KR101147541B1

KR101147541B1 - A skin-care agent containing Arctii fructus extracts using microbial fermentation

Info

Publication number: KR101147541B1
Application number: KR1020100054272A
Authority: KR
Inventors: 배준태; 이근수; 김진화; 송민현; 강정욱; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2010-06-09
Filing date: 2010-06-09
Publication date: 2012-05-21
Also published as: KR20110134614A

Abstract

본 발명은 우방자 추출물을 유효 미생물으로 발효시킨 우방자 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 발효균주인 잎새버섯(Grifola frondosa KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(Grifola fronodosa KCTC 10337BP) 전 배양액을 혼합하여 우방자 추출물을 발효시켜, 우방자 추출물 내에 주로 배당체(glucosides) 형태로 존재하는 악틴(arctiin) 성분을 아글리콘(aglycons) 형태로 전환된 악티게닌(arctigenin)과, 카페익산 배당체로부터 비배당체 형태의 카페익산(caffeic acid)의 함량이 향상된 우방자 발효물을 유효성분으로 0.001 - 30.0중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물은 피부흡수가 뛰어나며, 단순 열수 또는 유기용매 추출물 보다 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 슬리밍효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과가 우수하다. The present invention relates to an external composition for skin containing fermented fermented product of fermented milk extract as an effective microorganism as an active ingredient, more specifically, mycelia or leaf fungi (Grifola frondosa KCTC 10337BP), which is a fermented strain. 10337BP) Fermentation of allium extracts by mixing the whole culture solution, the actinogen (arctigenin) and caffeic acid glycosides in which the actin (arctiin) component mainly present in the form of glycosides (glucosides) in the allium extract is converted into aglycons. The skin external preparation composition which contains 0.001-30.0% by weight of the fermented fermented product having an improved content of caffeic acid in the form of non-glycosides as an active ingredient has excellent skin absorption, and is superior to simple hot water or organic solvent extracts. Free radical scavenging effect, wrinkle improvement effect, slimming effect, whitening effect, moisturizing effect, skin stimulation In effect, the effect of preventing acne, atopic improvement and anti-inflammatory effects are excellent.

Description

A skin-care agent containing Arctii fructus extracts using microbial fermentation}

본 발명은 우방자 추출물을 유효 미생물으로 발효시킨 우방자 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 발효균주인 잎새버섯(Grifola frondosa KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(Grifola fronodosa KCTC 10337BP) 전 배양액을 혼합하여 우방자 추출물을 발효시켜, 악티게닌(arctigenin)과 비배당체 카페익산(caffeic acid) 함량이 증가된 우방자 발효물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to an external composition for skin containing fermented fermented product of fermented milk extract as an effective microorganism as an active ingredient, more specifically, mycelia or leaf fungi (Grifola frondosa KCTC 10337BP), which is a fermented strain. 10337BP) Fermentation of allium extracts by mixing the whole culture solution, and relates to an external preparation composition for skin, characterized in that it contains allium fermented products with increased content of arctigenin and non-glycoside caffeic acid.

자외선에 노출된 피부는 프리라디칼과 활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)을 생성시켜 피부암, 광독성, 자기면역장애, 광과민증과 피부노화 등을 유발하게 된다(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 58:79, 1989). 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 그 합성이 점차 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 이러한 분해효소는 자외선 조사에 의해 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.
Skin exposed to UV rays produces free radicals and reactive oxygen species (ROS), which can cause skin cancer, phototoxicity, autoimmune disorders, photosensitivity and skin aging (Norins, J. Invest. Dermatol. , 39) . : 445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem. , 58:79, 1989). In vivo, the synthesis and degradation of extracellular matrix such as collagen is properly regulated, but as aging progresses, its synthesis gradually decreases and the elasticity of skin is enhanced by the expression of matrix metalloproteinase (MMP), an enzyme that degrades collagen. Deteriorates and wrinkles are formed. In addition, these degrading enzymes are also activated by ultraviolet irradiation. Therefore, there is a need for development of a substance capable of regulating MMP expression or inhibiting its activity in cells.

인체 내에는 약 200억 개나 되는 지방세포가 존재하고 있으며, 이는 포유류의 생체 내에서 에너지를 축적하거나 방출하는 역할을 담당하고 있다. 지방세포 내에서는 에너지의 축적과 방출에 대한 복잡한 조절 원리가 존재하며, 에너지의 수요보다 공급이 월등히 많을 경우에는 지방세포 내에 중성지방으로 저장되었다가 에너지가 고갈되었을 때 다시 유리 지방산과 포도당으로 분해되어 사용된다. 비만은 이 과정의 불균형으로 인하여 과도한 에너지의 축적이 일어났을 때 발생하는 것으로, 지방세포의 크기가 커지거나 그 수가 증가하는 현상에 기인하는 것으로 보고 있다. 현대인의 약 30~40%가 비만으로 알려져 있으며 고혈압, 고지혈증, 동맥 경화증, 심장질환, 당뇨병 등의 다양한 성인병을 수반할 수 있으므로 비만은 사회적 관심의 대상으로 대두되고 있다. 그러나, 이는 비단 건강의 측면에서뿐만 아니라 여성의 사회적 지위 향상과 경제적 독립 등의 사회적인 환경 변화에 의해 삶의 질을 높이고자 하는 욕구가 증가하게 되어 미의 관점에서 아름다운 몸매에 대한 관심도 급격히 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 건강 및 미적 관점에서 비만을 개선하기 위한 방법도 다각적인 측면에서 시도되고 있는데, 종래에 알려져 있는 비만 해소방법은 성형수술 외 에너지의 섭취를 저해하거나, 에너지 소비를 증대시킬 목적으로 식이요법, 운동요법, 수술요법, 약물요법 등의 다양한 방법들이 사용되고 있다. 그러나, 이러한 방법들이 비만을 완전하게 해결할 수는 없을 뿐만 아니라 요요 현상이나 심각한 부작용들이 보고되고 있어 아직은 안전성에 대한 명확한 보장이 없는 실정이다. 또한, 미적 관점에서 비만 해소에는 지방 분해와 더불어 피부에 대한 효능이 부가적으로 요구되므로 상기 요법들의 적용이 모든 필요충분 조건을 충족하기에는 아직 미비한 부분이 많다고 할 수 있다. 현재 많은 여성들이 성형수술에 대한 심리적 부담감, 비용, 부작용 등으로 인해 상대적으로 안전하고 저렴한 제품인 슬리밍(slimming) 및 안티 셀룰라이트(anti-celullite) 화장품에 대한 요구가 꾸준히 높아지고 있다. 하지만 기존의 슬리밍 바디 케어 제품들은 식욕억제 약물을 사용하거나 이뇨제를 사용하는 등 일시적인 효과에 촛점을 맞추고 있었고, 어지러움, 구토, 불면증, 환각 증세 등의 부작용을 일으키는 단점이 있었다. 또한 종래에 알려진 카페인이나 테오필린 같은 메틸잔틴계 지방분해 촉진물질 역시 중독성 물질이라는 인식과 기관지 확장과 월경 전 증후군 현상 악화 등의 부작용이 보고되어 그 안전성에 대한 보장이 없다. 따라서 슬리밍제로서 효과가 우수하며 친자연적인 천연물 소재의 개발이 시급한 상황이다. 따라서, 종래의 물질과 동등하거나 그 이상의 효능을 나타내면서도 인체에 대해서는 좀더 안전한 새로운 물질을 개발해야 할 필요성이 대두되고 있다.
There are about 20 billion fat cells in the human body, which are responsible for accumulating or releasing energy in mammals. In fat cells, there are complex control principles for the accumulation and release of energy. If the supply is much greater than the demand for energy, it is stored as triglycerides in the fat cells and then broken down into free fatty acids and glucose when energy is depleted. Used. Obesity is caused by excessive energy accumulation due to the imbalance of this process, and is believed to be due to the increase or increase in the size of fat cells. About 30 to 40% of modern people are known for obesity, and obesity is a social concern because it can involve various adult diseases such as hypertension, hyperlipidemia, atherosclerosis, heart disease, and diabetes. However, this is not only in terms of health, but also the desire to improve the quality of life due to changes in the social environment such as improving the social status of women and economic independence. to be. Therefore, a method for improving obesity from a health and aesthetic point of view has also been attempted from various aspects. The conventional methods for resolving obesity are known as dietary treatment for the purpose of inhibiting energy consumption or increasing energy consumption other than plastic surgery. Various methods such as exercise therapy, surgery therapy and drug therapy are used. However, not only do these methods completely solve obesity, but yo-yo or serious side effects have been reported, so there is no clear guarantee on safety. In addition, from the aesthetic point of view, eliminating obesity requires an additional effect on the skin in addition to lipolysis, and thus the application of the therapies may not be sufficient to meet all the necessary and sufficient conditions. Many women are now steadily increasing their demand for slimming and anti-celullite cosmetics, which are relatively safe and inexpensive products due to the psychological burden, cost and side effects of plastic surgery. However, existing slimming body care products focused on temporary effects such as using an appetite suppressant or diuretics, and had side effects such as dizziness, vomiting, insomnia, and hallucinations. In addition, conventionally known methyl xanthine-based lipolytic accelerators such as caffeine and theophylline are also addictive substances, and side effects such as bronchial dilatation and premenstrual syndrome worsening have been reported, and there is no guarantee of safety. Therefore, there is an urgent need for the development of natural materials that are excellent and effective as a slimming agent. Therefore, there is a need to develop a new material that is equivalent to or higher than the conventional material but more safe for the human body.

멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제 작용에 의해 티이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome)등을 거처 생성된다. 이 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비 조절에 중요한 기능을 가지고 있다. 그러나 멜라닌이 과잉생산됨으로써 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 멜라닌 과잉생산을 예방하는 연구개발이 활발히 진행되고 있다.Melanin is converted from tyrosine to dopa and dopaquinone by the action of tyrosinase present in pigment cells, and is generated via dopachrome. This melanin is present in the skin and protects the body from ultraviolet rays and has important functions in controlling hormone secretion in the body. However, over-production of melanin is known to play an important role in forming blemishes, freckles, etc., promoting skin aging, and causing skin cancer, and research and development for preventing melanin overproduction are being actively conducted.

이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 일부 천연물 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 나쁘기 때문에 분해되어 착색되거나, 이취 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.
Ascorbic acid (JP-A 4-9320), hydroquinone (JP-A 6-192062), kojic acid (JP-A 56-7710), arbutin (JP-A 4-93150), and some natural product extracts are already tyrosinase. It is used as a whitening cosmetic because it has an inhibitory activity, but its use is limited due to poor stability in cosmetic formulations due to degradation or coloring, odor generation, efficacy at the biological level, unclear effect and safety issues.

피부질환이란 사람을 포함한 포유동물의 머리털과 손톱, 발톱을 포함하는 모든 피부에 나타나는 이상 소견을 의미하는 것으로, 아토피 알러지를 가진 사람에게서 나타나는 아토피 피부염(atopic dermatitis)이 대표적인 질환이다. 아직까지 아토피 피부염의 원인은 명확히 밝혀지지 않았지만 아토피 피부염 환자의 약 70%에서 아토피의 병력이 있었으며, 알레르기성 체질인 사람에서 호발하고, 특히 다른 알러지 질환인 알러지성 비염, 천식 등을 동반하여 유전적 요인이나 면역 질환의 하나로 이해되고 있다. 아토피 피부염은 초기의 심한 가려움증에 의해 대부분이 피부를 긁고 이에 따른 2차 감염이 발생하며, 특히 환자의 정신적 불안정 및 감정 상태에 따라 더욱 악화될 수도 있다. 아토피 피부염은 상당히 많은 사람들이 앓고 있는데, 전 인구의 0.5~1%가, 어린이의 경우는 5~10%가 고통 받고 있다. 증상이 나타나는 시기는 대체로 생후 2~6개월 내이며, 특히 1세 미만의 영아에게서 가장 많이 나타나고, 85%가 만 다섯살 안에 나타난다. 아토피성 피부염은 주로 유아기에 자주 발생하지만, 최근에는 사춘기 이후의 환자가 증가하고 있고, 그 병력도 매우 길어지고 있다. 아토피성 피부염의 치료에는 높은 약리효과를 기대할 수 있는 부신피질 호르몬 등의 약제가 사용되고 있다. 그러나, 이와 같은 부신피질 호르몬제의 부작용이 문제가 되고 있고, 환자는 치료기간 중에 부작용의 위험에 노출되어 있다. 더욱이, 부신피질 호르몬제의 사용 중지에 의하여 리바운드(약물의 사용정지 후에 일어나는 극적인 환부의 병세악화)가 생기는 것도 잘 알려져 있다. 이와 같은 부작용의 대책으로서, 부신피질 호르몬 등의 호르몬을 포함하지 않는 비스테로이드성 항염증제 또는 항히스타민제 등이 사용되고 있으나 완치가 어려운 상태이다. 따라서, 부작용이 없는 아토피 피부염의 경감 또는 치료제 개발이 매우 절실한 실정이다.
Skin disease refers to abnormalities on all skin including hair, nails and toenails of mammals including humans, and atopic dermatitis, which occurs in people with atopic allergies, is a representative disease. The cause of atopic dermatitis has not been clarified so far, but about 70% of patients with atopic dermatitis have a history of atopic dermatitis, which is common in people with allergic predispositions, especially with other allergic diseases such as allergic rhinitis and asthma. It is understood as one of the factors and immune diseases. Atopic dermatitis is mostly caused by the initial severe itching of the skin, resulting in secondary infections, and may be particularly exacerbated by the mental instability and emotional state of the patient. Atopic dermatitis suffers from a significant number of people, with 0.5 to 1 percent of the population and 5 to 10 percent of children. The onset of symptoms usually occurs within two to six months of age, especially in infants under one year of age, with 85% occurring within five years of age. Atopic dermatitis mainly occurs in infancy, but recently, the number of patients after puberty is increasing, and the history is very long. In the treatment of atopic dermatitis, drugs such as corticosteroids, which can expect high pharmacological effects, are used. However, such side effects of corticosteroids are problematic and patients are exposed to the risk of side effects during treatment. Moreover, it is also well known that rebounding (acute disease lesions that occur after the drug is suspended) is caused by discontinuation of the corticosteroids. As a countermeasure for such side effects, nonsteroidal anti-inflammatory agents or antihistamines, which do not contain hormones such as corticosteroids, are used, but they are difficult to cure. Therefore, there is a very urgent need to reduce or treat atopic dermatitis without side effects.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 높아지고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라(Commiphora)속 식물, 특히, 코미포라 무쿨(Commiphora mukul) 추출물의 주름개선 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평9-672662 는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다. 대한민국 특허 제 0431076 호는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제 0511494호는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물을 개시하고 있으며, 대한민국 특허출원 공개 제 2004-0065126호는 천연의 영지버섯, 유근피, 감초, 백봉령, 백지마 및 백년초 등으로부터 얻은 한방 식물 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유와 예방에 효과를 갖는 한방 화장료 조성물을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허출원 공개 제 2004-0011584 호는 감초, 창이자, 홍화, 돈지(돼지비계)와 같은 천연성분의 물질을 정제 혼합하여 구성된 아토피성 피부질환의 치료에 우수한 조성물에 관해 개시하고 있다.
Recently, in order to reduce skin irritation caused by various chemicals, much attention has been focused on functional cosmetics having functions such as antioxidants, wrinkle relief, whitening, and itching relief. Natural ingredients have less side effects on the skin, and as the consumer's response to cosmetics using natural ingredients has recently increased, the development value of cosmetics as a raw material for cosmetics is increasing. For example, US Pat. No. 5,972,341 describes the antiwrinkle effect of a plant of the genus Commiphora, in particular Commiphora mukul . Japanese Patent Application Laid-open No. Hei 9-672662 describes seaweed extracts having a hyaluroronidase inhibitory effect. Japanese Patent Application Laid-open No. Hei 10-85905 describes the skin texture improvement effect of Fucoidan extracted from Wakame. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-245087 describes the antioxidant effect of Sargassum genus extract. Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-294384 describes an antioxidant composition extracted from the genus Hijikia. Japanese Patent Laid-Open No. 7-10769 describes a extract of Phaeophyceae having an astringent effect. Republic of Korea Patent No. 0431076 discloses a cosmetic composition for improving the healing of atopy skin, including white powder, jasmine, echinacea and fermented soybean extract, Korean Patent No. 0511494 is a treatment for atopic dermatitis including sewage, leaflet, illite Korean Patent Application Publication No. 2004-0065126 discloses an extract and a composition for treating atopy skin, including herbal plant extracts obtained from natural Ganoderma lucidum, Rhizome vulgaris, licorice, Baekbongryeong, Baekjima and Baeknyeoncho. Disclosed is a herbal cosmetic composition having a. In addition, Korean Patent Application Publication No. 2004-0011584 discloses a composition excellent in the treatment of atopic dermatitis, which is formed by purifying and mixing substances of natural ingredients, such as licorice, changja, safflower, and pork fat.

한편, 한방 생약재의 유효성분은 체내흡수율과 생체이용률은 높으나, 한방 생약재를 단순히 추출한 추출물의 경우, 생체 외에서는 유효한 효능을 나타내지만, 이를 함유하는 피부 외용제 경우는 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있다.
On the other hand, the active ingredient of the herbal herbal medicine has a high body absorption rate and bioavailability, but the extract simply extracted from the herbal herbal medicine shows an effective effect in vitro, but in the case of an external preparation containing it, the effect is not satisfactory. .

우방자(Arctii fructus)는 국화과(Asteraceae)에 속한 2년생 초본인 우엉(Arctium lappa L.)의 성숙한 씨앗으로 한국, 일본과 중국 등지에서 자생하고 있으며, 맛은 맵고 쓰며 성질은 차가우며 폐와 위에 작용한다. 우엉의 종자(seeds), 잎(leaves), 뿌리(roots)에 존재하는 활성성분의 대부분은 배당체(glycosides) 형태의 악틴(arctiin)과 폴리페놀류의 클로로겐산(chlorogenic acid)과 카페익산(caffeic acid) 또는 그의 유도체로 존재하고 있으며, 우방자 성분은 리그난(lignan)으로서 대부분이 악틴(arctiin, 15-20%)을 함유하고 있는데, 가수분해에 의해서 미량의 악티게닌(arctigenin)을 생성하며, 폴리페놀(polyphenol) 성분의 클로로겐산(chlorogenic acid)과 지방유(palmitic acid, fatty acid) 등이 함유되어 있다(Yizhong C et al., Life Sciences 74: 2157-2184, 2004; Liu S et al., Phytochem Anal 16: 86-89, 2005; 종합약용식물학, 한국약용식물학연구회, 2003). 우방자 추출물 및 활성성분들의 약리 및 생리적 작용에 관한 보고로서 항염, 항산화 및 간보호작용(Lin C.C et al., Am J Chin Med 24: 127-137, 1996; Lin S.C et al., J Biomed Sci 9: 401-409, 2002)과 더불어 주된 생리활성물질인 리그난계 악틴과 악티게닌의 항증식(antiproliferative), 항암작용 등의 화학적 암예방 및 면역활성 기능이 보고되었다(Ryu S.Y et al., Arch Pharm Res 18: 462-463, 1995; Hirose M et al., Cancer Lett 155: 79-88, 2000). 한방에서는 우방자가 체내의 풍열을 몰아내고 해열과 해독작용을 가지고 있어 유행성 감기로 인한 발열, 기침과 함께 가래가 많이 끓을 때, 두드러기와 종기 등의 피부질환이 있을 때, 목이 붓고 아플 때 등에 효과가 있다고 알려져 있다.
Arctii fructus is a mature seed of the two-year-old herb, Arctium lappa L. , belonging to the Asteraceae family. It is native to Korea, Japan, and China, and tastes spicy, bitter, cold, and works on the lungs and stomach. do. Most of the active ingredients present in the seeds, leaves and roots of burdock are chlorogenic and caffeic acid of glycerin and arginine in the form of glycosides and polyphenols. Or as a derivative thereof, and the allyan component is lignan, most of which contains actin (15-20%), which is produced by hydrolysis to produce a trace amount of arctigenin, and polyphenol ( It contains chlorogenic acid and fatty oil of fatty acid (Yizhong C et al., Life Sciences 74: 2157-2184, 2004; Liu S et al., Phytochem Anal 16: 86-89, 2005; Comprehensive Medicinal Botanical Science, Korean Society of Medicinal Botanical Science, 2003). A report on the pharmacological and physiological effects of allium extracts and active ingredients, including anti-inflammatory, antioxidant and hepatoprotective activities (Lin CC et al., Am J Chin Med 24: 127-137, 1996; Lin SC et al., J Biomed Sci 9 : 401-409, 2002), as well as chemical cancer prevention and immune-activating functions such as antiproliferative and anticancer activity of lignan-based actin and actigenin, the main bioactive substances (Ryu SY et al., Arch Pharm) Res 18: 462-463, 1995; Hirose M et al., Cancer Lett 155: 79-88, 2000). In oriental medicine, allies have the fever and detoxification effects of the body's fever, and fever due to pandemic flu, cough, sputum swells a lot, and skin diseases such as hives and boils, swelling and soreness. It is known.

상기 우방자 추출물에 관련된 특허문헌은 우방자 추출물을 함유하는 항산화 화장료[대한민국 특허등록 제10-0570118호]가 보고되어 있으며, 우방자 추출물 활성성분에 관련된 특허문헌은 악틴, 악티게닌 또는 그의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물[대한민국 특허등록 제10-0855457], 악티게닌 또는 악티게닌 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용 화장료 조성물[대한민국 특허공개 10-2008-0082106], 악티게닌을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 조성물[대한민국 특허등록 제10-0901661] 등이 보고되어 있다. 그러나 우방자 추출물과 같은 단순추출물의 경우 생체외에서는 유효한 효능을 나타내지만, 실제로 이를 함유하는 화장료를 피부에 도포하였을 때는 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있다.
The patent literature related to the alligator extract has been reported an antioxidant cosmetics [Korea Patent Registration No. 10-0570118] containing the alligator extract, the patent literature related to the active ingredient of the alligator extract is actin, actigenin or a mixture thereof as an active ingredient Cosmetic composition for skin whitening containing [Korean Patent Registration No. 10-0855457], skin anti-aging cosmetic composition containing Actigenin or Actigenin derivative as an active ingredient [Korean Patent Publication No. 10-2008-0082106], Actigenin as an active ingredient It has been reported a composition for improving skin wrinkles comprising a (Korean Patent Registration No. 10-0901661). However, in the case of simple extracts, such as wooja extract shows effective efficacy in vitro, when the cosmetics containing the same actually applied to the skin there is a problem that the effect is not satisfactory.

위와 같이, 지금까지 우방자로부터 악틴 그리고 그들의 아글리콘(악티게닌)의 분리 및 동정 그리고 그들의 생리작용에 관한 다수의 연구가 보고되어 왔으나 아직까지 우방자로부터 미생물을 이용한 생물학적 발효법을 통해 다량으로 존재하는 악틴을 생체내 흡수능과 생체 이용률이 우수한 아글리콘 형태인 악틴게닌으로 전환하는 기술 개발과 이를 대량 순수 분리 및 정제에 관한 연구는 없었다.
As mentioned above, many studies on the isolation and identification of actin and their aglycone (actinigen) from their allies and their physiology have been reported, but until now, microorganisms from microorganisms have been used to produce large amounts of actin. There has been no research on the development of a technology for converting actingenin, an aglycone form with excellent bioabsorption and bioavailability, and mass pure separation and purification.

본 발명의 목적은 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과, 함염효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 우방자 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is an allergy fermented product which can be applied to cosmetics and exhibits excellent anti-aging effects such as scavenging free radicals, reducing MMP-1 biosynthesis and promoting type 1 procollagen biosynthesis, improving skin wrinkles, and salting effect when contained in cosmetics. It is to provide a cosmetic composition containing a.

또한, 본 발명의 목적은 화장료에 적용시 자외선 조사 등에 의한 미백효과와 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화효과를 나타내는 우방자 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a cosmetic composition containing a fermented fermented product exhibiting a whitening effect by ultraviolet irradiation or the like and a skin irritation-reducing effect by an inflammatory mediator when applied to a cosmetic.

또한, 본 발명의 목적은 화장료에 적용시 보습효과 및 아토피 피부 개선에 효과를 나타내는 우방자 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다. It is also an object of the present invention to provide a cosmetic composition containing a fermented fermented product exhibiting an effect on moisturizing effect and atopic skin improvement when applied to cosmetics.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장표에 적용시 우수한 여드름 방지효과를 갖는 우방자 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다. It is also an object of the present invention to provide a cosmetic composition containing a fermented fermented product having an excellent acne prevention effect when applied to skin cosmetics.

또한, 본 발명은 우방자 추출물을 잎새버섯 균사체 발효배양을 통해 발효시킴으로써 우수한 화장료를 제조하는 방법을 제공하려는 것이다.
In addition, the present invention is to provide a method for producing an excellent cosmetic by fermenting the wooja extract through fermentation culture mycelial leaves.

이에, 본 발명자들은 우방자에 함유되어 있는 리그난 성분의 상기와 같은 우수한 효능을 인식하고, 좀 더 효율적이며 다양하게 이용 가능하도록 하기 위하여 우방자 추출물로부터 생체내 흡수능이 우수한 아글리콘 형태의 악티게닌 제조방법에 대하여 다각도로 연구하였다. 그 결과, 잎새버섯 또는 본원 출원인의 선행 특허[대한민국 특허등록 제0461960호] 잎새버섯(Grifola frondosa) KCTC 10337BP의 균사체나 균사체 추출물 또는 배양액을 이용하여 우방자 추출물을 발효시키면 상기 균주가 리그난 배당체인 악틴(arctiin)의 당 부분과 아글리콘 부분을 연결하는 알파-1,4-글루코시드 결합을 절단하는 글루코시다아제(β-glucosidase)의 활성이 우수하여 리그난 배당체를 악티게닌(arctigenin)으로 용이하게 전환할 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 우방자 발효물에는 피부 활성이 우수한 카페익산(caffeic acid) 함량도 증가함을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. Thus, the present inventors recognize the above excellent efficacy of the lignan component contained in the alligator, and in order to make a more efficient and versatile use, the method for producing the aglycone in the aglycone form of actinigen with excellent in vivo absorption ability from the alligator extract The study was conducted at various angles. As a result, fermentation of leaf mushrooms or mycelium extracts using mycelium or mycelium extract or culture solution of leaf mushrooms (G Korean Patent Registration No. 0461960) of Krifola frondosa KCTC 10337BP, the strain is actin (Lignan glycosides) Excellent activity of glucosidase (beta-glucosidase) that cleaves the alpha-1,4-glucoside linkage linking the sugar and aglycone moieties of arctiin) to facilitate the conversion of lignan glycosides to arctigenin. Confirmed that it can. In addition, allergic fermented products have been found to increase the content of caffeic acid (caffeic acid) with excellent skin activity to complete the present invention.

따라서, 본 발명은 종래의 정제수 또는 유기용매를 이용한 우방자 추출물을 통해 화학적인 산/알칼리 처리법 또는 종래 효소처리법으로 악티게닌을 회수하는 공정과 비교할 때 화학물질에 대한 거부감을 해소하고, 공정비용을 크게 감소시킬 뿐 아니라 우방자 단순 추출물보다 피부 개선 활성이 우수한 화장료를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 우방자 발효물이 피부 안전성이 우수하고 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과가 우수한 화장료로서의 효능을 기대할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Therefore, the present invention eliminates the resistance to chemicals and greatly increases the process cost compared to the process of recovering actigenin by chemical acid / alkali treatment or conventional enzyme treatment through the extract of the allergy using conventional purified water or organic solvent. In addition to reducing, it is possible to provide a cosmetic having excellent skin improving activity than a simple extract of ally. In addition, the inventors of the present invention has an excellent skin safety, active oxygen scavenging effect, wrinkle improvement effect, whitening effect, moisturizing effect, skin irritation effect, anti-acne effect, atopy improvement effect and anti-inflammatory effect excellent efficacy as a cosmetic It has been found that it can be expected to complete the present invention.

본 발명의 잎새버섯 균사체 배양을 통해 얻어진 우방자 발효물은 피부 흡수력이 뛰어나고, 기존의 단순 추출물보다 부작용이 적고, 활성산소 소거효과와 MMP 저해 효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 피부 잔주름 개선효과등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.Allium fermented product obtained through cultivating leaf mycelium mycelium of the present invention has excellent skin absorption ability, less side effects than conventional simple extracts, active oxygen scavenging effect and MMP inhibitory effect and MMP expression control effect by UV irradiation, skin wrinkle improvement effect It showed excellent anti-aging effect and alleviating skin irritation caused by UV irradiation.

또한, 본 발명의 우방자 발효물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과 등 미백작용을 나타내었다.In addition, the fermented fermented product of the present invention showed a whitening effect such as melanin production inhibitory effect that is a substance causing blemishes, freckles and skin pigmentation.

또한, 본 발명의 우방자 발효물은 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화 및 아토피 개선효과를 나타내었다.In addition, the fermented fermented product of the present invention showed an effect of reducing skin irritation and atopy by inflammatory mediators.

또한, 본 발명의 우방자 발효물은 우수한 여드름방지 효과를 갖는 여드름균 항균활성 억제 효과를 나타내었다. In addition, the fermented fermented product of the present invention showed an antibacterial activity inhibitory effect of acne bacteria having an excellent acne prevention effect.

따라서, 이러한 우방자 발효물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백, 보습, 여드름방지, 아토피 개선효과, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 나타낸다.
Therefore, cosmetic compositions such as lotion, cream, milky lotion, pack, powder, etc. containing fermented fermented products have free radical scavenging effect, collagen degrading activity control effect, skin fine wrinkle improvement effect, whitening, moisturizing, acne prevention, atopic improvement effect It shows excellent external skin effect such as skin irritation alleviation effect.

도 1은 우방자 추출물과 잎새버섯 균사체를 이용한 우방자 발효물의 배양시간에 따른 악틴, 악티게닌, 그리고 카페익산 성분의 함량변화를 고속액체크로마토그래피한 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the results of high-performance liquid chromatography of the contents of actin, actigenin, and caffeic acid content according to the incubation time of the fermented fermented product of the alligator extract and leaf fungus mycelium.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 피부 개선 효과가 있는 우방자 추출물에 잎새버섯 균사체, 균사체 추출물 또는 잎새버섯 배양액을 가하여 발효시켜 우방자 발효물을 얻고, 이를을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present inventors add leaf mushroom fungus mycelium, mycelium extract or leaf mushroom culture solution to fermentation extract having a skin improving effect to obtain a fermented fertilizer, and comprising the same as an active ingredient skin An external preparation composition is provided.

또한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 배양액으로 우방자 추출물을 발효처리하여 악티게닌과 카페익산 함량이 증가한 우방자 발효물을 주요성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다. In addition, the composition for external application for skin according to the present invention is characterized in that the fermented milk powder extract is fermented with leaf fungus mycelium or leaf fungus culture to contain allium fermented product with increased content of actinigen and caffeic acid as main ingredients.

또한, 상기 발효는 30시간 내지 90시간 동안 수행함을 특징으로 한다. 30시간 미만이면 유효 성분의 생성 정도가 미미하며, 90시간을 초과하면 유효 성분이 더이상 빠르게 증가하지 않는다.In addition, the fermentation is characterized in that carried out for 30 to 90 hours. If it is less than 30 hours, the generation of the active ingredient is insignificant, and if it exceeds 90 hours, the active ingredient no longer increases rapidly.

또한, 본 발명에서 상기 잎새버섯은 KCTC 10337BP임을 특징으로 한다.In addition, the leaf mushroom in the present invention is characterized in that KCTC 10337BP.

또한, 본 발명에 따른 피부외용제 조성물은 우방자 추출물을 잎새버섯 균사체(Grifoal frondosa KCTC 10337BP, 대한민국 특허등록: 10-0461960) 또는 잎새버섯 배양액으로 발효 배양시켜 악티게닌과 카페익산 함량이 증가된 우방자 발효물을 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30중량% 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 우방자 발효물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.In addition, the composition for external application for skin according to the present invention is fermented product of which allium extract is fermented with leaf fungus mycelium (Grifoal frondosa KCTC 10337BP, Republic of Korea Patent Registration: 10-0461960) or leaf fungus culture medium to increase the content of actinigen and caffeic acid. It is characterized by containing 0.001 to 30% by weight relative to the total weight of the cosmetic composition. When the content of the fermented fermented product is less than 0.001% by weight, there is almost no skin improvement effect, and when it is 30.0% by weight or more, the degree of increase in effect on the increase of content is insignificant and economical.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 자극완화 기능을 나타냄을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the composition exhibits a stimulating function.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 아토피 피부 개선 효과를 나타냄을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the composition exhibits an atopic skin improvement effect.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 여드름 예방 또는 개선 효과를 나타냄을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the composition exhibits an acne prevention or improvement effect.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 노화 방지 효과를 나타냄을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the composition exhibits an anti-aging effect.

또한, 본 발명은 상기 피부외용제 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the topical skin composition is selected from a lotion, gel, water-soluble liquid, cream, essence, oil-in-water (O / W) type and water-in-oil (W / O) type formulation.

또한, 본 발명은 상기 피부외용제 조성물이 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물임을 특징으로 한다. In addition, the present invention is characterized in that the topical skin composition is a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.

우방자 발효물은 캡슐제, 액상제, 연고제, 첩부제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 이용한 서방화제제 등의 약학 조성물로 제제화할 수 있으며, 약리학적으로 허용되는 기제, 운반제, 부형제, 결합제(예: 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스), 분쇄제(예: 한천, 전분, 벨라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨), 윤활제(예: 스테아린산 마그네슘, 활석, 수첨 식물유) 및 착색제 등을 포함한다. 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등을 사용한다. Allium fermentation products may be formulated into pharmaceutical compositions, such as capsules, liquids, ointments, patches, or sustained-release agents using pharmaceutically acceptable carriers, and include pharmacologically acceptable bases, carriers, excipients, binders ( Examples: starch, tragacanth gum, gelatin, molasses, polyvinyl alcohol, polyvinylether, polyvinyl pyrrolidone, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose and carboxymethyl cellulose), grinding agents (e.g., agar, Starch, vellatin powder, sodium carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, crystalline cellulose, calcium carbonate, sodium bicarbonate and sodium alginate), lubricants (e.g. magnesium stearate, talc, hydrogenated vegetable oils), colorants and the like. The carriers and excipients include lactose, glucose, sucrose, mannitol, potato starch, corn starch, calcium carbonate, calcium phosphate and cellulose.

상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.In addition to the above, additives such as adjuvants such as stabilizers, dissolution aids, transdermal absorption accelerators, and preservatives may be further added.

이와 같이 제조되는 약학 조성물은 증상에 따라 일일 1회 내지 수회 피부에 적용할 수 있으며 증상의 호전정도에 따라 적용을 조절할 수 있다.The pharmaceutical composition prepared as described above may be applied to the skin once or several times daily according to the symptoms, and the application may be adjusted according to the improvement of the symptoms.

또한, 본 발명의 우방자 발효물을 의약품, 의약부외품 또는 화장품에 이용하는 경우, 그 제형은 본 발명의 효과를 발휘할 수 있는 제형이면 특별한 제한 없이 임의로 선택할 수 있으며, 예컨대 토닉, 로션, 유액(乳液), 크림, 연고, 젤, 스프레이, 무스 등을 들 수 있다.In addition, in the case of using the fermented fermented product of the present invention in medicine, quasi-drug or cosmetics, the formulation can be arbitrarily selected without particular limitation as long as it is a formulation capable of exhibiting the effects of the present invention, such as tonic, lotion, milky lotion, Creams, ointments, gels, sprays, mousses and the like.

그리고, 이러한 제제 중에는 본 발명에 관련된 우방자 발효물 이외에 의약품, 의약부외품, 화장품의 분야에서 통상 배합가능한 성분을 배합할 수 있다. 예를 들면 혈행촉진작용을 갖는 비타민 E 및 그 유도체 등의 약제 등을 들 수 있다.In addition, in such a formulation, the component which can be normally mix | blended in the field of a medicine, quasi drug, cosmetics can be mix | blended in addition to the fermented fermentation product which concerns on this invention. For example, drugs, such as vitamin E and its derivative which have a blood circulation promoting action, etc. are mentioned.

또, 상기 의약품, 의약부외품, 화장품 등에는 세파란틴 등의 피부기능항진제; 헥사클로로펜, 운데실렌산, 트리클로로카르바니드, 비티오놀 등의 항균제; 아연 및 그 유도체; 락트산 또는 그 알킬에스테르; 시트르산 등의 유기산류; 트라네키사무산 등의 프로테아제 저해제 등을 배합할 수 있다.In addition, the medicines, quasi-drugs, cosmetics, etc. include skin antifungal agents such as ceparantin; Antibacterial agents such as hexachlorophene, undecylenic acid, trichlorocarbanide, and bithionol; Zinc and its derivatives; Lactic acid or alkyl esters thereof; Organic acids such as citric acid; Protease inhibitors, such as a Trane samsamic acid, etc. can be mix | blended.

뿐만 아니라, 상기 의약품, 의약부외품, 화장품 등에는 에탄올, 이소프로필알콜 등의 알콜류; 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 등의 다가알콜류; 고급 지방산, 고급 알콜, 탄화수소유, 천연유지, 에스테르유, 실리콘유 등의 유분; 계면활성제; 향료; 킬레이트제; 1,3-부틸렌글리콜, 히알루론산 및 그 유도체, 말티톨, 아테로콜라겐, 락트산나트륨 등의 보습제; 카복시비닐폴리머 등의 증점제; 산화방지제; 자외선 흡수제; 색소; 물; 안정화제 등 통상 양모제에 배합되는 성분을 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위에서 배합할 수 있다.
In addition, the medicines, quasi-drugs, cosmetics, etc., alcohols such as ethanol and isopropyl alcohol; Polyhydric alcohols such as glycerin, propylene glycol and polyethylene glycol; Oils such as higher fatty acids, higher alcohols, hydrocarbon oils, natural oils, ester oils and silicone oils; Surfactants; Spices; Chelating agents; Moisturizing agents such as 1,3-butylene glycol, hyaluronic acid and derivatives thereof, maltitol, atherocollagen and sodium lactate; Thickeners such as carboxyvinyl polymers; Antioxidants; Ultraviolet absorbers; Pigments; water; The component normally mix | blended with the wool agent, such as a stabilizer, can be mix | blended in the range which does not impair the effect of this invention.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these Examples are only illustrative description of the present invention and the scope of the present invention is not limited to these Examples.

실시예 1: 우방자 추출물 제조Example 1 Preparation of Allium Extract

세절하여 음건한 우방자 2kg을 정제수로 80℃에서 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #2 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜, 감압농축물 및 동결건조물이 0.001~30.0중량% 함유되게 정제수를 사용하여 우방자 추출물을 제조하였다.
3 kg of dried dry allies were refluxed three times for 5 hours at 80 ° C. with purified water, and then cooled and filtered through Whatman # 2 filter paper. The filtered extract was concentrated under reduced pressure and lyophilized at 50 ° C. or lower, and the extract was prepared using purified water so that the reduced concentration and the freeze-dried product were contained in 0.001 to 30.0% by weight.

실시예 2: 잎새버섯 균사체를 이용한 우방자 발효물 제조Example 2: Preparation of Allied Fermentation Using Leaf Mushroom Mycelium

잎새버섯 KCTC 10337BP 균사체를 효모-맥아즙 한천배지가 든 시험관에서 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 계대배양된 균사체를 무균적으로 균질화하여, 실시예 1에서 수득한 우방자 추출물과 당이 혼합된 최적화된 합성배지(대한민국 특허등록: 10-0461960)로 하며 pH 5.5로 조정한 액체배지에 5%(v/v)되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 27℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 6일간 배양 후, 균사체를 제거한 우방자 발효물을 제조하였다.
Leaf fungus KCTC 10337BP mycelium was inclined in a test tube containing yeast-wort agar medium, stored at 4 ℃ and used subcultured every month. Aseptic homogenization of mycelial subcultured on the slope medium to obtain an optimized synthetic medium (Korean patent registration: 10-0461960) mixed with the sugar extract and sugar obtained in Example 1 and adjusted to pH 5.5 After inoculating 5% (v / v) in, incubated for 6 days under conditions of a temperature of 27 ℃, rotation speed 150rpm, aeration amount 1.5vvm in a fermenter, to prepare a fermented product fermented mycelium removed.

실시예 3: 우방자 발효물 성분 확인 및 함량 실험Example 3: Identification and Content Test of Allied Fermentation Products

본 실시예는 실시예 1과 2에서 수득한 우방자 추출물과 우방자 발효물에 함유되어 있는 주요성분을 HPLC법에 의한 분석방법으로 분석하였다. 구체적으로는 우방자 추출물과 우방자 발효물 내의 악틴, 악티게닌, 그리고 카페익산 성분의 발효시간에 따른 변화량을 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, 분획 콜렉터(fraction collector)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하는데 사용된 기기분석 자료는 다음과 같다.In this example, the main components contained in the allium extract and allium fermented product obtained in Examples 1 and 2 were analyzed by HPLC method. Specifically, the amount of change according to the fermentation time of the actin, actinigen, and caffeic acid components in the alligator extract and the alligator fermentation were measured and the results are shown in FIG. 1. In addition, instrumental analysis data used to perform column chromatography using a fraction collector are as follows.

분석장비는 Waters사의 Alliance 2695와 C-18 컬럼(Xterra)을 사용하였으며, 이동상 용매로는 메탄올과 완충액(20mM 초산)을 농도구배로 변화시키면서(메탄올:완충액 = 20:80 → 60:40) 분리하였다. 스탠다드는 각각 크로마덱스(arctiin; Chromadex, USA)와 시그마-알드리치(arctigenin, caffeic acid; Sigma-Aldrich, USA)에서 구입하였으며, 스탠다드와 분획물의 확인은 자외선 흡광도 280nm로 고정하여 PDA (photodiode array) 분석기로 확인하였다.
The analytical equipment used Water 26's Alliance 2695 and C-18 column (Xterra), and separated methanol and buffer (20mM acetic acid) as concentration gradient (methanol: buffer = 20:80 → 60:40) as mobile phase solvent. It was. Standards were purchased from arctiin (Chromadex, USA) and Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, USA). It was confirmed as.

악틴(arctiin)Actin

13C-NMR (Me2CO-d6) δ: 178.4, 45.5, 43.7, 70.6, 35.3, 33.5, 131.8, 112.5, 113.9, 148.7, 148.7, 147.4, 145.3, 111.9, 115.2, 120.5, 121.3, 55.4, 55.7, 100.3, 73.2, 76.9, 69.7, 76.9, 60.713C-NMR (Me2CO-d6) δ: 178.4, 45.5, 43.7, 70.6, 35.3, 33.5, 131.8, 112.5, 113.9, 148.7, 148.7, 147.4, 145.3, 111.9, 115.2, 120.5, 121.3, 55.4, 55.7, 100.3, 73.2, 76.9, 69.7, 76.9, 60.7

1H-NMR (Me2CO-d6) δ: 2.58(2H,m,Ar-CH2), 2.85(2H,m,Ar-CH2), 3.69, 3.71, 3.75(9H,s,-OCH3), 3.66(OH), 4.09(1H,d,7,glu-H1), 6.7, 7.2(6H,m,Ar-H)1 H-NMR (Me 2 CO-d 6) δ: 2.58 (2H, m, Ar-CH 2), 2.85 (2H, m, Ar-CH 2), 3.69, 3.71, 3.75 (9H, s, -OCH 3), 3.66 (OH) , 4.09 (1H, d, 7, glu-H1), 6.7, 7.2 (6H, m, Ar-H)

MS : M+=534, m/z= 372, 221, 178, 151, 137
MS: M + = 534, m / z = 372, 221, 178, 151, 137

악티게닌(arctigenin)Arctigenin

13C-NMR (Me2CO-d6) δ: 56.2, 149.6, 147.0, 115.1, 121.5, 113.2, 132.0, 41.0, 40.9, 72.5, 177.4, 49.2, 35.4, 132.3, 121.9, 142.9, 151.2, 113.613C-NMR (Me2CO-d6) δ: 56.2, 149.6, 147.0, 115.1, 121.5, 113.2, 132.0, 41.0, 40.9, 72.5, 177.4, 49.2, 35.4, 132.3, 121.9, 142.9, 151.2, 113.6

1H-NMR (Me2CO-d6) δ: 3.72(6H,s), 3.80(3H,s), 2.54(4H,br), 2.84(2H,br), 6.50-6.82(6H,m)1 H-NMR (Me 2 CO-d 6) δ: 3.72 (6H, s), 3.80 (3H, s), 2.54 (4H, br), 2.84 (2H, br), 6.50-6.82 (6H, m)

MS : M+=372, m/z= 221, 194, 178, 151, 137, 107, 91, 73
MS: M + = 372, m / z = 221, 194, 178, 151, 137, 107, 91, 73

카페익산(caffeic acid)Caffeic acid

13C-NMR (CDCl3+DMSO) δ: 170.6, 115.6, 148.0, 129.2, 120.4, 117.2, 146.5, 147.2, 113.613C-NMR (CDCl 3 + DMSO) δ: 170.6, 115.6, 148.0, 129.2, 120.4, 117.2, 146.5, 147.2, 113.6

1H-NMR (CDCl3+DMSO) δ: 6.17(2H,m,Ar-CH2), 6.22(2H,m,Ar-CH2), 6.69, 6.85, 7.01(3H,m,Ar-H), 7.31(2H,m,Ar-OH), 9.21(H,s,COOH)1 H-NMR (CDCl 3 + DMSO) δ: 6.17 (2H, m, Ar—CH 2), 6.22 (2H, m, Ar—CH 2), 6.69, 6.85, 7.01 (3H, m, Ar—H), 7.31 (2H , m, Ar-OH), 9.21 (H, s, COOH)

MS :M+=180
MS: M + = 180

표 1과 같이 실시예 1의 우방자 추출물과 비교할 때 우방자 발효물의 악티게닌 및 카페익산의 총 함량이 높았으며, 각각 13배 및 12배 이상 증가하였다.As shown in Table 1, the total content of actinigen and caffeic acid in the fermented fertilizer of the allied fermentation extract was higher than that of Example 1, and increased by 13 times and 12 times, respectively.

시료명

Name of sample

악티게닌(arctigenin)
(ug/mg of extract)

Arctigenin
(ug / mg of extract)

카페익산(caffeic acid)
(ug/ml of extract)
Caffeic acid
(ug / ml of extract)
실시예 1
Example 1
23.6
23.6
10.8
10.8
실시예 2
Example 2
319.4
319.4
134.7
134.7

실시예 4: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험Example 4 Experiment for Measuring Antioxidant Effect Using NBT Method

실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교시료로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.In order to confirm the antioxidant effect of the fermented fermentation product obtained in Example 2, butylated hydroxytoluene (BHT), which is well known as an antioxidant under laboratory conditions, was used as a comparative sample and the antioxidant activity was measured using NBT (Nitro Blue Tetrazolium) method.

항산화 효과를 측정하기 위해서 잔틴과 잔틴옥시데이즈에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 시료가 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 잔틴과 잔틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정하였다.In order to measure the antioxidant effect, the active oxygen produced by xanthine and xanthine oxides is measured by NBT method, and the effect of the sample removing the active oxygen, that is, the active oxygen scavenging effect, is evaluated. The reactive oxygen scavenging rate was measured by reacting the active oxygen produced by xanthine and xanthine oxidase with Nitro Blue Tetrazolium (NBT) to measure the blue color produced by this at wavelength 560 nm.

측정방법은 How to measure

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------- 2.4ml0.05M Na ₂ CO ₃ ------------------------------------- 2.4ml

2. 3mM 잔틴 용액---------------------------------- 0.1ml 2.3mM xanthine solution ---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml 3.3mM EDTA Solution ------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml 4.BSA solution ---------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml 5.0.72 mM NBT solution ---------------------------------- 0.1ml

6. 잔틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml 6. Xanthine Oxidase Solution ----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1ml7.6 mM CuCl ₂ solution ----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.① Add 1,2,3,4,5 to Bayer's bottle and add 0.1ml of sample solution to it and leave at 25 ℃ for 10 minutes.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.② Add 6 and stir quickly, and start incubation for 20 minutes at 25 ℃.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.③ After that, add 7 to stop the reaction and measure the absorbance St at 560nm.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.④ For the blank test, measure the absorbance Bt by using distilled water instead of the sample solution as above.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.⑤ Also, the blank of the sample solution is operated in the same manner using distilled water instead of 6 to measure the absorbance Bo.

효과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.The effect was calculated by Equation 1, and the results are shown in Table 2.

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도 St: absorbance at 560 nm after enzyme reaction of sample solution

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도 Bt: absorbance at 560 nm after enzymatic reaction of blank test solution

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도 So: absorbance at 560 nm before reaction without enzyme in sample solution

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도 Bo: absorbance at 560 nm before reaction without enzyme in blank test solution

표 2와 같이, 우방자 발효물은 BHT보다 우수한 항산화력을 나타냄을 확인할 수 있었다.As shown in Table 2, it was confirmed that the ally fermented product exhibited better antioxidant power than BHT.

시료명Name of sample 세포내 항산화 효과(%)Intracellular Antioxidant Effect (%) 우방자 발효물 0.25중량%0.25% by weight of milk ferment 97%97% 우방자 발효물 0.1중량%0.1% by weight of fermented fermented product 92%92% 우방자 발효물 0.05중량%0.05% by weight of milk ferment 81%81% 우방자 발효물 0.025중량%Allium fermented product 0.025% by weight 69%69% BHT 0.1중량%BHT 0.1 wt% 85%85%

실시예 5: 자유라디칼 소거활성 측정 실험Example 5: Free radical scavenging activity measurement experiment

실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT와 같은 항산화제를 비교시료로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.In order to measure the free radical scavenging activity of the allied fermentation product obtained in Example 2, an antioxidant such as BHT was used as a comparative sample under laboratory conditions, and the free radical scavenging activity was measured by DPPH method.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정한다. 시료에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공 시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.The DPPH method measures free radical scavenging activity by reducing power using a free group called DPPH (2,2-Di (4-tert-octylphenyl) -1-picrylhydrazyl free radical). The free radical scavenging rate is measured at a wavelength of 560 nm by comparing the degree of DPPH reduction by the sample to decrease the absorbance.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 0.25, 0.1, 0.05, 0.025% 농도의 우방자 발효물을 준비하였다. 상기 농도의 추출물을 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.Allium fermentation products of 0.25, 0.1, 0.05, 0.025% concentration were prepared for DPPH free radical scavenging activity measurement. Extracts of the above concentrations were placed in 96-well plates, respectively, and DPPH prepared in 100 uM methanol solution was added to obtain a total volume of 200 μl. After leaving it at 37 ° C. for 30 minutes, absorbance was measured at 560 nm. Free radical scavenging activity (%) was calculated by the following equation.

A: 본 발명의 우방자 발효물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도A: absorbance of control wells not treated with mate fermentation of the present invention

B: 본 발명의 우방자 발효물을 처리한 실험군 웰의 흡광도 B: Absorbance of Experimental Wells Treated with Allier Ferment of the Present Invention

표 3에서 확인할 수 있듯이 우방자 발효물은 항산화제로 많이 이용되고 있는 BHT보다 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.As can be seen in Table 3, the fermented fermented product showed a superior antioxidant effect than BHT, which is widely used as an antioxidant.

시료명Name of sample 항산화효과(%)Antioxidative effect(%) 우방자 발효물 0.25중량%0.25% by weight of milk ferment 94%94% 우방자 발효물 0.1중량%0.1% by weight of fermented fermented product 93%93% 우방자 발효물 0.05중량%0.05% by weight of milk ferment 90%90% 우방자 발효물 0.025중량%Allium fermented product 0.025% by weight 86%86% BHT 0.1중량%BHT 0.1 wt% 82%82%

실시예 6: 세포내 활성산소 소거효과Example 6 Intracellular Active Oxygen Scavenging Effect

실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 자외선에 의해 세포내에서 생성되는 활성산소 생성 억제효과 즉, 활성산소 소거효과를 알아보기 위하여 비교시료로 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 지정하고, 형광물질을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to determine the inhibitory effect of the production of active oxygen generated in the cell by ultraviolet light of the fermented fermented product obtained in Example 2, that is, the active oxygen scavenging effect, EGCG (Epigallocatechin gallate) was designated as a comparative sample, and the following The same experiment was performed.

실험에 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양 받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 × 10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 1일간 배양한 후, 0.02, 0.01, 0.005% 농도로 우방자 발효물을 처리하였다.The cell line used in the experiment was a human keratinocytes HaCaT cell line distributed by Dr. Fusenig of the German Cancer Research Center, which was used per well in a 96-well black plate for fluorescence measurement. Dispense 2.0 x 10 ⁴ pieces and use Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA (DMEM) medium supplemented with penicillin / streptomycin for 1 day at 37 ° C and 5% CO ₂ After cultivation, allium fermented product was treated at 0.02, 0.01, 0.005% concentration.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후 HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이 후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 판독기(Ex; 485nm, Em; 530nm)로 측정하였다. 이후 UVB(20mJ/㎠)를 조사하고 우방자 발효물 처리 후 형광도를 형광플레이트 판독기(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다. Incubate the test sample for 24 hours, wash with HCSS (HEPES-buffered control salt solution) to remove the remaining medium, and prepare DCFH-DA (2 ', 7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, prepared with 20μM in HCSS). USA) was added to 100 μl and incubated for 20 minutes at 37 ° C. and 5% CO ₂ , followed by washing with HCSS. Thereafter, 100 μl of the treated HCSS was added, and then the fluorescence of DCF (dichlorofluorescein) oxidized with active oxygen was measured with a fluorescence plate reader (Ex; 485 nm, Em; 530 nm). After UVB (20mJ / ㎠) was irradiated and fluorescence after the treatment of allies fermentation was measured by a fluorescence plate reader (Ex; 485 nm, Em; 530nm).

표 4에서 확인할 수 있듯이 우방자 발효물은 활성산소 소거효과의 비교 시료로 많이 이용되고 있는 EGCG보다 더 우수한 활성산소 소거 효과를 나타냄을 알 수 있었다.As can be seen in Table 4, the fermented fermented product shows that the free radical scavenging effect is better than the EGCG which is widely used as a comparative sample of the free radical scavenging effect.

시료명Name of sample 활성산소 소거효과(%)Free radical scavenging effect (%) 우방자 발효물 0.02중량%Allium fermented product 0.02% by weight 5151 우방자 발효물 0.01중량%0.01% by weight of milk ferment 4545 우방자 발효물 0.005중량%0.005% by weight of milk ferment 1818 EGCG 0.01중량%EGCG 0.01% by weight 4242

실시예 7: 인비트로 MMP-1 활성저해 실험Example 7: In Vitro MMP-1 Inhibition Experiment

MMP-1 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-콜라겐, 효소 콜라게네이즈(collagenase)는 Molecular probe사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5M Tris-HCl, 1.5M NaCl, 50mM CaCl₂, 2mM 소듐 아자이드, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100㎕에 0.25㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ 콜라겐 20㎕와 실시예 2의 우방자 발효물(0.02, 0.01, 0.005중량%) 40㎕을 첨가하고 0.5단위(unit)로 희석한 콜라게네이즈 40㎕을 첨가한다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495nm, 방출파장 515nm로 형광값을 측정하였으며, 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며, 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.Fluorescence assay was used to determine the effect of inhibiting MMP-1 activity. The substrate used in the experiment was a fluorescent substance-labeled DQ-collagen, and the enzyme collagenase (collagenase) was commercially available from Molecular probe (Eugene, OR, USA), and the reaction buffer solution (0.5M Tris-HCl, 1.5). M NaCl, 50 mM CaCl ₂ , 2 mM sodium azide, pH 7.6) were used after 10-fold dilution. To 100 µl of the reaction buffer, 20 µl of DQ collagen dissolved in the reaction buffer at 0.25 mg / ml and 40 µl of the fermented fermented product (0.02, 0.01, 0.005% by weight) of Example 2 were added and the collagen diluted to 0.5 unit (unit). Add 40 μL of naze. After 20 minutes at room temperature, the fluorescence value was measured by using a fluorescence spectrophotometer (Perkin Elmer, UK) at 495 nm absorption wavelength and 515 nm emission wavelength. The fluorescence value was measured by adding the same amount of reaction buffer as enzyme instead of enzyme solution as a control. The fluorescence value of the sample itself was also measured and corrected when calculating the enzyme activity.

결과는 표 5와 같이, 우방자 발효물을 0.02% 처리시 클로스트리디움 콜라게네이즈의 콜라겐 분해활성을 87% 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수한 것이다.As shown in Table 5, when 0.02% of allium fermented product was treated, the collagen degrading activity of Clostridium collagenase was inhibited by 87%, which is superior to the inhibitory effect of green tea extract.

시료명Name of sample 저해율(%)Inhibition rate (%) 우방자 발효물 0.02중량%Allium fermented product 0.02% by weight 8787 우방자 발효물 0.01중량%0.01% by weight of milk ferment 6565 우방자 발효물 0.005중량%0.005% by weight of milk ferment 4141 녹차추출물 0.2중량%0.2% by weight of green tea extract 6767

실시예 8: 자외선 조사 후 우방자 발효물에 의한 MMP-1 발현억제 평가Example 8 Evaluation of Inhibition of MMP-1 Expression by Allier Fermentation after UV Irradiation

본 실험예는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다. In this experimental example, the enzyme immunoassay (ELISA) was performed to measure the concentration of MMP-1 after UV irradiation and sample addition of the fermented fermented product obtained in Example 2.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖ ρ-나이트로페닐인산을 포함하는 다이에탄올아민 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.Human dermal fibroblasts were irradiated with UVA at an energy of 6.3 J / cm 2 using a UV chamber. UV irradiation amount and incubation time were established through preliminary experiments to maximize the expression of MMP in fibroblasts. The negative control was wrapped in tinfoil to keep the same time in the environment of UVA. UVA emission was measured using a UV radiometer. The cells during the UVA irradiation were intact in the previously dispensed medium and irradiated with UVA, exchanged with the medium containing the sample, and then cultured for 24 hours, and the medium was recovered and coated in 96 wells. The primary antibody (MMP-1 (Ab-5) monoclonal antibody) was treated and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. After reacting the secondary antibody, an anti-mouse IgG (whole mouse, alkaline phosphatase conjugated) for about 60 minutes, the alkaline phosphatase substrate solution (dieethanolamine buffer solution containing 1 mg / ml ρ-nitrophenyl phosphate) was room temperature. After reacting for 30 minutes at 405 nm absorbance was measured by a microplate reader. As a control, one without addition of a sample was used.

자외선 조사시 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 우방자 발효물은 73% 이상의 억제율을 보였으며, 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율에 비해 상당히 우수한 결과이다.In the UV irradiation, allium fermented products showed more than 73% inhibition rate compared to the control group without treatment for MMP-1 expression, which is significantly superior to the inhibition rate of retinol used as a control.

시험군Test group MMP-1 발현억제율(%)MMP-1 expression inhibition rate (%) 대조군Control group -- 우방자 발효물 0.02중량%Allium fermented product 0.02% by weight 7373 우방자 발효물 0.01중량%0.01% by weight of milk ferment 3232 우방자 발효물 0.005중량%0.005% by weight of milk ferment 1717 레티놀Retinol 3535

실시예 9: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과Example 9 Type 1 Procollagen Biosynthesis Promoting Effect

본 실험예에서는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같은 방법으로 실시하였다.In this Experimental Example, a procollagen assay was performed in the following manner to investigate the effect of promoting the type 1 procollagen biosynthesis, which is a skin substrate component of the fermented fermentation product obtained in Example 2.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1) 배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1× 10⁴cell/㎠ 농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.Human dermal fibroblasts isolated from neonatal foreskin tissue were obtained from Modern Tissue Technology (MTT, Korea) and added 10% fetal bovine serum (FBS) to DMEM / F-12 (3: 1) medium. And incubated at a concentration of 1 × 10 ⁴ cell / cm 2. When grown at about 70-80%, the cells were subcultured at a ratio of 1: 3, and the 3-4th passaged cells were used for the experiment.

프로콜라겐 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 실시예 2의 우방자 발효물을 각각 0.02%, 0.01%, 0.005% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.For experiments to measure the amount of procollagen, the fibroblasts were incubated at least 90% in 48 well plates, and the fermented fermented product of Example 2 was added at 0.02%, 0.01%, and 0.005% concentrations, respectively, and after 24 hours. The amount of free collagen in the medium was measured using the procollagen type-1 C-peptide EIA kit (MK101, Takara, Japan).

결과는 표 7에 나타냈으며 우방자 발효물 0.02% 처리시 프로콜라겐 생합성은 39% 촉진되었으며, 이는 세포신호전달 물질인 TGF-β와 유사한 정도의 효과이다.The results are shown in Table 7. Procollagen biosynthesis was promoted by 39% when treated with 0.02% of allied ferment, which is similar to TGF-β.

시료명Name of sample 프로콜라겐 생합성촉진효과(%)Pro collagen biosynthesis promoting effect (%) 우방자 발효물 0.02중량%Allium fermented product 0.02% by weight 39%39% 우방자 발효물 0.01중량%0.01% by weight of milk ferment 18%18% 우방자 발효물 0.005중량%0.005% by weight of milk ferment 8%8% TGF-β 0.001중량%TGF-β 0.001 wt% 36%36%

실시예 10: 우방자 발효물의 엘라스틴 생성 촉진 효과Example 10 Elastin Production-Promoting Effect of Allied Fermentation

우방자 발효물의 엘라스틴 생성 촉진 효과를 알아보기 위하여, 사람으로부터 직접 채취한 섬유 아세포에 상기 실시예 2의 우방자 발효물을 처리하여 엘라스타제(elastase) 활성 억제효과를 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to investigate the effect of promoting the elastin production of allied fermentation, the following experiment was performed to treat the allied fermented product of Example 2 on the fibroblasts collected directly from humans to inhibit the elastase activity.

먼저, 사람 섬유 아세포를 배양용 플라스크에 넣고 약 70～80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이후 우방자 발효물을 1일간 처리한 후 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용 가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성 정도를 측정하였다[Bieth J: Biochem med., 11, 350-357(1974), Schwartz DE: J.Invest Dermatol., 86, 63-68(1986)]. 즉, 엘라스타제의 기질인 Suc-(Ala) 3 NA를 이용하여, NA가 분해되면서 생기는 흡광도 변화를 이용하여 엘라스타제 활성도를 측정하였다. 이때 우방자 발효물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.First, human fibroblasts were placed in a culture flask and incubated until about 70-80% growth. Thereafter, after treating the fermented fermented product for 1 day, cell culture fluid was collected and the degree of elastin production was measured using a commercially available elastin measuring instrument [Bieth J: Biochem med. , 11, 350-357 (1974), Schwartz DE: J. Invest Dermatol ., 86, 63-68 (1986)]. In other words, using the Suc- (Ala) 3 NA, which is the substrate of the elastase, the elastase activity was measured by using the absorbance change generated when the NA was decomposed. At this time, the group was not treated with allied fermentation was used as a control.

표 8에 나타낸 바와 같이, 우방자 발효물은 대조군에 비하여 엘라스타제 활성을 현저히 억제함을 알 수 있으며, 활성 억제율은 우방자 발효물 농도가 증가할수록 높아짐을 확인하였다. 이를 통하여 우방자 발효물이 우수한 노화 방지 및 탄력 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.As shown in Table 8, it can be seen that the fermented fermented product significantly inhibited elastase activity as compared to the control, and the activity inhibition rate was increased as the concentration of the fermented fermented product was increased. Through this, it can be seen that the fermented fermented product exhibits excellent anti-aging and elasticity enhancing effects.

시료명Name of sample 물질 활성 억제율 (%)% Inhibition of substance activity 우방자 발효물 0.02중량%Allium fermented product 0.02% by weight 39%39% 우방자 발효물 0.01중량%0.01% by weight of milk ferment 21%21% 우방자 발효물 0.005중량%0.005% by weight of milk ferment 15%15% 대조군Control group 0%0%

실시예 11: 티로시나제 활성 억제 실험Example 11: Tyrosinase Activity Inhibition Experiment

티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신(Sigma)은 0.05M 인산나트룸 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 우방자 발효물은 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5 ㎖를 시험관에 넣고 여기에 우방자 발효물 시료액 0.5㎖을 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후 각 시료액에 200단위(unit)/㎖ 티로시나제 0.5㎖를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시킨 후 파장 475nm 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5㎖를 넣은 것을 사용하였다.Tyrosinase was isolated and purified from mushrooms and purchased from Sigma. Substrate L-tyrosine (Sigma) was dissolved in 0.05M sodium phosphate buffer (pH 6.8) to make a 0.1mg / ㎖ solution was used. Allium fermented product was used after being dissolved in 0.05M sodium phosphate buffer (pH 6.8) at a suitable concentration. 0.5 ml of L-tyrosine solution was placed in a test tube, and 0.5 ml of allium fermented product sample solution was added thereto, and left for 10 minutes in a 37 ° C thermostat. Thereafter, 0.5 ml of 200 units / ml tyrosinase was added to each sample solution and reacted at 37 ° C for 10 minutes. The test tube containing the reaction solution was placed on ice, quenched to stop the reaction, and the absorbance at 475 nm was measured. As a control, 0.5 ml of buffer solution was used instead of the sample.

상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 수학식 3에 따라 계산하였다.The tyrosinase activity inhibition rate of each sample was calculated according to the equation (3).

결과는 표 9에 나타냈으며 우방자 발효물 0.02% 처리시 티로시나아제 저해율은 알부틴과 유사하였다.The results are shown in Table 9 and the tyrosinase inhibition rate was similar to arbutin when treated with 0.02% of allium ferment.

시료명Name of sample 티로시나제 저해율(%)Tyrosinase inhibition rate (%) 대조군Control group -- 우방자 발효물 0.02중량%Allium fermented product 0.02% by weight 52%52% 우방자 발효물 0.01중량%0.01% by weight of milk ferment 41%41% 우방자 발효물 0.005중량%0.005% by weight of milk ferment 21%21% 알부틴 0.2중량%Arbutin 0.2 wt% 54%54%

실시예 12: B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성억제 실험Example 12 Melanin Synthesis Inhibition Using B16F1 Melanocytes

실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라닌 세포에 대한 멜라닌 합성억제 효과를 측정하였다.In order to confirm the whitening effect of the fermented fermentation product obtained in Example 2, melanin synthesis inhibitory effect on B16F1 melanocytes was measured.

B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라닌 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄[Lotan : Cancer Res., 40, 3345-3350(1980)]의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포여액에 1N NaOH(10% DMSO(Dimethyl Sulfoxide))를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 4에 의하여 계산하였다.The melanin synthesis inhibitory effect of B16F1 melanocytes was measured as follows. B16F1 melanocytes were dispensed into 6-well plates at a concentration of 2 x 10 ⁶ per well, and the cells were attached and incubated for 72 hours by treating the samples at a concentration that does not cause toxicity. After 72 hours of incubation, the cells were detached with trypsin-EDTA, the cell number was measured, and the cells were recovered by centrifugation. Quantification of intracellular melanin was performed by Rotan: Cancer Res. , 40, 3345-3350 (1980). After washing the cell pellet with PBS once, 1 ml of homogenization buffer (50 mM sodium phosphate, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)) was added to vortex for 5 minutes to disrupt the cells. Melt the extracted melanin by adding 1N NaOH (10% DMSO (Dimethyl Sulfoxide)) to the cell filtrate obtained by centrifugation (3,000 rpm, 10 minutes), and measure the absorbance of melanin at 405 nm with a microplate reader, and then quantitate melanin. The melanin production inhibition rate (%) of the sample was measured. Melanin production inhibition rate (%) of B16F1 melanocytes was calculated by the equation (4).

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양A: Melanin amount in wells without sample

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양B: Melanin amount in the wells to which the sample was added

B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과를 시험한 결과 우방자 발효물은 0.02%에서 34%의 멜라닌 생성 억제효과를 나타내어 알부틴과 유사한 생성억제 효과를 나타내었다(표 10).As a result of testing the melanin synthesis inhibitory effect of B16F1 melanocytes, allium fermented product showed melanin production inhibitory effect of 0.02% to 34%, similar to arbutin (Table 10).

시료명Name of sample 멜라닌 합성 저해효과(%)Melanin Synthesis Inhibitory Effect (%) 대조군Control group -- 우방자 발효물 0.02중량%Allium fermented product 0.02% by weight 34%34% 우방자 발효물 0.01중량%0.01% by weight of milk ferment 20%20% 우방자 발효물 0.005중량%0.005% by weight of milk ferment 7%7% 알부틴 0.2중량%Arbutin 0.2 wt% 35%35%

실시예 13: 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과 측정 실험Example 13: Inhibitory Effect of Inflammation-Related Enzyme (hyaluronidase) Activity

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 항염증 효과를 확인하기 위해 염증유발관련 효소인 히아루로니디아제의 효소 활성을 측정한 것이다. This example is to measure the enzyme activity of the hyaluroniadiaze enzyme, an inflammation-associated enzyme, in order to confirm the anti-inflammatory effect of the fermented fermentation product obtained in Example 2.

히아루로니다제(hyaluronidase)는 히아루론산을 가수분해하는 효소로 염증을 유발한다. 본 실시예에서는 이 효소의 활성을 억제하여 항염증효과를 측정하는 방법[Kakegawa Y: Japanese J. of Inflammantion, 4, 437-438(1984)]을 응용해 항염증효과를 판정하였다.Hyaluronidase is an enzyme that hydrolyzes hyaluronic acid and causes inflammation. In this example, the anti-inflammatory effect was determined by applying a method of inhibiting the activity of the enzyme to measure the anti-inflammatory effect (Kakegawa Y: Japanese J. of Inflammantion , 4, 437-438 (1984)).

컴프리, 시소, 유용성 감초 추출물, 우방자 발효물을 각각 시료로 사용하여 히아루로니다제 활성 억제 효과를 조사하였다.The inhibitory effect of hyaluronidase activity was investigated using comfrey, seesaw, oil-soluble licorice extract, and allium fermented product as samples.

각 시료들의 히아루로니다제에 대한 저해활성은 다음과 같이 행하였다.Inhibitory activity of each sample on hyaluronidase was performed as follows.

시료 100μl와 히아루로니다제 용액(type Ⅳ-S, Sigma사, 400U/ml) 50μl를 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 효소활성화 용액(compound 48/80 CaCl₂2H₂O, Sigma사, 0.1mg/ml) 100μl를 첨가하고 다시 37℃에서 20분간 반응시켰다. 히아루론산(hyaluronic acid) 용액(0.4mg/ml)을 250μl 넣고 37℃에서 40분간 반응시키고, 0.4N NaOH 100μl를 넣어 반응을 종결시켰다. 포타슘보레이트 용액을 100μl 첨가하여 95℃에서 3분간 반응시키고 냉각시킨 다음 ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액 3ml를 넣고 다시 20분간 37℃에서 반응시켜 발색시켰다. 585nm 흡광도를 측정하여 히아루로니다제에 대한 저해율을 측정하였다. 히아루로니다제에 대한 저해율(%)은 수학식 5에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 히아루로니다제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.100 μl of sample and 50 μl of hyaluronidase solution (type IV-S, Sigma, 400 U / ml) were added and reacted at 37 ° C. for 20 minutes, followed by enzyme activation solution (compound 48/80 CaCl ₂ 2H ₂ O, Sigma, 0.1 mg / ml) 100 μl was added and reacted again at 37 ° C. for 20 minutes. 250 μl of a hyaluronic acid solution (0.4 mg / ml) was added thereto and reacted at 37 ° C. for 40 minutes, and 100 μl of 0.4N NaOH was added to terminate the reaction. 100 μl of potassium borate solution was added thereto, reacted at 95 ° C. for 3 minutes, cooled, and 3 ml of ρ-dimethylaminobenzaldehyde solution was added thereto, followed by 20 minutes of reaction at 37 ° C. for color development. Absorbance for hyaluronidase was determined by measuring absorbance at 585 nm. Inhibition rate (%) for hyaluronidase was calculated by the equation (5), IC ₅₀ value is the concentration of a substance that inhibits 50% hyaluronidase enzyme activity.

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 효소활성A: Enzyme activity of wells without sample

B : 시료를 첨가한 웰의 효소 활성B: Enzyme Activity of Well Added Samples

히아루로니다제 효소 활성 억제 효과를 시험한 결과 우방자 발효물의 IC₅₀값은 0.23%로 나타나 히아루로니다제 저해효과가 뛰어나다고 알려진 기존의 항염증제인 유용성 감초 추출물, 컴프리 추출물, 시소 추출물 등에 비해 우수하거나 유사한 효과를 나타내었다(표 11).As a result of testing the inhibitory effect of hyaluronidase enzyme activity, the IC ₅₀ value of allium fermentation product was 0.23%, which is superior to the useful anti-inflammatory licorice extract, comfrey extract, and seesaw extract, which are known to be excellent in inhibiting hyaluronidase. Similar effects were shown (Table 11).

시료sample 히아루로니다제 활성 억제효과(IC₅₀)Hyaluronidase activity inhibitory effect (IC ₅₀ ) 컴프리 추출물Comfrey Extract 0.25%0.25% 시소 추출물Seesaw extract 0.53%0.53% 유용성 감초 추출물Usefulness Licorice extract 0.22%0.22% 우방자 발효물 Allies Ferment 0.23%0.23%

실시예 14: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과Example 14: Cytotoxic Alleviation Effect by UV Irradiation

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500ul의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 우방자 발효물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 6에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 7에 의하여 계산하였다.This example was carried out to evaluate the mitigating effect of cytotoxicity by ultraviolet irradiation of the allied fermentation product obtained in Example 2. Fibroblasts (fibroblasts) were placed in a 24-well test plate 1 x 10 ⁵ and attached for 24 hours. Each well was washed once with PBS and 500 ul of PBS was added to each well. The fibroblasts were irradiated with UV 10mJ / cm 2 using an ultraviolet B (UVB) lamp (Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, Japan), and then PBS was removed and 10% FBS was added to the cell culture medium (DMEM). 1 ml) was added. After treatment with the fermented fermented product to be evaluated here was incubated for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed, and 500 μl of cell culture medium and 60 μl of MTT solution (2.5 mg / ml) were added to each well, followed by incubation in a 37 ° C. CO ₂ incubator for 2 hours. The medium was removed and 500 μl of isopropanol-HCl (0.04 N) was added. After shaking for 5 minutes, the cells were lysed and 100 μl of the supernatant was transferred to a 96-well test plate, followed by measurement of 565 nm absorbance in a microplate reader. Cell viability (%) was measured by Equation 6, and cytotoxicity remission by UV was calculated by Equation 7.

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도Bo: 565 nm absorbance of wells that developed cell culture media only

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도 Bt: 565 nm absorbance of wells that developed and reacted wells without sample

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도 St: 565 nm absorbance of wells that reacted with the sample treated wells

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율Bo: cell viability of wells without UV irradiation and no sample treatment

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율 Bt: cell viability of wells that were not irradiated with UV light

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율 St: Cell survival rate of wells treated with UV

실험 결과 우방자 발효물은 0.02% 농도에서 51%의 자외선에 의한 세포 독성을 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있었다(표 12).Experimental results showed that the fermented fermented product effectively alleviates cytotoxicity caused by UV rays at 51% at 0.02% concentration and effectively prevents cytotoxicity caused by UV rays at low concentrations (Table 12).

시료명Name of sample 처리농도(%)Treatment concentration (%) 세포독성 완화율(%)Cytotoxic Relaxation Rate (%)
우방자 발효물
Allies Ferment 0.020.02 5151 0.010.01 3131 0.0050.005 1515

실시예 15: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과Example 15: Inhibitory Effect of Inflammatory Cytokine Expression by UV Irradiation

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 우방자 발효물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 우방자 발효물의 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 8에 의해 계산하였다.This Example is to evaluate the inhibitory effect of inflammatory cytokine expression expressed by UV irradiation of the fermented fermentation product obtained in Example 2 Fibroblasts isolated from the epidermal tissue of humans in a 24-well test plate 5X10 ⁴ One by one and attached for 24 hours. Each well was washed once with PBS and 500 μl of PBS was added to each well. The fibroblasts were irradiated with 10 mJ / cm 2 of UV light using an ultraviolet B (UVB) lamp (Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, Japan), after which PBS was removed and FBS was not added to the cell culture medium (DMEM). Medium) 350 μl was added. After treatment with the fermented fermented product to be evaluated here was incubated for 5 hours. 150 µl of the culture supernatant was taken to quantify IL-1α to determine the inhibitory effect of inflammatory cytokine expression of the fermented fermented product. The amount of IL-1α was quantified using Enzyme-linked Immunosorbent Assay, and the production rate of IL-1α was calculated by Equation 8.

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량Bo: IL-1α production in wells without UV irradiation

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량 Bt: IL-1α production in wells that were not irradiated with UV light

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량
St: IL-1α production amount of wells that were irradiated with UV light

실험 결과 우방자 발효물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.02% 농도에서 41% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 13).Experimental results show that the ally fermented product inhibits the production of the inflammatory cytokine-induced inflammatory cytokine IL-1α at a concentration of 0.02% at a concentration of 0.02%, and effectively protects the inflammation caused by UV rays at low concentrations (Table 13).

시료명Name of sample 처리농도(%)Treatment concentration (%) 염증성 사이토카인 발현 억제율(%)Inhibitory rate of inflammatory cytokine expression (%) 우방자 발효물
(실시예 2)Allies Ferment
(Example 2) 0.020.02 4141 0.010.01 20.120.1 0.0050.005 88

실시예 16: 자외선 조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제 효과Example 16: Inhibitory Effect of Prostaglandin Biosynthesis by UV Irradiation

본 실험예는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 프로스타글란딘 생합성 억제 효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하고, 18시간 동안 배양한 다음, 상기의 각질형성세포에 최종농도가 50uM이 되도록 아스피린(aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(prostaglandin E₂ synthetase, 또는 cyclooxygenase, 이하 COX)의 활성을 제거하였다. 아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어있는 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 100㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 UVB 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, Biowhittacker사, MD, USA) 250㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 우방자 발효물을 처리한 후 16시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 적당량 취하여 16시간 동안 생합성된 PGE₂(prostaglandin E₂)를 정량함으로서 우방자 발효물의 프로스타글란딘 억제효과를 판단하였다. PGE₂의 양은 효소면역분석법(enzyme immunoassay)을 이용하여 정량화하였으며 실험결과 우방자 발효물은 자외선에 의한 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. 특히 생성되는 PGE₂는 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있으므로 상기 실험을 통해 우방자 발효물이 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 알 수 있다(표 14).This experimental example is Example 2 woobangja obtained from 5x10 ⁴ each into the keratinocytes (Keratinocyte) isolated from the skin tissue of the person in a 24-well test plates in order to evaluate the inhibition of prostaglandin biosynthesis water fermentation effect was attached for 24 hours . After replacement with medium without FBS, and cultured for 18 hours, prostaglandin biosynthetic enzymes (prostaglandin E ₂ synthetase) present in keratinocytes were treated with aspirin to achieve a final concentration of 50 uM on the keratinocytes. , Or cyclooxygenase (hereinafter referred to as COX) was removed. Two hours after aspirin treatment, each well containing keratinocytes was washed twice with PBS and 100 μl of PBS was added to each well. The keratinocytes were irradiated with UV 30 mJ / cm 2 using a UVB lamp (Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, Japan), and then PBS was removed and each cell was prepared with keratinocyte growth media (Clonetics, Biowhittacker, MD, USA) 250 μl was added. After treatment with the fertilizer fermentation to be evaluated here was incubated for 16 hours. An appropriate amount of the culture supernatant was taken to quantify PGE ₂ (prostaglandin E ₂ ) biosynthesized for 16 hours to determine the prostaglandin inhibitory effect of the allied fermentation. The amount of PGE ₂ was quantified by enzyme immunoassay, and the experimental results showed that the ally fermented product effectively inhibited the production of prostaglandins by UV light. Particularly, the produced PGE ₂ is known to be mainly produced by the COX-2 enzyme. Thus, the experiment shows that the ally fermented product inhibits the induction or activity of the COX-2 enzyme (Table 14).

시료명Name of sample PGE₂ 억제율(%)PGE ₂ Inhibition Rate (%) (-) UV B(-) UV B 대조군Control group (+) UV B(+) UV B -- (+) UV B + 우방자 발효물 0.02중량%(+) UV B + allium ferment 0.02% by weight 64%64% (+) UV B + 우방자 발효물 0.01중량%(+) UV B + Allium Ferment 0.01% by weight 38%38% (+) UV B + 우방자 발효물 0.005중량%(+) UV B + allium ferment 0.005% by weight 15%15%

실시예 17: 여드름균에 대한 항균력 시험Example 17 Antibacterial Activity Test against Acne Bacteria

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생원인인 피부 상재균 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI액체배지 (Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균배양액을 BHI고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%;agar1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후 건조시켰다. 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물을 95% 에탄올 수용액에 12%(W/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려 놓고, 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다. 그 결과, 우방자 발효물의 균 성장 저지환 크기는 19.5㎜인 것으로 나타났다.
This Example was a paper disc test (Paper Disc Test) to confirm the antibacterial activity against acne bacteria of the fermented fermentation product obtained in Example 2. First, preactivation of BHI liquid medium (Brain-Heart Infusion Broth; 3.7%) was performed for 48 hours to activate acne prophylactic bacterium Propionibacterium acnes. The culture medium thus prepared was plated in 0.1 ml each of BHI solid medium (Brain-Heart Infusion Broth; 3.7%; agar 1.5%) and dried. The fermented fermented product obtained in Example 2 was diluted to 12% (W / v) in an aqueous 95% ethanol solution, and 50 µl each was added to a paper disk having a diameter of 8 mm and placed on a solid medium prepared above. The cells were incubated for 3 days. The antimicrobial activity was evaluated by observing the bacterial growth inhibition area around the paper disk and measuring the size of the ring. As a result, it was found that the bacterial growth-retaining ring size of the ally fermented product was 19.5 mm.

실시예 18: 화합물 48/80에 의한 아토피 피부염 유발 후 항염증 실험Example 18 Anti-inflammatory Test After Induction of Atopic Dermatitis by Compound 48/80

BALB/c 마우스(5wks, male)의 등쪽 목부위 피부의 진피 내로 마리당 30㎕의 화합물 48/80 (Sigma, Co.; 1㎎/㎖ in saline)을 주사한 후 우리에 집어넣고 60분 동안 마우스가 목을 긁는 행동을 관찰하였다. 우방자 발효물의 항염 치료 효능을 검정하기 위하여 화합물(compound) 48/80을 주사하기 5일전부터 우방자 발효물들을 250㎕/㎖의 농도로 마리 당 100㎕씩 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하였다. 5일 동안 하루에 두 번씩 총 10회에 걸쳐 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하여 전처리한 다음 화합물 48/80을 주사한 후 총 1시간 동안 5분 간격으로 마우스가 뒷발로 목을 긁는 시간을 측정하여 소양증 정도를 측정하였다.Inject 30 μl of Compound 48/80 (Sigma, Co .; 1 mg / ml in saline) per horse into the dermis of the dorsal neck skin of BALB / c mice (5wks, male) and place in mice for 60 minutes He observed scratching behavior. In order to assay the anti-inflammatory efficacy of allied fermentation, allied fermentations were applied to the dorsal neck region of mice at a concentration of 250 μl / ml from 5 days prior to injection of compound 48/80. Twice a day for 5 days, applied to the dorsal neck area of the mouse 10 times a day, and then pre-treated. After injection of Compound 48/80, the amount of time the mouse scratches the neck with the hind feet is measured at 5 minute intervals for a total of 1 hour. The degree of pruritus was measured.

표 15에서 알 수 있듯이, 우방자 발효물을 적용한 경우 화합물 48/80에 의한 아토피 피부염 (피부 소양증) 유발을 억제하는 효과를 나타내었다.As can be seen in Table 15, the application of the alliance fermentation showed an effect of inhibiting the atopic dermatitis (skin pruritus) induced by the compound 48/80.

5분 동안 긁는 횟수 Number of scratches in 5 minutes 5분5 minutes 10분10 minutes 15분15 minutes 20분20 minutes 25분25 minutes 30분30 minutes 35분35 minutes 40분40 minutes 45분45 minutes 50분50 minutes 55분55 minutes 60분60 minutes 우방자
발효물Allies
Fermented products 2020 2222 2727 3333 3333 3535 3939 4141 4545 2323 1919 1515 대조군Control group 3939 4141 4949 6464 8080 9090 9494 6969 5454 5050 4141 3535

실시예 19: 수분 흡습성 실험Example 19 Moisture Hygroscopicity Experiment

우방자 발효물의 수분 흡습성을 실험하기 위하여, 사람으로부터 직접 채취한 사람 건조 표피세포에 상기 실시예 2의 우방자 발효물과 증류수를 각각 포화 흡수시키고 흡수된 물의 양을 측정한 후, 48시간 건조 후의 질량변화를 측정하였다. 각각의 측정된 질량 변화로부터 피부세포 단위 질량 당 흡수된 물의 양을 비교하였다. 이러한 실험은 표피세포에 흡수되는 물의 양을 비교하기 위한 방법으로 실제 사람의 피부에 있어서도 그 보습효과를 예상할 수 있는 한가지 방법으로 사용되고 있다.In order to test the moisture hygroscopicity of the allied fermented product, the human dried epidermal cells obtained directly from the human were saturated and absorbed by the allied fermented product of Example 2 and distilled water, respectively, and the amount of water absorbed was measured, followed by mass change after 48 hours of drying. Was measured. The amount of water absorbed per unit of skin cell mass was compared from each measured mass change. This experiment is used to compare the amount of water absorbed by epidermal cells and is used as a way to anticipate the moisturizing effect on human skin.

구체적으로, 사람의 표피세포를 건조시켜 단위질량 당 함유된 수분의 양을 일정하게 만든 후, 각각의 표피세포 시료의 무게와 함유된 물의 양을 카이저 방법(Kaiser method)을 사용하여 측정하였다. 물의 함량이 측정된 표피세포를 우방자 발효물(A) 또는 정제수(B)에 각각 24시간 담지하여 포화 흡수시켜준 뒤, 세포 내에 물이 포화흡수된 표피세포를 꺼내서 무게를 측정하고, 일부를 채취하여 카이저 수분측정기로 함유되어 있는 단위질량 당 수분의 양을 측정하였다. 이후 다시 48시간 감압건조시키고 무게를 측정하고 난 후, 일부를 채취하여 카이저 방법에 의해 수분량을 측정하여 함유되어 있는 단위질량 당 수분의 양을 측정하였다.Specifically, after the human epidermal cells were dried to make the amount of water contained per unit mass constant, the weight of each epidermal cell sample and the amount of water contained therein were measured using the Kaiser method. The epidermal cells in which the water content was measured were saturated and absorbed in the fermented fermentation product (A) or purified water (B) for 24 hours, respectively, and then the epidermal cells saturated with water were absorbed into the cells, weighed, and some were collected. The amount of water per unit mass contained in the Kaiser moisture meter was measured. Thereafter, the resultant was dried under reduced pressure for 48 hours and weighed, and then, a part of the sample was collected and water content was measured by Kaiser method to determine the amount of water per unit mass contained therein.

표 16 표피세포에 대한 수분함량(수분 mg/표피세포 질량 g)에 나타낸 바와 같이, 우방자 발효물로 포화 흡습시킨 표피세포가 정제수에 의하여 포화흡습된 표피세포의 재건조 과정에 있어 정제수보다 훨씬 많은 물을 함유하고 있음을 확인할 수 있었으며, 이로부터 우방자 발효물의 우수한 피부 흡습성을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 우방자 발효물이 우수한 보습 효과를 나타냄을 알 수 있다.As shown in Table 16, the water content (mg water / g epidermal cell mass) for epidermal cells, the epidermal cells saturated with hygrophilic fermentation were significantly more than the purified water in the process of redrying the epidermal cells saturated with purified water. It could be confirmed that it contained water, and from this, it was confirmed that excellent skin hygroscopicity of allied fermented product. Through this, it can be seen that the fermented fermented product exhibits an excellent moisturizing effect.

수분함량Moisture content 초기 건조상태Initial dry state 포화상태Saturation 건조 후after drying 우방자 발효물Allies Ferment 400400 800800 550550 정제수Purified water 400400 790790 400400

실시예 20 및 비교예 1Example 20 and Comparative Example 1

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.In this example, the cosmetics containing the fermented fermentation product obtained in Example 2 were prepared, and the skin elasticity improvement effect and the wrinkle improvement effect were evaluated in a comparative experiment with Comparative Example 1 in humans.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 17에 나타낸 바와 같다. 우선 표 17에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 20, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 20에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.The cosmetics used in the comparative experiments are in the form of a cream, the composition of which is shown in Table 17. First, the phase b) recorded in Table 17 is heated and stored at 70 ° C. To this, a) phase is added, and after pre-emulsification, it is emulsified uniformly with a homomixer, and then cooled slowly to prepare a cream (Example 20, Comparative Example 1). For 20 experimenters (20-35 year old female), the cream prepared in Example 20 was applied to the right side of the face, and the cream prepared in Comparative Example 1 was applied to the left side of the face twice a day for 2 consecutive months.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표18에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 18에서 나타난 바와 같이 우방자 발효물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.The skin elasticity improvement effect after the completion of the experiment was measured using a skin elasticity measuring instrument (cutometer SEM 575, C + K Electronic Co., Germany) before and after using the product for 2 months. The experimental results are described in Table 18 below as the ΔR7 value of the cutometer SEM 575, where the R7 value represents the nature of the viscoelasticity of the skin. As shown in Table 18, it can be seen that the skin elasticity improving effect of the tester coated with the cream containing the fermented fermented product is excellent.

원료Raw material 실시예 20Example 20 비교예 1Comparative Example 1 가end 스테아릴 알콜Stearyl alcohol 88 88 스테아린산 Stearic acid 22 22 스테아린산 콜레스테롤Stearic acid cholesterol 22 22 스쿠알란Squalane 44 44 2-옥틸도데실알콜2-octyldodecyl alcohol 66 66 폴리옥시에틸렌(25몰부
가)알콜에스테르Polyoxyethylene (25 moles)
A) Alcohol ester 33 33 글리세릴모노스테아린산
아스테르Glyceryl Monostearic Acid
Aster 22 22 나I 우방자 발효물Allies Ferment 1One -- 프로필렌글리콜Propylene glycol 55 55 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity

주)단위: 중량%Note) Unit: Weight%

실험제품Experimental product 피부탄력효과(△R7)Skin elasticity effect (△ R7) 비고Remarks 실시예 20Example 20 0.260.26 비교예 1Comparative Example 1 0.110.11

n=20, p＜0.05n = 20, p <0.05

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 20에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.For 20 experimenters (20-35 year old female), the cream prepared in Example 20 was applied to the right side of the face, and the cream prepared in Comparative Example 1 was applied to the left side of the face twice a day for 2 consecutive months.

실험완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오 미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 19에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter)값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서 표 19에서 나타나듯 우방자 발효물을 함유한 실시예 20의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.After completion of the experiment, the skin wrinkle improvement effect is made by using a silicone replica to examine the skin's wrinkle improvement effect before and after using the product for two months. SV60, C + K Electronic Co., Germany). The results are shown in Table 19, which shows the average of each parameter value after 2 months minus the parameter value 2 months ago. In other words, the negative the value, the higher the wrinkle improvement effect. Therefore, as shown in Table 19, it could be confirmed that the skin wrinkle improvement effect of Example 20 containing the fermented fermented product was greatly enhanced.

실험제품Experimental product R1R1 R2R2 R3R3 R4R4 R5R5 실시예 20Example 20 -0.22-0.22 -0.18-0.18 -0.10-0.10 -0.08-0.08 -0.07-0.07 비교예 1Comparative Example 1 -0.12-0.12 -0.06-0.06 -0.05-0.05 -0.05-0.05 -0.02-0.02 R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값
R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균
R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치
R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값
R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값R1: difference between the highest and lowest of the wrinkle contour
R2: The wrinkle contours are divided randomly by 5 spaces, and then the average of R1 values
R3: Highest value of R1 divided by 5
R4: Baseline of the fold contour subtracted the mean of each top and valley
R5: Mean value of the baseline of the wrinkle contour subtracted each wrinkle profile

실시예 21 및 비교예 2Example 21 and Comparative Example 2

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 2과 비교실험을 행하여 평가하였다.In this example, the cosmetics containing the fermented fermented product obtained in Example 2 were prepared, and the skin whitening effect of humans was evaluated by performing a comparative experiment with Comparative Example 2.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 20에 나타낸 바와 같다. 우선 표 20에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 21, 비교예 2)을 제조한다. 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 21에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 21에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.The cosmetics used in the comparative experiments are in the form of a cream, the composition of which is shown in Table 20. First, the phase b) recorded in Table 20 is heated and stored at 70 ° C. To this, a) phase is added, and after pre-emulsification, it is emulsified uniformly with a homomixer, and then cooled slowly to prepare a cream (Example 21, Comparative Example 2). 20 experimenters (women aged 20-35 years) were applied to the right side of the face with the cream prepared in Example 21 and the left side of the face with the cream prepared in Comparative Example 2 twice a day for 2 consecutive months. . After completion of the test, the skin of the applied areas on both sides of the face was measured using an image analyzer and the color change of the skin using chromameter (Minolta CR300) to measure the change in brightness of color (ΔL). Subjective visual observation was performed and the effect was measured according to the following classification. The results are shown in Table 21 below. At this time, the degree of whitening efficacy was classified into the following seven ratings.

?미백효능 평가 기준 :Whitening efficacy evaluation criteria:

-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, -3: very worse, -2: worse, -1: slightly worse, 0: no change,

1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선1: slightly improved, 2: improved, 3: highly improved

표 21에서 나타낸 바와 같이 우방자 발효물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.As shown in Table 21, it can be seen that the whitening effect is excellent in the facial skin of the experimenter who applied the cream containing the fermented fermented product.

원료Raw material 실시예 21Example 21 비교예 2Comparative Example 2 가end 스테아릴 알콜Stearyl alcohol 88 88 스테아린산 Stearic acid 22 22 스테아린산 콜레스테롤Stearic acid cholesterol 22 22 스쿠알란Squalane 44 44 2-옥틸도데실알콜2-octyldodecyl alcohol 66 66 폴리옥시에틸렌(25몰부
가)알콜에스테르Polyoxyethylene (25 moles)
A) Alcohol ester 33 33 글리세릴모노스테아린산
아스테르Glyceryl Monostearic Acid
Aster 22 22 나I 우방자 발효물Allies Ferment 1One -- 프로필렌글리콜Propylene glycol 55 55 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity

주)단위: 중량%Note) Unit: Weight%

피부색의
밝기 변화(ΔL)Skin-colored
Change in brightness (ΔL) 숙련자의
객관적 평가Skilled
Objective evaluation 피검자의
주관적 평가Subject's
Subjective evaluation 실시예 21Example 21 비교예 2Comparative Example 2 실시예 21Example 21 비교예 2Comparative Example 2 실시예 21Example 21 비교예 2Comparative Example 2 평균값medium 4.144.14 1.261.26 3.13.1 2.32.3 2.72.7 1.11.1

실시예 22 및 비교예 3Example 22 and Comparative Example 3

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 아토피성 피부염 개선효과를 비교예 3과 비교실험을 행하여 평가하였다.In this example, the cosmetics containing the fermented fermentation product obtained in Example 2 were prepared, and the atopic dermatitis improvement effect in humans was evaluated by performing a comparative experiment with Comparative Example 3.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 22에 나타낸 바와 같다. 우선 표 22의 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 22, 비교예 3)을 제조한다. 아토피 피부 개선효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 임상실험을 실시하였다. 5-30세의 아토피 환자로서, 2년 이상 아토피성 피부염을 앓고 있는 환자 30명에 대하여 아토피성 피부염 개선효과를 조사하였다. 동일인에게 왼쪽 손에는 실시예 22의 크림을, 오른쪽 손에는 비교예 3의 크림을 매일 저녁 세정 후, 피부에 1일 1회 60일간 도포하고 아토피성 피부염 상태 개선 정도를 측정하였다. 측정은 설문조사에 의한 관능평가로 실시하였다. 그 결과는 하기 표 23에 나타내었다.The cosmetics used in the comparative experiments are in the form of a cream, the composition of which is shown in Table 22. First, phase b) of Table 22 is heated and stored at 70 degreeC. To this, a) phase is added, and after pre-emulsification, it is emulsified uniformly with a homomixer, and then cooled slowly to prepare a cream (Example 22, Comparative Example 3). In order to confirm the atopic skin improvement effect, the following clinical experiments were conducted. Thirty patients with atopic dermatitis, aged 5-30 years, who had atopic dermatitis for more than two years were examined for atopic dermatitis improvement. The same person was washed with cream of Example 22 on the left hand and the cream of Comparative Example 3 on the right hand every evening, and then applied to the skin once a day for 60 days and the degree of atopic dermatitis improvement was measured. The measurement was performed by sensory evaluation by survey. The results are shown in Table 23 below.

표 23에 나타난 바와 같이 우방자 발효물을 첨가하여 제조한 실시예 22의 크림이 상기 추출물이 첨가되지 않은 비교예 3의 화장료보다 우수한 아토피성 피부개선 효과가 있다는 것을 알 수 있다.As shown in Table 23, it can be seen that the cream of Example 22 prepared by adding fermented fermented product has a superior atopic skin improvement effect than the cosmetic of Comparative Example 3, in which the extract was not added.

원료Raw material 실시예 22Example 22 비교예 3Comparative Example 3 가end 스테아릴 알콜Stearyl alcohol 88 88 스테아린산 Stearic acid 22 22 스테아린산 콜레스테롤Stearic acid cholesterol 22 22 스쿠알란Squalane 44 44 2-옥틸도데실알콜2-octyldodecyl alcohol 66 66 폴리옥시에틸렌(25몰부
가)알콜에스테르Polyoxyethylene (25 moles)
A) Alcohol ester 33 33 글리세릴모노스테아린산
아스테르Glyceryl Monostearic Acid
Aster 22 22 나I 우방자 발효물Allies Ferment 1One -- 프로필렌글리콜Propylene glycol 55 55 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity

주)단위: 중량%Note) Unit: Weight%

매우 좋다very good 좋다good 그저 그렇다so so 실시예 22Example 22 69% (21명)69% (21 people) 31% (9명)31% (9 people) %% 비교예 3Comparative Example 3 11% (3명)11% (3 people) 19% (6명)19% (6 people) 70% (21명)70% (21 people)

실시예 23: SLS에 의한 피부자극 완화 효과Example 23: Skin Stimulation Relaxation Effect by SLS

본 실험예에서는 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가하였다.In the present experimental example, the stimulating alleviation effect of the cosmetics containing the fermented fermentation product obtained in Example 2 was evaluated by human patch experiment.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 20에서 제조된 제품을 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포하여 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.1% SLS (sodium lauryl sulfate) that causes irritation in general cosmetic prescriptions (cream, lotion, skin, essence) and the product prepared in Example 20 are mixed and patched for 24 hours, 48 hours and 72 hours The stimulation-relaxation effect was evaluated based on this.

20-50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 각각의 제품을 0.3㎎씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.FINN CHAMBER (FINLAND) was applied to each arm of 50 healthy men and women aged 50 to 50 with 0.3 mg of each product, and the acute irritation index was evaluated after 24 hours. After evaluation, the same amount of product was applied to the same site again, and the delayed stimulation index after 48 and 72 hours was evaluated.

시험 결과 SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 우방자 발효물을 함유하는 제품을 첩포한 경우에는 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.As a result of the test, the area covered with SLS alone showed red irritation on the skin after 24 hours, but when the product containing allied fermented product was patched, no skin seizures occurred even after 24 hours, 48 hours, and 72 hours. .

이 평가의 결과는 우방자 발효물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있는 유의한 효과가 있음을 나타내는 것이다.The results of this evaluation indicate that there is a significant effect of reducing skin irritation by substrates (surfactants, fragrances, alcohols) that cause irritation when mate fermented products are mixed in cosmetics.

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 24내지 26과 같이 제조하였다. 이들 우방자 발효물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.
Other examples are shown below. In other words, the lotion, milky lotion and cosmetic liquid containing the fermented fermented product obtained in Example 2 were prepared as in Examples 24 to 26. Skin lotion, latex, and beauty liquids containing fermented fermented products have anti-oxidation effect, collagen synthesis promoting effect, skin fine wrinkle improvement effect, whitening effect, moisturizing effect, skin irritation effect, acne prevention effect, atopy improvement effect and anti-inflammatory effect Showed excellent effect.

실시예 24: 실시예 2 우방자 발효물을 함유한 화장수 제조Example 24 Preparation of Lotion Containing Allier Ferment

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부 개선효과가 있는 화장수를 얻었다.
To 8 g of 95% ethanol, 0.05 g of polypyrrolidone, 0.1 g of oleyl alcohol, 0.2 g of polyoxyethylene monooleate, 0.2 g of fragrance, 0.1 g of paraoxybenzoic acid methyl ester, a small amount of antioxidant, and a small amount of pigment are dissolved. . 0.05 g of the fermented fermented product obtained in Example 2 and 5 g of glycerin were dissolved in 85.33 g of purified water, and the mixed solution was added and stirred to obtain a lotion having a skin improving effect.

실시예 25: 실시예 2 우방자 발효물을 함유한 유액 제조Example 25 Example 2 Preparation of Latex Containing Alligator Fermentation

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.
1.2 g of cetyl alcohol, 10 g of squalane, 2 g of petrolatum, 0.2 g of paraoxybenzoic acid ethyl ester, 1 g of glycerin monoesteralide, 1 g of polyoxyethylene (20 mole added) monooleate and 0.1 g of fragrance were mixed and dissolved at 70 ° C. 0.5 g of the fermented fermented product obtained in Example 2, 5 g of dipropylene glycol, 2 g of polyethylene glycol-1500, 0.2 g of triethanolamine, and 76.2 g of purified water were heated to 75 ° C to dissolve it. Both mixtures were emulsified and cooled to obtain an emulsion having an oil-in-water (O / W) type skin improvement effect.

실시예 26: 실시예 2 우방자 발효물을 함유한 미용액 제조Example 26 Preparation of Cosmetic Liquid Containing Allier Ferment

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 2에서 수득한 우방자 발효물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.
5 g of 95% ethyl alcohol, 1.2 g of polyoxyethylene sorbitan monooleate, 0.3 g of kitulose, 0.2 g of sodium hyaluronate, 0.2 g of vitamin E-acetate, 0.2 g of sodium licorice, 0.1 g of paraoxybenzoic acid ethyl ester, 1 g of the fermented fermented product obtained in Example 2 and a suitable amount of pigment were mixed to obtain a cosmetic liquid having a skin improvement effect.

Claims

delete

It is obtained by fermentation by adding at least one selected from mycelia and mycelium broth to Grifola frondosa mycelium extract, and allium composition containing aglycone containing aglycone of arctigenin and caffeic acid. The skin external composition containing 0.001-30.0 weight% with respect to.

The method according to claim 3,
The composition is characterized in that it exhibits a stimulating function.

The method according to claim 3,
The composition is characterized in that it exhibits an atopic skin improvement effect.

The method according to claim 3,
The composition is characterized in that it exhibits an acne prevention or improvement effect.

The method according to claim 3,
The composition is characterized in that it exhibits an anti-aging effect.