응용할 수 있을 것으로 사료된다.

본 발명은 바람직한 실시예를 참조하여 특정되게 도시되고 설명되었으나, 본 발명의 정신 및 범위를 이탈하지 않고 형태와 세부사항에 있어서 첨부된 특허청구범위의 요지 및 범위내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 당업자들은 이해하여야 한다.

도 1은 BLC 및 BLC HEN Egg 파우더의 암세포에 대한 항암저지력별 암세포 크기변화도를 도시한 도면이고,

도 2는 세포고사가 유도된 세포에서 핵산 분절 및 응축을 유도되는 것을 도시한 도면이고,

도 3은 DNA 분열를 특징적으로 관찰할 수 있는 ladder를 형성하는 것을 도시한 도면이고,

도 4는 세포 주기를 측정한 결과를 도시한 도면이고,

도 5는 BLC와 BLC/HEN Egg가 PARP 기질을 분해시켜 세포사멸로 이끌어 가는 것을 도시한 도면이고,

도 6은 실험 3의 실험군 구성을 도시한 도면이고,

도 7은 실험 3의 사료구성을 도시한 도면이고,

도 8은 실험 3의 대조군과 시험군간의 통계학적 유의성을 도시한 도면이고,

도 9는 실험 3에서 대조군과 시험군의 체중의 변화를 도시한 도면이고,

도 10은 실험 3에서 튜머의 무게변화의 결과를 도시한 도면이고,

도 11은 실험 1의 매질의 조성을 도시한 도면이고,

도 12는 실험 1의 안티마이코틱의 조성을 도시한 도면이고,

도 13은 실험 1의 PBS의 조성을 도시한 도면이고,

도 14, 도 15 및 도 16은 실험 1의 결과를 도시한 도면이다.

Claims

BLC 파우더를 함유하는 사료의 제조방법에 있어서,

건조한 모자반(Sargassum fulvellum)를 세절분쇄하고, 70%의 에탄올을 가하여 90℃에서 7시간 환류 추출하여 추출액을 생성하는 단계,

상기 추출액을 회수하여 소정의 각속도로 원심분리하고, 그 여액을 회전 진공 증발기로 농축하는 단계,

에탄올 추출물(E-Ex)을 검액하고, 탈수분하여 생성된 Essence 파우더에 조각자(Gled koraiensis) 35% 파우더를 첨가하여 BLC 파우더를 생성하는 단계 및

상기 BLC 파우더에 증류수를 가하여 음수용액을 생성하는 단계를 포함하고,

이로써, 상기 BLC 파우더의 유방암에 대한 제암력은 47%, 자궁암 헬라 세포에 대한 제암력은 49%인 것을 특징으로 하는 BLC 파우더를 함유하는 사료의 제조방법.
제 1 항의 사료를 닭에게 20-40일간 음수용으로 1일 150-250ml를 투여하여 얻어지는 계란으로서, 상기 계란의 유방암에 대한 항암효과는 76%, 자궁암 헬라 세포에 대한 항암효과는 79%인 것을 특징으로 하는 항암계란.