KR101185117B1

KR101185117B1 - 쯔쯔가무시병 진단용 프라이머 및 이를 이용한 쯔쯔가무시병의 진단 방법

Info

Publication number: KR101185117B1
Application number: KR1020100060009A
Authority: KR
Inventors: 김동민
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2010-06-24
Publication date: 2012-10-22
Also published as: WO2011162441A1; KR20110139905A; CN103080312A; HK1184825A1; CN103080312B

Abstract

본 발명은 쯔쯔가무시병을 진단하는 방법에 관한 것으로, 쯔쯔가무시병의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시 (Orientia tsutsugamushi) 균을 검출하기 위하여 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 16s ribosomal RNA 유전자의 염기 서열에 근거한 프라이머를 제작 및 이를 이용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시를 검출하므로써 쯔쯔가무시병을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의한 진단 방법은 기존의 46kDa, 57kDa, groEL 유전자를 증폭하여 비교 분석하는 검사 방법들에 비해 훨씬 우수한 진단적인 정확도를 보일 뿐만 아니라, 비교적 간단하며, 비용-효과적인 측면에서도 우수하다.

Description

쯔쯔가무시병 진단용 프라이머 및 이를 이용한 쯔쯔가무시병의 진단 방법{Primer sets for detecting Orientia tsutsugamushi and detection method using them}

본 발명은 쯔쯔가무시병 진단용 프라이머 및 이를 이용한 쯔쯔가무시병의 진단 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 쯔쯔가무시병의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi)의 16s ribosomal RNA 유전자의 염기 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 이를 이용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시균을 검출하여 쯔쯔가무시병을 진단하는 방법에 관한 것이다.

쯔쯔가무시병은 급성 발열성 질환으로서 오리엔티아 쯔쯔가무시에 의해 감염된 털진드기의 유충에 물려 전염되며, 전신적 혈관염으로 인한 특징적인 임상 양상을 나타낸다. 주요 숙주는 설치류이며 진드기는 숙주이자 매개체이다.

주요 가을철 열성 질환으로서 우리나라에서는 1951년 처음 보고된 이래, 우리나라 전역에서 발생하고 있으며 9월과 11월 사이에 발생하고 있으며, 특히, 우리나라 가을에 발생하는 환자의 30%가 쯔쯔가무시병으로 진단될 만큼 많은 환자가 발생되고 있다.

진드기에 물린 후 1-2 주경에 발열, 오한, 두통, 근육통, 홍반성 구진성 발진이 나타나며, 특징적인 가피(eschar)가 발견되면 신속한 진단에 도움이 된다. 대개 병의 경과가 중하지 않고, 항생제 치료에 잘 반응하나, 진단이 늦어질 경우 폐렴, 급성 신부전, 뇌수막염, 뇌염, 상부 위장관 출혈, 다기관 기능 부전, 심지어 심근 경색이나 중풍의 형태로 나타날 수 있으며, 이러한 합병증으로 일부 환자에서는 사망이 초래될 수 있다. 그러므로 신속하고 정확한 진단이 환자의 예후 개선을 위해 필수적이다.

현재, 쯔쯔가무시 병의 진단은 환자의 혈액으로부터 오리엔티아 쯔쯔가무시 (Orientia tsutsugamushi)를 배양 분리하여 확인하는 방법, 환자의 혈청 내에서 오리엔티아 쯔쯔가무시에 대한 항체를 검출하는 방법 및 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 환자의 혈액 내에서 오리엔티아 쯔쯔가무시의 DNA를 증폭하여 검사하는 방법이 있다.

이 중에서 균체를 배양하여 질병을 진단하는 방법은, 배양에 필요한 시간이 수주 이상 요구되고 있어 실제 환자의 진단 목적으로는 합당하지 못하므로, 주로 진단에 사용되는 검사 방법들은 혈청학적 검사인 간접 면역 형광 항체법, 면역 효소법이 가장 흔히 사용되었다.

그러나, 이 방법들 또한 다른 병원체와 교차 반응으로 위양성 반응이 있고, 증상 발생 후 항체 형성까지 수일이 소요되어 질병의 조기에 내원하여 검사를 시행할 경우 민감도가 낮으며, 확진을 위해서는 추적 검사가 필요하다는 단점이 있다.

다른 진단 방법으로 쯔쯔가무시병을 질병의 초기에 신속하게 진단하기 위해 환자의 혈액에서 PCR법을 이용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시의 특이 유전자를 검출하는 방법이 소개되었다. PCR 법은 전통적인 방법에 의해 이루어지는 컨벤셔널(Conventional) PCR과, 이를 변형하여 컨벤셔널 PCR 보다 100배 더 민감한 네스티드(nested) PCR 및 PCR이 진행되는 중에 결과를 확인할 수 있어 2시간 이내에 결과를 속성으로 확인 할 수 있는 리얼 타임(real time) PCR 등이 있다.

종래의 쯔쯔가무시 병의 PCR 진단방법으로는 46kDa, 57kDa, groEL등 다양한 타겟 단백 유전자 (target protein gene)를 이용한 PCR이 시도되었으며, 컨벤셔널 PCR보다는 네스티드 PCR 및 리얼 타임 PCR법이 주로 이용되었다. 왜냐하면, 46kDa, 57kDa gene을 target으로 컨벤셔널 PCR을 시행할 경우 민감도가 10% 이내로 매우 낮기 때문인데, 다만, 네스티드 PCR의 경우 PCR을 두번 시행하여 민감도를 상승시킴에 따라, 다른 PCR 방법에 비해 소요되는 검사 시간이 더 오래 걸리는 단점이 있고, 리얼 타임 PCR의 경우 검사 장비가 매우 고가여서 의료 기관에서 보편적으로 사용되기에는 제한점이 있다.

따라서, 높은 민감도와 특이도를 보이면서, 대체로 검사 방법이 간단하고 비용이 적은 진단 방법의 개발이 매우 절실한 실정이다.

이에 본 발명자들은 환자의 혈액 검체로부터 오리엔티아 쯔쯔가무시를 쉽고, 간편하게 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 오리엔티아 쯔쯔가무시의 16s ribosomal RNA 유전자 서열 일부를 특이적으로 증폭함으로써 기존의 컨벤셔널 PCR을 이용하면서도 우수한 진단적 정확도를 나타낼 수 있다는 것을 확임함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 컨벤셔널 PCR을 이용하면서도 오리엔티아 쯔쯔가무시의 16s ribosomal RNA 유전자를 증폭하여 오리엔티아 쯔쯔가무시균을 검출하는 방법을 제공한다.

이러한 새로운 검출 방법은, 종래의 컨벤셔널 PCR 검사들의 민감도가 10% 이내로 매우 낮은 단점을 보완하며, 2회 이상의 PCR을 시행하므로써 필요 이상의 인력 및 시간이 소요되고, 잠재적인 오염가능성이 더 높은 네스티드(nested) PCR, 또는 고가의 장비여서 쉽게 구비하지 못하는 등의 문제가 있는 리얼 타임(real-time) PCR 등의 진단적 정확도와 견줄 수 있는 등, 비용-효과적인 측면에서 우월한 검사법이다.

발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 오리엔티아 쯔쯔가무시의 16s ribosomal RNA 유전자 서열을 증폭하여 이를 판별함으로써 오리엔티아 쯔쯔가무시균을 검출하는 방법을 설계하였으며, 이 방법은 오리엔티아 쯔쯔가무시의 16s ribosomal RNA 유전자만을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작함으로써 달성될 수 있다.

상기에서, 본 발명의 프라이머 제작은 우리나라에서 흔한 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령균주에 감염되어 병원에 내원한 환자의 혈액에서 증폭한 보령균주의 16s ribosomal 유전자에 근거하여 디자인하였다.

따라서, 본 발명은 쯔쯔가무시병 의심 환자의 혈액 샘플에 존재하는 16s ribosomal RNA 유전자에 대한 프라이머 및 이 프라이머들을 이용하여 타겟 단백 유전자(target protein gene)를 증폭하는 단계를 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 확인 및 쯔쯔가무시병의 진단 방법을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 함유하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 검출용 PCR 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구 범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 쯔쯔가무시병의 진단 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 쯔쯔가무시병의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)균의 16s ribosomal RNA 유전자의 염기 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 이를 이용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시 균을 검출, 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 의한 진단 방법은 기존의 46kDa, 57kDa, groEL유전자를 증폭하여 분석하는 검사 방법들에 비해 보다 우수한 진단적인 정확도를 보일 뿐만 아니라, 본 발명의 프라이머를 일반적인 PCR 방법인 컨벤셔널 PCR 방법을 수행하여도 비교적 진단적인 정확도가 우수한 네스티드 또는 리얼 타임 PCR 방법보다 진단적 정확도가 우수하며, 게다가 방법적인 측면에서 간단하며, 비용적인 측면에서도 우월한 결과를 도출할 수 있다.

도 1은 본 발명의 16s ribosomal RNA 유전자 유래의 서열 번호 1 및 2로 구성된 프라이머쌍를 이용한 오리엔티아 쯔쯔가무시 검출 방법과 비교 실시예 1-6의 종래의 검출 방법의 진단적 효능성을 receiver operator characteristic (ROC) curve로 비교한 그래프이다.

본 발명은 쯔쯔가무시병을 진단하는 방법에 관한 것으로, 쯔쯔가무시병의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시 (Orientia tsutsugamushi) 균의 16s ribosomal RNA 유전자의 염기 서열을 증폭하기 위한 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR )용 프라이머를 이용한 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 검출 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 쯔쯔가무시병의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시 (Orientia tsutsugamushi) 균의 16s ribosomal RNA 유전자의 염기 서열을 증폭하기 위한 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR )용 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머를 함유하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 검출용 PCR 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은, 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 16s ribosomal RNA 유전자를 증폭할 수 있는 PCR용 프라이머쌍을 제작하고, 이를 이용하여 16s ribosomal RNA 유전자를 증폭하여 검출하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 프라이머는 우리나라에서 흔한 쯔쯔가무시 보령균주에 감염된 환자의 혈액에서 증폭된 16s ribosomal 유전자의 염기 서열에 근거하여 디자인하였다.

또한, 본 발명은 쯔쯔가무시병 의심 환자의 혈액 샘플에 존재하는 16s ribosomal RNA 유전자를 상기 프라이머들을 이용하여 타겟 단백 유전자(target protein gene)를 증폭하는 것을 특징으로 한다.

상기에서, PCR은 중합 효소 연쇄 중합 반응(polymerase chin reation)의 약어로서, 가장 일반적인 컨벤셔널(conventional) PCR, 두 번의 PCR을 동시에 또는 연속해서 수행하는 듀플렉스(duplex) PCR 및 네스티드(nested) PCR, 실시간 결과를 확인할 수 있는 고가의 리얼 타임(real-time) PCR을 모두 포함하며, 가장 바람직하게는 컨벤셔널 PCR이다.

또한, 상기에서 검출용 PCR 키트에는 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 16s ribosomal RNA 유전자를 증폭할 수 있는 PCR용 프라이머쌍 이외에도, 중합 효소 반응에 관여하는 효소, dNTP, 완충 용액, 미네랄 오일, 표준 마커, 염색 시약인 브로모페놀블루 또는 자일렌 FF 등의 PCR용 재료들이 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 균의 검출, 진단 방법에 대해 보다 구체적으로 설명한다. 다음의 실시예는 단지 본 발명을 자세히 설명하기 위한 것으로, 이들에 의해 본 발명의 내용 및 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 프라이머 제작

우리나라에서 흔한 쯔쯔가무시 보령균주에 감염된 환자의 혈액에서 증폭된16s ribosomal 유전자의 염기 서열에 근거하여 디자인하였다. 더 자세하게는. 프라이머는 GenBank Accession No. bankit1356164 HM352765 :O. tsutsugamushi Boryoung Genotype에 대하여, 정방향의 프라이머(position 403-428영역) 및 역방향의 프라이머(position 577-601영역)로 제작하였으며, 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표기하였다. 또한 기타 영역에 대해서도 정방향 및 역방향의 프라이머를 제작할 수 있으며, 각각 서열 번호 3 내지 서열 번호 36으로 표기하였다(표 1 참조).

구분	서 열
서열 번호 1	5′-AGGGATGATAATGACAGTACCTACAG-3′
서열 번호 2	5′-CCTCTACCATACTCTAGCCTAACAG-3′
서열 번호 3	5′-ATTAGTGGCAAACGGGTGAG-3′
서열 번호 4	5′-CACAGGCTTGGTAAGCCATTA-3′
서열 번호 5	5′-GGAATCTGCCCATCAGTACA-3′
서열 번호 6	5′-GCTGTTCGTCCTCTCAGACC-3′
서열 번호 7	5′-TGCTAATACCGTATGCCCTCT-3′
서열 번호 8	5′-CGTGTCTCAGTCCCAGTGTG-3′
서열 번호 9	5′-GGAAAGATTTATCGCTGATGG-3′
서열 번호 10	5′-TGTCCAATATTCCCCACTGC-3′
서열 번호 11	5′-GCGGCAGATTAGGTAGTTGG-3′
서열 번호 12	5′-CATTGCTGGATCAGGCTTTC-3′
서열 번호 13	5′-AAGGTAATGGCTTAGCAAGCCTGTG-3′
서열 번호 14	5′-CAACCCTAAGGCCTTCATCA-3′
서열 번호 15	5′-GGTCTGAGAGGACGAACAGC-3′
서열 번호 16	5′-CGGGGCTTTTTCTGTAGGTA-3′
서열 번호 17	5′-ATATTGGACAATGGGCGAAA-3′
서열 번호 18	5′-TACGCCCAGTAATTCCGAAC-3′
서열 번호 19	5′-TGATGAAGGCCTTAGGGTTG-3′
서열 번호 20	5′-TTAAGCCCTGGGATTTCATC-3′
서열 번호 21	5′-AGAAAAAGCCCCGGCTAACT-3′
서열 번호 22	5′-GAAATTCCATCACCCTCTACCA-3′
서열 번호 23	5′-GTTCGGAATTACTGGGCGTA-3′
서열 번호 24	5′-AGATGACAGCTTTCGCCACT-3′
서열 번호 25	5′-AGGGCTTAACCCTGGAACTG-3′
서열 번호 26	5′-CTCATCGTTTACAGCGTGGA-3′
서열 번호 27	5′-GCTGTCATCTGGGCCATTAC-3′
서열 번호 28	5′-TTAATCTTGCGACCGTACTCC-3′
서열 번호 29	5′-TGGGGAGCAAACAGGATTAG-3′
서열 번호 30	5′-GTAAGGTTTTTCGCGGATCA-3′
서열 번호 31	5′-ATGGTAGTCGCGAAAAATGG-3′
서열 번호 32	5′-AAGGGCCATGATGACTTGAC-3′
서열 번호 33	5′-CAGCTCGTGTCGTGAGATGT-3′
서열 번호 34	5′-CACCGTATCGCATCACTCTG-3′
서열 번호 35	5′-CTACACGCGTGCTACAATGG-3′
서열 번호 36	5′-TGTACAAGGCCCGAGAACGTA-3'

실시예 2. 검체 준비 및 인구 통계

2007년부터 2008년까지 4주 내에 급성 열성 질환으로 일개 병원에 내원한 18세 이상 성인 중에서 가피 또는 홍반성 구진성 발진을 동반하며 두통, 전신 쇄약, 근육통, 기침, 오심, 복통 중에서 2가지 이상을 만족하는 환자들의 혈액 검체를 채취하였다.

혈액 검체에서 오리엔티아 쯔쯔가무시에 대한 간접 면역 형광 항체(IFA)역가가 4배 이상 상승된 경우를 확진으로 정의하여 쯔쯔가무시병 환자군(스크럽 티푸스군)에 포함시켰으며, 발열 대조군(비-스크럽 티푸스군)은 오리엔티아 쯔쯔가무시에 대한 간접 면역 형광 항체가 검출되지 않고 감염내과 전문의의 판단에 의해 혈청학검사(serology), 배양검사(culture), 혈액 바른 표본검사 (peripheral blood smear) 등 여러 진단 검사 방법으로 분명하게 쯔쯔가무시병 이외의 열성질환으로 확인된 환자로 정의하였다.

무작위로 선정된 쯔쯔가무시병으로 확인된 115명과 진단명이 분명하고 발열 대조군(비-스크럽 티푸스)로 확인된 52 명의 혈액검체를 대상으로 하여 실험을 수행하였다. 또한, 인구 통계를 산출하였다. 그 결과는 하기 표 2에 기재하였다.

환자의 인구통계

특징	쯔쯔가무시병 환자군 (스크럽 티푸스군)	발열 대조군 (비-스크럽 티푸스군)	P-values
나이, 중앙값(범위)	69(17-91세)	54(16-93세)	0.0002
성비			NS
남성	39(33.9%)	20(38.5%)
여성	76(66.1%)	32(61.5%)
인구수	115	52	167

표 2에서도 확인할 수 있듯이, 전체 환자에 대한 평균 연령(환자군;66세, 대조군;53세, 중앙값은 각각 69세, 54세)은 쯔쯔가무시병 환자군(스크럽 티푸스군)이 발열 대조군(비-스크럽 티푸스군)에 비해 통계적으로 유의하게 높았다(P=0.0002). 쯔쯔가무시병 환자군(스크럽 티푸스군)과 발열 대조군(비-스크럽 티푸스군)의 성비는 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다.(P=0.693)(표 2)

실시예 3. 본 발명의 프라미어쌍을 이용한 PCR 진단

제작한 프라이머 및 비교 검사 방법의 효능성을 확인하기 위하여 실시예 2에서 준비한 쯔쯔가무시 환자의 검체를 대상으로 하여 DNA를 검출하였다. 자세하게 기술하면, 환자로부터 전혈을 채취하고, 백혈구 연층을 분리한 다음, QIA amp DNA 미니 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 DNA를 분리하였다. 분리 방법은 키트에 동봉된 매뉴얼(manual)에 의해 실시하였다. 분리한 DNA는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 검출을 위한 주형(template)으로 사용하였다.

PCR 진단 방법으로는, 추출된 DNA를 주형으로 하며 컨벤셔널 PCR을 시행하였다. PCR은 AccuPowerTM PCR PreMix (1 U Top polymerase, 250 μM dNTP, 10 mM Tris-HCl(pH9.0); 바이오니아, Daejeon, Korea)에 2 ㎕ 주형 DNA, 각각 1 ㎕씩 5 pmole/μL 정방향 프라이머, 및 역방향 프라이머, 및 16㎕의 멸균 3차 증류수를 첨가하여 총 20㎕의 반응액을 만든 다음 튜브를 잘 혼합하여 Biosystems VeritiTM 96-well Thermal cycler(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 세팅한 다음 PCR을 수행하였다. PCR의 수행 조건은 표 3에 요약하였다.

PCR이 종료된 다음 PCR 최종산물의 확인을 위해 0.5 ng/mL Etbr (Ethidium bromide; Bioneer, Daejeon, Korea)을 넣은 1.5% agarose gel (Seakem^R LE agarose; Cambrex Bio Science, Rockland, ME)을 바이오니아 전기영동 기기 (Bioneer, Korea)로 loading하고, 100 V (1X TAE; Bioneer, Korea) 조건으로 40분 동안 전기 영동하였다.

이때 실험에 사용한 프라이머로는 본 발명의 서열 번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 이용하였으며, 본 발명의 프라이머에 의한 16s ribosomal RNA 유전자의 증폭산물의 크기는 199 bp로 예상되며, 해당 크기의 밴드를 확인함으로써 오리엔티아 쯔쯔가무시 검출 여부를 확인하는 것으로 하였다.

16s 컨벤셔널 PCR의 프라이머 및 반응조건

PCR 반응조건
predenaturation	94℃	2 minutes	36 cycle
denaturation	94℃	1 minutes
annealing	53℃	30 seconds
extension	72℃	45 seconds
extra-extension	72℃	10 minutes

비교 실시예 1~6:

본 발명의 프라이머쌍에 의한 진단 방법의 진단적 정확도를 비교하기 위하여 다음과 같이 비교 실험을 실행하였다. 주형 DNA는 실시예 3에서 제작된 것을 동일하게 사용하였다.

각각의 실험은 쯔쯔가무시 균의 검출에 일반적으로 사용되는 방법인 47kDa에 대한 컨벤셔널 PCR(47kDa C-PCR: 비교 실시예 1), 네스티드 PCR(47kDa N-PCR: 비교 실시예 2), 리얼 타임 PCR(47kDa Q-PCR: 비교 실시예 3)과 56kDa에 대한 컨벤셔널 PCR(56kDa C-PCR: 비교 실시예 4), 네스티드 PCR(56kDa N-PCR: 비교 실시예 5) 및 groEL 유전자에 대한 PCR(groEL C-PCR: 비교 실시예 6)을 수행하여 그 효능성을 비교하였다.

각각의 PCR에 사용한 프라이머는 하기 표 4에 표기한 참고 문헌에 따라 제작하거나, 직접 디자인하여 사용하였으며, 방법은 하기에 설명하였다.

비교실시 PCR에 사용한 프라이머 및 프로브 서열정보

구분	서열명	서열	product size(bp)	Ref
47kD C-PCR/Q-PCR	OtsuFP630	(5’-AACTGATTTTATTCAACTAATGCTGCT- 3’)	118	1
	OtsuRP747	(5’-TATGCCTGAGTAAGATACRTGAATRGAATT- 3’)
	OtsuPR665	[6FAM]TGGGTAGCTTTGGTGGACCGATGTTTAATCT[BHQ1]	probe	1
47kDa N-PCR (External Primer)	OtsuFP555	(5’-TCCTTTCGGTTTAAGAGGAACA-3’)	238
	OtsuRP771	(5’-GCATTCAACTGCTTCAAGTACA- 3’)
47kDa N-PCR (Internal Primer)	OtsuFP630	(5’-AACTGATTTTATTCAACTAATGCTGCT- 3’)	118	1
	OtsuRP747	(5’-TATGCCTGAGTAAGATACRTGAATRGAATT- 3’)
56kD C-PCR	P10	(5’-GATCAAGCTTCCTCAGCCTACTATAATGCC- 3’)	483	2
	P11	(5’-CTAGGGATCCCGACAGATGCACTATTAGGC- 3’)
56kD N-PCR (External Primer)	P34	(5’-TCAAGCTTATTGCTAGATCTGC- 3’)	1003	2
	P55	(5’-AGGGATCCCTGCTGCTGTGCTTGCTGCG- 3’)
56kD N-PCR (Internal Primer)	P10	(5’-GATCAAGCTTCCTCAGCCTACTATAATGCC- 3’)	483	2
	P11	(5’-CTAGGGATCCCGACAGATGCACTATTAGGC- 3’)
groEL C-PCR	STG-F1(TF1)	(5’-ATATATCACAGTACTTTGCAAC- 3’)	366	3
	STG-R1(TR2)	(5’-GTTCCTAACTTAGATGTATCAT- 3’)

1) 컨벤셔널 PCR (C-PCR)

2μL DNA, 각각 1 μL씩 정방향과 역방향 프라이머, AccuPowerTM PCR PreMix (1 U Top polymerase, 250μM dNTP, 10 mM Tris-HCl(pH9.0), 30 mM KCl, 1.5mM MgCl₂, stabilizer and tracking dye; Bioneer, Daejeon, Korea), 멸균된 3차 증류수를 넣어 총 20μL의 반응액을 만들었다.

이때 각 PCR들은 표 4에 기재한 각각의 프라이머를 사용하여, Biosystems VeritiTM 96-well Thermal cycler(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하였으며, 각각의 target gene에 따른 수행 조건은 표 5에 정리하였다.

PCR product는 0.5 ng/mL Etbr (Ethidium bromide; Bioneer, Daejeon, Korea)을 넣은 1.5% agarose gel (Seakemⓡ LE agarose; Cambrex Bio Science, Rockland, ME)에 Bioneer electrophoresis machine (Bioneer, Korea)으로 100 V (1X TAE; Bioneer, Korea)에 40분 동안 전기 영동하여 확인하였다.

			56 kDa			47 kDa			groEL
			온도(℃)	시간(분)	주기 ( cycle )	온도(℃)	시간(분)	주기( cycle )	온도(℃)	시간(분)	주기( cycle )
C- PCR		predenaturation	94	10m	35	94	10m	30	94	10m	35
		denaturation	94	1m		94	1m		94	30s
		annealing	63	1m		60	1m		59	45s
		extension	72	1m		72	1m		72	1m
		extra - extension	72	7m		72	7m		72	7m
N- PCR	1 st	predenaturation	94	10m	35	94	10m	30
		denaturation	94	1m		94	1m
		annealing	61	1m		56	1m
		extension	72	1m		72	1m
		extra - extension	72	10m		72	7m
	2 nd	predenaturation	94	10m	30	94	10m	25
		denaturation	94	30s		94	30s
		annealing	63	30s		60	30s
		extension	72	1m		72	1m
		extra - extension	72	7m		72	7m
Q- PCR		predenaturation				95	10m	45
		denaturation				95	10s
		annealing				60	30s
		cooling				40	30s

2) 네스티드 PCR (N-PCR)

56kDa gene 경우, internal primer로 P10과 P11(5 pmole/μL)을, external primer로 P34 그리고 P55 (5 pmole/μL) 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 PCR의 반응액 제조는 컨벤셔널 PCR의 과정과 같으며, second round PCR의 주형 DNA는 first PCR의 product (1μL/ 20μL total volume)와, 프라이머 P10과 P11(5 pmoles/μL)을 이용하여 수행하였다. 최종 PCR 산물은 1.5 % agarose gel에서 100 V로 전기영동하였다. 또한, 47kDa gene의 경우, 사용되는 프라이머를 제외하고는 56kDa N-PCR 방법과 동일하게 PCR를 시행하였다.

3) 리얼 타임 PCR (Q-PCR)

47 kD gene의 리얼 타임 PCR은 총 20μL의 reaction mixture (5 μL의 genomic DNA, 각각 1μL씩의 5 pmole/μL 정방향과 역방향 프라이머 (OtsuFP630 및 OtsuRP747), 1μL의 2 pmole/μL probe (OtsuPR665), 4μL의 master mix (reaction buffer, FastStart Taq DNA polymerase, MgCl₂, dNTP (dTTP 대신 dUTP)), 및 증류수)로 수행하였다.

리얼 타임 PCR의 수행조건은 95℃에서 10분, 그리고 두 단계의 95℃ 10초, 60℃ 30초를 45주기로 하며, 40℃에서 30초 더 진행하였으며, Light Cycler software 4.0 program으로 결과를 분석했다.

또한, 프로브인 OtsuPR665의 5'과 3'의 말단에 FAM (6-carboxyFluo-rescein)과 BHQ-1 (Black Hole Quencher-1)로 표지하여 사용하였다.

실시예 4: 진단적 정확도의 비교분석.

본 발명의 16s ribosomal RNA 유전자 유래의 서열 번호 1 및 2로 구성된 프라이머쌍를 이용한 오리엔티아 쯔쯔가무시 검출 방법과 다른 검출 방법의 진단적 효능성을 평가하였다.

평가 방법은 민감도와 특이도를 receiver operator characteristic (ROC) curve concept로 표시하였으며, MEDCALC software program (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium, version 11.2.1)을 이용하여 다른 검출 방법들의 결과와 진단적 정확도를 비교 분석 하였으며, 그 결과는 표 6, 도 1 및 하기 <결과>에 나타내었다(표 6, 도 1).

<결과>

본 발명의 PCR 방법에 의한 쯔쯔가무시 병의 진단적 정확도.

쯔쯔가무시병 환자로 확인된 115명과 비-스크럽 티푸스군로 확인되고 진단명이 분명한 52명의 혈액 검체를 이용하여 PCR 검사를 시행하였다. 47kDa C-PCR 검사에서 115명 중에서 3명의 환자(3%)에서 양성을 보였으며, 47kDa N-PCR 검사 결과 115명 중 93명의 환자에서 양성을 확인할 수 있어 81%의 민감도를 확인할 수 있었다.

47kDa Q-PCR을 시행한 경우 38 cp 이상을 음성으로 채택할 때 115명의 쯔쯔가무시병 환자 중 87명의 환자에서 양성을 보여 76%의 양성율을 확인하였다.

56kDa protein gene을 target으로 한 C-PCR 검사에서 115명의 쯔쯔가무시병 환자군에서 9명의 환자에서 양성소견이 관찰되었고, N-PCR 검사상 115명 중에서 92명에서 양성을 보여 80%의 민감도를 보였다.

groEL gene을 target으로 시행한 C-PCR에서 115명의 쯔쯔가무시병 환자군에서 76명이 양성을 보였으며, 66%의 민감도를 보였다.

16s ribosomal RNA gene을 target으로 한 본 발명의 PCR 방법(실시예 3의 C-PCR)의 경우, 쯔쯔가무시병 환자군에서 100명에서 양성을 보여 86%의 민감도를 보였다.

또한, 비-스크럽 티푸스군에서 47kDa Q-PCR 을 시행하여 2명의 혈액 검체에서 양성 소견이 확인되었던 것을 제외할 경우, 비-스크럽 티푸스군에서 시행한 모든 PCR 검사에서 양성 소견을 보인 환자는 없었다.

본 발명의 진단 방법과 비교 실시예의 진단 방법의 진단적 정확도 비교

1) 컨벤셔널 PCR에서 각각의 target gene에 따른 진단적 정확도 비교.

컨벤셔널 PCR의 AUC 값은 다음과 같다. 16s C-PCR의 경우 0.94(95% CI, 0.89-0.97)이었으며, 47kDa C-PCR은 0.51(95% CI, 0.44-0.59), 56kDa C-PCR은 0.54(95% CI, 0.46-0.62), groEL C-PCR은 0.8(95% CI, 0.77-0.88)이었다. 16s C-PCR의 AUC 값은 다른 C-PCR의 경우에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (16s C-PCR vs 47kDa C-PCR, p<0.001; 16s C-PCR vs 56kDa C-PCR, p<0.001). 47kDa C-PCR과 56kDa C-PCR의 AUC 값은 서로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.081)(도 1).

2) 각각의 타겟 단백 유전자(target protein gene)에서 PCR 방법에 따른 진단적 정확도의 비교

47kDa gene을 target으로 PCR을 시행할 경우 C-PCR은 3%(95% CI, 0.5-7.4)의 민감도와 100%(95% CI, 93.2-100)의 특이도를 보였고, N-PCR은 81%(95% CI, 72.5-87.6)의 민감도와 100%(95% CI, 93.2 100)의 특이도를 보였다. 47kDa Q-PCR의 진단 정확도 (diagnostic accuracy)는 38 cp 값을 negative result에 대한 절단값으로 선정할 경우 76%(95% CI, 66.8-83.2)의 민감도와 96%(95% CI, 86.8-99.5)의 특이도를 보였다. AUC는 47kDa N-PCR은 0.9(95% CI, 0.85-0.94), Q-PCR은 0.86(95% CI, 0.8-0.91) 그리고 C-PCR은 0.51(95% CI, 0.44-0.59) 이었으며 각각의 비교에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다.(N-PCR vs C-PCR, p<0.001; N-PCR vs Q-PCR, p=0.012, C-PCR vs Q-PCR, p<0.001)

56kDa gene을 target 으로 PCR을 시행할 경우 C-PCR의 민감도는 8%(95% CI, 3.6-14.3), 특이도 100%(95% CI, 93.2-100)이었고, N-PCR의 민감도 80%(95% CI, 71.5-86.9), 특이도 100%(95% CI, 93.2 100)이었다. AUC(area under the curve)의 경우 N-PCR은 0.9(95% CI, 0.46-0.61), C-PCR은 0.54(95% CI, 0.46-0.62)로 통계적으로 유의한 차이를 보였다(N-PCR vs C-PCR, p<0.001).

47kDa N-PCR 및 Q-PCR, 56kDa N-PCR과 16s ribosomal RNA 유전자에 대한 프라이머를 이용하는 쯔쯔가무시 병 진단 방법에 있어 진단적 정확도를 AUC 값에 따라 비교할 경우, 16s ribosomal RNA에 대한 프라이머를 이용하는 본 발명의 C-PCR 진단 방법은 다른 PCR 진단 방법에 비해 AUC 값이 모든 경우에서 우월한 값을 나타낼 뿐만 아니라, 통계적으로 유의하게 차이를 보였다(16s C-PCR vs 47kDa N-PCR, p=0.017; 16s C-PCR vs 56 kDa N-PCR, p=0.03; 16s C-PCR vs 47kDa Q- PCR, p<0.001)(도 2).

타겟 유전자, PCR 방법에 따른 ROC curve에 의한 진단적 정확도 분석

구 분	민감도/특이도	AUC	p value (실시예 3과의 비교)
실시예 3 (본 발명)	86%/100%	0.94(95% CI, 0.89-0.97)	-
비교실시예 1 (47kDa C-PCR)	3%/100%	0.51(95% CI, 0.44-0.59)	<0.001
비교실시예 2 (47kDa N-PCR)	81%/100%	0.9(95% CI, 0.85-0.94)	0.017
비교실시예 3 (47kDa Q-PCR)	76%/96%	0.86(95% CI, 0.8-0.91)	<0.001
비교실시예 4 (56kDa C-PCR)	8%/100%	0.54(95% CI, 0.46-0.62)	<0.001
비교실시예 5 (56kDa N-PCR)	80%/100%	0.9(95% CI, 0.46-0.61)	0.03
비교실시예 6 (groEL)	61%/100%	0.8(95% CI, 0.77-0.88)	<0.001

다시 말해, 쯔쯔가무시병 진단 방법에 있어 진단적 정확도를 AUC 값에 따라 비교할 경우, 상기 결과들은 16s ribosomal RNA에 대한 프라이머를 이용하는 본 발명의 쯔쯔가무시 병 진단 방법(실시예 3)의 진단적 정확도가 기존의 다른 진단 방법들(비교실시예 1-6)에 비해 우월할 뿐만 아니라, 이러한 차이는 통계적으로 유의하였다. 게다가, 진단학적으로 훨씬 효능성이 좋다고 알려진 네스티드 PCR, 리얼 타임 PCR 방법을 이용하여 47kDa 유전자를 증폭한 검사 결과보다, 본 발명자가 개발한 16s ribosomal RNA 유전자에 대한 프라이머를 이용한 컨벤셔널 PCR 진단방법이 훨씬 진단의 정확도가 우월함을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였으며, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 정확한 실시의 예시일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아니며, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<참고문헌>

1. Jiang J, Chan TC, Temenak JJ, Dasch GA, Ching WM, Richards AL. Development of a quantitative real-time polymerase chain reaction assay specific for Orientia tsutsugamushi. Am J Trop Med Hyg. 2004 Apr;70(4):351-6.

2. Kim DM, Yun NR, Yang TY, Lee JH, Yang JT, Shim SK, et al. Usefulness of nested PCR for the diagnosis of scrub typhus in clinical practice: A prospective study. Am J Trop Med Hyg. 2006 Sep;75(3):542-5.

3. Park HS, Lee JH, Jeong EJ, Kim JE, Hong SJ, Park TK, Kim TY, Jang WJ, Park KH, Kim BJ, Kook YH, Lee SH. Rapid and simple identification of Orientia tsutsugamushi from other group rickettsiae by duplex PCR assay using groEL gene. Microbiol Immunol. 2005;49(6):545-9.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 쯔쯔가무시병 진단용 프라이머쌍.
서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머쌍을 포함하는 쯔쯔가무시병 진단용 PCR 키트.
제2항에 있어서, 상기 PCR 키트는 컨벤셔널 PCR에 사용되는 것을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 진단용 PCR 키트.
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서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 포함하는 16S 리보솜 RNA 유전자를 증폭하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 검출용 PCR 키트.