KR101187155B1 - 비변형 금 나노입자를 이용한 표면증강라만분광에 의한ｄｎａ 혼성화를 이용한 병원균의 탐지 및 단일염기변이구분방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 DNA 혼성화를 이용한 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 비변형 금 나노입자를 이용한 표면증강라만분광(surface-enhanced Raman scattering; SERS)에 의한 올리고뉴클레오타이드의 DNA 혼성화를 이용한 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 SERS가 태그 물질(tagging materials)이나 염색 표지를 사용하지 않고 약 15분 내에 DNA내의 단일염기 미스매치를 신속하게 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있어, 단일염기변이 구분 및 특정병원균의 존재를 탐지하는데 이용될 수 있으며, 특히 조류로부터 조류독감 바이러스의 감염여부를 신속히 찾아낼 수 있다.

DNA 혼성화, 금 나노입자, 표면증강라만분광(SERS), 조류독감(AI)

Description

비변형 금 나노입자를 이용한 표면증강라만분광에 의한 ＤＮＡ 혼성화를 이용한 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법{Detection Method of Pathogenic Agents and Single Nucleotide Polymorphism Using DNA Hybridization by Surface-Enhanced Raman Scattering Using Unmodified Gold Nanoparticles}

본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 DNA 혼성화를 이용한 조류독감(avian influenza; AI) 바이러스를 비롯한 일반적인 병원균의 탐지방법에 관한 것이다.

특이 DNA 서열의 탐지는 생물학적 연구나 의학적 진단에 있어서 중요한 응용분야에서 사용된다(S.B. Primrose, R.B. Twyman, Principle of Genomic Analysis and Genomics, Blackwell, Malden, MA, 3^rd Ed. 2003). 예를 들어, 인간 세포에 대한 H5N1의 감염능역이 밝혀진 1997년 이래, 조류독감(AI) 바이러스는 인체를 위협하는 가장 치명적인 바이러스 중의 하나로 여겨지고 있다(M.D. Jong, T.T. Hien, Journal of Clinical Virology, 35 (2006) 2; B. Olsen et. al., Science, 312 (2006) 384; D.L. Suarez, Biologicals, 33 (2005) 221). AI 바이러스의 특이 염기서열의 탐침은 질병 진단, 음식과 의약산업 모니터링, 유전자 치료 및 의학연구에 있어 중요하다(D. Deregt et. al., J. Virol. Meth., 137 (2006) 88; Z. Xie et. al., Mol Cell Probes, 20 (2006) 245).

AI 바이러스를 탐지하기 위하여, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)(E. Starick et. al., J. Vet. Med., B 53 (2006) 370) 및 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)(M. Munch et. al., Arch. Virol., 146 (2001) 87; H-L. Wei et. al., Virus Genes, 32 (2006) 261; D.P. Offringa et. al., J. Virol. Meth., 88 (2000) 15; L. Di Trani et. al., BMC Infectious Diseases, 6 (2006) 87)과 같은 다양한 진단 방법들이 개발되어 왔다. 그러나, 이들 방법들은 때로는 시간이 너무 걸리고, 노동 집약적인 절차가 필요로 되는 단점이 있다. AI 바이러스는 다른 숙주에 전파되어 유전적으로 변이가 가능하므로, 빠른 진단 스크리닝 수단의 개발이 중요하다.

금 나노입자 프로브(probe)에 기반한 DNA 혼성화의 색도 탐지가 유전자 발현을 위하여 광범위하게 개발되어 왔다(Storhof et. al., Biosensors and Bioelectronics, 19 (2004) 875-883; Penn et. al., "Nanoparticles for bioanalysis" Current Opinion in Chemical Biology, 2003, 7:609-615; C.A. Mirkin et. al., Nature, 382 (1996) 607; Y.P. Bao et. al., Nucl. Acid. Res. 33 (2005) e15; H. Li and L. Rothberg, PNAS, 101 (2004) 14036). 대부분의 경우, DNA 센서들은 상보적으로 태그(tagging)된 올리고뉴클레오타이드 프로브와 단일 가 닥의 타겟 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화에 기초한다. 미스매치된 단일염기쌍과 완전히 매치된 이중 가닥의 DNA는 상이한 정전기적 상호작용에 의하여 비변형된 금 나노입자를 흡착하는 것에 대해 다른 성향을 갖는 것으로 나타난다(H. Li and L. Rothberg, PNAS, 101 (2004) 14036).

상기 발견 이후, SERS(surface-enhanced Raman scattering)는 분석화학 분야에 있어서 고감도 화학 센서로 사용되어왔다(C. Ruan et. al., Anal. Chim. Acta, 297 (2002) 1536; C-C. Yu and Y-C. Liu, Anal. Chim. Acta, 566 (2006) 130; H. Wang et. al., Anal. Chim. Acta, 560 (2006) 64; R. Dijkstra et. al, Anal. Chim. Acta, 508 (2004) 127). 그것은 DNA 복합체의 경우 자기조립단층막(self-assembled monolayers; SAMs)에서의 목표대상물질과 흡착 결합 후 독특한 진동 모드에 기초한 화학적 특정 정보를 제공할 수 있다(Y.C. Cao et. al., Science, 297 (2002) 1536; D. Graham et. al., Analyst, 128 (2003) 692). 그러나, 탐지물질에 표지를 붙이기 위하여 라만 염료(Raman dyes)가 사용되어져야 한다는 측면에서 단점을 가지고 있으며 DNA 및 RNA를 탐지를 위해 나노입자를 사용하는 SERS-기초 유전자 진단방법은 그 응용이 제한되어 왔다(Y.C. Cao et. al., Science, 297 (2002) 1536; D. Graham et. al., Analyst, 128 (2003) 692; K. Fauld et. al., Anal. Chem., 76 (2004) 412; M. Culha et. al., Anal. Chem., 75 (2003) 6196). 이러한 탐지 방법의 두드러진 단점 중 하나는 비용, 복잡성 및 태킹(tagging) 반응의 비효율성이다(Hejazi, MS et. al., (2007) Talanta 71: 1734; Charrier, A et. al., (2006) J. Phys. Chem. B 110: 12896). 최근에는 SERS를 사용한 DNA/RNA 모노뉴클 레오타이드의 마이크로몰이하(sub-micromolar) 탐지가 보고되었다(S.E.J. Bell and N.M.S. Sirimuthu, J. Am. Chem. Soc., 128 (2006) 15580). 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 SERS 스펙트럼이 금 전극(gold electrode)에서 보고되었다(R-Y. Zhang et. al., J. Phys. Chem., B 106 (2002) 11233).

본 발명의 목적은 태그 물질(tagging materials)이나 염색 표지를 사용하지 않고 단시간 내에 DNA내의 단일염기 미스매치를 신속하게 탐지하여 조류로부터 조류독감 바이러스의 감염여부를 비롯한 일반적인 병원균을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 조류독감 바이러스를 비롯한 일반적인 병원균의 신속한 탐지 방법의 개발을 목표로 비변형 금 나노입자를 이용한 SERS에 의한 DNA 혼성화를 사용하였다. 본 발명자들 SERS 방법은 수용액상에서 마이크로몰 이하 농도에서 표지없이도 직접적으로 DNA 종류 및 서열을 확인할 수 있는 가능성을 제시한다.

본 발명은 비변형 금 나노입자를 이용한 표면증강라만분광(surface-enhanced Raman scattering; SERS)에 의한 올리고뉴클레오타이드의 DNA 혼성화를 이용한 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법을 제공한다.

비변형 금 나노입자를 이용한 표면증강라만분광(surface-enhanced Raman scattering; SERS)에 의하여 조류독감 바이러스(avian influenza; AI)와 관련된 올리고뉴클레오타이드에 대하여 DNA 혼성화의 탐지를 수행하였다. SERS 측정을 위한 금 나노입자 용액의 첨가에 앞서서 AI 바이러스의 cDNA와 티올-변형된 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드를 혼성화시켰다. 약 100 nM 이하의 낮은 농도에서 올리고뉴클레오타이드의 SERS 스펙트럼을 얻었다. 본 발명은 SERS가 태그 물질(tagging materials)이나 염색 표지를 사용하지 않고 약 15분 내에 특정 DNA내의 단일염기 미스매치를 신속하게 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명자들은 SERS를 수단으로 하여 비변형된 시트레이트-안정화 금 나노입자에서 올리고뉴클레오타이드의 DNA 혼성화를 조사하였다. 본 발명은 SERS가 어떠한 표지 라만 염료 또는 태깅 물질(tagging material) 없이도 단지 약 15분 내에 마이크로몰 이하의 농도에서 AI 바이러스를 비롯한 일반적인 병원균의 DNA에 단일-염기 미스매치를 신속하게 탐지하는데 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명은 비변형 금 나노입자를 이용한 표면증강라만분광(surface-enhanced Raman scattering; SERS)에 의한 올리고뉴클레오타이드의 DNA 혼성화를 이용한 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법을 제공한다. 본 발명에서 비변형 금 나노입자란, 특별한 개질없이 시트레이트-안정화한 금 나노입자를 말한다.

본 발명의 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법에 있어서, 상기 SERS에 사용된 데이터 획득 시간은 축척(accumulation) 후 대략 10~15분인 것이 바람직하고, 상기 SERS는 DNA 사슬중에서 DNA 염기, 글리코시드 결합 또는 인산염 그룹으로부터의 진동 밴드를 모니터링하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법에 있어서, 상기 탐지 및 단일염기변이 구분방법은 ⅰ) 병원균내의 핵산을 추출 및 정제하는 단계; ⅱ) 상기 정제된 핵산을 증폭시키는 단계; ⅲ) 상기 증폭된 핵산의 특정서열에 상보적인 치올변형 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 수행하는 단계; ⅳ) 상기 혼성화된 이중 가닥 DNA에 금 나노입자를 결합시키는 단계; ⅴ) 상기 금 나노입자가 결합된 이중 가닥 DNA에 라만분광(SERS)을 수행하는 단계; 및 ⅵ) 상기 라만분광 결과를 분석하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법에 있어서, 상기 병원균은 조류독감(avian influenza; AI) 바이러스인 것이 바람직하고, 상기 탐지방법은 ⅰ) 조류내의 바이러스 RNA를 추출, 역전사 및 cDNA를 정제시키는 단계; ⅱ) 상기 정제된 cDNA를 증폭시키는 단계; ⅲ) 상기 증폭된 cDNA의 특정서열에 상보적인 치올변형 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 수행하는 단계; ⅳ) 상기 혼성화된 이중 가닥 DNA에 금 나노입자를 결합시키는 단계; ⅴ) 상기 금 나노입자가 결합된 이중 가닥 DNA에 라만분광(SERS)을 수행하는 단계; 및 ⅵ) 상기 라만분광 결과를 분석하여 조류독감 바이러스의 감염여부를 확인하는 단계를 포함하는 것이 보 다 바람직하다. 또한, 이때 상기 cDNA 증폭은 RNA 바이러스의 경우 RT-PCR로 이루어지는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법에 있어서, 상기 혼성화된 이중 가닥 DNA 농도는 염료 및 표지물질을 사용하지 않는 경우에는 0.1 내지 25 μM인 것이 보다 바람직하고, 염료 및 표지물질을 사용하는 경우에는 1 pM 내지 100 nM인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법에 있어서, 상기 병원균의 핵산 또는 조류독감 바이러스 cDNA 염기서열 크기는 10 내지 50 염기서열 크기를 갖는 것이 바람직하고, 상기 금 나노입자는 시트레이트-안정화(citrate-reduced) 방법으로 화학적으로 합성되는 것이 바람직하고, 상기 금 나노입자의 농도 및 이온 세기는 각각 5~15 x 10^-9 M 및 1~5 x 10^-2 M인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법에 있어서, 상기 라만분광은 15 ㎽의 이상의 에너지(시료에 대해서는 수 ㎽)로 300 nm에서 800 ㎚ 사이의 파장의 레이저 빛 조사로 이루어지는 것이 보다 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 Lee와 Meisel의 방법에 상응하는 방법으로 시트레이트-안정화(citrate-reduced)된 금 나노입자를 화학적으로 합성하였다.

또한, 티올-변형된 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 이와 완전 히 상보적 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 그리고 이와 관련없는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다(표 1 참조).

본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드 서열이 조류독감(AI) 바이러스와 관련된, 보존부위(conservative region), 매트릭스(matrix; M) 단백질을 탐지하도록 고안하고, 세포배양 분리균으로부터 바이러스 RNA를 추출하고, 역전사를 수행하여 cDNA를 합성 및 정제한 후, RT-PCR을 이용하여 cDNA를 증폭하였다.

본 발명자들은 금 나노입자 용액의 UV-vis 흡광도 스펙드럼을 얻고, 632.8 ㎚ 파장의 레이저 빛 조사(20 ㎽)에 의한 라만(Raman) 측정방법을 수행하였다.

표 1에 나열된 서열과 완전히 매치되는 dsDNA를 혼성화시키고 UV-vis 흡수 스펙트럼를 얻은 결과, 완전히 매치된 가닥은 600 ㎚와 800 ㎚ 사이에 UV-vis 흡수 밴드의 광범위한 증가를 야기한다(도 1 참조).

금 나노입자 표면의 SERS 스펙트럼을 4개의 뉴클레오타이드 염기들(아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민) 및 완전히 매치된 dsDNA에 대하여 조사하였다(도 2 참조). 그 결과, dsDNA의 SERS 스펙트럼에서 대부분의 진동 밴드는 각 DNA 염기 때문으로 추정된다. 시료 올리고뉴클레오타이드에서 가장 풍부한 염기는 DNA 시료에서 시토신이다(표 1 참조). ~560, ~800, ~1300 및 1370 ㎝^-1에서 진동 밴드는 시토신에 기인할 수 있다. ~630, ~730, ~1020, ~1200, 및 ~1390 ㎝^-1에서의 진동 밴드는 아데닌에 기인할 수 있다. 또한, ~490, ~990, ~1340, 그리고 ~1390 ㎝^-1 에서의 티민의 몇몇의 강한 밴드와 ~660, ~1260, ~1340, 및 ~1540 ㎝^-1에서의 구아닌의 몇몇의 강한 밴드는 SERS 스펙트럼에서 발견될 수 있다. ~930 ㎝^-1에서의 피크는 DNA 염기 때문이 아니라 글리코시드 C-C 밴드 또는 인산염 그룹의 P-O 스트레칭(stretching) 밴드 중 하나에 기인한 것이다(표 2 참조).

R6G 또는 Cy5와 같은 라만 염료(Raman dyes)를 사용한 DNA 탐지에 대한 SERS 연구와의 비교할 때, 본 발명은 DNA 염기, 글리코시드 결합, 및 인산염 그룹으로부터의 진동 밴드를 모니터링하는 장점을 갖는다.

AI 바이러스의 cDNA와 대조군의 SERS 스펙트럼을 비교할 때, 본 발명은 선택성이 뛰어난다(도 2(e) 및 도 2(f) 참조). 티올-변형된 올리고뉴클레오타이드와 혼성된 AI 바이러스를 위한 cDNA 시료의 SERS 스펙트럼은 완전히 매치된 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드의 스펙트럼과 매우 유사하게 나타난다(표 2 참조).

농도 의존적 SERS 스펙트럼은 매우 민감도가 높다. 완전히 매치된 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드에 대한 200-1800 ㎝^-1 의 파동수 범위에서 연속적인 Au 용액 SERS을 채택한 결과, 3 내지 25 μM 사이에서는 피크가 많은 편차를 나타내지 않았다(도 3 참조). 본 발명은 SERS 방법을 이용하면 서브마이크로몰(sub-micromolar) 수준의 탐지가 달성될 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드의 정량적 측정은 마이크로몰 이하의 농도 범위에서 달성될 수 있다(도 4 참조). 또한, 단일염기변이된 이중가닥과 완전히 매치된 이중 가닥의 SERS 밴드의 상대적 강도 비가 특정 농도 범위에서는 그 세기 달라 이들을 구분하는데 이용될 수 있다(도 5참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 시료의 준비

본 발명자들은 Lee와 Meisel의 방법(P.C. Lee, D. Meisel, J. Phys. Chem., 86 (1982) 3391)에 상응하는 방법에 의하여, 시트레이트-안정화(citrate-reduced)된 금 나노입자를 화학적으로 합성하였다. 결과적으로 생성되는 Au 이온의 농도는 ~10^-3 M이며, 증발된 수분의 양을 고려하지 않는다면, Au 나노입자들의 농도 및 이온 세기는 각각 ~9 x 10^-9 및 ~2 x 10^-2 M로 측정되었다.

첫 테스트의 올리고뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1(티올 변형), 서열번호 2(완전 매치), 서열번호 3(단일염기변이) 및 서열번호 4(대조군)이다. 이때, 서열번호 2는 3'으로부터는 3-TGT TTC GCA GAT GCG ACG TCA GGA GCG AGT-5와 같이 표시될 수 있다. 서열번호 3은 3'으로부터는 중간에 G가 C로 바뀐 3-TGT TTC GCA GAT GCC ACG TCA GGA GCG AGT-5와 같이 표시될 수 있다. 서열번호 4는 3'으로부터 3-GTC AAA GCC CTG GGT-5같이 표시될 수 있다.

시험된 DNA 서열

올리고뉴클레오타이드	서열
프로브(티올 변형)(서열번호 1)	5-ACA AAG CGT CTA CGC TGC AGT CCT CGC TCA-3
완전히 상보적 타겟(서열번호 2)	5-TGA GCG AGG ACT GCA GCG TAG GCA CTT TGT-3
단일염기변이(서열변호3)	5-TGA GCG AGG ACT GCA CCG TAG GCA CTT TGT-3
대조군(비연관 서열)(서열번호 4)	5-TGG GTC CCG AAA CTG-3

본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드 서열이 조류독감(AI) 바이러스를 빠르게 스크리닝하기 위하여, 매트릭스(matrix; M) 단백질을 탐지하도록 고안하였다(M. Zhang et. al., Mol . Immunol., 43 (2006) 2195).

<실시예 2> 스펙트럼의 측정

본 발명자들은 스펙트로포토미터를 사용하여 금 나노입자 용액의 UV-vis 흡광도 스펙드럼을 얻었다. UV-vis 스펙트럼의 데이터 획득시간은 대략 3~4분이다. 지난 보고서(S. Jang et. al., Surf. Interf. Anal., 36 (2004) 43; T. Kim et. al., Langmuir, 21 (2005) 9524)에서 요약되었던 인티그럴 마이크로스코프(Leica DL LM)가 장착된 Renishaw Raman 시스템 모델 1000 스펙트로포토미터를 이용하여, 632.8 ㎚ 빛조사(20 ㎽)에 의한 라만(Raman) 측정방법을 수행하였다. Au SERS 실험을 위한 여기 광원(excitation sources)로 20 ㎽ 공냉식 HeNe 레이저(Melles Griots model LHP 928)로부터 632.8 ㎚를 사용하였다. 스펙트로미터에 적당한 홀로그래픽 노치 필터(holographic notch filter)를 세팅하였다. 펠티에(peltier)로 냉각시킨(-70℃) CCD 카메라(400*600 픽셀)를 사용하여 180^o 지오메트리(geometry)로 라만 분산(Raman scattering)을 탐지하였다. 샘플링 장치로 1.1 ㎜의 외부 직경을 갖는 유리모세관(Chase Scientific)을 사용하였다. 홀로그래픽 회절격자(1800 grooves/㎜), 및 슬릿은 1 ㎝^-1의 스펙트럼 분해능을 가능케 했다. 스펙트로미터를 보정(calibration)하기 위하여, 520 ㎝^-1에서 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)의 라만 밴드(Raman band)를 사용하였고, 스펙트럼의 측정의 정확성은 1 ㎝^-1 정도일 것으로 예측되었다. 라만 스펙트로미터를 IBM-호환 PC에 연결하였으며, GRAMS/32C suite 프로그램(Galactic)에 기초한 Renishaw WiRE 소프트웨어 버전 1.2를 사용하여 스펙트럼 데이터를 분석하였다. SERS 실험에 사용된 데이터 획득 시간은 축척(accumulation) 후 대략 10~15분이었다.

<실시예 3> DNA 혼성화의 특성 분석

NaCl 0.15 M를 포함한 ~50 mM의 인산 완충액(pH 7.4)으로 준비된 올리고뉴클레오타이드를 희석한 후, 이것을 냉동고(-20℃)에 보관하였다. 라만 실험에 앞서서, 올리고뉴클레오타이드의 수용액(1 mM)을 100 μM로 희석하였다. 이중 가닥의 DNA(dsDNA)의 SERS 실험을 위하여, 0.15 M NaCl 및 0.01~0.1 M 인산 완충액(pH 7)내의 2.5 ℓ 올리고뉴클레오타이드를, 0.15 M NaCl 및 0.1 M 인산 완충액내의 이들의 상보적 올리고뉴클레오타이드(0.2 mM, 2.5 ℓ)와 혼성화시켰다. 그리고 나서, 상기 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 용액에 Au 나노입자용액을 15 ㎖를 첨가하여, 25 mM NaCl 및 ~10 mM의 인산 완충액내의 ~20 μM 최종 농도가 되도록 하였다.

<실시예 4> 완전히 매치된 dsDNA의 UV-vis 흡광스펙트럼

이전에 보고(H. Li and L. Rothberg, PNAS, 101 (2004) 14036)와 일치하게 완전히 매치된 단일 가닥과 혼성화된 티올-변형된 올리고뉴클레오타이드의 추가에 의하여 금 나노입자 용액의 색은 변색되었다. Au 나노입자 용액에 첨가되기 전에 표 1에 나열된 바와 같은 서열과 완전히 매치되는 dsDNA를 혼성화시켰다. 금 나노입자의 표면 플라스몬 밴드의 상기 스펙트럼의 변화를 조사하기 위하여 UV-vis 흡수 스펙트럼을 얻었다. 색 변화로부터 예측한 바와 같이, 완전히 매치된 가닥은 600 ㎚와 800 ㎚ 사이에 UV-vis 흡수 밴드의 광범위한 증가를 야기하였다(도 1). Au 나노입자의 표면 플라스몬 밴드의 UV-vis 흡수 스펙트럼 관찰되는 차이를 보다 세밀히 조사하기 위하여, 632.8 ㎚ 파장의 레이저 광원을 조사(irradiation)하여 SERS를 수행하였다.

<실시예 5> 금 나노입자 표면의 SERS 스펙트럼

4개의 뉴클레오타이드 염기들(아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민)의 SERS 스펙트럼을 도 2(a) - 도 2(d)에 제시하였다. 표 1에 나열된 서열의 완전히 매치된 dsDNA의 SERS 스펙트럼은 도 2(e)에 제시하였다. SERS 측정을 위한 Au 나노입자 용액에 첨가하기 전에, 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드의 완전히 매치된 서열을 갖는 티올-변형된 올리고뉴클레오타이드를 혼성화시켰다.

dsDNA의 SERS 스펙트럼에 있어서, 대부분의 진동 밴드는 각 DNA 염기 때문일 수 있다. 예를 들어, 표 1에 제시한 바와 같이, 시료 올리고뉴클레오타이드에서 가장 풍부한 염기는 DNA 시료에서 시토신이다. ~560, ~800, ~1300 및 1370 ㎝^-1에서 진동 밴드는 시토신에 기인할 수 있다. 반면, 티올-변형된 DNA 가닥에서 Au 표면에 가장 가까운 염기는 아데닌이다. 전자기(electromagnetic; EM) 선택 법칙에 따르면, a가 입자의 반지름이고, 금속 표면으로부터 거리가 d라면, SERS 증강 요소들은 (a / a + d)¹²의 요소들에 의해 감소된다고 가정된다(S. Jang et. al., Surf. Interf. Anal. 36 (2004) 43). 이런 측면에서, 아데닌은 EM 선택 규칙으로부터 가장 증강되어야 한다. ~630, ~730, ~1020, ~1200, 및 ~1390 ㎝^-1에서의 진동 밴드는 아데닌에 기인할 수 있다. 사실, 대부분의 진동 피크들은 아데닌 또는 시토신에 기인할 수 있다. 또한, ~490, ~990, ~1340, 그리고 ~1390 ㎝^-1 에서의 티민의 몇몇의 강한 밴드와 ~660, ~1260, ~1340, 및 ~1540 ㎝^-1에서의 구아닌의 몇몇의 강한 밴드는 SERS 스펙트럼에서 발견될 수 있다.

실험조건에 따라 시료 올리고뉴클레오타이드의 SERS 스펙트럼에 대한 ~900 ㎝^-1에서 다소 브로드한 특징이 관찰되었다. 상기 밴드는 4개 DNA 염기의 하나 때문에 기인한 것이 아닐 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 이전의 라만 분석으로부터, ~930 ㎝^-1에서의 피크는 DNA 염기 때문이 아니라 글리코시드 C-C 밴드 또는 인산염 그룹의 P-O 스트레칭(stretching) 밴드 중 하나에 기인한 것이라 생각된다(G.J. Pupple and C. Otto, J. Greve, Biochem., 33 (1994) 3386; R. Santamaria et. al., J. Comp. Chem., 20 (1999) 511; A. Rodriguez-Casado et. al., Biophys. Chem., 124 (2005) 73). 상기 밴드는 완충액 및 콜로이드질의 조건에 매우 민감한 것으로 확인되었다. 상세한 내용은 표 2에 요약한다.

금 나노입자에 SERS 스펙트럼의 스펙트럼 데이터 진동 크기(assignment)^a

ds DNA	AI cDNA	T	C	G	A	Assignmenta
240w		257s	264m	243m	211w	Au-N
376w	370w			374w		G(C-N bend)
491m	489m	490w		491w	490w	T(ring def), G, A (N-H wag)
563w	549w		562w			C(C=O bend, N-C-C or C-C-N bend)
632w	631w				626w	A(N-H wag)
				659s		G(ring breathing)
733s	711s				734s	A(ring breathing)
804w	801w		800s			C(ring breathing)
908m	886b					C-C str (ribose), P-O str (phosphate)
				956m	960w	G(N-C-N def), A(N-C str)
992w		994m	991w	990w		T(NH wag)
1026s	1003s				1023w	A(C-N str)
						A(C-N str)
						Antisymmetric PO2- stretch
1261w	1241w			1263w		G(N-C str, C-H bend)
1306s	1302s		1307s	1300w		C(N-H or C-H bend)
		1341m		1344s	1338m	T(CH3,ring def), G(N-C,), A (C-N str)
	1375w		1373m		1374m	C(bend CH or NH), A(bend CH or NH)
		1397m			1394m	T(CH3 def NH def)
1446w	1450w				1458m	A(ring N=C)
	1540w			1537m		G(ring N=C)
1595s	1595s	1585m				T(C=O str)

^aAssignment는 문헌들(Pupple GJ et al., (1994) Biochem. 33: 3386; Santamaria R et al., (1999) J. Comp. Chem. 20: 511; Rodriguez-Casado A et al., (2005) Biophys. Chem. 124: 73)을 참고. 약어: w; 약함, m; 중간세기, s; 강함, A; Adenine, C; Cytosine, G; Guanine, T; Thymine, def; deformation, str; stretching vibration.

R6G 또는 Cy5와 같은 라만 염료(Raman dyes)를 사용한 DNA 탐지에 대한 SERS 연구와의 비교할 때(Hejazi MS et. al., (2007) Talanta 71: 1734; Charrier A et. al., (2006) J. Phys. Chem. B 110: 12896), 본 발명의 방법은 라만 염료(Raman dye)가 아니라 DNA 염기, 글리코시드 결합, 및 인산염 그룹으로부터의 진동 밴드를 모니터링하는 장점을 갖는다. 본 발명자들의 dsDNA의 SRRS 스펙트럼은 모노뉴클레오타이드(S.E.J. Bell and N.M.S. Sirimuthu, J. Am. Chem. Soc., 128 (2006) 15580)와 dsDNA(R-Y. Zhang et. al., J. Phys. Chem., B 106 (2002) 11233)에 관한 종래 보고의 스펙트럼에 비교할 만하다고 판단된다. 특정 생물학 제제와 관련된 특정 서열을 목표로 하여, 본 발명자들은 상기 표 1의 서열을 갖는 티올-변형된 올리고뉴클레오타이드와 혼성된 AI 바이러스에 대한 cDNA의 SERS 스펙트럼을 얻었다.

<실시예 6> AI 바이러스의 cDNA와 대조군의 SERS 스펙트럼: 선택성

도 2(e) 및 도 2(f)에서 비교한 바와 같이, 티올-변형된 올리고뉴클레오타이드와 혼성된 AI 바이러스를 위한 cDNA 시료의 SERS 스펙트럼은, 표 1의 서열을 갖는 완전히 매치된 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드의 스펙트럼과 매우 유사하게 나타난 것은 주목할 만하다. 표 2에 나열된 바와 같이, 이들의 진동 주파수 및 강도는 본 발명자들의 실험 조건하에서 매우 잘 매치되었다. 본 발명자들의 발견이 AI 바이러스 DNA에 특이적일 수 있음을 확인하기 위하여, 도 2g에 제시한 것과 같이, 본 발명자들은 다른 서열의 DNA 가닥(3-ACG GGA ACT CCT GGA CGC -5)을 실험하였고, 이것은 도 2(e) 및 도 2(f)와 다른 스펙트럼 특징을 갖는 매우 약한 강도를 나타내었다.

<실시예 7> 농도 의존적 SERS 스펙트럼: 민감도

본 발명자들의 탐지방법의 민감도(sensitivity)를 측정하기 위하여, 도 3에서 제시한 바와 같이, 0.1과 25 μM 사이의 농도 범위에서의 완전히 매치된 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드에 대한 200-1800 ㎝^-1 의 파수 영역에서 연속적인 Au 용액 SERS을 채택하였다. SERS 강도는 ~3 μM보다 낮은 농도에서 현저하게 감소되는 반면에, 3 내지 25 μM 사이에서는 피크가 많은 편차를 나타내지 않았다. 본 발명의 결과는 SERS 방법을 이용하여 서브마이크로몰(sub-micromolar) 수준의 탐지가 달성될 수 있음을 제시한다(S.E.J. Bell and N.M.S. Sirimuthu, J. Am. Chem. Soc., 128 (2006) 15580). 또한, 올리고뉴클레오타이드의 정량적 측정은 마이크로몰 이하의 농도 범위에서 달성될 수 있다. 도 4는 올리고뉴클레오타이드의 농도에 따른 ~1300 ㎝^-1 에서의 SERS 밴드 세기의 상관관계를 나타낸다. 비변형된 금 나노입자를 이용한 어떤 특정 DNA 혼성화를 탐지하기 위하여, 본 발명은 신속한 프리스크리닝(pre-screening) 방법으로 SERS가 사용될 수 있음을 암시한다. 아울러, 도 5는 염료(Cy5)를 사용하여 단일염기변이된 이중가닥(a)과 완전히 매치된 이중 가닥(b)의 SERS 밴드의 상대적 강도 비를 농도에 따라 나타낸 것이다. 상기 도 5의 결과는 10 μM 이상(상기 도면에서는 10 내지 100 μM 사이)의 농도에서는 완전히 매치된 이중가닥과 단일염기변이된 이중가닥 사이에 SERS 강도가 비례적으로 나타남을 확인할 수 있으며, 이때 완전히 매치된 이중 가닥이 단일염기변이 된 이중가닥보다 세게 나타나므로, 이들을 구분할 수 있다.

도 1은 첨가 전(a) 및 (b) 단일염기변이된 이중 가닥(~100 nM)과 (c) 완전히 매치된 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드(~100 nM)의 시트레이트-안정화(citrate-reduced)된 금 나노입자 용액들의 UV-Vis 흡광스펙트럼이고,

도 2는 (a) 아데닌(~1 mM), (b) 구아닌(~1 mM), (c) 시토신(~1 mM), 및 (d) 티민(~1 mM)의 DNA 염기에 대한 200-1800 ㎝^-1 파동수 영역에서의 SERS 스펙트럼, (e) 완전히 상보적으로 매치된 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드 및 (f) AI 바이러스 cDNA와 혼성화된 티올-변형된 30-mer 올리고뉴클레오타이드(~25 μM)의 SERS 스펙트럼, (g) 관련없는 서열을 갖는 15-mer 올리고뉴클레오타이드와 티올-변형된 30-mer 올리고뉴클레오타이드의 대조군의 SERS 스펙트럼이고,

도 3은 (a) 25, (b) 10, (c) 3, (d) 0.7, 및 (e) 0.1 μM의 다른 농도에서 이것과 완전히 매치된 혼성화된 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드에 대한 200-1800 ㎝^-1 파수 영역에서의 금 용액(Au sol) SERS 스펙트럼이고,

도 4는 25 μM에서의 그것과 대비되는 ~1300 ㎝^-1 영역에서 SERS 밴드의 상대적 강도 비를 나타낸 그래프이다(이때, 0.1 내지 0.3 μM 사이의 농도에서는 SERS 강도가 비례적으로 나타나며, 마이크로몰 농도 이하(sub-micromolar)의 민감도로 정량적 탐지가 달성될 수 있다. 10% 에러바를 그래프에 삽입한다).

도 5는 염료(Cy5)를 사용한 경우 (a) 단일염기변이된 이중가닥과 (b) 완전히 매치된 이중 가닥과 SERS 밴드의 상대적 강도 비를 농도에 따라 나타낸 그래프이 다(이때, 10 내지 100 μM 사이의 농도에서는 SERS 강도가 비례적으로 나타나며 완전히 매치된 이중 가닥이 단일염기변이 된 이중가닥보다 세게 나타나고 구분될 수 있다).

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Detection Method of Pathogenic Agents Using DNA Hybridization by Surface-Enhanced Raman Scattering Using Unmodified Gold Nanoparticles <130> 2007p-08-098 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thiol Modified Probe <400> 1 acaaagcgtc tacgctgcag tcctcgctca 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary Target <400> 2 tgagcgagga ctgcagcgta ggcactttgt 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single Nucleotide Polymorphism <400> 3 tgagcgagga ctgcaccgta ggcactttgt 30 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unlinkaged Sequence <400> 4 tgggtcccga aactg 15

Claims (12)

1. 금 나노입자를 이용한 표면증강라만분광(surface-enhanced Raman scattering; SERS)에 의한 올리고뉴클레오타이드의 DNA 혼성화를 이용한 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법에 있어서,

   ⅰ) 병원균내의 핵산을 추출 및 정제하는 단계;

   ⅱ) 상기 정제된 핵산을 증폭시키는 단계;

   ⅲ) 상기 증폭된 핵산의 특정서열에 상보적인 치올변형 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 수행하는 단계;

   ⅳ) 상기 혼성화된 이중 가닥 DNA에 금 나노입자를 결합시키는 단계;

   ⅴ) 상기 금 나노입자가 결합된 이중 가닥 DNA에 라만분광을 수행하는 단계; 및

   ⅵ) 상기 라만분광 결과를 분석하는 단계;를 포함하며, 상기 SERS는 DNA 사슬중에서 DNA 염기, 글리코시드 결합 또는 인산염 그룹으로부터의 진동 밴드를 모니터링하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 병원균은 조류독감(avian influenza; AI) 바이러스인 것을 특징으로 하는 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법은

   ⅰ) 조류내의 바이러스 RNA를 추출, 역전사 및 cDNA를 정제시키는 단계;

   ⅱ) 상기 정제된 cDNA를 증폭시키는 단계;

   ⅲ) 상기 증폭된 cDNA의 특정서열에 상보적인 치올변형 올리고뉴클레오타이드 또는 염료변형 올리고뉴클레오타이드 의 혼성화를 수행하는 단계;

   ⅳ) 상기 혼성화된 이중 가닥 DNA에 금 나노입자를 결합시키는 단계;

   ⅴ) 상기 금 나노입자가 결합된 이중 가닥 DNA에 라만분광을 수행하는 단계; 및

   ⅵ) 상기 라만분광 결과를 분석하여 조류독감 바이러스의 감염여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법.
5. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 혼성화된 이중 가닥 DNA 농도는 염료 및 표지물질을 사용하지 않는 경우에는 0.1 내지 25 μM의 감도를 특징으로 하는 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법.
6. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 혼성화된 이중 가닥 DNA 농도는 염료 및 표지물질을 사용하는 경우에는 1 pM 내지 100 nM인 것을 특징으로 하는 병원균의 탐지 및 단일염기변이 구분방법.
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12. 삭제

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