KR101149396B1 - 사슴만성소모성질병의 변형프리온을 감별 및 검출할 수 있는 단클론항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그 용도 - Google Patents

사슴만성소모성질병의 변형프리온을 감별 및 검출할 수 있는 단클론항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사슴의 PrP 펩타이드 중 특정부위를 선발하여 이를 유전자 적중 마우스에 접종하여 면역시킨 후 여기에서 분리한 면역 B 세포와 마우스 골수종유래세포를 융합하여 제조한 융합세포주; 상기 융합세포주로부터 생산되고 사슴만성소모성질병의 변형프리온(PrPsc)을 사슴의 정상프리온 및 소해면상뇌증 및 스크래피(Scrapie) 등의 다른 전염성해면상뇌증의 변형프리온과 감별하여 검출해 내는 단클론항체 및 그 용도에 관한 것이다.
사슴만성소모성질병, 변형프리온, 단클론항체, 융합세포주, PrP 펩타이드, 전염성해면상뇌증

Description

사슴만성소모성질병의 변형프리온을 감별 및 검출할 수 있는 단클론항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그 용도{Monoclonal antibody for discriminating and detecting abnormal prion causing chronic wasting disease}
본 발명은 사슴의 PrP 펩타이드 중 특정부위를 선발하여 이를 유전자 적중 마우스에 접종하여 면역시킨 후 여기에서 분리한 면역 B 세포와 마우스 골수종유래세포를 융합하여 제조한 융합세포주; 상기 융합세포주로부터 생산되고 사슴만성소모성질병의 변형프리온(PrPsc)을 사슴의 정상프리온 및 소해면상뇌증 및 스크래피(Scrapie) 등의 다른 전염성해면상뇌증의 변형프리온과 감별하여 검출해 내는 단클론항체 및 그 용도에 관한 것이다.
사슴만성소모성질병(CWD: Chronic wasting disease)은 1967년 미국의 콜로라도주에서 이상한 행동을 보이며 신경증상이 있는 포획된 뮬사슴(mule deer)에서 최초로 발생하였다. 계속해서 동남쪽의 와이오밍주, 동북쪽의 콜로라도주 및 서부의 네브라스카에서 유사한 증상을 보이는 검은 꼬리 사슴과 로키마운틴 엘크에서 CWD가 발생하였다. 전염성해면상뇌증(TSE: Transmissible Spongiform Encephalopathies)은 뇌에 단백분해효소(proteinase)에 저항성이 있는 프리온 단백질이 침착되고 신경 세포 내에 공포가 형성되는 특징을 보이는 질병으로서 CWD도 이에 해당된다.
CWD의 임상증상은 심한 쇠약, 체중감소, 운동실조, 무리로부터의 이탈, 침울, 마비, 연하곤란, 과도한 침흘림 및 폐렴을 동반하기도 한다. CWD와 소해면상뇌증(BSE: Bovine Spongiform Encephalopathy)의 특이적인 조직병리학적 병변으로는 뇌간부위, 특히 미주신경의 등쪽 운동신경 핵에서 관찰된다.
2001년과 2004년 두 차례에 걸쳐 우리나라에서도 캐나다에서 수입한 엘크에서 CWD가 발생된 바 있다. 확진검사를 위해 뇌 조직을 이용한 조직병리학적 검사, 면역조직화학적 검사 및 웨스턴블로팅을 통해 CWD를 최종적으로 진단한 바 있다.
세포 내에 정상적으로 존재하는 단백질인 정상프리온(PrPc)은 33-35 kDa의 분자량을 가진 시알로당단백(sialoglycoprotein)으로서 글라이코실 포스파티딜 이노시톨(glycosyl phosphatidyl inositol) 앵커부위가 포유동물의 세포막에 부착되어 있다. 정상프리온과 변형프리온의 일차적인 구조는 동일하지만 변형프리온인 PrPsc는 PrPc 보다 구조학적으로 β-시트(β-sheet)가 증가되어 있고 단백분해효소 K(proteinase K)에 부분적인 저항성이 있다.
지금까지는 주로 단백분해효소 K에 저항성이 있는 변형프리온을 TSE 감염뇌 에서 프리온의 특이적인 항체를 이용하여 면역학적으로 검출해 내는 방법을 이용하여 TSE를 진단해 왔다. 최근에는 유전자 적중 마우스(knock-out mouse; 프리온 단백질이 없는 형질전환 마우스)를 이용하여 생산된 많은 단클론항체들이 프리온 질병의 진단에 사용되기도 하였다. 하지만, 이들 대부분의 종래 단클론항체들이 정상프리온과 변형프리온을 감별해 내거나 종특이적 변형프리온을 검출해 내는 데에는 한계가 있었다. 따라서, 다양한 전염성해면상뇌증의 동물별 감별 진단을 위해서 전염성해면상뇌증이 발병되는 종에 따라 특이적으로 반응하는 단클론항체의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 사슴의 PrP 펩타이드 중 특정부위를 선발하여 이를 유전자 적중 마우스에 접종하여 면역시킨 후 여기에서 분리한 면역 B 세포와 마우스 골수종유래세포를 융합하여 제조한 융합세포로부터 생산된 단클론항체가 CWD의 변형프리온에만 특이적으로 반응하고 다른 TSE 질병인 BSE 및 스크래피와 감별되는 것을 면역조직화학법 및 웨스턴블로팅을 통해 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 CWD 변형프리온만을 감별하여 검출할 수 있는 단클론항체 및 그 용도를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 CWD 변형프리온을 검출할 수 있는 단클론항체를 생산하기 위한 융합세포주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 사슴만성소모성질병의 변형프리온을 검출하기 위한 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00214의 융합세포주를 제공한다.
또한 본 발명에서는 1) 서열번호 1의 펩타이드를 유전자 적중 마우스에 접종하여 면역시키는 단계; 2) 상기 1)의 마우스로부터 면역 B 세포를 분리하는 단계; 및 3) 상기 2)에서 분리한 면역 B 세포와 마우스 골수종유래세포를 융합시키는 단계를 거쳐 기탁번호 KCLRF-BP-00214의 융합세포주를 제조하는 방법을 제공한다.
또 본 발명에서는 상기 융합세포주로부터 생산되고, 사슴만성소모성질병의 변형프리온을 검출하기 위한 단클론항체 및 이 단클론항체를 사용하는 웨스턴블로팅을 통해 사슴만성소모성질병의 변형프리온을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 융합세포주에 의해 생산되는 단클론항체는 사슴의 정상프리온 및, 소해면상뇌증 및 스크래피(Scrapie) 등의 다른 전염성해면상뇌증의 변형프리온과 감별하여 사슴만성소모성질병의 변형프리온(PrPsc)만을 특이적으로 검출하였다.
본 발명은 사슴만성소모성질병의 변형프리온을 사슴의 정상프리온 및 소해면상뇌증 및 스크래피 등의 다른 전염성해면상뇌증의 변형프리온과 감별할 수 있는 단클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주에 관한 것이다.
본 발명에 의한 융합세포주를 제조하는 과정을 하기 단계들을 포함한다:
1) 서열번호 1의 펩타이드를 유전자 적중 마우스에 접종하여 면역시키는 단계;
2) 상기 1)의 마우스로부터 면역 B 세포를 분리하는 단계; 및
3) 상기 2)에서 분리한 면역 B 세포와 마우스 골수종유래세포를 융합시키는 단계.
상기 1) 단계에서는 사슴의 PRNP 유전자 중 152-168 번째 아미노산 서열(YYRENMYRYPNQVYYRP)에 해당하는 서열번호 1의 펩타이드를 합성하여 사용한다. 본 발명에서는 상기 펩타이드의 N-말단에 시스테인을 추가한 후 면역원성을 높이기 위하여 선택적으로 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin) 및/또는 오발부민(Ovalbumin)과 같은 캐리어와 중합시켜 대량의 시료를 검사하거나 제작된 융합세포주를 스크리닝하기 위한 효소결합면역측정법(ELISA)에 사용할 수 있다.
상기 펩타이드를 제조하기 위한 합성기술은 당업계에 잘 알려진 통상적인 기술을 당업자가 용이하게 적용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, Fmoc 고상법(Soild phase synthesis procedure)을 이용하여 서열번호 1의 펩타이드를 합성한 후 워터스 C18 칼럼(Waters C18 colum)을 이용한 HPLC법으로 정제하는 과정을 거쳐 제조될 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
상기 합성 펩타이드를 유전자 적중 마우스(프리온 단백질이 없는 형질전환 마우스)에 접종한 후 이로부터 분리한 마우스의 면역 B 세포와 골수종유래 세포간의 세포융합에 의해 사슴만성소모성질병의 변형프리온과 특이적으로 반응하는 단클론항체를 생산하는 융합세포주(하이브리도마 세포)를 작출하였다. 본 발명에 의한 융합세포주는 2009년 7월 13일자로 한국세포주은행에 기탁하여 기탁번호 KCLRF-BP-00214를 부여받았다.
상기 융합세포주로부터 생산된 단클론항체를 “8E63 단클론항체”로 명명하였다.
또한 본 발명에서는 펩스폿막(Pepspot membrane)을 제작하여 상기 단클론항체와 소의 프리온 펩타이드의 반응성을 통해 에피토프를 분석한 후, 이 8E63 단클론항체를 사슴만성소모성질병의 변형프리온에 대한 반응을 나타내는 진단 항체로 사용하는 웨스턴블로팅 및 면역조직화학염색을 통해 상기 8E63 단클론항체와 CWD, BSE 및 스크래피의 변형프리온과의 반응성 차이를 조사해 본 결과, 상기 항체가 사슴만성소모성질환의 변형프리온에만 결합하고, 다른 항원들과는 반응하지 않았다. 따라서, 본 발명에 의한 단클론항체를 사용할 경우 사슴의 정상프리온 및 BSE와 스크래피의 변형프리온과 감별이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에서는 웨스턴블로팅 및 면역화학염색에서 8E63 단클론항체를 사용함으로써 사슴만성소모성질병 이외의 다른 전염성해면상뇌증 즉, BSE 및 스크래피 등과 감별되는 새로운 감별진단법을 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] 사슴의 PrP 합성펩타이드 제작
하기 표 1에 기재된 사슴 정상프리온의 아미노산을 기본으로 하여 친수성이 존재하면서 변형프리온과 정상프리온을 감별할 수 있는 에피토프 “YYR"을 포함하서열번호 1의 펩타이드를 합성하였다.
합성 펩타이드로 사용한 사슴 PrP 아미노산 서열
종(기탁번호) 위치 합성 펩타이드 서열
사슴(Deer, Elk; AY748455) 152-168 YYRENMYRYPNQVYYRP(서열번호 1)
펩타이드 합성방법은 다음과 같다. (주) 펩트론에서는 Fmoc 고상법(Soild phase synthesis procedure)을 이용하여 서열번호 1의 펩타이드를 합성한 후 워터스 C18 칼럼(Waters C18 column)을 이용한 HPLC법으로 정제한 다음 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacrtic acid)이 포함된 아세토니트릴 5～75%(v/v) 용액을 이용하는 아세토니트릴 선형 구배(actonitrile linear gradient)로 용출하였다.
상기 서열번호 1의 펩타이드 N-말단에 시스테인을 추가한 후 펩타이드 절편의 면역원성을 높이기 위하여 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin)과 중합시켰다. 또한 상기 펩타이드 절편을 오발부민(Ovalbumin)과 중합시켜 대량의 시료를 검사하거나 제작된 융합세포주를 스크리닝하기 위한 효소결합면역측정법(ELISA)에 사용하였다.
[실시예 2] 단클론항체를 생산해내는 융합세포주 제조
상기 실시예 1에서 제조한 합성 펩타이드-키홀림펫헤모시아닌(KLH) 중합체를 완전프로인트 어쥬반트(complete Freund's adjuvant)와 동량 혼합한 다음 8주령 유전자 적중 마우스 당 100 ㎍씩 피하로 접종하였다. 첫 번째 면역 후 3주 경과한 다음 동일 항원과 불완전 프로인트 어쥬반트(incomplete Freund's adjuvant)를 동일한 면역 방법으로 3회 추가 접종하였다. 세포융합 3일전에 마우스를 어쥬반트 없이 인산완충용액(PBS)에 100 ㎍ 펩타이드를 중합하여 복강에 주입하여 2차 면역을 유도하였다.
단클론항체를 생산해 내는 융합세포주를 작성하기 위해서 면역화된 유전자 적중 마우스의 비장에서 B 림프구를 채취하여 세포융합에 사용하였다. 세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 상기 채취한 림프구를 무혈청 배지로 세척한 후, 마우스골수종 유래세포주(Sp 2/0-Ag14)와 폴리에틸렌글리콜 1500을 1 ml 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포는 증식배지(DMEM, HAT(Hypoxanthine Aminopterine Thymidine) 및 10% 우태아혈청)에 적당히 희석한 다음 미리 마우스 복강세포가 배양되어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 7 내지 14일 동안 배양하였다.
융합세포주를 선별 및 분리하기 위해서는 상기에서 획득한 상층액을 취하여 간접적 ELISA 방법으로 상기에 명시되어 있는 펩타이드 절편에 오발부민이 중합되어있는 펩타이드와 사슴 프리온 재조합 단백질을 이용한 사슴 변형프리온에 대한 양성클론을 선별한 다음, 양성 반응을 보이는 웰의 융합세포들을 마우스 복강세포가 배양된 96웰 플레이트에 웰당 0.5개의 세포가 포함되도록 첨가하고 단클론이 형성될 때까지 배양하였다. 상기 융합세포주를 2009년 7월 13일자로 한국세포주은행에 기탁하여 기탁번호 KCLRF-BP-00214를 부여받았다.
[실시예 3] 단클론항체 생산 및 분리
상기 실시예 2에서 얻어진 양성 클론을 이용하여 마우스 복강 배양액을 제조하기 위하여 ELISA 방법으로 확인된 단클론항체를 생성하는 양성 클론 융합세포를 배양하여 5×106 개의 세포를 1주일 전에 불완전 프로인트 어쥬번트를 미리 처리한 BALB/C 마우스의 복강내로 주사하였다. 10～15일 후에 5～10 ml의 복수를 추출하였다.
단클론항체를 포함하는 복강 배양액으로부터 다음과 같은 방법으로 항체를 정제하였다. 상기 획득한 복수를 단백질 A/G 친화성 컬럼(Immobilized protein A/G column; Pierce, U.S.A)이 포함된 IgG 정제 키트(Immunopure (A/G) IgG purification kit; Pierce, U.S.A)를 이용하여 정제를 하였으며, 이의 아이소타입은 아이소타입핑 실험 스트립(Serotec, UK)을 이용하여 하기 표 2와 같이 결정되었다. 정제된 항체의 농도는 BCA(bicinchoninic acid; Pierce, U.S.A) 방법으로 정량하였으며, 인산완충용액으로 농도를 0.5 mg/ml로 희석하였다.
단클론항체 8E63
아이소타입 IgG1, kappa
[실시예 4] 단클론항체(8E63)의 항원결정기(epitope) 분석
제작된 단클론항체의 특이적인 항원결정기를 분석하기 위하여 펩스폿막을 제작하여 반응성을 조사하였다. 즉, 사슴의 PrP 22-227번째 아미노산을 스폿 1개당 펩타이드를 12개를 합성시켜 2개의 아미노산이 옆으로 이동하여 98개의 펩스폿막을 주문제작(Sigma Genosys)하여 면역블롯 방법으로 단클론항체에 대한 항원결정기를 분석하였다. 방법으로는 TBST(Tris-buffered saline; 0.05% Tween 20 첨가)로 막을 세척한 후, 5% 블록킹 완충액을 제조하기 위해서 5 g 블록킹파우더와 5 g의 수크로오스를 100 ml의 TBST에 첨가하여 충분히 녹인 다음 사용하였다. 블록킹 완충액 20 ml로 한 시간 동안 실온에서 반응시킨 후, TBST로 가볍게 1회 세척한 다음, 항체희석액 20 ml에 제작된 단클론항체를 2 ㎍/ml로 제작하여, 여기에 막을 넣어 실온에서 한 시간 반응시켰다. TBST로 5분간 6번 세척한 후 항체 희석액 20 ml에 2차 항체(anti-mouse HRP,1:10,000) 2 ㎕ 넣어 여기에 막을 실온에서 30분간 세척하였다. 발색하기 위하여 발색제(Chemiluminescence)로 ECL 웨스턴블로팅 검출 시약(Amersham RPN2106)을 막에 적셔서 LAS 4000(Kodak)으로 확인하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 결과에서, 65번째 스폿부터 68번째까지의 스폿이 양성반응을 나타내는 것으로 미루어 보아 중복되는 아미노산인 156번째부터 161번째까지의 아미노산인 NMYRYP가 8E63 단클론항체의 항원결정기임을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] 뇌 조직에서 정상프리온과 변형프리온 추출
SDS-PAGE와 웨스턴블로팅에 사용할 면양, 소 및 엘크의 정상 뇌에서 프리온을 추출하기 위해서 뇌조직 100 mg을 채취하여 균질화 완충액(homogenized buffer)을 사용하여 10% 뇌유제액을 제조한 다음 10,000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액 100 ㎕를 채취하여 2x 샘플 로딩 완충액(sample loading buffer)을 동량 첨가하여 100℃ 5분간 가열하였다. 더불어 감염뇌에서 변형프리온을 추출하기 위해서는 각 종류의 TSE에 감염된 면양, 엘크 및 소의 뇌 유제액을 상기와 같은 방법으로 제조하여 100 mg 조직에 40 ㎍의 DNaseⅠ과 콜라게나아제 100 mg 조직당 0.5 mg을 첨가한 후, 37℃에서 2시간에서부터 4시간 반응시켰다. 단백분해효소 K를 100 mg 조직당 40 ㎍ 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, 0.1 M 페파블록(Pefablock)을 10 ㎕ 첨가한 후, 15,000 rpm에서 15분간 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 펠렛에 5% SDS(sodium dodecyl sulfate)를 100 ㎕ 첨가하여 100℃ 5분간 끓여준 후, 1 ml의 차가운 메탄올을 첨가하여 -20℃ 냉동고에 30분 이상 방치하였다. 이 상태로는 하룻밤(overnight)까지 가능하며 다음으로 4℃에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 메탄올을 버린 다음 5분간 정치시켜 메탄올을 증발시켰다. 1x 샘플 로딩 완충액 100 ㎕에 녹여 100℃ 5분간 끓였다.
[실시예 6] SDS-PAGE 및 웨스턴블로팅
상기 실시예 5에서 추출한 정상프리온과 변형프리온을 12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔(Bis-tris polyacrylamide gel; Invitrogen)에 로딩하였다. 전기영동은 200 V로 35분간 시행하고 단백질 시료들을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF: polyvinylidene difluoride) 막을 이용하여 전기적으로 150 V로 1시간 트랜스퍼시켰다. 막을 30분간 블록킹한 후, 8E63 단클론항체를 2 ㎍/ml 1시간 실온에서 반응시켰다. TBST로 5분간 3회 세척한 다음, 2차 항체[마우스 IgG에 대한 알칼리 포스파타아제 결합 염소 항체(alkaline phosphatase-conjugated goat antibody to mouse IgG)]를 1:3000으로 TBST에 희석하여 실온에서 1시간동안 반응시켰다. TBST로 5분간 3회 세척한 후 발색제로 화학발광(chemiluminescence)인 CDP star를 사용하여 LAS 4000(Kodak, Japan)으로 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 결과에서, 본 발명에 의한 8E63 단클론항체는 면양, 엘크 및 소의 정상프리온과는 전혀 반응하지 않았다. 변형프리온 중에서는 면양 스크래피의 변형프리온과 미약하게 반응성을 보였고, 소해면상뇌증(BSE)의 변형프리온과는 전혀 반응하지 않았으며, CWD(엘크)의 변형프리온과는 강한 반응성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 7] 포르말린 고정조직과 파라핀 포매 조직 제조
BSE와 CWD에 감염된 소와 엘크의 뇌 시료를 10% 중성 포르말린에 하루 동안 침지하여 고정시킨 후, 뇌간의 빗장부위를 횡단면으로 잘라서 흐르는 물에 세척한 다음 감염력을 소실시키기 위해서 96% 개미산 용액에 1시간가량 침지시켰다. 이 조직을 통상적인 방법으로 조직처리기를 거친 후 파라핀으로 포매한 다음 4 ㎛ 두께로 절단하였다. 절단된 조직 슬라이드를 40℃에서 24시간 말린 후 면역조직화학염색법에 사용하였다.
[실시예 8] 전처리방법과 면역조직화학염색법(IHC: Immunohistochemistry)
파라핀 조직 슬라이드를 자일렌과 알콜에 침지시키는 단계를 거쳐 탈파라핀화시켰다. 내재성 과산화효소의 활성을 막기 위하여 메탄올에 3% 과산화수소를 제조하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 다음으로 슬라이드를 88% 개미산 용액에 침지하여 5분 동안 전처리한 후 시트르산염 완충액(Citrate buffer)에 침지시켜 고압멸균기 내에서 121℃에서 25분간 반응시켜 항원노출화 과정을 수행하였다.
IHC는 Ventana AEC 검출키트(Ventana medical system, 미국)를 이용하여 자동화된 IHC 기계(Nexus)에서 수행하였다. 8E63 항체(일차 항체) 5 ㎍/ml를 37℃에서 32분간 반응시켰다. 바이오틴이 붙은 항마우스(Biotinylated-anti mouse) 이차항체와 퍼옥시다아제-스트렙타비딘 컨쥬게이트(peroxidase-streptavidin conjugate)는 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole) 기질과 반응하여 항원에 대하여 발색하도록 하며 대조염색을 위해 메이어스(Mayer's) 헤마톡실린을 사용하였다. 수용성 봉입제를 사용하여 봉입한 후 검경하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 결과에서, BSE에 감염된 조직은 음성이었고, CWD에 감염된 조직에서 양성반응을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 융합세포주에 의해 생산되는 단클론항체는 특이성이 우수하여 사슴만성소모성질병 감염에 대한 진단시약으로서 활용될 수 있으며 이러한 결과는 사 슴만성소모성질병의 변형프리온을 검출하는 특이적인 진단법으로서 향후, 사슴만성소모성질병의 예방 및 발생요인분석을 위한 귀중한 자료로서도 충분히 활용될 수 있다.
도 1은 사슴의 프리온 단백질 아미노산 서열 22번째부터 227번째까지의 아미노산들을 한 스폿(spot)당 12개 펩타이드를 배열하고, 2개의 아미노산이 겹치게 배열하여 작성한 펩스폿막에 8E63 단클론항체와 결합하는 프리온 단백질 에피토프를 분석한 결과이다.
도 2는 8E63 단클론항체를 이용하여 웨스턴블로팅한 결과이다.
도 3은 소해면상뇌증에 감염된 소의 뇌조직과 사슴만성소모성질병에 감염된 사슴의 뇌 조직에 8E63 단클론항체를 이용하여 면역조직화학염색법을 시행한 결과이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> Monoclonal antibody for discriminating and detecting abnormal prion causing chronic wasting disease <130> YPD/200906-0016 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg 1 5 10 15 Pro

Claims (5)

  1. 사슴만성소모성질병의 변형프리온을 검출하기 위한 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00214의 융합세포주.
  2. 1) 서열번호 1의 펩타이드를 유전자 적중 마우스(Knock-out mouse)에 접종하여 면역시키는 단계;
    2) 상기 1)의 마우스로부터 면역 B 세포를 분리하는 단계; 및
    3) 상기 2)에서 분리한 면역 B 세포와 마우스 골수종유래세포를 융합시키는 단계;
    를 거쳐 기탁번호 KCLRF-BP-00214의 융합세포주를 제조하는 방법.
  3. 제 1항에 의한 융합세포주로부터 생산되고, 사슴만성소모성질병의 변형프리온을 검출하기 위한 단클론항체.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 단클론항체는 156번째부터 161번째까지의 아미노산인 “NMYRYP” 부위가 항원결정기임을 특징으로 하는 단클론항체.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 의한 단클론항체를 사용하는 웨스턴블로팅을 통해 사슴만성소모성질병의 변형프리온을 검출하는 방법.
KR1020090067453A 2009-07-23 2009-07-23 사슴만성소모성질병의 변형프리온을 감별 및 검출할 수 있는 단클론항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그 용도 KR101149396B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Annals New York academy of sciences, 2006, Vol.1081, pp.112-123 *
이세영, 2006, Detection of bovine spongiform encephalopathy and chronic wasting disease using monoclonal antibodies, 석사학위논문, 서울대학교 대학원 수의학과 *
이세영, 2006, Detection of bovine spongiform encephalopathy and chronic wasting disease using monoclonal antibodies, 석사학위논문, 서울대학교 대학원 수의학과*

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