KR101161575B1 - 다가양이온성 화합물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 측면은 혈관신생 조절에 유용한 화합물 및 조절방법, 및 다가양이온성 화합물에 의한 혈관신생과 관련된 질환의 치료 또는 예방방법에 관한 것이다. 본 발명은 동물과 사람을 포함하는 포유동물의 혈관신생 매개된 장애 억제용 조성물 및 사용방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 상이한 혈관신생 매개된 장애의 치료를 위한, 다가양이온과 기타 항혈관신생제와의 배합 용도에 관한 것이다. 추가로, 당해 다가양이온성 화합물은 다양한 소염제 및 세포독성제와 사용될 뿐만 아니라, 방사선 치료제와도 함께 사용되어 암 환자의 종양 성장 및 전이를 예방 및 치료할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본원은 본원에서 전체적으로 참조로 인용된, "다가양이온성 화합물에 의한 혈관신생 (angiogenesis)의 조절"을 발명의 명칭으로 하는, 2004년 6월 15일자로 출원된 미국 가출원 제60/579,282호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 한 측면은 혈관신생을 조절하기에 유용한 다가양이온성 화합물 및 다가양이온성 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 치료적 유효량의 다가양이온성 화합물을 혈관신생의 조절을 필요로 하는 동물 또는 사람에게 투여함을 포함하는, 당해 동물 또는 사람의 혈관신생 조절방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 치료적 유효량의 다가양이온성 화합물을 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 동물 또는 사람에게 투여함을 포함하는, 당해 동물 또는 사람의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방방법에 관한 것이다.
혈관신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 발달하는 것이다. 생리학적으로, 혈관신생은 성숙한 유기체의 적당한 발달을 보장하고, 난자를 착상할 자궁을 준비하고, 상처 치유, 골절 복구 및 임신 달성 및 유지에서 중요한 역할을 한다. 혈관신생은 또한 암, 염증 및 안 질환 등의 다수의 질환 상태와 관련된 병리학적 상태와도 연관된다.
혈관신생 또는 "신혈관형성 (neovascularization)"은 혈관신생 촉진 인자 및 항혈관신생 인자의 균형에 의해 제어되는 다단계 절차이다. 당해 절차의 후반 단계들은 내피 세포 (EC)가 관형 구조물로 증식 및 조직화하는 데 관련된다. 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 등의 성장 인자는 내피 세포 성장 및 분화를 촉진하는데 중대한 역할을 맡는다고 생각된다. 내피 세포는 혈관신생 절차의 중추 성분이고, 이의 세포 표면 수용체 및 세포내 신호전달 메카니즘을 통하여 다수의 사이토킨에 반응한다.
혈관신생의 제어는 혈관 성장 인자, 세포외 매트릭스 부착 분자 및 대사 인자의 국소 방출을 수반하는 복잡한 절차이다. 혈관 내의 기계적인 힘이 또한 중요한 역할을 할 수 있다. 신규한 혈관 성장에 연루되는 내인성 성장 인자의 주요 부류는 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 계열과 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)이다. 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK; ERK1/2) 신호전달 캐스케이드는 VEGF 유전자 발현과 혈관 내피 세포의 증식 제어에 모두 관련된다.
일부 병태하에 특정 시간에서 또는 특정 조직에서 모세 혈관의 성장 및 확장을 정지시킬 수 있는 경우, 다수의 질환 및 원치않은 병태가 예방되거나 경감될 수 있다. 본원에 기재된 발명에 의해 치료될 수 있는 혈관신생-의존성 질환은 혈관 성장을 요하거나 유도하는 병태/질환이다. 다른 한편으로, 이들로 한정하려는 것은 아니지만, 졸중, 심장병, 궤양, 피부경화증 및 불임증과 같이, 혈관형성이 달성되거나 확장되어야 하는 경우에는 혈관신생의 촉진이 바람직하다.
혈관신생의 억제가 예를 들면, 종양 성장에서와 같이, 혈관의 조절되지 않은 성장을 제한하는 데 유용한 요법이라는 것이 제안되었다. 혈관신생의 억제는 문헌[참조: Folkman et al., Cancer Biology 3:89-96 (1992)]에 제안된 바와 같이 혈관신생 자극에 대한 내피 세포 반응을 억제함으로써 달성될 수 있으며, 당해 문헌에는 내피 세포 반응 억제제의 예, 예를 들면, 혈관억제 스테로이드, 진균 유도된 생성물, 예를 들면, 푸마길린, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘, α-인터페론, 비타민 D 동족체 및 D-페니실라민이 기재되어 있다. 추가로 제안된 혈관신생 억제제에 대하여, 문헌[참조: Blood et al., Bioch, Biophys. Acta 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science 248:1408-1410 (1990)] 및 미국 특허공보 제5,092,885호, 제5,112,946호, 제5,192,744호 및 제5,202,352호를 참조한다.
원치않은 혈관신생 절차를 억제하면 부적합하거나 원치않은 혈관신생에 대한 치료 및/또는 예방법을 제공할 수 있다. 역으로, 혈관신생 절차를 촉진하면 혈관신생으로부터 혜택을 받는 질환 상태에 대한 치료법을 제공할 수 있다. 본원에 개시된 본 발명의 측면은 항혈관신생 특성에 대하여 양쪽성 화합물, 예를 들면, 다가양이온성 화합물을 제공한다. 혈관신생을 억제하는 능력은 혈관신생 질환 및/또는 병태를 조절하는 데 효과적인 치료적 기구를 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법을 설명하기 전에, 본 발명이 기재된 특정 분자, 조성물, 방법론 또는 연구계획서로 한정되지는 않음을 이해해야 하는데, 이는 이들이 변화될 수 있기 때문이다. 상세한 설명에 사용된 용어는 특정한 변형 또는 양태만을 설명하기 위한 것이지, 첨부한 청구항에 의해서만 제한되는 본 발명의 측면을 제한하려는 것은 아니다.
또한, 본원 및 첨부한 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형 관사 "a", "an" 및 "the"는 본문에서 달리 명확히 명기하지 않는 한, 복수형을 포함하는 것임을 또한 주의해야 한다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 세포 및 이의 동등물을 언급하는 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동일한 어떠한 방법 및 물질이라도 본 발명의 양태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질을 이제 설명한다. 본원에 언급된 모든 문헌은 참조 문헌으로 포함된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 기재 내용을 선행할 자격을 부여받지 않았음을 승인하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 용어 "약"은 사용된 수의 수치 값의 ±10%를 의미한다. 따라서, 약 50%는 45 내지 55%의 범위에 있음을 의미한다.
용어 "혈관신생" 또는 "신혈관형성"은 기존의 혈관 조직 (예: 혈관구조)으로부터 신규한 혈액 공급, 예를 들면, 모세혈관, 혈관 및 정맥의 발생을 말한다. 혈관신생의 절차는 예를 들면, 모든 혈관의 단일 세포층 내면을 형성하는 내피 세포를 포함하는 다수의 조직 세포 유형을 포함할 수 있고 혈류와 주위 조직 사이의 교환의 조절과 연관된다. 신규한 혈관 (혈관신생)은 내피 세포의 성장에 의해 기존의 작은 혈관의 벽으로부터 발달할 수 있다. 혈관신생은 또한 종양 세포 생존 및 증식 (성장)에 필요한 혈액 공급을 종양에 제공하므로 종양 성장에 연관되기도 한다.
용어 "환자" 및 "피검체"는 사람을 포함한 모든 동물을 의미한다. 환자 또는 피검체의 예는 사람, 암소, 개, 고양이, 염소, 양 및 돼지를 포함한다.
약제학적 조성물에 관한 "치료학적 유효량"은 의학적 상태 또는 질병과 관련된 증상을 감소시키거나 예방하거나, 특정 신체 기능의 장애를 유발하는 질환 또는 장애 상태인 신체 기능을 정상화시키거나, 질환의 임상적으로 측정된 변수 중의 하나 이상의 개선을 제공하기에 충분한 양이다. 본원과 관련하여, 치료학적 유효량의 다가양이온성 화합물은 혈관신생을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양이다.
본 발명의 태양은 치료학적 유효량의 다가양이온성 화합물을 혈관신생의 조절을 필요로 하는 동물에게 투여함을 포함하는, 당해 동물의 혈관신생 조절방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 태양은 치료학적 유효량의 다가양이온성 화합물을 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 동물에게 투여함을 포함하는, 동물의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방방법에 관한 것이다.
일반적으로, 다가양이온성 화합물은, 바람직하게는 당해 구조가 비틀림이 강제되도록 하고, 주쇄의 한 면에 양으로 하전된 측그룹을 표시하는, 경질 또는 반경질 주쇄를 나타낸다. 양으로 하전된 측그룹은 주쇄의 길이를 따라 최적으로 분포되어 있으며 임의로 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있는 탄소 스페이서 (spacer)에 의해 주쇄로부터 최적으로 분리된다. 주쇄를 따른 비틀림 자유도 (torsional freedom)는 분자내 수소 결합, 입체 제한 또는 폐환에 의해 안정화될 수 있다. 다양한 다가양이온성 화합물의 바람직한 화학식, 예를 들면, 아릴아미드, 하이드라지드, 칼릭스렌 및 살리실아미드가 기재되어 있지만, 양전하를 안정화시키는 데 사용될 수 있는 기타의 적합한 측그룹은 예를 들면, (A-G)를 포함한다:
사용될 수 있는 기타 아민은 예를 들면, 피페리딘, 4-아미노피리딘, 모르폴린 및 아미노티아졸을 포함한다. 임의로, 아미노 그룹의 염기도는 쇄의 메틸렌 그룹 중의 하나에 1 또는 2개의 불소를 혼입시켜 조절할 수 있다. 주쇄를 경질화 (비틀림 자유도를 감소시킴)시키는 데에로 사용될 수 있는 기타의 중심 환 치환체는 예를 들면, (H-K)를 포함한다:
본 발명의 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 1의 아릴아미드 올리고머 화합물이다.
화학식 1에서,
X는 O 또는 S이고,
R1은 하나 이상의 -NH2 또는 
로 임의로 치환된 C1-C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
Y는 결합 또는 
이고,
Z는 결합 또는 
이고,
R2는 수소이거나, 하나 이상의 -NH2 또는 
으로 임의로 치환된 C1-C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이거나, -X-R1이고,
R3은 
이거나 C1-C9 직쇄 또는 측쇄 알킬로 치환된 메틸렌이고,
C1-C9 직쇄 또는 측쇄 알킬은 하나 이상의 -NH2 또는 
로 임의로 치환되고,
n은 2 내지 10이며,
m은 1 또는 2이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 아릴아미드 올리고머 화합물은 화학식 2의 화합물이다.
화학식 2에서,
R1은 
이다.
바람직한 양태에서, 화합물은 화학식 3의 아릴아미드이다.
화학식 3에서,
X는 O 또는 S이고,
Y는 O 또는 S이고,
R1은 H 또는 -C(=O)-A{여기서, A는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
으로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이고,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R3은 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이며,
R4는 H, -B 또는 -C(=O)-O-B{여기서, B는 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이다.
또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 4의 하이드라지드이다.
화학식 4에서,
n은 1 내지 10이고,
X는 O 또는 S이고,
Y는 O 또는 S이고,
Z는 결합, C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 1,4-사이클로헥실이고,
R1은 NH2 또는 NH-A{여기서, A는 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이고,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R3은 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이며,
R4는 H 또는 
이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 5의 칼릭스렌이다.
화학식 5에서,
n은 2 내지 8, 보다 바람직하게는 4 내지 8이고,
X는 결합, O 또는 -O-CH2-C(=O)-O-이고,
R1은 -A 또는 -O-A{여기서, A는 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이며,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 6의 살리실아미드이다.
화학식 6에서,
n은 2 내지 10이고,
R1는 H 또는 
이고,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R3은 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이며,
R4는 OH, NH2 또는 
{여기서, A는 OH 또는 NH2이다}이다.
추가의 양태에서, 다가양이온성 화합물은 아래 표 1에 나타낸 바와 같이, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 8, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15, 화합물 16, 화합물 17, 화합물 18, 화합물 19, 화합물 20, 화합물 21, 화합물 22, 화합물 23, 화합물 24, 화합물 25, 화합물 26, 화합물 27, 화합물 28, 화합물 29, 화합물 30, 화합물 31, 화합물 32, 화합물 33, 화합물 34, 화합물 35, 화합물 36, 화합물 37, 화합물 38, 화합물 39, 화합물 40, 화합물 41, 화합물 42, 화합물 43, 화합물 44, 화합물 45, 화합물 46, 화합물 47, 화합물 48, 화합물 49, 화합물 50, 화합물 51, 화합물 52, 화합물 53, 화합물 54 및 화합물 55로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
화합물 1 및 화합물 2는 동일한 아릴아미드 구조를 포함하지만, 화합물 1 및 화합물 2는 상이한 조건하에서 합성되어 상이한 순도를 나타낸다. 중합 동안, 용매로서 화합물 2에 대해서는 DCM (디클로로메탄)을 사용하였고 화합물 1에 대해서는 NMP (1-메틸-2-피롤리디논)을 사용하였다. 중합은 NMP 중에서 덜 효율적이므로, 화합물 1은 n이 2 내지 10이고, 화합물 2에 대해서는 n이 10이다.
보다 바람직한 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화합물 26, 화합물 28, 화합물 29, 화합물 34, 화합물 48 또는 화합물 50, 또는 이들의 배합물을 포함한다.
본 발명의 방법에서 유용한 기타 다가양이온성 화합물은 "항감염제로서의 표면 양쪽성 중합체"를 발명의 명칭으로 하는, 2002년 3월 7일자로 출원된 제WO 02/072007호, "항감염제로서의 표면 양쪽성 중합체"를 발명의 명칭으로 하는, 2002년 3월 7일자로 출원된 제WO 02/100295호 및 "표면 양쪽성 중합체 및 올리고머, 및 이들의 용도"를 발명의 명칭으로 하는, 2004년 3월 17일자로 출원된 제WO 04/082634호에 기재된 것이다.
또 다른 양태에서, 치료학적 유효량의 다가양이온성 화합물을 포함하는 화합물이 혈관신생 조절에 제공된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 1의 아릴아미드 올리고머 화합물이다.
화학식 1
화학식 1에서,
X는 O 또는 S이고,
R1은 하나 이상의 -NH2 또는 
로 임의로 치환된 C1-C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
Y는 결합 또는 
이고,
Z는 결합 또는 
이고,
R2는 수소이거나, 하나 이상의 -NH2 또는 
으로 임의로 치환된 C1-C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이거나, -X-R1이고,
R3은 
이거나, C1-C9 직쇄 또는 측쇄 알킬로 치환된 메틸렌이고,
C1-C9 직쇄 또는 측쇄 알킬은 하나 이상의 -NH2 또는 
로 임의로 치환되고,
n은 2 내지 10이며,
m은 1 또는 2이다.
바람직한 양태에서, 화합물은 화학식 3의 아릴아미드이다.
화학식 3
화학식 3에서,
X는 O 또는 S이고,
Y는 O 또는 S이고,
R1은 H 또는 -C(=O)-A{여기서, A는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
으로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이고,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R3은 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이며,
R4는 H, -B 또는 -C(=O)-O-B{여기서, B는 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이다.
또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 4의 하이드라지드이다.
화학식 4
화학식 4에서,
n은 1 내지 10이고,
X는 O 또는 S이고,
Y는 O 또는 S이고,
Z는 결합, C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 1,4-사이클로헥실이고,
R1은 NH2 또는 NH-A{여기서, A는 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이고,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R3은 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이며,
R4는 H 또는 
이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 5의 칼릭스렌이다.
화학식 5
화학식 5에서,
n은 2 내지 8, 보다 바람직하게는 4 내지 8이고,
X는 결합, O 또는 -O-CH2-C(=O)-O-이고,
R1은 -A 또는 -O-A{여기서, A는 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이며,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 6의 살리실아미드이다.
화학식 6
화학식 6에서,
n은 2 내지 10이고,
R1는 H 또는 
이고,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R3은 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이며,
R4는 OH, NH2 또는 
{여기서, A는 OH 또는 NH2이다}이다.
바람직한 양태에서, 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 8, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15, 화합물 16, 화합물 17, 화합물 18, 화합물 19, 화합물 20, 화합물 21, 화합물 22, 화합물 23, 화합물 24, 화합물 25, 화합물 26, 화합물 27, 화합물 28, 화합물 29, 화합물 30, 화합물 31, 화합물 32, 화합물 33, 화합물 34, 화합물 35, 화합물 36, 화합물 37, 화합물 38, 화합물 39, 화합물 40, 화합물 41, 화합물 42, 화합물 43, 화합물 44, 화합물 45, 화합물 46, 화합물 47, 화합물 48, 화합물 49, 화합물 50, 화합물 51, 화합물 52, 화합물 53, 화합물 54, 화합물 55 또는 이들의 배합물을 포함한다.
보다 바람직한 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화합물 26, 화합물 28, 화합물 29, 화합물 34, 화합물 48, 화합물 50, 또는 이들의 배합물을 포함한다.
살리실아미드 다가양이온성 화합물은 반응식 1과 같이 합성할 수 있다.
[반응식 1]
또 다른 양태에서, 화합물은 치료학적 유효량의 다가양이온성 화합물을 포함하여 혈관신생을 조절하는 데 제공된다.
하나의 양태에서, 화합물은 치료학적 유효량의 다가양이온성 화합물을 함유하여 혈관신생을 촉진시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 화합물은 치료학적 유효량의 다가양이온성 화합물을 함유하여 혈관신생을 억제할 수 있다.
바람직한 양태에서, 화합물은 화학식 3의 아릴아미드이다.
화학식 3
화학식 3에서,
X는 O 또는 S이고,
Y는 O 또는 S이고,
R1은 H 또는 -C(=O)-A{여기서, A는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
으로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이고,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R3은 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이며,
R4는 H, -B 또는 -C(=O)-O-B{여기서, B는 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이다.
또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 4의 하이드라지드이다.
화학식 4
화학식 4에서,
n은 1 내지 10이고,
X는 O 또는 S이고,
Y는 O 또는 S이고,
Z는 결합, C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 1,4-사이클로헥실이고,
R1은 NH2 또는 NH-A{여기서, A는 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이고,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R3은 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이며,
R4는 H 또는 
이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 5의 칼릭스렌이다.
화학식 5
화학식 5에서,
n은 2 내지 8, 보다 바람직하게는 4 내지 8이고,
X는 결합, O 또는 -O-CH2-C(=O)-O-이고,
R1은 -A 또는 -O-A{여기서, A는 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다}이며,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 화학식 6의 살리실아미드이다.
화학식 6
화학식 6에서,
n은 2 내지 10이고,
R1는 H 또는 
이고,
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R3은 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는 
로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이며,
R4는 OH, NH2 또는 
{여기서, A는 OH 또는 NH2이다}이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 다가양이온성 화합물은 혈관신생과 관련된 질환 또는 장애의 치료에 유용할 수 있다. 바람직한 양태에서, 화합물은 치료학적 유효량의 화합물 26, 화합물 28, 화합물 29, 화합물 34, 화합물 48, 화합물 50 또는 이들의 배합물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 불충분한 혈관신생과 관련된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 이러한 질환에는 예를 들면, 졸중, 심장병, 궤양, 불임증 및 경피증이 포함된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 다가양이온성 화합물은 과도한 혈관신생과 관련된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 이러한 질환에는 예를 들면, 암, 류머티스성 관절염, AIDS 합병증, 건선 및 실명이 포함된다.
일반적으로, 암은 비정상 및 제어되지 않은 세포 분열에 의해 발생되는 악성 성장 또는 종양을 지칭하는데, 림프계 또는 혈류를 통하여 신체 각 부분으로 번질 수 있다. 암은 고형 종양 및 혈액계 종양 둘 다를 포함한다. 고형 종양은 이들로 한정하려는 것은 아니지만, 카포시 육종, 혈관종, 고형 종양, 혈액계 종양, 유방암, 폐암, 난소암, 고환암, 결장암, 횡문근육종, 망막모세포종, 유잉 (Ewing) 육종, 신경모세포종 및 골육종을 포함하거나 예로들 수 있다. 혈관신생은 또한 혈관계 종양, 예를 들면, 통상적으로 빈혈증, 손상된 혈액 응고 및 림프절, 간 및 비장의 확장을 동반하는, 백혈구 세포의 증식이 제한되지 않는 골수의 모든 다양한 급성 또는 만성 신생물 질환인 백혈병과도 관련된다. 혈관신생은 백혈병-유형의 종양을 발생시키는 골수의 이상에 영향을 미친다고 여겨진다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 질환 또는 장애는 폐암, 유방암, 전립선암, 결장암, 신장암, 방광암, 췌장암, 교모세포종, 신경모세포종, 실명, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 각막 이식, 근시 변성, AIDS 관련 합병증, 관절염, 류머티스성 관절염, 건선, 경피증, 염증성 장 질환, 졸중, 심장병, 궤양 및 불임증이다. 예를 들면, 이들로 한정하려는 것은 아니지만, 암, 염증성 관절염 (예: 류머티스성 관절염), 당뇨병성 망막병증, 및 기타 눈의 혈관신생 질환 (예: 각막 혈관신생, 혈관신생 녹내장, 수정체후부 섬유증식증 및 황반 변성), 동정맥 기형, 과도한 출혈 상태 (월경과다), 오슬러-웨버 증후군, 심근 혈관신생, 플라크 혈관신생, 모세혈관확장증, 혈우병성 관절, 혈관섬유종 및 창상 육아이다. 본원에서 제공되는 항혈관신생 조성물은 또한 내피 세포의 과도한 또는 이상 자극의 질환 치료에도 유용하다. 이러한 질환은 이들로 한정하려는 것은 아니지만, 장관 유착증, 크론 병, 아테롬성 경화증, 경피증 및 비후성 반흔 (즉, 켈로이드)를 포함한다.
제공되는 다가양이온성 화합물로 치료되거나 예방될 수 있는 기타 적합한 혈관신생 중개 장애는 이들로 한정하려는 것은 아니지만, 종양 및 암 관련 장애 (예: 망막 종양 성장, 양성 종양 (예: 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종), 고형 종양, 혈액계 종양 (예: 백혈병, 혈관섬유종 및 카포시 육종), 종양 전이 및 종양 성장을 지지하는데 신혈관형성을 필요로 하는 기타 암), 안구 신혈관 장애 (예: 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 미숙아 망막병증, 신혈관 녹내장, 각막 이식 거부 및 기타 안구 혈관신생 매개된 장애), 염증성 장애 (예: 면역성 및 비면역성 염증, 류머티스성 관절염, 만성 관절 류머티즘, 장 질환, 건선 및 기타 만성 염증성 장애), 자궁내막증, 부적절하거나 시기를 놓친 혈관침입과 관련된 기타 장애 (예: 수정체후부 섬유증식증, 루베오시스 및 죽상경화판 및 골다공증에서의 모세관 증식), 오슬러-웨버 증후군, 심근 혈관신생, 판 혈관신생, 모세혈관확장증, 혈우병 관절 및 창상 육아를 포함한다. 혈관신생이 병리학적 상태의 유지 또는 진행에 하나의 역할을 하는 기타 질환은 당업자에게 공지되어 있으며, 본 명세서에서 사용된 용어 "혈관신생 매개된"의 의미 내에 유사하게 포함된다.
하나의 양태에서, 다가양이온성 화합물은 다른 혈관신생 억제제와 함께 사용된다. 혈관신생 억제제는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 혈관신생 억제제 및 표적의 기재 사항은 예를 들면, 본원에서 전체적으로 참조로 인용되는 문헌[참조: Chen et al., Cancer Res. 55:4230-4233 (1995), Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6629-6628 (1990), O'Reilly et al., Cell 79:315-328 (1994), Parangi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2002-2007 (1996), Rastinejad et al., Cell 56:345-355 (1989), Gupta et at, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7799-7803 (1995), Maione et al., Science 247:77-79 (1990), Angiolillo et al., J. Exp. Med. 182:155-162 (1995), Strieter et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 210:51-57 (1995); Voest et al., J. Natl. Cancer Inst. 87:581-586 (1995), Cao et al., J. Exp. Med. 182:2069-2077 (1995), and Clapp et al., Endocrinology 133:1292-1299 (1993)]을 참조한다. 추가의 혈관신생 억제제의 기재 사항에 대해서는, 예를 들면, 본원에 전체적으로 참조로 인용되는 문헌[참조: Blood et al., Bioch. Biophys Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lat Invest., 59:44-51 (1988)] 및 미국 특허공보 제5,092,885호 및 제5,112,946호를 참조한다.
또 다른 양태에서, 다가양이온성 화합물은 기타 요법, 예를 들면, 표준 소염 요법, 표준 안과 요법, 표준 피부과 요법, 방사선 요법, 종양 수술 및 고형 종양에 대한 그리고 전이 달성의 제어를 위한 통상적인 화학 요법에 사용된다. 혈관신생 억제제의 투여는, 종양 조직이 혈관신생을 유도하여 종양 조직에 혈액 공급 및 영양소를 제공함으로써 회복시킴으로써 인한 독성 습격에 반응하여야 하는 때인 화학 요법 중에 또는 이후에 통상적으로 수행된다. 추가로, 이러한 혈관신생 억제제는, 전이에 대한 예방으로서 고형 종양을 제거하는 수술후에 투여하는 것이 바람직하다. 아지리딘 티오테파, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아스, 백금 착체, NO 류의 알킬화제, 폴레이트 유사체, 푸린 유사체, 아데노신 유사체, 피리미딘 유사체, 치환된 우레아, 항종양 항생제, 마이크로튜블 제제 (microtubulle agent) 및 아스프리그나제 등의, 세포 독성 또는 화학요법제가 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 단독으로 또는 기타 기존의 소염제, 항혈관신생제, 항암제 및 기타 안과 요법과 배합한 다가양이온성 화합물의 혈관신생 매개된 절차의 억제에서의 용도에 관한 것이다. 다가양이온성 화합물은 암, 염증 및 안과 질환에서의 혈관신생 매개 장애의 예방 및 치료를 위한 효과적인 사용법을 나타낸다.
위에서 기재한 화합물은 다가양이온성 화합물 및 유도체를 투여 방식에 허용되는 담체와 함께 포함하는 제형에 투여될 수 있다. 당업자에게 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이 의도하는 용도에 적합한, 활성 성분을 함유하는 어떠한 제형 또는 약제 전달 시스템이라도 사용될 수 있다. 경구, 직장, 국소 또는 비경구 (피하, 복막내, 근육내 및 정맥내) 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 담체는 제형의 기타 성분과 혼화된다는 의미에서 허용 가능하며, 이의 수용자에 해롭지 않아야 한다.
비경구 투여에 적합한 제형은 편리하게는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 활성 화합물의 멸균 수성 제제를 포함한다. 따라서, 이러한 제형은 편리하게는 증류수, 5% 덱스트로스 함유 증류수 또는 염수를 포함할 수 있다. 유용한 제형은 또한 화학식 I의 화합물을 함유하는 농축 용액 또는 고체를 포함하며, 이를 적합한 용매로 희석하면 상기 비경구 투여에 적합한 용액이 생성된다.
장내 투여를 위하여, 화합물은 산제 또는 입제로서, 또는 수성액 또는 비수성액 중의 현탁제 또는 용액제로서, 예를 들면, 시럽, 엘릭서, 에멀젼 또는 드래프트로서 각각 소정량의 활성 화합물을 함유하는 캡슐, 캐셰이, 정제 또는 로젠지 등의 개별 단위에 불활성 담체로 혼입시킬 수 있다. 적합한 담체는 전분 또는 당일 수 있으며 윤활제, 풍미제, 결합제 및 기타 동일 특성의 물질을 포함할 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압착 또는 성형으로 제조할 수 있다. 압착 정제는 활성 화합물을 유동 형태로, 예를 들면, 임의로 보조 성분, 예를 들면, 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 표면 활성제 또는 분산제와 혼합한 산제 또는 입제로 적합한 기계 안에서 압착하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 활성 화합물 분말과 임의의 적합한 담체를 적합한 기계 속에서 성형하여 제조할 수 있다.
시럽 또는 현탁액은 활성 화합물을 농축된 당 수용액, 예를 들면, 수크로스에 가하고, 여기에 또한 임의의 보조 성분을 가하여 제조할 수 있다. 이러한 보조 성분은 향미제, 당의 결정화를 지연시키는 제제 또는 기타 성분의 용해도를 증가시키는 제제, 예를 들면, 다가 알콜, 예를 들면, 글리세롤 또는 소르비톨을 포함할 수 있다.
장내 투여용 제형은 좌제 베이스로서 통상적인 담체, 예를 들면, 코코아 버터 또는 위텝솔 (Witepsol) S55[독일 소재의 다이나마이트 노벨 케미칼 (Dynamite Nobel Chemical) 제품]를 사용하여 좌제로서 제시될 수 있다.
또 다른 방법으로, 화합물은 리포좀 또는 미소구 (또는 미소입자)에 투여할 수 있다. 환자에게 투여하기 위한 리포좀 및 미소구의 제조방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이의 내용이 이로써 참조로 인용되는 미국 특허공보 제4,789,734호는 리포좀에 생물학적 물질을 캡슐화시키는 방법이 기재되어 있다. 본질적으로, 당해 물질을 수용액에 용해시키고, 적합한 인지질 및 지질을, 필요한 경우 계면활성제와 함께 첨가하고, 당해 물질을 필요한 만큼 투석 또는 초음파처리한다. 공지된 방법에 대한 검토는 문헌[참조: G. Gregoriadis, Chapter 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341 (Academic Press, 1979)]에 기재되어 있다.
중합체 또는 단백질로 형성된 미소구 또는 나노구는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 위장관로를 통하여 혈류로 직접 통과하도록 맞출 수 있다. 또 다른 방법으로, 화합물은 혼입시키고 미소구/나노구 또는 이들의 복합체를 수 일 내지 수 개월 동안의 기간에 걸쳐 서서히 방출하기 위하여 이식할 수 있다. 예를 들면, 이의 내용이 이로써 참조로 인용되는, 미국 특허공보 제4,906,474호, 제4,923,673호 및 제3,625,214호 및 문헌[참조: Jein, TIPS 19:155-157 (1998)]을 참고한다.
본 발명의 다가양이온성 화합물은 시험관내 및 생체내에서 항혈관신생 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 다가양이온성 화합물은 헤파린에 대하여 길항 효과를 나타낸다. 이론으로 제약하려는 것은 아니지만, 다가양이온성 화합물의 항혈관신생 효과는, 적어도 부분적으로는, FGF 및 VEGF 수용체의 활성화를 촉진시키는 헤파린의 역할을 길항하는 다가양이온성 화합물의 능력으로 인한 것일 수 있다.
다음 실시예에 대하여, 다음과 같이 다양한 물질이 수득되었다. 모든 시약은 화학 등급이고 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니 (Sigma Chemical Co.)로부터 또는 미국 뉴 저지주 브릿지포트 소재의 VWR 사이언티픽 (Scientific)을 통하여 구입하였다. 코르티손 아세테이트, 소 혈청 알부민 (BSA) 및 젤라틴 용액 (소 피부로부터의 2% B형)을 시그마 케미칼 캄파니로부터 구입하였다. M199 성장 배지와 얼 염 (Earl's salt), 염기성 FGF, 인슐린-트랜스페린-셀레늄-G 보충 (I-T-Se) 100X, Ca+2 및 Mg+2의 존재 및 부재하의 둘벡코 (Dulbecco) 인산염 완충된 염 용액 (PBS), 및 0.5M EDTA를 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 깁코 (Gibco) BRL로부터 입수하였다. 사람 배꼽정맥 내피 세포 (HUVEC), 내피 세포 기저 배지 (무혈청, EBM), 내피 성장 배지 (EGM) (성장 인자로 보충됨, 소 태아 혈청) 및 0.025% 트립신/0.01% EDTA 용액은 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 클로네틱스 인코포레이티드 (Clonetics, Inc.)로부터 구입하였다. 사람 전립선 (TSU-Pr) 종양 세포는 미국 메릴랜드주 록빌 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 입수하였다. 마트리겔 (Matrigel)® 매트릭스 및 사람 콜라겐 III형은 미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson)으로부터 구입하였다. HEMA-3 정착 및 착색 용액은 미국 뉴 저지주 스웨즈보로 소재의 바이오케미칼 사이언시즈, 인코포레이티드 (Biochemical Sciences, Inc.)로부터 구입하였다. 수정란은 미국 코네티컷주 노쓰 프랭클린 소재의 챨스 리버 래보러토리즈 (Charles River Laboratories), SPAFAS 어비언 프로덕츠 앤 러비시즈 (Avian Products & Services)로부터 구입하였다. 생체내 신혈관형성은 전체적으로 본원에 참조로 인용된, 선행 문헌[참조: Auerbach et al. (Auerbach et al., J. Dev. Biol., 41:391- 394 (1974)]에 기재된 방법으로 측정하였다.
본원의 파일은 컬러로 촬영하거나 도시한 하나 이상의 사진 또는 도면을 포함한다. 컬러 도면(들) 또는 사진(들)을 포함한 본원의 사본은 요청시 필요 수수료를 지불하고 특허상표청에서 제공받을 것이다.
도 1은 혈관신생의 CAM 모델에서의 다가양이온성 화합물의 효과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 다가양이온성 화합물의 인자 Xa의 억제율 (%)을 나타낸 막대 그래프이다.
도 3은 본 발명의 다가양이온성 화합물인, COMPOUND 110002의, 응고 시간에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 1은 혈관신생의 CAM 모델에서의 다가양이온성 화합물의 효과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 다가양이온성 화합물의 인자 Xa의 억제율 (%)을 나타낸 막대 그래프이다.
도 3은 본 발명의 다가양이온성 화합물인, COMPOUND 110002의, 응고 시간에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
실시예
1
다음 실시예는 본 발명의 예시적 다가양이온성 화합물의 항혈관신생 효과를 나타낸다. 10일된 배아를 미국 코네티컷주 프레스톤 소재의 스파파스, 인코포레이티드 (Spafas, Inc.)로부터 구입하고 37℃에서 55% 상대 습도로 배양하였다. 캔들링 램프의 도움으로 암실에서, 피하 바늘로 기낭을 감춘 쉘에 작은 구멍을 천공시켰다. 캔들링 동안 관찰된 바와 같이 배아 막의 무혈관성 부분 위로 직접 란의 넓은 부분 위의 쉘에 제2 구멍을 천공시켰다. 허위 기낭이 제1 구멍에 대한 음의 압력의 적용으로 제2 구멍 밑에서 생성되며, 이는 융모요막 (CAM)을 쉘로부터 분리시킨다. 밑에 있는 CAM에 직접 접근시키는 작은 크래프트 연삭 휠[미국 위스콘신주 라신 소재의 드레멜, 디비젼 오브 에머슨 일렉트로닉 캄파니 (Dremel, Division of Emerson Electronic Company) 제품]을 사용하여 떨어진 CAM 상의 쉘에서 약 1.0㎠의 창을 절단하였다. #1 필터지 (Watman International, United Kingdom)의 필터 디스크를 95% 에탄올과 물의 용액에 코르티손 아세테이트 (Sigma, St. Louis, MO) 3㎎/㎖에 침지시킨 다음, 멸균 조건하에 공기 건조시켰다. FGF2[미국 메릴랜드주 게이터스버스 소재의 라이프 테크놀로지스 (Life Technogogies) 제품]를 사용하여 10일된 병아리 배아의 CAM 위에 혈관을 성장시켰다. FGF2로 흡착시킨 멸균 필터 디스크를 PBS에 1㎍/㎖으로 용해시키고 성장하는 CAM에 위치시켰다. FGF2로 흡착시킨 멸균 필터 디스크를 PBS에 1㎍/㎖으로 용해시키고 성장하는 CAM에 위치시켰다. 24시간 후, 시험 화합물 또는 대조 비히클을 CAM에 직접 국소적으로 가하였다.
FGF2 포화 필터 디스크 바로 밑의 CAM 조직을 시험 화합물 또는 대조군으로 48시간 전에 처리한 배아로부터 절단하였다. 조직을 PBS로 3회 세척하였다. 섹션을 35mm 페트리 디시[미국 뉴욕주 톤우드 소재의 날겐 자이즈 (Nalgen Zeiss) 제품]에 놓고, SV6 입체현미경[미국 뉴욕주 톤우드 소재의 칼 자이즈 (Karl Zeiss) 제품]하에 50X 배율에서 검사하였다. 필터에 인접한 CAM 섹션의 디지털 상을 3-CCD 비디오 카메라 시스템[미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 도시바 어메리카 (Toshiba America) 제품]을 사용하여 수집하고, 이미지-프로 플러스 (Image-Pro Plus) 소프트웨어[미국 메릴랜드주 실버 스프링 소재의 미디어 사이버네틱스 (Media Cybernetics) 제품]를 사용하여 분석하였다. 표 4는 각각의 섹션에 대하여 계수한 필터 디스크의 영역과 동일한 원형 영역에 함유된 관 분지점의 수를 함유한다.
FGF2 포화 필터 디스크 바로 밑의 CAM 조직을 화합물 또는 대조군으로 48시간 전에 처리한 배아로부터 절단하였다. 조직을 PBS로 3회 세척하였다. 섹션을 35mm 페트리 디시[미국 뉴욕주 로체스터 소재의 날게 눈크 (Nalge Nunc) 제품]에 놓고, SV6 입체현미경 (미국 뉴욕주 톤우드 소재의 칼 자이즈 제품)하에 50X 배율에서 검사하였다. 필터와 인접한 CAM 부분의 디지털 상을 3-CCD 비디오 카메라 시스템 (미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 도시바 어메리카 제품)을 사용하여 수집하고, 이미지-프로 플러스 (Image-Pro Plus) 소프트웨어[미국 메릴랜드주 실버 스프링에 소재하는 미디어 사이버네틱스 제품]를 사용하여 분석하였다. 혈관신생에 대한 다가양이온성 화합물의 효과를 표 2, 3 및 4에 나타낸다. 효과도 또한 도 1에 나타낸다.
| CAM 처리 | 분지 pts±SEM | 억제율(%)±SEM |
| PBS(대조군) | 69±16.0 | |
| FgF(1.0㎍/㎖) | 155±10 | |
| 화합물 29(1.2㎍)+FGF2(1㎍) | 82±5 | 85±6 |
| 데이터는 평균 + SEM, n=8을 나타낸다. | ||
| 분지 pts±SEM | 억제율(%)±SEM | |
| CAM 처리 | ||
| PBS(대조군) | 80±7 | |
| FgF2(1.0㎍/㎖) | 177±10 | |
| 화합물 26(1.0㎍) +FGF2(1㎍) |
123±7 | 55±8 |
| 화합물 34(1.0㎍) +FGF2(1㎍) |
156±9 | 21±9 |
| 화합물 40(1.0㎍) +FGF2(1㎍) |
142±6 | 36±6 |
| 화합물 36(1.0㎍) +FGF2(1㎍) |
156±6 | 21±6 |
| 화합물 33(1.0㎍) +FGF2(1㎍) |
160±18 | 17±18 |
| 화합물 27(1.0㎍) +FGF2(1㎍) |
144±9 | 34±9 |
| 처리 그룹 | 평균 억제율(%)±SEM |
| PBS(대조군) | |
| FGF2(1.0㎍/㎖) | |
| 화합물 50(1.0㎍)+FGF2(1㎍) | 21±9 |
| 화합물 50(3.0㎍)+FGF2(1㎍) | 42±8 |
| 화합물 50(10㎍)+FGF2(1㎍) | 66±7 |
| 화합물 48(1.0㎍)+FGF2(1㎍) | 16±6 |
| 화합물 48(3.0㎍)+FGF2(1㎍) | 38±8 |
| 화합물 48(10㎍)+FGF2(1㎍) | 55±7 |
| 데이터는 평균±SEM, n = 8을 나타낸다. | |
위의 표 2, 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 다가양이온성 화합물은 혈관신생의 CAM 모델에서 FGF2 유도된 혈관신생을 차단시켰다.
실시예
2
다음 실시예는 본 발명의 다가양이온성 화합물의 내피 세포 튜브 형성의 억제를 나타낸다. 내피 세포에 의한 분화는 문헌[참조: Grant et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 27A:327-336 (1991)]에 전개된 방법을 사용하여 검사하였다. 페놀-레드 무함유 마트리겔® 매트릭스[미국 매사추세츠주 메드포드 소재의 벡톤 디킨슨 제품]를 차가운 24 다중웰 플레이트에 위치시켰다. 마트리겔® 매트릭스를 37℃에서 30분 동안 배양 중에 중합시켰다.
사람 배꼽정맥 내피 세포 (HUVEC)를 2% 소 태아 혈청이 포함된 내피 세포 성장 배지 (EGM) 중에 37℃에서 5% CO2 및 95% 습도로 유지시켰다. 관 검정을 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1:100 희석된 인슐린-트랜스페린-셀레늄-G 보충물 (I-T-Se, 100X)로 보충된 내피 세포 기저 배지 (EBM)에서 수행하였다. HUVEC을 트립신화시키고 원심분리시킨 후, 인산염 완충 염수 (PBS)에 2회 세척하였다. 계수 후, 세포 밀도를 35,000 세포/㎖로 조절하였다.
35,000 세포/㎖/웰의 최종 농도를 재조합 사람 섬유아세포 성장 인자 베이직으로 100ng/㎖에서 처리하고 다가양이온성 화합물 (표 1b 참조)을 EBM 배지에 용해시켰다. 처리된 세포를 37℃에서 5% CO2 및 95% 습도로 밤새 배양하여 세포 부착시켰다.
후속적으로, 배지를 흡인하고 세포를 고정하고 개질된 HEMA-3 착색 키트를 사용하여 착색시켰다. 마이크토 적정 웰 섹션의 디지털 상을 DKC5000 3-CCD 컬러 비디오 카메라 시스템 (미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 도시바 어메리카 제품)을 사용하여 수집하고, 이미지-프로 플러스 소프트웨어 (미국 메릴랜드주 실버 스프링 소재의 미디어 사이버네틱스 제품)를 사용하여 분석하였다. 관 형태의 착색 세포의 면적 및 주축 길이를 5 상/웰로부터 계수한 마트리겔® 매트릭스 표면 (미국 펜실베니아주 베드포드 소재의 벡톤 디킨슨 제품) 위에서 측정하였다.
아래의 표 5에 나타낸 바와 같이, 다가양이온성 화합물은 시험관내 EC 관 형성의 잠재적 억제제이다.
| 처리 그룹 | 평균 억제율(%)±SEM |
| 화합물 29(0.01㎍) | 25±7 |
| 화합물 29(0.1㎍) | 42±5 |
| 화합물 29(1.0㎍) | 76±6 |
| 데이터는 평균 ±SEM, n=3을 나타낸다. | |
실시예
3
당해 실시예는 세포 이동 검정을 나타낸다. 이러한 검정은 8㎛ 기공 크기를 갖는 뉴로프로브 96 웰 일회용 화학주성 챔버를 사용하여 수행하였다. 당해 챔버는 세포 이동을 비트로넥틴 또는 오스테오폰틴의 구배 쪽으로 향하도록 한다. 배양 세포를 EDTA/트립신 (0.01%/0.025%)을 사용하여 표준화 방법에 따라 제거하였다. 제거 후, 세포를 2회 세척하고, EBM (내피 세포 기반 배지, 클로네틱스 인코포레이티드 제품)에 재현탁 (2 × 106/㎖)시켰다. 비트로넥틴 또는 오스테오폰틴 (33㎕)을 0.0125 내지 100㎍/㎖로 일회용 화학주성 챔버의 하부 벽에 가한 다음, 프리프래임화 필터를 사용하여 어셈블링하였다. 세포 현탁액 (45㎕)을 상이한 농도의 시험 시약을 5㎕ 함유하는 폴리프로필렌 플레이트에 가하고 22℃에서 10분 동안 배양하였다. 상부 필터 웰에 세포/시험 시약 현탁액 25㎕를 가한 다음, 가습 세포 배양기에서 밤새 (37℃에서 22시간) 배양하였다. 밤새 배양한 후, 이동되지 않은 세포와 과량의 배지를 12개의 채널 피펫과 세포 스크레이퍼를 사용하여 부드럽게 제거하였다. 이어서, 필터를 PBS (Ca+2 또는 Mg+2 없음) 속에서 2회 세척하고 1% 포름알데히드로 고정하였다. 이동 세포의 막을 트리톤 X-100 (0.2%)으로 침투시킨 다음, PBS로 2 내지 3회 세척하였다. 이동 세포의 액틴 필라멘트를 로다민 팔로이딘 (12.8 IU/㎖)으로 30분 동안 (22℃) 착색시켰다. 로다민 팔로이딘을 매주 새로이 제조하고 4℃에서 빛으로부터 보호하여 저장한 경우, 3일 이하 동안 재사용하였다. 화학주성을 사이토플루오르 (Cytofluor) II (530 여기/590 방출)를 사용하여 형광 검출로 정량적으로 측정하였다. 독특하게 디자인된 처리/세척 스테이션을 사용하여 모든 세포 처리 및 후속적 세척을 수행하였다. 당해 스테이션은 각각 용적 수용량이 30㎖인 6개의 개별적인 시약 단위로 이루어져 있다. 개별적인 단위를 다음 시약 중의 하나로 충전시켰다: PBS, 포름알데히드, 트리톤 X-100 또는 로다민-팔로이딘. 당해 기술을 사용하여, 필터를 적합한 용액에 부드럽게 침지시켜 이동 세포 손실을 최소화시켰다. 당해 기술로 세포 이동을 최대 정량화시키고 검정간 및 검정내 변동성이 최소인 재현 가능한 결과를 제공한다[참조: Bozarth et al., Methods In Cell Science, 19 (3): 179-187, 1997; Penno et al., J. Method In Cell Science, 19 (S): 189-195, 1997].
아래 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 다가양이온성 화합물은 사람 배꼽정맥 내피 세포 이동을 억제한다.
| 처리 그룹 | 평균 억제율(%)±SEM |
| 화합물 29(0.01μM) | 19±2 |
| 화합물 29(0.1μM) | 40±3 |
| 화합물 29(1.0μM) | 67±5 |
| 데이터는 평균 ±SEM, n=3을 나타낸다. | |
실시예
4
다음 실시예는 본 발명의 다가양이온성 화합물의 헤파린 길항 효과를 나타낸다. 다가양이온성 화합물의 항헤파린 활성을 측정하기 위하여, 사람 적혈구 세포의 50%의 세포용해를 발생시키는 다가양이온성 화합물(들)의 고정된 농도를 사용한 억제율을 측정하는 검정을 수행하였다.
안티-트롬빈 10 IU를 완충액 10㎖에 용해시켜 안티트롬빈의 저장용액 (250x) 1 IU/㎖를 수득하였다. 안티-트롬빈 저장용액 1 IU/㎖ (250x)와 NaCl 336mM 저장용액을 완충액 50㎕의 총 용적으로 희석시켜 최종 안티-트롬빈 농도가 0.004 IU/샘플 웰이고 NaCl이 150mM/샘플 웰이 되도록 하였다. 시험 화합물 1㎕, 최종 농도 10㎍/㎖ (0.5 로그 길항 희석에 상응)를 샘플 웰에 가한다. 샘플을 혼합하고 실온에서 20분 동안 배양한다. 완충액에 용해된 인자 Xa 50㎕를 샘플 웰에 가하여 0.14 knat/웰 (100㎕의 최종 샘플 웰 완충 용적에 대한 7.1 knat/㎖ 저장용액 2㎕)의 최종 농도를 수득한다. 샘플을 혼합하고 실온에서 10분 동안 추가로 배양하였다. 기질 S-2765의 4mM 저장용액 10㎕를 각각의 샘플 웰에서 0.4mM의 최종 농도가 되도록 각각의 샘플 웰에 가하였다. 샘플을 혼합하고 발색성 기질 Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA (S-2765)을 가수분해시켜 발색단 pNA (p-니트로아닐린)를 유리시키고, 405nm에서 모니터링하였다. 샘플을 30초마다 혼합하여 균일한 혼합물을 유지시켰다. 터모랩시스템즈 멀티스칸 스펙트럼 (ThermoLabsystems Multiskan Spectrum) 분광계를 사용하여 흡광 스펙트럼을 측정하였다. 흡광도의 증가는 효소 (인자 Xa) 활성에 비례하였다. 인자 Xa의 억제율 (%)은 표준 곡선을 사용하여 측정하였다. 결과를 표 7에 나타낸다. 억제율 (%)을 또한 나타내는 막대 그래프는 도 2에 제시한다.
도 2 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 다가양이온성 화합물은 인자 Xa를 억제하였다.
인자 Xa 억제: EC50. 사람 적혈구 세포의 약 50% 용해를 발생시키는 다가양이온성 화합물의 농도를 측정하기 위하여, 고정된 헤파린 농도를 사용하고 상이한 양의 헤파린 길항제를 가하였다. 결과를 표 8에 나타낸다.
위의 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 다가양이온성 화합물은 인자 Xa의 다양한 억제도를 나타낸다.
실시예
5
다음 실시예는 응고 시간에 대한 본 발명의 다가양이온성 화합물의 효과를 나타낸다. 본 명세서에 기재된 항헤파린 검정을 사용하였다. 검정은 헤파린 1㎎/ℓ, 2㎎/ℓ 또는 4㎎/ℓ를 함유하며, 화학식 26의 화합물을 증가량으로 가하였다. 표 9 및 도 3은 응고 시간에 대한 화합물 26의 효과를 나타낸다.
도 3 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 다가양이온성 화합물인 화학식 26은, 헤파린의 다양한 농도에서 응고 시간을 감소시켜, 화합물이 헤파린의 활성을 길항시키는 능력이 있음을 입증한다.
바람직한 양태가 본 명세서에 상세히 도시되고 기재되었지만, 당업자에게는 다양한 변형, 추가, 치환 등이 본 발명의 의도를 벗어나지 않고 가능하며, 따라서, 이들은 아래의 청구의 범위에서 정의한 본 발명의 영역 내에서 고려됨이 명백할 것이다. 본 발명의 기타 양태는 본 명에서의 고려 사항 또는 본 명세서에 기재된 발명의 실시로부터 당업자에게 명백할 것이다. 명세서 및 실시예는 예시로서만 고려되며, 본 발명의 진정한 의도 및 정신은 다음 청구의 범위에 의해 지시하려는 것이다.
Claims (24)
- 하기 화학식의 살리실아미드 화합물 또는 이의 염:
상기 식에서,
n은 2 내지 10이고;
R1은이고;
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R3는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R4는 OH, NH2 또는(여기서, A는 OH 또는 NH2이다)이다.
- 하기 화학식의 살리실아미드 화합물 또는 이의 염:
상기 식에서,
n은 2 내지 10이고;
R1은 H 또는이고;
R2는 하나 이상의 -N(CH3)2로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R3는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R4는 OH, NH2 또는(여기서, A는 OH 또는 NH2이다)이다.
- 하기 화학식의 살리실아미드 화합물 또는 이의 염:
상기 식에서,
n은 2 내지 10이고;
R1은 H 또는이고;
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R3는 하나 이상의 -N(CH3)2로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R4는 OH, NH2 또는(여기서, A는 OH 또는 NH2이다)이다.
- 하기 화학식의 살리실아미드 화합물 또는 이의 염:
상기 식에서,
n은 2 내지 10이고;
R1은 H 또는이고;
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R3는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R4는 OH 또는(여기서, A는 OH 또는 NH2이다)이다.
- 하기 화학식의 화합물 중에서 선택된 살리실아미드 화합물 또는 이의 염:
- 하기 화학식의 살리실아미드 화합물 또는 이의 염:
- 치료학적 유효량의 하기 화학식의 살리실아미드 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 혈관신생을 억제하거나 헤파린에 대해 길항하거나 항-인자 Xa를 억제하거나 폐암, 유방암, 전립선암, 결장암, 신장암, 교모세포종, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 관절염, 류머티스성 관절염, 졸중, 심장병, 카포시 육종 및 미숙아 망막병증 중에서 선택되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
상기 식에서,
n은 2 내지 10이고;
R1은 H 또는이고;
R2는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R3는 하나 이상의 -NH2, -N(CH3)2 또는로 임의로 치환된 C1 내지 C9 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
R4는 OH, NH2 또는(여기서, A는 OH 또는 NH2이다)이다.
- 제7항에 있어서, 화학요법제 또는 방사선요법을 추가로 포함하는 조성물.
- 제7항에 있어서, 살리실아미드 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염인 조성물:
- 제7항에 있어서, 캡슐, 캐셰이, 정제 또는 로젠지의 형태인 조성물.
- 제7항에 있어서, 산제 또는 입제의 형태인 조성물.
- 제7항에 있어서, 수성액 또는 비수성액 중의 현탁제 또는 용액제의 형태인 조성물.
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