KR101170812B1 - Composition for controlling plant diseases comprising stigmasterol as active components and uses thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스티그마스테롤(stigmasterol) 화합물 또는 이를 포함하는 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방제용 조성물은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 다양한 식물병에 대하여 높은 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 천연물 살균제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
The present invention is a stigmasterol compound or Dipsacus containing the same The present invention relates to a plant disease control composition containing the plant extract as an active ingredient and a plant disease control method using the same.
The control composition according to the present invention is derived from natural products and is harmless to the human body and exhibits high control activity against various plant diseases without causing environmental pollution, and thus is useful for the development of environmentally friendly natural product disinfectants and the production of high value-added organic products. Can be used.

Description

스티그마스테롤을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도{Composition for controlling plant diseases comprising stigmasterol as active components and uses thereof}Composition for controlling plant diseases comprising stigmasterol as active components and uses approximately}

본 발명은 스티그마스테롤(stigmasterol) 화합물 또는 이를 포함하는 천속단(Dipsacus asperoides 또는 D. asper), 산토끼꽃(Dipsacus japonicus) 등을 포함하는 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.The present invention is a stigmasterol (stigmasterol) compound or a compound containing the same ( Dipsacus asperoides or D. asper ), hare ( Dipsacus) Dipsacus , including japonicus ), and the like. The present invention relates to a plant disease control composition containing the plant extract as an active ingredient and a plant disease control method using the same.

작물 재배시 많은 식물병원균, 해충 및 잡초들이 작물의 생장에 저해를 일으켜, 이들에 대한 방제를 실시하지 않을 경우 작물에 따라서는 30 내지 100%의 수확량 감소가 야기된다. 이러한 유해 생물을 방제하기 위하여 지금까지 많은 합성농약들이 개발되고 사용되어 왔으나 식물병, 해충 및 잡초방제에 오?남용됨에 따라 인축에 대한 독성, 지하수 오염, 환경오염, 생태계 교란, 저항성 유해생물 증가 등 여러 가지 문제점들이 야기되고 있다. 이에 따라 우리나라를 포함한 OECD 가입국들을 중심으로 합성농약의 사용량을 40% 감축하고자 하는 친환경농업정책을 시행 중에 있다. 이러한 정책의 일환으로, 합성농약의 대안으로 떠오르는 기술이 바로 생물농약이다. Many phytopathogens, pests and weeds inhibit crop growth in crop cultivation, resulting in a yield reduction of 30 to 100%, depending on the crop if not controlled. Many synthetic pesticides have been developed and used to control these harmful organisms, but they have been used for plant diseases, pests, and weed control, so they are toxic to livestock, groundwater contamination, environmental pollution, ecosystem disturbance, and resistance to harmful organisms. Various problems are caused. As a result, eco-friendly agricultural policies are being implemented to reduce the use of synthetic pesticides by 40%, especially among OECD member countries including Korea. As part of this policy, bio-pesticides are emerging as an alternative to synthetic pesticides.

생물농약에는 미생물농약과 생화학농약이 있으며, 생물농약은 환경친화적 작물보호제로서 합성농약과는 달리 인축 및 생태계에 안전하여 부가가치가 높은 농산물을 생산할 수 있고, 합성농약으로 방제하기 어려운 병해충을 효과적으로 방제하여 안전한 농작물의 생산을 증대시킴과 동시에 합성농약의 오남용으로 인한 문제점을 해결할 수 있다. 국내의 경우 미생물농약에 대한 연구는 많이 이루어져 등록된 미생물농약이 다수 있지만, 천연물을 이용한 생화학농약의 경우 2005년에 등록규정이 마련되었음에도 불구하고 아직 등록된 생화학농약은 없는 실정이다. Bio pesticides include microbial pesticides and biochemical pesticides, which are environmentally friendly crop protection agents. Unlike synthetic pesticides, biopesticides can produce high value-added agricultural products because they are safe for human beings and ecosystems, and effectively control pests that are difficult to control with synthetic pesticides. Increase the production of safe crops and at the same time solve the problems caused by misuse of synthetic pesticides. In Korea, many researches on microbial pesticides have been made, but biochemical pesticides using natural products have not yet been registered, although registration regulations were established in 2005.

전 세계적으로 식물 추출물들을 이용하여 상품화에 성공하여 시판되고 있는 살균제 제품은 2004년 현재 5개이며, 가장 대표적인 것이 밀사나(Milsana™)이다. 이 제품은 왕호장근(Reynouria sachalinensis)의 추출물을 이용하여 개발된 친환경살균제로서, 식물병원균을 직접 치사시키는 효과보다는 식물체에 저항성을 유도함으로써 흰가루병에 대한 방제효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 또한, 천연물 살균제로서 등록되어 있는 신남알데하이드(cinnamaldehyde)는 카시아 식물체(Cassia tora)의 종자로부터 추출되는 오일로서 살충활성 뿐만 아니라 버티실리엄(Verticillium ) 속, 리족토니아(Rhizoctonia ) 속, 피티엄(Pythium) 속 및 후사리움 모니리폼 (Fusarium moniliforme var. subglutinans)(근류병: canker disease) 등의 식물병원균들에 대해서도 살균활성이 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 호호바(jojoba) 종자로부터 추출되는 호호바 오일은 살충활성 뿐만 아니라 흰가루병에 대하여 살균활성이 있다. 마클레아이아(Macleaya) 속 추출물은 죽자초(Macleaya cordata) 추출물로서 흰가루병과 알터나리아(Alternaria) 속 잎점무늬병과 셉토리아(Septoria) 속 잎점무늬병 등에 효과가 있다. 또한, 올레산을 주성분으로 하는 지방산도 흰가루병에 효과가 있다.There are five fungicide products on the market that have been successfully commercialized using plant extracts worldwide. As of 2004, Milsana ™ is the most representative. This product is an eco-friendly disinfectant developed using the extract of Reynouria sachalinensis , and it has been shown to control powdery mildew by inducing resistance to plants rather than directly killing phytopathogens . Moreover, cinnamic aldehyde (cinnamaldehyde), which is registered as a natural product fungicides Cassia plant as an oil extracted from the seeds of (Cassia tora), as well as insecticidal activity cavity chamber William (Verticillium), A Li Estonian (Rhizoctonia), A repetition moth (Pythium Genus and Husarium Moniform ( Fusarium) moniliforme var. It has been reported to have bactericidal activity against phytopathogens such as subglutinans (canker disease). In addition, jojoba oil extracted from jojoba seeds is not only insecticidal but also has bactericidal activity against powdery mildew. Macleaya genus extract is Macleaya cordata ) extract is effective in powdery mildew, leaf spot disease of Alternaria , and leaf spot disease of Septoria . In addition, fatty acids based on oleic acid are also effective in powdery mildew.

한편, 천속단(Dipsaci Radix)은 산토끼과(Dipsacaceae)에 속하는 천속단(Dipsacus asperoides 또는 D. asper) 및 산토끼꽃(D. japonicus) 등의 뿌리로서 한약재로서 널리 사용되고 있으며, 살균작용, 항종류(抗腫瘤)작용, 지혈(止血)작용, 진통작용 및 자궁발육촉진작용 등이 있는 것으로 보고되고 있다. 천속단(또는 속단)의 용도와 관련하여 뇌기능개선 조성물(대한민국특허 제2004-0111336호), 아세틸콜린에스테라제 저해제 조성물(대한민국특허 제2003-0031035호) 및 디프사쿠스 사포닌(Dipsacus saponin C)를 유효성분으로 하는 비마약성 중추 진통제(대한민국특허 제1995-0019839호) 등이 보고되어 있다.Meanwhile, Dipsaci Radix is a genus Dipsacus belonging to the genus Dipsacaceae. asperoides Or D. asper ) and D. japonicus , which are widely used as herbal medicines, and have bactericidal, anti-type, hemostatic, analgesic and uterine growth promoting activities. It is reported. Brain function improving composition (Korean Patent No. 2004-0111336), acetylcholinesterase inhibitor composition (Korean Patent No. 2003-0031035) and Dipssacus saponin (Dipsacus saponin C) Non-narcotic central analgesic (Korean Patent No. 195-0019839), etc., as an active ingredient has been reported.

한편, 식물스테롤은 β-sitosterol(베타-시토스테롤), campesterol(캄페스테롤) 및 stigmasterol(스티그마스테롤)로 구성되어 있으며, 일반적으로 과일, 채소, 견과류, 곡류, 옥수수, 콩과류 등을 포함하여 식물계에 널리 존재하며, 그 분자구조는 콜레스테롤과 매우 유사하다. 식물스테롤은 장에서 콜레스테롤의 흡수를 차단해 주고, 혈관에 쌓인 콜레스테롤을 감소시켜 주는 역할을 한다. 이러한 효능으로 인하여 식물스테롤은 현재 제약 및 화장품 분야 뿐만 아니라 식품/음료 분야에 있어서도 널리 이용되고 있다. 식물스테롤의 시장 규모는 2005년 1억 8460만 달러에서 2012년 3억 9520만 달러로 성장할 것으로 예측되고 있다. On the other hand, phytosterols are composed of β-sitosterol (beta-sitosterol), campesterol (campesterol) and stigmasterol (Stigmasterol), and generally includes vegetable, including fruits, vegetables, nuts, grains, corn, legumes, etc. It is widely present in, and its molecular structure is very similar to cholesterol. Phytosterols block the absorption of cholesterol in the intestine and reduce cholesterol in the blood vessels. Because of this efficacy, plant sterols are widely used in food and beverage fields as well as pharmaceutical and cosmetic fields. Phytosterols are expected to grow from $ 184.6 million in 2005 to $ 395.2 million in 2012.

식물스테롤과 관련해서는 고지혈증, 동맥경화증 및 간질환 예방 및 치료용 조성물(대한민국특허 제2005-0069410), 식물스테롤 함유 식품 및 이의 제조방법(대한민국특허 제2004-0098017), 식물스테롤 또는 식물스테롤 에스테르를 함유하는 식용유지의 제조 방법(대한민국특허 제2004-0019189), 식물스테롤, 헤스페리딘 및 루틴을 포함하는 고지혈증, 동맥경화증 및 간질환 예방 및 치료용 조성물(대한민국특허 제2003-0101482) 등에 대한 특허가 우리나라에 출원되어 있다. 식물스테롤의 항진균활성에 대한 보고는 몇몇 있으며, 이들의 대부분은 베타-시토스테롤에 대한 내용이다. 캄페스테롤과 스티그마스테롤의 항진균활성에 대해서는 거의 보고된 바 없다. 베타-스토스테롤의 경우에도 대상 곰팡이에 따라 항진균활성이 매우 다른 것으로 보고되고 있다. Kiprono 등(2000년)은 Senecio lyratus(Asteraceae)에서 분리한 베타-시토스테롤이 Fusarium속 균의 균사생육은 억제하나, Penicillum속 균의 생장은 억제하지 않는다고 보고하였다(Z. Naturforsch. 55c:485-488). F. Kawamura 등(2004)은 Malaysian Gmelia arborea(Verbenaceae)로부터 4개의 리그난 물질과 베타-시토스테롤을 분리하였는데, 이들 중 4개의 리그난 물질들은 두 개의 담자균, 즉 Tramees versicolorFomitopsis palustris의 균사생육을 저해하지만, 베타-시토스테롤은 이들 두 개의 담자균에 대하여 전혀 활성이 없다고 보고하였다(Holzforschung 58:189-192). 그리고 Lall 등(2006)은 Euclea natalensis(Ebenaceae)에서 분리한 베타-시토스테롤이 Aspergillus niger , A. flavusCladosporium cladosporioides의 균생생육은 저해하지만, Phytophthora속 균의 균사생육은 거의 저해하지 못한다고 보고하였다(South African J. Bot. 72:579-583). 천연물질이든 합성화합물이든 많은 경우 시험관 내(in vitro)에서의 균사생육 저해효과와 생체 내(in vivo)에서의 식물병에 대한 방제활성은 상당히 다르다. 베타-시토스테롤의 경우 시험관 내에서 일부 진균에 활성이 있다고 보고된 바는 있지만, 식물병에 대한 생체 내 항진균활성은 전혀 보고된 바가 없다. 한편, 캄페스테롤과 스티그마스테롤의 항진균활성에 대해서는 거의 보고된 것이 없다.In relation to phytosterol, a composition for preventing and treating hyperlipidemia, atherosclerosis and liver disease (Korean Patent No. 2005-0069410), food containing phytosterol and a method for preparing the same (Korean Patent No. 2004-0098017), phytosterol or phytosterol ester Patent for a method for preparing edible oils containing (Korean Patent No. 2004-0019189), a composition for preventing and treating hyperlipidemia, arteriosclerosis and liver disease, including phytosterol, hesperidin and rutin (Korea Patent No. 2003-0101482) Filed in There are several reports of the antifungal activity of phytosterols, most of which are for beta-sitosterol. Little anti-fungal activity of camphorsterol and stigmasterol has been reported. In the case of beta-stosterol, antifungal activity is reported to be very different depending on the fungus. Kiprono, etc. (2000) are Senecio Beta-sitosterol isolated from lyratus (Asteraceae) It has been reported that the mycelial growth of Fusarium spp. Is inhibited but not the growth of Penicillum spp. (Z. Naturforsch. 55c: 485-488). F. Kawamura et al. (2004) report Malaysian Gmelia Four lignans and beta-sitosterols were isolated from arborea (Verbenaceae), four of which were lignans, or two biliary bacteria , Tramees versicolor with Fomitopsis Although it inhibited the mycelial growth of palustris , beta-sitosterol was reported to be inactive against these two basidiomycetes (Holzforschung 58: 189-192). And Lall et al. (2006) reported that Aspergillus was a beta-sitosterol isolated from Euclea natalensis (Ebenaceae). niger , A. flavus and Cladosporium It has been reported that the fungal growth of cladosporioides is inhibited, but the mycelial growth of Phytophthora is hardly inhibited (South African J. Bot. 72: 579-583). In many cases, whether natural products or synthetic compounds in vitro (in mycelial growth inhibitory effect and in vivo (in the in vitro) vivo , the control efficacy against plant diseases is quite different. Beta-sitosterol has been reported to be active against some fungi in vitro, but no in vivo antifungal activity against plant diseases has been reported. On the other hand, little is reported about the antifungal activity of camphorsterol and stigmasterol.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 역병(Phytophthora infestans) 및 벼 도열병에 대하여 우수한 생체 내 항진균활성을 보이는 천속단 뿌리로부터 항진균활성 물질을 분리 및 동정한 결과, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤 및 스티그마스테롤이 이들 식물병에 대하여 효과가 있다는 사실을 발견하였다. 이에, 식물 스테롤 및 이를 포함하는 식물 추출물이 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제활성을 나타냄을 발견하고, 이를 식물병 방제를 위한 천연물 살균제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present invention has been made by such a demand, the present inventors have a tomato gray mold ( Botrytis cinerea ), tomato plague ( Phytophthora Isolation and identification of antifungal actives from the gentian roots with excellent in vivo antifungal activity against infestans ) and rice blasts revealed that beta-sitosterol, campestrol and stigmasterol are effective against these plant diseases. . Accordingly, the present invention was completed by confirming that the plant sterol and the plant extract including the same exhibit excellent control against various plant diseases, and confirming that it can be used as a natural fungicide for controlling plant diseases.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 다양한 식물병에 대해 우수한 방제활성을 나타내는 환경친화적인 식물병 방제용 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides an environmentally friendly plant disease control composition derived from natural products, harmless to the human body and exhibiting excellent control against various plant diseases without causing environmental pollution.

또한, 본 발명은 상기 방제용 조성물을 이용한 식물병의 방제방법을 제공한다.The present invention also provides a method for controlling plant diseases using the composition for controlling the above.

본 발명에 따르면, 천속단 뿌리 추출물을 유효성분으로 하는 본 발명의 방제용 조성물은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 토마토 역병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 등의 식물진균병에 대한 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 천연물 살균제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다.According to the present invention, the composition for the control of the present invention using the cheonssan root extract as an active ingredient is harmless to the human body without originating from natural products and does not cause environmental pollution, tomato blight, rice blast, rice leaf blight blight, tomato gray mold Since it exhibits control against plant fungal diseases such as diseases, it can be usefully used for the development of environmentally friendly natural product disinfectants and the production of high value-added organic products.

도 1은 식물스테롤의 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대한 생체 내 항균활성을 나타낸 것이다.
도 2는 분리한 캄페스테롤(A)과 라이브러리 캄페스테롤(B)의 질량스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 분리한 스티그마스테롤(A)과 라이브러리 스티그마스테롤(B)의 질량스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 분리한 베타-시토스테롤(A)과 라이브러리 베타-시토스테롤(B)의 질량스펙트럼을 나타낸 것이다.
Figure 1 shows the antimicrobial activity in vivo against tomato gray mold and tomato late blight of phytosterols.
Figure 2 shows the mass spectrum of the isolated camphorsterol (A) and library campestrol (B).
Figure 3 shows the mass spectrum of the separated stigmasterol (A) and library stigmasterol (B).
Figure 4 shows the mass spectrum of the isolated beta-sitosterol (A) and library beta-sitosterol (B).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1(베타-시토스테롤), 화학식 2(캄페스테롤) 및 화학식 3(스티그마스테롤) 등의 식물스테롤 화합물 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다:In order to achieve the object of the present invention, the present invention contains a plant sterol compound, such as formula (beta-sitosterol), formula (2) (campsterol) and formula (3) (stiggsterol) or a plant extract containing the same as an active ingredient To provide a composition for controlling plant diseases:

Figure 112011074681170-pat00001
Figure 112011074681170-pat00001

Figure 112011074681170-pat00002
Figure 112011074681170-pat00002

Figure 112011074681170-pat00003
Figure 112011074681170-pat00003

또한, 본 발명은 상기 방제용 조성물을 작물 또는 토양에 처리하여 다양한 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.
In addition, the present invention provides a method for controlling various plant diseases by treating the control composition to crops or soil.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으며, 다양한 식물병에 대하여 높은 방제활성을 나타내는 상기 화학식 1 내지 3의 식물스테롤 화합물 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.The present invention is derived from natural products are harmless to the human body and do not cause environmental pollution, plant diseases comprising the plant sterol compound of the formula (1 to 3) or a plant extract containing the same as an active ingredient exhibiting high control against various plant diseases Provided is a composition for controlling.

본 발명에서 다양한 식물병에 대하여 방제활성을 나타내는 바람직한 화합물로는 상기 화학식 1의 베타-시토스테롤, 화학식 2의 캄페스테롤, 화학식 3의 스티그마스테롤을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Preferred compounds exhibiting control activity against various plant diseases in the present invention may be a beta-sitosterol of Formula 1, camphorsterol of Formula 2, stigmasterol of Formula 3, but is not limited thereto.

본 발명에 사용되는 식물재료로는 천속단(Dipsacus asper)을 포함하여 천속단(Dipsacus asperoides), 산토끼꽃(D. japonicus) 등을 포함하는 산토끼과(Dipsacaceae), Senecio lyratus가 속하는 국화과(Asteraceae=Compositae), Gmelia arborea이 속하는 마편초과(Verbenaceae), Euclea natalensis이 속하는 감나무과(Ebenaceae), Discorea alata가 속하는 마과(Dioscoreaceae)(Aderiye 등, 1996, Folia Microbiologica 41:407-412) 등의 식물을 사용할 수 있다.Of the plant material used in the present invention, including a cloth speed (Dipsacus asper) cloth speed (Dipsacus Dipsacaceae, including asperoides ), D. japonicus , and Senecio Asteraceae belongs lyratus (Asteraceae = Compositae), Gmelia arborea the verbenaceae (Verbenaceae), Euclea belonging Ebenaceae belonging to natalensis , Discorea Plants such as Dioscoreaceae belonging to alata (Aderiye et al., 1996, Folia Microbiologica 41: 407-412) can be used.

바람직하게는 상기 식물 추출물은 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물추출물이며, 더욱 바람직하게는 천속단(Dipsacus asperoides 또는 D. asper) 또는 산토끼꽃(Dipsacus japonicus) 추출물이다.Preferably the plant extract is a plant extract of the genus Dipsacus , more preferably Dipsacus asperoides or D. asper ) or hare ( Dipsacus) japonicus ) extract.

본 발명에 따른 식물 추출물은 식물스테롤을 포함하는 다양한 식물 조직을 유기용매로 추출함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에서 추출용 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올과 같은 저급알콜 또는 이의 수용액, 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌클로라이드 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 건조시킨 천속단 뿌리 1 ㎏에 약 5 내지 20 ℓ, 바람직하게는 8 내지 12 ℓ의 저급 알콜을 가하고 20 내지 60℃, 바람직하게는 상온에서 6시간 내지 3일 동안 침출시켜 저급 알콜 추출물을 얻은 후, 이를 다른 유기용매로 추가로 추출하여 유기용매 추출물을 얻는다. 이때, 사용가능한 유기용매로는 헥산, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 에틸에테르 등을 예시할 수 있다. 본 발명에서는 또한 당분야에서 통상적으로 사용되는 분획 공정을 수행할 수도 있다.The plant extract according to the present invention can be prepared by extracting various plant tissues including phytosterols with an organic solvent. In the present invention, the extraction organic solvent may be used alone or mixed with a lower alcohol such as methanol, ethanol, propanol, butanol or an aqueous solution thereof, hexane, ethyl acetate, acetone, methylene chloride and the like. For example, about 5-20 L, preferably 8-12 L, lower alcohol is added to 1 kg of dried Cheondan root and leached at 20-60 ° C., preferably at room temperature for 6 hours to 3 days to lower alcohol. After obtaining the extract, it is further extracted with another organic solvent to obtain an organic solvent extract. At this time, the organic solvent that can be used may include hexane, ethyl acetate, methylene chloride, chloroform, acetone, methanol, ethanol, ethyl ether and the like. In the present invention, it is also possible to carry out the fractionation process commonly used in the art.

상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 식물스테롤은 식물 추출물로부터 분리?정제하거나 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 식물스테롤의 화학적 합성 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있다.Phytosterols represented by Chemical Formulas 1 to 3 may be separated or purified from plant extracts or chemically synthesized. Chemical synthesis method of the phytosterol may use a general method known in the art.

구체적으로, 방제활성을 갖는 상기 3종의 식물스테롤은 천속단 등의 식물 조직의 유기용매 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 분리?정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이때, 사용가능한 컬럼은 실리카겔 컬럼, 역상실리카겔 컬럼 또는 세파덱스 컬럼 등이 있고, 용출액으로는 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 저급알콜 등과 같은 유기용매 및 이들의 혼합액을 사용할 수 있다.Specifically, the three phytosterols having a control activity may be prepared by a method comprising the step of separating and purifying the organic solvent extract of plant tissues such as Cheondan by column chromatography. In this case, the column may be a silica gel column, a reverse phase silica gel column or a Sephadex column, and the eluent may be an organic solvent such as hexane, ethyl acetate, chloroform, methylene chloride, acetone, lower alcohol, and a mixture thereof.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 식물진균병을 효과적으로 방제할 수 있으며, 식물진균병은 바람직하게는 토마토 역병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 또는 토마토 잿빛곰팡이병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 천속단 뿌리의 메탄올 추출물, 이로부터 분리?정제된 베타-시토스테롤, 캄페스테롤 및 스티그마스테롤은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병에 대하여 방제활성을 나타낸다 (표 1 및 2 참조).The plant disease control composition of the present invention can effectively control the plant fungus, plant fungal disease is preferably tomato late blight, rice blast, rice leaf blight blight, or tomato ash fungus disease, but is not limited thereto. Methanol extracts of Cheondan Root according to the present invention, isolated from purified beta-sitosterol, camphorsterol and stigmasterol show control activity against rice blast, rice leaf blight, tomato ash mold and tomato blight (Table 1 and 2).

따라서, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병에 대해 우수한 방제활성을 나타내는 천연물 살균제로 유용하게 사용될 수 있다.Thus, a composition containing beta-sitosterol, campestrol, stigmasterol, or a plant extract comprising the same as an active ingredient is innocuous to humans and does not cause environmental pollution, but is a rice blast, rice leaf blight, tomato gray mold and It can be usefully used as a natural product fungicide showing excellent control against tomato late blight.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 단독으로 포함할 수 있지만, 식물진균병, 특히 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병을 방제하는데 효과적인 것으로 알려진 기존의 시리네올 A(ciryneol A), 시리네올 C(ciryneol C), 1-헵타데신-11,13-다이인-8,9,10-트리올(1-heptadecene-11,13-diyne-8,9,10-triol), 마그놀롤(magnolol), 호노키올(honoliol), 4-메톡시호노키올(4-methoxyhonokiol), 그리세오풀빈(griseofulvin) 및 카스가마이신(kasugamycin) 등의 천연 화합물과 같이 이용될 수도 있다.The composition for controlling plant diseases of the present invention may include beta-sitosterol, camphorsterol, stigmasterol, or a plant extract containing the same alone, but plant fungal diseases, especially rice blast, rice leaf blight, tomato ash fungus And conventional ciryneol A, ciryneol C, 1-heptadecine-11,13-dyne-8,9,10-triol, which are known to be effective in controlling tomato late blight. heptadecene-11,13-diyne-8,9,10-triol), magnolol, honoliol, 4-methoxyhonokiol, griseofulvin and casga It may also be used with natural compounds such as kaisugamycin.

본 발명의 방제용 조성물은 통상적으로 이용되는 살충제 또는 살균제에 함유되는 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 활성성분 이외에 부형제로 약제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 활성성분과 상기 부형제를 혼합한 방제용 조성물을 농약분야에 공지된 다양한 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있으며, 제제화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제제화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다.The control composition of the present invention may further include a substance contained in a commonly used insecticide or fungicide, and in addition to the active ingredient, a pharmaceutically acceptable solid carrier, liquid carrier, liquid diluent, liquefied gas diluent as an excipient , Solid diluents, or other suitable auxiliaries such as emulsifiers, dispersants or foaming agents. The composition for controlling the active ingredient and the excipients may be formulated into various formulations known in the pesticide field. For formulation, any formulation method commonly used in the pesticide field may be used.

본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.
The control composition of the present invention may preferably be formulated in a hydrated, granulated, powdered, emulsified, sprayed, smokescreen, capsule and gelled formulation and contacted through a formulation such as a donut for buoyancy of the formulation. Preferably provided as.

본 발명의 방제용 조성물은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병을 효과적으로 방제하기 위하여 식물 추출물은 10 ㎍/㎖ 내지 3,000 ㎍/㎖의 농도로, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤은 각각 50 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 것이 바람직하나, 이는 작물의 종류, 생육 정도, 경작지 환경, 식물병의 발병 정도 등을 고려하여 적절하게 조절할 수 있다. In order to effectively control rice blast, rice leaf blight, tomato ash fungus and tomato late blight, the composition of the present invention is a plant extract at a concentration of 10 μg / ml to 3,000 μg / ml, beta-sitosterol, camphorsterol, The stigmasterol is preferably included at a concentration of 50 μg / ml to 500 μg / ml, respectively, but it may be appropriately adjusted in consideration of the type of crop, the degree of growth, the environment of cropland, and the incidence of plant diseases.

상기와 같이 제형화된 본 발명의 방제용 조성물을 방제가 필요한 식물체 또는 지역에 처리함으로써 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 또는 토마토 역병을 방제할 수 있다. 바람직한 방법은 상기 방제용 조성물을 식물 병원균과 직접 접촉할 수 있도록 적용하여 방제하는 것으로, 토양에 혼화 처리하거나 작물에 직접 분무하는 방법이 가장 바람직하다.
By treating the control composition of the present invention formulated as described above to plants or areas requiring control, rice blast, rice leaf blight, tomato gray mold disease or tomato late blight can be controlled. The preferred method is to apply the control composition so as to be in direct contact with the plant pathogens to control, the most preferred is a method of mixing the soil or spraying directly to the crop.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

<< 실시예Example 1> 천속단 뿌리 추출물의  1> Heavenly Root Extract 식물병에In plant diseases 대한 방제활성 Control activity

시중에서 구입한 천속단(D. asper)의 뿌리 건조시료 3 kg에 7 ℓ의 80% 메탄올을 첨가하고 실온에서 24시간 동안 침출하여 얻은 추출물을 여과지를 사용하여 여과하였다. 이로부터 얻어진 메탄올 추출물은 완전히 감압 농축한 후 실험에 사용할 때까지 냉장 보관하였다. 7 L of 80% methanol was added to 3 kg of D. asper root dried samples purchased commercially, and the extract obtained by leaching at room temperature for 24 hours was filtered using a filter paper. The methanol extract obtained therefrom was completely concentrated under reduced pressure and then refrigerated until use in experiments.

메탄올 추출물의 식물병에 대한 방제활성을 조사하기 위하여, 대표적인 식물병인 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 메탄올 추출물을 메탄올에 용해시킨 후 250 ㎍/㎖의 트윈 20(Tween 20) 용액으로 희석하여 최종 농도가 3,000 ㎍/㎖이 되도록 준비하였다. 이때, 메탄올의 최종 농도는 5% 수준이 되도록 하였고, 증류수 30 ㎖에 1.5 ㎖의 메탄올(최종 농도 5%)과 7.5 ㎎의 트윈 20(최종 농도 250 ㎍/㎖)을 첨가한 용액을 음성 대조군으로 사용하였다. 이와 같이 제조된 메탄올 추출물과 대조군 시료들을 각각 병원균 접종 1일전에 식물체 유묘의 엽면에 분무 살포한 후 상온에서 24시간 동안 건조시켰다.To investigate the control activities of methanol extracts against plant diseases, we conducted experiments on the control activities of plant diseases such as rice blast, rice leaf blight, tomato ash mold, tomato late blight, wheat red rust, barley flour and pepper anthrax. It was performed together. First, the methanol extract was dissolved in methanol and diluted with 250 µg / ml Tween 20 solution to prepare a final concentration of 3,000 µg / ml. At this time, the final concentration of methanol was 5%, and a solution containing 1.5 ml of methanol (final concentration 5%) and 7.5 mg of Tween 20 (final concentration 250 μg / ml) was added to 30 ml of distilled water as a negative control. Used. Methanol extracts and control samples thus prepared were spray sprayed on the foliar of plant seedlings 1 day before inoculation of the pathogen, and then dried at room temperature for 24 hours.

실험에 사용한 벼, 토마토, 보리 및 밀은 지름 4.5 ㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 후, 종자를 파종하여 25±5℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다. 벼 도열병은 3~4엽기의 유묘에 도열병의 원인균인 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5X105 포자/㎖)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 5일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 잎집무늬마름병은 잎집무늬마름병의 원인균인 타네이트포러스 큐큐메리스(Thanatephorus cucumeris, 한국화학연구원)를 배지(밀기울 90 g, 왕겨 15 g 및 증류수 100 ㎖)에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을 5엽기 유묘에 접종하고 25℃의 습실상에서 4일간 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 역병은 3~4엽기 토마토 유묘에 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans, 강릉대학교)의 유주자낭(105 유주자낭/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후 25℃의 습실상에서 2일간 습실처리하고 25℃의 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3~4엽기 유묘에 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(106 포자/㎖)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다. 밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물기생균으로 알려진 녹병의 원인균인 퍽시니아 리콘디타(Puccinia recondita, 인천대학교)의 포자를 250 ㎍/㎖의 트윈 20 용액에 0.67 g 포자/ℓ의 양으로 현탁하여 분무 처리하고 20℃의 습실에서 하루 동안 습실처리한 후 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다. 보리 흰가루병은 보리의 1엽기 유묘에 숙주 식물에서 계대배양된 흰가루병의 원인균인 에리시페 그래미니스 폼 스피시스 호르데이(Erysiphe graminis f. sp. hordei, 한국화학연구원)의 포자를 털어서 접종하고 20℃의 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일 후, 그리고 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후에 병반면적율을 조사하였다.Rice, tomatoes, barley and wheat used in the experiment were filled with water or clay for horticulture 70% in plastic pots with a diameter of 4.5 cm, and then seeded and grown in a greenhouse at 25 ± 5 ℃ for 1 to 4 weeks. Rice blasts are seedlings of the 3-4 leaf period, Magnaporthe, the causative agent of blasts. grisea , Korea Chemical Research Institute) spore suspension (5X10 5 spores / ㎖) was inoculated by spraying, wetted for one day in a 25 ℃ wet room, and then incubated for 5 days in a constant temperature room at 25 ℃ to induce the onset. Rice leaf blight is Thanatephorus which is the cause of leaf blight. cucumeris , Korea Research Institute of Chemical Technology) was incubated for 7 days in a medium (90 g of wheat bran, 15 g of chaff and 100 ml of distilled water) inoculated in 5 leaf seedlings, and then wet-treated in a 25 ° C. humidity chamber for 4 days. Incubation was induced by incubation for 4 days in a constant temperature room. Tomato late blight is 3-4 in Saratov pie causative agent of plague in the bizarre tomato seedlings inpe Afghanistan's Tora (Phytophthora infestans , Gangneung National University) After inoculation of the drift suspension from the drift sac (10 5 sorghum sac / ml), the incubation was induced by incubation for 2 days in a 25 ° C. wet room and incubated in a constant temperature and humidity room at 25 ° C. for 1 day. Tomato gray mold disease is caused by Botrytis , a 3-4 leaf seedling in tomato seedlings. After treatment with the spore suspension of cinerea (Korea Research Institute of Chemical Technology) (10 6 spores / ㎖), the incubation was induced by incubation for 3 days in a 20 ℃ wet room. Wheat rust is a Puccinia recondita, a causative agent of rust that is known as a biotic parasite in one-leaf seedlings. recondita (Incheon University) spores were suspended and sprayed in 250 ㎍ / ml Tween 20 solution in an amount of 0.67 g spores / l, and then treated in a humidified environment at 20 ° C for 1 day and transferred to a constant temperature room at 20 ° C for 6 days. To induce onset. Barley powdery mildew is Erysiphe , a causative agent of powdery mildew, passaged from host plants to seedlings of barley. graminis f. sp. hordei , Korea Research Institute of Chemical Technology) and spores were inoculated and incubated for 7 days in a constant temperature room at 20 ℃ to induce the onset. The area ratios of rice blast, wheat rust, and barley flour were investigated 7 days after inoculation, 8 days after inoculation for rice leaf blight, and 3 days after inoculation for tomato ash and tomato late blight.

한편, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 7.0 ㎝의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 후 최아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3~4엽기까지 키운 다음 상기에서 준비된 천속단 뿌리의 메탄올 추출물 시료를 엽면 살포하였다. 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes, 고려대학교)의 포자 현탁액(4X105 포자/㎖)을 분무 접종하였다. 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반면적율을 조사하였다.On the other hand, for the control activity test for pepper anthracnose, 70% of horticultural soil is filled in a plastic pot with a diameter of 7.0 cm, sowing the seeds of the most pepper, grown in the greenhouse to 3 to 4 leaves and then prepared cloth Methanol extract samples of the inner roots were foliar sprayed. After spraying the sample, dried at room temperature for 24 hours and then Colletotrichum ( choletotrichum) spore suspension (4 × 10 5 spores / ml) of coccodes , Korea University). After 2 days of invasion in a humid room, it was left in a constant temperature room at 25 ° C. for 1 day, and the lesion area ratio was examined after 3 days of inoculation.

이로부터 얻은 병반면적율을 이용하여 하기 수학식 1에 따라 방제가를 계산하였고, 상기 7가지 식물병에 대한 천속단 뿌리의 메탄올 추출물의 방제활성을 하기 표 1에 나타내었다.The control value was calculated according to the following Equation 1 using the lesion area ratio obtained therefrom, and the control activities of the methanol extracts of the Cheondan root against the seven plant diseases are shown in Table 1 below.

Figure 112011074681170-pat00004
Figure 112011074681170-pat00004

시료sample 농도(㎍/㎖)Concentration (µg / ml) 방제가(%)Control price (%) RCBRCB RSBRSB TGMTGM TLBTLB WLRWLR BPMBPM PANPAN 천속단 뿌리
메탄올 추출물
Temple of Heaven Root
Methanol extract
3,0003,000 6666 55 8282 7373 5353 00 6464
RCB: 벼 도열병; RSB: 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병;
TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병
RCB: rice blast; RSB: rice leaf blight; TGM: tomato gray mold;
TLB: tomato late blight; WLR: wheat rust; BPM: wheat flour; PAN: Chilli Anthrax

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 천속단 뿌리의 메탄올 추출물은 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병에 대하여 방제활성을 나타내었다.
As shown in Table 1, the methanol extract of the Cheondan stage showed control activities against rice blast, tomato gray mold, tomato blight, wheat red rust, and pepper anthrax.

<< 실시예Example 2> 방제 활성성분의 분리, 정제 및 구조 결정 2> Isolation, Purification and Structure Determination of Controlled Active Ingredients

천속단 뿌리의 건조시료 3 kg에 7 ℓ의 80% 메탄올을 가한 후 상온에서 1일간 침출하여 얻은 메탄올 추출물을 여과지를 사용하여 여과한 다음 여과액을 감압 농축하였다. 상기 천속단 뿌리의 메탄올 추출물을 2 ℓ의 70% 메탄올에 용해시킨 후 동량의 헥산(hexane)으로 2회 추출한 후 헥산층과 수용액층을 감압 농축하였다. 농축한 수용액층을 다시 2 ℓ의 증류수로 용해한 후 동량의 에틸아세테이트(ethylacetate)와 부탄올(butanol)로 2회씩 각각 추출하였다. 상기에서 얻은 세 가지 유기용매 추출물 및 수용액층을 감압 농축한 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 7가지 식물병에 대한 방제활성을 조사하였다.7 L of 80% methanol was added to 3 kg of the dried sample of Cheonndan root, and the methanol extract obtained by leaching at room temperature for 1 day was filtered using filter paper, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. After dissolving the methanol extract of the Cheondan stage in 2 L of 70% methanol and extracting twice with the same amount of hexane, the hexane layer and the aqueous layer were concentrated under reduced pressure. The concentrated aqueous layer was again dissolved in 2 L of distilled water and extracted twice with the same amount of ethyl acetate and butanol. The three organic solvent extracts and the aqueous solution layer obtained above were concentrated under reduced pressure, and the control activities for the seven plant diseases were investigated in the same manner as in Example 1.

시료sample 농도(㎍/㎖)Concentration (µg / ml) 방제가(%)Control price (%) RCBRCB RSBRSB TGMTGM TLBTLB WLRWLR BPMBPM PANPAN 헥산층Hexane layer 2,0002,000 9090 55 5050 8181 6060 00 6969 에틸아세테이트층Ethyl acetate layer 2,0002,000 9494 1010 9696 9696 6060 88 5555 뷰탄올층Butanol layer 2,0002,000 6666 55 77 3838 4343 88 6060 수용액층Aqueous solution layer 2,0002,000 5050 00 2121 4646 1313 88 00 RCB: 벼 도열병; RSB: 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병;
TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병
RCB: rice blast; RSB: rice leaf blight; TGM: tomato gray mold;
TLB: tomato late blight; WLR: wheat rust; BPM: wheat flour; PAN: Chilli Anthrax

그 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 헥산층과 에틸아세테이트층이 7가지 식물병에 대해 전반적으로 가장 높은 방제활성을 보여 헥산층과 에틸아세테이트층을 각각 별도로 방제 활성성분의 분리 및 정제에 사용하였다.As a result, as shown in Table 2, the hexane layer and the ethyl acetate layer showed the highest overall control activity against the seven plant diseases, and the hexane layer and the ethyl acetate layer were used separately for the purification and purification of the active ingredient, respectively. It was.

상기 헥산층(12.9 g)으로부터 방제 활성성분을 분리하기 위하여, 헥산:에틸아세테이트 혼합액(3:1, v/v)을 전개용매로 하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(5X60 ㎝, 카이젤 겔 60, 70-230 메쉬, 500 g: 머크사)를 실시하였다. 이로부터 얻은 용출액을 분취한 후 헥산-에틸아세테이트(3:1, v/v)을 전개용매로 하는 박층 크로마토그래피(카이젤 겔 60 F254, 0.25 ㎜; 머크사)로 분석하였다. TLC의 패턴에 따라 F1 내지 F12의 12개 분획으로 나누고, 각 분획을 클로로포름으로 50 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 벼 도열병균에 대하여 생물검정을 실시하였다. 벼 도열병균에 대한 생물검정은 7일간 25℃, 150 rpm으로 감자덱스트로스액체배지(potato dextrose broth: PDB)에서 배양한 도열병균을 blender를 이용하여 10초간 마쇄하였다. 이 도열병균의 혼탁액을 멸균한 후 식은 감자덱스트로스한천배지(potato dextrose agar: PDA)에 1%의 양으로 접종하고 잘 흔들어준 다음 페트리디쉬에 부었다. 배지를 잘 굳힌 다음 지름 8 mm의 종이디스크(paper disc)에 각각의 분획의 용액을 35 ㎕씩 점적한 다음 용매를 제거한 후 도열병균이 접종된 배지위에 치상하였다. 이 때 무처리구의 경우 용매만 35 ㎕ 처리한 다음 건조한 후 치상하였다. 25℃에서 3일간 배양한 다음 저지원을 조사하였다. 그 결과 F6 내지 F9의 4개의 분획이 효과가 있는 것으로 나타나, 이들 4개의 분획을 합하였다. 활성 분획(998.3 mg)으로부터 항균물질을 더 순수분리하기 위하여 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 용출용매로는 디메틸클로라이드:헥산:메탄올(5:5;1, v/v/v)를 사용하였다. 동일한 컬럼을 3회 반복 실시하여 TLC에서 단일한 물질로 보이는 분획을 365.4 mg 분리하였다. 분리한 물질의 순도를 조사하기 위하여 HPLC 분석을 실시한 결과, 3개의 물질이 함유되어 있는 것으로 나타나, 분취 HPLC(preparative HPLC)를 이용하여 3개의 물질을 각각 분리하였다. 이 때 HPLC 조건은 다음과 같다. 컬럼: Capcell Pak C18(20 mm X 250 mm), 용출용매: 100% 메탄올, 유속: 10 ml/min, 검출파장: 210 nm. 이상과 같은 조건에서 스티그마스테롤은 19.5분과 21.0분 사이에서, 캄페스테롤은 21.0분에서 23.0분 사이에서, 그리고 베타-시토스테롤은 23.0분과 25.0분 사이에서 용출되었다. 이상과 같이 실시하여 베타-시토스테롤(181.0 mg), 캄페스테롤(51.3 mg) 및 스티그마스테롤(7.7 mg)을 순수하게 분리하였다. In order to separate the active ingredient from the hexane layer (12.9 g), silica gel column chromatography (5X60 cm, Kaigel gel 60, 70-230) using hexane: ethyl acetate mixture (3: 1, v / v) as a developing solvent. Mesh, 500 g: Merck). The eluate obtained therefrom was separated and analyzed by thin layer chromatography (Kaygel gel 60 F254, 0.25 mm; Merck) using hexane-ethyl acetate (3: 1, v / v) as the developing solvent. According to the pattern of TLC divided into 12 fractions of F1 to F12, each fraction was dissolved in chloroform at the level of 50 mg / ㎖ and then bioassay for rice blast bacteria. The bioassay for rice blast bacterium was crushed for 10 seconds using a blender for blast bacteria cultured in potato dextrose broth (PDB) at 25 ℃, 150 rpm for 7 days. After sterilizing the turbidity of the bacterium, the inoculum was inoculated in a 1% amount of cold potato dextrose agar (PDA), shaken well, and poured into Petri dishes. After hardening of the medium, 35 μl of each fraction was dropped on a paper disc of 8 mm in diameter, and then the solvent was removed and placed on a medium inoculated with the germ. At this time, in the case of no treatment, only 35 μl of the solvent was dried and then dried. Incubation at 25 ° C. for 3 days was followed by low support. As a result, four fractions of F6 to F9 appeared to be effective, and these four fractions were combined. Sephadex LH-20 column chromatography was performed to further separate the antimicrobial substance from the active fraction (998.3 mg). Dimethyl chloride: hexane: methanol (5: 5; 1, v / v / v) was used as the elution solvent. The same column was repeated three times to separate 365.4 mg of a fraction that appeared to be a single substance in TLC. As a result of HPLC analysis to investigate the purity of the separated substance, it was found that three substances were contained, and the three substances were separated using preparative HPLC. At this time, HPLC conditions are as follows. Column: Capcell Pak C18 (20 mm × 250 mm), eluent: 100% methanol, flow rate: 10 ml / min, detection wavelength: 210 nm. Under these conditions, stigmasterol was eluted between 19.5 and 21.0 minutes, camphorsterol between 21.0 and 23.0 minutes, and beta-sitosterol between 23.0 and 25.0 minutes. As described above, beta-sitosterol (181.0 mg), camphorsterol (51.3 mg), and stigmasterol (7.7 mg) were separated purely.

분리한 3개의 물질의 순도 및 구조를 결정하기 위하여 GC-MS 분석을 실시하였다. GC-MS 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼: DB-5 capillary column (0.25 mm X 30 m, 0.25 ㎛ film thickness), 주입기 온도: 300℃, 인터페이스 온도: 280℃, 컬럼 시작온도: 120℃(5 min), 온도 증가 속도: 10℃/min, 컬럼 최종온도: 270℃(30 min). 이와 같이 분석하였을 때, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤은 각각 26.48분, 27.17분 및 28.44분에 단일 피크가 나타났으며, 이들 각각의 질량스펙트럼을 library에 있는 것과 비교하였을 때, 일치하는 것으로 나타났다. 도 2, 3, 4는 각각 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤의 질량스펙트럼을 라이브러리에 있는 질량스펙트럼과 비교하여 나타내었다.
GC-MS analysis was performed to determine the purity and structure of the three isolated materials. GC-MS analysis conditions are as follows. Column: DB-5 capillary column (0.25 mm X 30 m, 0.25 μm film thickness), injector temperature: 300 ° C., interface temperature: 280 ° C., column start temperature: 120 ° C. (5 min), temperature increase rate: 10 ° C. / min, column final temperature: 270 ° C. (30 min). In this analysis, camphorsterol, stigmasterol and beta-sitosterol showed single peaks at 26.48, 27.17 and 28.44 minutes, respectively, and their respective mass spectra were matched when compared to those in the library. appear. 2, 3 and 4 show the mass spectra of camphorsterol, stigmasterol and beta-sitosterol, respectively, compared to the mass spectra in the library.

< 실시예 3> 천속단 뿌리 추출물 유래 방제 활성성분의 식물병에 대한 방제활 <Example 3> for controlling plant diseases of the fabric speed control root extract derived active ingredients active

상기 실시예 2에서 천속단 뿌리 추출물로부터 분리?동정한 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤의 생체 내(in vivo) 방제활성을 조사하기 위하여, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병 등의 총 7가지 식물병에 대하여 하기와 같이 방제활성 실험을 수행하였다.? Example 2 separated from cloth speed root extract in a campesterol, stigmasterol and beta-sympathetic-sitosterol in vivo (in the In order to investigate the control activities in vivo , we tested the control activities of seven plant diseases such as rice blast, rice leaf blight, tomato ash mold, tomato blight, wheat red rust, barley flour and red pepper anthrax. Was performed.

3가지 활성성분 각각을 아세톤에 용해시킨 후 250 ㎍/㎖의 트윈 20 용액을 가하여 최종 농도를 250과 500 ㎍/㎖로 조절하였으며, 모든 시료의 최종 아세톤 농도는 10%로 맞추었다. 이때, 대조군으로는 10% 아세톤과 250 ㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 용액을 사용하였다. 각 식물병당 2개의 포트를 이용하였고, 활성성분 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 이들 7가지 식물병에 대한 방제활성은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조사하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.After dissolving each of the three active ingredients in acetone, the final concentration was adjusted to 250 and 500 μg / ml by adding 250 μg / ml of Tween 20 solution, and the final acetone concentration of all samples was adjusted to 10%. At this time, a solution containing 10% acetone and 250 μg / ml Tween 20 was used as a control. Two pots were used for each plant disease, and the active ingredient samples were spray-sprayed on the foliar and air-dried for 24 hours before inoculating each plant pathogen. The control activity against these seven plant diseases was investigated according to the method described in Example 1, and the results are shown in Table 3 below.

활성성분Active ingredient 농도
(㎍/㎖)
density
(Μg / ml)
방제가(%)Control price (%)
RCBRCB RSBRSB TGMTGM TLBTLB WLRWLR BPMBPM PANPAN 베타-시토스테롤Beta-sitosterol 500500 2525 3333 5050 5252 00 00 00 250250 2525 00 3030 4242 00 00 00 캠퍼스테롤Campus terrol 500500 2525 4747 1010 2525 00 00 00 250250 1313 3333 00 1717 00 00 00 스티그마스테롤Stigmasterol 500500 2525 2020 3030 6363 00 00 00 250250 1313 2020 1010 3333 00 00 00 RCB: 벼 도열병; RSB: 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병;
TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병
RCB: rice blast; RSB: rice leaf blight; TGM: tomato gray mold;
TLB: tomato late blight; WLR: wheat rust; BPM: wheat flour; PAN: Chilli Anthrax

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 베타-시토스테롤은 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 효과를 보였으며, 벼 도열병과 벼 잎집무늬마름병에 대해서도 활성을 보였다. 캄페스테롤의 경우 벼 잎집무늬마름병에 대하여 상대적으로 높은 활성을 보였고, 토마토 역병과 벼 도열병에 대해서도 활성을 보였다. 스티그마스테롤은 토마토 역병에 비교적 높은 활성을 보였으며, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병에 대하여도 활성을 보였다.As shown in Table 3, beta-sitosterol showed an effect on tomato gray mold and tomato late blight, and also showed activity against rice blast and rice leaf blight. Camphorsterol showed relatively high activity against rice leaf blight, and against tomato late blight and rice blast. The stigmasterol showed relatively high activity against tomato late blight, and against rice blast, rice leaf blight, and tomato gray mold.

세 개의 물질을 각각 분리하기 전 단계, 즉 세 개의 물질이 혼합되어 있는 것을 식물스테롤(phytosterol)이라 하는데, 보통 식물스테롤 40%라 하면 베타-시토스테롤의 함량이 40%인 것을 나타낸다. 천속단에서 분리하여 분취형 HPLC 전단계까지 분리한 식물스테롤의 경우 GC-MS 분석 결과, 베타-스토스테롤의 함량이 약 40%였다. 이 물질에 대하여 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대하여 생체 내 항균활성을 조사한 결과, 도 1과 같이 두 식물병에 대하여 농도가 증가함에 따라 높은 방제활성을 보였다.Before separating each of the three substances, that is, a mixture of the three substances is called phytosterol. Usually, 40% phytosterol indicates that the content of beta-sitosterol is 40%. As a result of GC-MS analysis, the content of beta-stosterol was about 40% in the case of phytosterol separated from the stream and separated up to the preparative HPLC stage. In vivo against tomato gray mold and tomato late blight against this substance As a result of examining the antimicrobial activity, as shown in Figure 1 showed a high control activity as the concentration increases for the two plant diseases.

Claims (4)

하기 화학식 3의 스티그마스테롤(stigmasterol) 화합물 또는 이를 포함하는 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물추출물을 유효성분으로 함유하는 토마토 역병 방제용 조성물:
[화학식 3]
Figure 112012013223019-pat00005
A composition for controlling tomato late blight containing a stigmasterol compound of Formula 3 or a plant extract of the genus Dipsacus comprising the same as an active ingredient:
(3)
Figure 112012013223019-pat00005
제1항에 있어서, 상기 디프사쿠스 (Dipsacus) 속 식물이 천속단(Dipsacus asperoides 또는 D. asper) 또는 산토끼꽃(Dipsacus japonicus)인 것을 특징으로 하는 토마토 역병 방제용 조성물.The method of claim 1, wherein Dipsacus The genus plant is Dipsacus asperoides or D. asper or Dipsacus japonicus , characterized in that the composition for controlling tomato blight. 제1항에 있어서, 상기 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물추출물은 10 ㎍/㎖ 내지 3,000 ㎍/㎖의 농도로, 스티그마스테롤은 50 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 토마토 역병 방제용 조성물.According to claim 1, Dipsacus genus plant extract is characterized in that the concentration of 10 ㎍ / ㎖ to 3,000 ㎍ / ㎖, stigmasterol is contained in a concentration of 50 ㎍ / ㎖ to 500 ㎍ / ㎖ Tomato plague control composition. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 작물 또는 토양에 처리하여 토마토 역병을 방제하는 방법.A method for controlling tomato late blight by treating the crop or soil with the composition of any one of claims 1 to 3.
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