KR101146469B1 - 다른 약물과 공동으로 결핵의 복합 치료에 유용한면역치료제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 악성 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 균주로부터 유래된 세포벽 단편에 기초한 면역치료제; 이런 면역치료제를 수득하는 방법; 이를 함유하는 제약학적 조성물; 다른 약물과 공동으로 결핵의 복합 치료를 위한 약물의 제조에서 이의 용도에 관계한다.
면역치료제
Description
본 발명은 다른 약물과 공동으로 결핵의 복합 치료에 유용한 면역치료제를 제조하는 방법에 관계한다. 본 발명은 악성 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis-complex)(MTB-C) 균주로부터 유래된 세포벽 단편에 기초하고, 상기한 법으로 수득된 면역치료제에 기초한다.
결핵은 아래의 종: 미코박테리움 튜베쿨로시스(M.tuberculosis), 미코박테리움 보비스(M.bovis), 미코박테리움 미크로티(M.microti), 미코박테리움 아프리카눔(M.africanum)을 비롯한 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis-complex)(MTB-C)에 의해 유발되는 만성 감염성 질환이다.
세계 보건 기구(WHO)에 따르면, 매년 8,000,000명의 새로운 결핵 환자가 발생하고, 대략 3,000,000명이 결핵으로 사망하고 있다. 전세계적으로 2,000,000,000명이 결핵에 감염된 것으로 생각된다.
결핵에 대한 예방제로 현재 사용되고 있는 백신은 미코박테리움 보비스(M.bovis)의 변종인 BCG 균주(Calmette-Guerin bacillus)로부터 유래된 박테리아 에 기초한다.
WO-A-03018053에 따르면, 상기 백신은 결핵에 대한 면역보호를 유도하는데 있어 현재 가용한 최고의 백신이다. 하지만, 인간에서 상기 백신의 안정성과 효능이 일부 국가에서 여전히 논쟁되고 있는데, 그 이유는 상기 백신이 폐결핵으로부터 성인을 완전히 보호하지 못하기 때문이다.
다른 한편, WO-A-03004520에서는 감염된 사람, 다시 말하면, 결핵에 걸린 사람과 결핵이 발병하지 않은 사람 모두에서 결핵을 억제하는데 가장 효과적인 치료법이 수개월동안 이소니아지드를 비롯한 여러 약물의 투여임을 공지된 사실로서 기술한다.
이런 장기간 치료는 치료가 완결되지 않은 시점에서 이들 약물에 저항하는 미생물의 발생을 유발하고, 게다가 전술한 약물들은 바실러스가 활성 대사(즉, 성장)를 지속하는 경우에만 작용하고 활성 대사가 중단되면 작용하지 못한다. 이는 매우 불편한데, 그 이유는 결핵 감염동안 바실러스가 활성 대사 상태와 비-활성 대사 상태로 모두 존재하기 때문이다.
특허 US4724144에 기술된 바와 같이, 이들 문제를 해결하는 한가지 가능성은 다른 약물, 예를 들면, 리팜피신과 이소니아지드의 투여와 함께, 결핵 치료를 위한 어쥬번트로서 사멸된 미코박테리움 박케(M. vaccae) 세포에 기초한 면역치료제의 이용이다.
하지만, 특허 US6001361에서는 이런 어쥬번트 약물이 결핵에 대한 인간의 대규모 예방접종에 사용되지 않고 있으며, 이의 효능에 관한 정보가 거의 없다고 진 술한다.
이런 이유로, 결핵 치료를 위하여 이들 약물에 대한 보조 어쥬번트로서 기능하는 면역치료제가 필요한데, 상기 면역치료제는 저항성 미생물의 발생을 유발하지 않고 비-활성 상태의 바실러스에 대하여도 면역 반응을 유도해야 한다.
본 발명의 저자들은 다른 약물과 공동으로 결핵의 복합 치료에 유용한 새로운 면역치료제의 제조가 가능한 방법을 개발하였다. 상기 면역치료제는 악성 MTB-C 균주의 세포벽 단편을 함유하는데, 이는 연관된 다른 약물의 효능을 증가시켜 비-활성 대사 상태에 있는 바실러스에 대한 효과적인 면역 반응을 유도함으로써 내성의 위험을 감소시킨다.
본 발명의 목적
본 발명의 목적은 악성 MTB-C 균주의 세포벽 단편을 함유하고, 다른 약물과 공동으로 결핵의 복합 치료에 유용한 면역치료제를 수득하는 방법을 제시하는 것이다.
상기한 방법을 이용하여 수득된 면역치료제 및 다른 약물과의 공동으로 결핵의 복합 치료를 위한 약물을 제조하기 위한 상기 면역치료제의 용도 역시 본 발명의 목적에 포함된다.
더 나아가, 본 발명의 다른 목적은 상기 면역치료제로 제조되는 제약학적 화합물을 제시하는 것이다.
본 발명의 저자들은 악성 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis-complex)(MTB-C) 균주로부터 유래된 세포벽 단편을 함유하는 면역치료제를 수득하는 방법을 개발하였다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것으로 특성화된다:
- 3주 이상의 기간동안 악성 MTB-C 균주를 배양하고;
- 비-이온성 표면활성(tensioactive) 화합물의 존재하에 세포 배양액을 균질화시킨다.
악성 균주는 MTB-C의 임의의 악성 균주일 수 있는데, 그 이유는 결핵균이 매우 안정하고 면역 화합물에서 돌연변이가 보고된 적이 없기 때문이다. 당분야에서 연구자들에 의해 가장 빈번하게 이용되고 참고 균주로서 간주되는 균주중의 하나는 예로써 National Collection of Type Cultures(NCTC, London, Great Britain)로부터 무료로 분양되는 H37Rv 균주(수탁 번호 NC007416)이다.
악성 균주는 당업자에게 널리 공지된 배양 배지에 접종으로 배양될 수 있다. 배양 배지는 고체 배지, 예를 들면, Middlebrook 7H10 또는 7H11-형 아가, 또는 액체 배지, 예를 들면, Sauton 또는 Proskauer-Beck 배양 배지이다.
본 발명에서, 배양은 3주 또는 그 이상, 바람직하게는 3 내지 4주 기간동안 수행된다. 배양 온도는 가급적, 34℃ 내지 38℃로 유지된다.
배양의 완결이후, 배양이 고체 상에서 수행된 경우에, 플레이트는 긁어내어 배지(아가) 적출을 피하면서 클론을 수득한다. 하지만, 배양이 액체 상에서 수행된 경우에, 세포는 당업자에게 공지된 통상적인 기술(가령, 원심분리)을 이용하여 농축하고 세척한다.
균주의 균질화는 중성 pH의 완충 매체에서 수행된다. 본 발명에서, 균질화는 미세하게 분할된 세포벽 입자의 수득이 가능하고 원치않는 지질 분획물을 적어도 부분적으로 유화시키는 비-이온성 표면활성 화합물의 존재하에 수행된다.
이런 균질화 방법으로, MTB-C 세포는 파괴되고 세포벽의 작은 단편이 수득된다.
균질화는 초음파에 의한 초음파처리, 또는 기계적 고압균질기와 함께 대략 1 ㎜ 직경의 소형 비드(가령, 실리카 또는 실리카-지르코늄)를 이용하여 수행된다. 기계적 고압균질기, 예를 들면, Biospec 사의 BEADBEATER 모델이 이용된다.
완충 매체는 예로써 PBS 완충액(인산염 완충액의 염 용액)으로 구성된다.
사용되는 비-이온성 표면활성 화합물의 유형은 중요하지 않지만, 가급적 알킬페놀 에톡실레이트 기와 에톡실화된 솔비탄 에스테르에서 선택된다. 적절하게는, 비-이온성 표면활성 화합물은 옥틸페놀 에톡실레이트 화합물에서 선택된다. 가장 적절하게는, 7-8 mol의 산화에틸렌을 보유하는 옥틸페놀 에톡실레이트가 사용된다; 이들은 예로써 상품명 TRITON X-114로 시판되고 있다. 균질화동안 비-이온성 표면활성 화합물의 농도는 균질화된 전체 중량의 1 내지 5%이다.
목적하는 세포벽 단편을 보유하는 균질화된 덩어리는 통상적인 처리를 수행하여 이들 단편을 비-단편화된 세포 및 용해된 화합물로부터 분리한다.
가령, 경사분리(decantation)로 실리카 또는 실리카-지르코늄(사용된 경우)을 분리한 이후, 균질화된 산물은 5,000 rpm 보다 느린 속도로 부드럽게 교반하여 비-단편화된 세포를 침전물로서 제거한다.
이후, 생성된 상층액은 더욱 높은 속도(가령, 15,000 rpm 초과)로 원심분리하여 상층액에 농축되는 용해된 요소를 제거하는데, 여기서 세포벽 단편은 침전물에 농축된다. 당업자에게 공지된 통상적인 기술, 예를 들면, PBS 완충액에서 세척 및 원심분리를 이용하는 이런 방법은 완전하게 투명한 상층액이 수득될 때까지 수회 반복한다; 이후, 상층액은 버린다.
세포벽 단편을 보유하는 수득된 침전물은 PBS 완충액에 분산시키고 화학적(가령, 포몰(formol)로 처리) 또는 물리적(가령, 고압멸균기에서 처리 또는 저온살균) 방법을 수행하여, 단편화와 정제이후에도 생존할 수 있는 MTB-C 세포의 완전한 불화를 담보한다.
최종적으로, PBS 완충액에서 세포벽 단편의 분산액은 바이알에 분배하고 -15℃ 내지 -25℃ 온도와 0.1 내지 0.5 mbar의 진공에서 냉동 건조시킨다.
이런 방식으로, 본 발명의 면역치료제를 형성하는 MTB-C의 세포벽 단편을 보유하는 바이알을 획득하고, -70℃에서 보관한다.
본 발명의 면역치료제로부터 여러 제약학적 화합물이 제조될 수 있는데, 이들 역시 본 발명의 목적중의 하나이다; 이들은 수중유(O/W)-형 에멀젼 또는 리포좀으로 조제된다. 리포좀-형 제약학적 조성물이 선호된다.
리포좀의 조제는 당업자에게 널리 공지된 통상적인 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 가령, 리포좀은 냉동 건조된 세포벽 단편 및 리포좀-형성 보조 지질(adjunct lipid)을 수성 매체에서 혼합하고, 생성된 혼합물을 표준 방법, 예를 들면, 고속 교반기를 이용하여 균질화시킴으로써 수득된다.
리포좀-형성 보조 지질은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 여기에는 알짜 중성 및/또는 음성 전하 인지질과 스테롤이 포함된다.
인지질은 예로써, 포스파티디딜콜린, 포스파티디딜세린, 포스파티디딜이노시톨이다.
정상적으로, 리포좀에서 가장 풍부한 성분은 포스파티디딜콜린인데, 이는 합성되거나 자연 공급원으로부터 분리될 수 있다. 가장 빈번하게 사용되는 시판 상품은 콩 레시틴이다.
리포좀의 제조에 사용되는 스테롤은 특히, 콜레스테롤과 담즙산염이다.
적절하게는, 리포좀은 콩 레시틴과 소디움 콜레이트(sodium cholate)의 혼합물을 사용하여 형성된다.
선택적으로, 리포좀은 이들의 안전성을 개선하는 첨가물, 예를 들면, 지질 항산화제로서 기능하는 비타민 E를 보유한다.
수득된 리포좀은 크기가 다양한데, 99.9%는 1 마이크론(micron)보다 작다.
리포좀은 냉동 건조시켜 본 발명의 면역치료제를 냉동 건조된 리포좀으로 수득할 수 있다.
본 발명의 목적에는 또한, 다른 약물과 공동으로 결핵의 복합 치료를 위한 약물을 제조하기 위한 본 발명의 면역치료제의 용도가 포함된다.
본 발명의 면역치료제는 가급적 장관외 경로로 투여되지만, 다른 투여 경로 역시 배제되지 않는다.
공지된 항-결핵 약물 중에서, 본 발명의 면역치료제와의 복합 치료에 선호되는 약물은 이소니아지드와 리팜피신이다.
결핵의 복합 치료를 위한 본 발명의 면역치료제와 항-결핵 약물간의 공동은 동시에 또는 순차적으로, 예를 들면, 이들 약물과 면역치료제의 동시 투여, 또는 이들 약물의 선행 투여와 면역치료제의 후속 투여로 달성된다.
놀랍게도, 결핵 치료용 약물과 공동으로 본 발명의 면역치료제의 투여에 의한 결핵의 복합 치료는 이들 약물의 효능을 증가시키는 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 본 발명의 면역치료제가 비-활성 대사 상태에 있는 바실러스에 대한 면역 반응을 유도함으로써 내성 발생의 위험을 감소시키기 때문이다.
아래의 실시예에서는 본 발명의 특정 구체예에 관한 더욱 구체적인 설명을 당업자에게 제공한다.
실시예 1.- 면역치료제의 제조
대략 80 - 100개의 Middlebrook 7H11-형 아가 평판은 National Collection of Type Cultures(NCTC, London, Great Britain)에 의해 제공된 H37Rv(수탁 번호 NC007416) 배양액으로 접종한다. 각 평판에 접종된 콜로니-형성 단위의 농도는 105-106 UFC이다. 이들 평판은 34℃ 내지 38℃의 온도에서 21일(3주)동안 배양한다.
배양이후, 콜로니는 주걱을 이용하여 배양 배지가 떨어지지 않도록 조심스럽게 아가 평판으로부터 떼어낸다. 15 내지 18 g의 정제되지 않은 추출물이 획득된다.
정제되지 않은 추출물은 4wt%의 TRITON X-114를 함유하는 대략 20 ㎖의 PBS 완충액에 분산시킨다. 1 ㎜의 직경을 보유하는 35 ㎖의 실리카-지르코늄 비드를 첨가하고, 이후 Biospec 사에서 제조된 BEADBEATER 고압균질기를 이용하여 기계적 균질화를 수행한다.
균질화 방법은 질-닐센(Ziehl-Neelsen) 기술로 염색이후 1000 확대도(augment)에서 100개 필드의 관찰이후 5개 미만의 전체 바실러스가 검출될 때까지 지속한다.
균질화로부터 산출된 산물은 경사분리로 실리카-지르코늄 비드로부터 분리한다. 이들은 4wt%의 TRITON X-114를 함유하는 PBS-완충된 용액에서 세척하고, 상이한 세척으로부터 얻은 액체는 산물과 함께 수거하여 대략 80-100 ㎖의 총 부피를 얻는다.
이후, 균질화로부터 산출된 산물 및 세척으로부터 얻은 액체는 4℃에서 냉각된 원심분리기에서 30분간 3,000 rpm으로 원심분리하여 침전물로부터 비-단편화된 세포를 제거한다.
상층액은 보관한다.
이후, 상층액은 4℃에서 60분간 15,100 rpm(27,000 g에 상당함)으로 원심분리하여 세포벽 단편을 보유하는 백색 침전물을 얻는다.
침전물은 보관하고, 황색 상층액은 제거한다.
침전물은 먼저, PBS 완충액(3 x 3 ㎖)에서 세척하고, 이후 3 ㎖의 완충액 용액에 재분산시키고, PBS 완충액으로 20 ㎖로 만들고, 4℃에서 60분간 15,100 rpm으로 다시 원심분리한다.
수득된 상층액은 버린다.
세척과 원심분리는 반복하고, 수득된 상층액은 완전히 제거한다.
세포벽 단편을 보유하는 침전물은 PBS 완충액(3x3 ㎖)에 세척하고 12 ㎖의 PBS 완충액에 재분산시킨다.
원심분리와 세척이후, PBS 완충액에서 세포벽 단편의 분산에 기인한 총량은 용기에 수거하고 65℃에서 1시간동안 처리로 저온살균한다.
이후, 혼합물은 얼음조(ice bath)에서 급속하게 냉각시키고, 세포벽 단편 분산액은 크료튜브(cryotube)당 1 ㎖의 비율로 크료뷰트에 분산시킨다.
분산된 세포벽 단편을 보유하는 크료튜브는 -70℃에서 동결시키고 -15℃ 내지 -22℃의 온도와 0.180 내지 0.400 mbar의 진공에서 냉동 건조시킨다.
1 내지 1.5 g의 면역치료제가 수득된다.
실시예 2.- 면역치료제의 리포좀 제조
실시예 1에서 수득된 740 내지 770 ㎎의 산물은 비커에 칭량한다. 이후, 에탄올에 녹인 20 ㎖의 약품-등급 콩 레시틴 분산액(1 ℓ의 절대 에탄올에서 1 ㎏의 레시틴) 및 물에 녹인 7 ㎖의 약품-등급 소디움 콜레이트 용액(1 ℓ의 이중증류수(bidistilled water)에서 200 g의 소디움 콜레이트)을 첨가한다.
pH는 HCl 0.997 N 용액으로 7.7 내지 8로 조정한다.
리포좀은 고속 교반기를 이용한 균질화로 제조한다.
이런 방식으로 수득된 리포좀 분산액은 이중증류수에서 10%로 희석한다; pH 는 HCl 0.0997 N 용액으로 7.1 내지 7.3으로 조정한다.
리포좀 분산액은 크료튜브(튜브당 0.5 ㎖)에 분산시키고 -80℃에서 동결시킨다.
이후, 이들 분산액은 냉동 건조시키고, 본 발명의 면역치료제를 리포좀으로 수득한다.
실시예 3.- 약물 치료에서 어쥬번트로서 본 발명의 면역치료제의 효능
감염 모형으로, 특정 병원균이 없는 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c, 129/Sv, C57BL/6, DBA/2 생쥐를 이용하였다.
결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 악성 균주는 중간 대수기(middle logarithmic phase)에 도달할 때까지 Proskauer-Beck 배지에서 배양하고, 이용할 때까지 -70℃에서 1-㎖ 분량으로 보관하였다.
이들 생쥐는 대략 10-50개의 생존 바실러스 접종물을 폐에 제공하는 Middelbrook 에어로졸 접종 장치에서 접종하였다.
바실러스 농도, 다시 말하면, 생존 바실러스의 총수는 Middelbrook 7H11-형 아가에서 균질화된 좌측 폐와 비장의 연속 희석액의 배양으로 결정하였다. 좌측 폐와 비장 샘플은 1 ㎖의 PBS 완충액의 존재하에 균질화시켰다.
I) 이소니아지드와 동시에 리포좀성 면역치료제의 1회 투약으로 처리
감염된 BALB/c-유형 생쥐는 3가지 군으로 분할하였다:
- 6주 동안 주 5일간 일일 25 ㎎/㎏의 이소니아지드 단독의 1회 투약으로 처 리됨(대조), 또는
- 6주 동안 주 5일간 일일 25 ㎎/㎏의 이소니아지드 1회 투약 및 180 ㎍의 본 발명의 리포좀성 면역치료제의 비강내 투약으로 처리됨, 또는
- 6주 동안 주 5일간 일일 25 ㎎/㎏의 이소니아지드 1회 투약 및 180 ㎍의 본 발명의 리포좀성 면역치료제의 복강내 투약으로 처리됨.
항생제 이소니아지드 처리는 9주에 시작하고 15주까지 지속하였다.
본 발명의 리포좀성 면역치료제는 13주에서 투여하였다.
15주에, 이들 동물은 희생시키고, 좌측 폐와 비장에서 바실러스 농도를 측정하였다.
섹션 C의 도입부에 기술된 방법에 따라 확립된 바실러스 농도는 예방접종된 동물의 폐에서 유의하게 낮은 반면, 비장에서 결과는 대조군과 비교하여 통계학적으로 별다른 차이가 없었다.
이들 결과(UFC/㎖)는 표 1에 도시한다:
| 생쥐군 | 폐 | 비장 |
| 대조 | 7.5 ± 2.89 | 0.75 ± 0.33 |
| 비강내 | ≤ 2 ± 0* | 0.4 ± 0.2 |
| 복강내 | ≤ 2 ± 0* | 0.52 ± 0.44 |
| * 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 수치, p<0.05 | ||
이소니아지드와 동시에 비강내와 복강내 투여된 본 발명의 리포좀성 면역치료제로 처리된 동물은 항생제 이소니아지드 단독으로 처리된 생쥐보다 폐에서 바실러스의 총수가 현저하게 낮음을 확인할 수 있다.
확립된 바실러스의 총수가 모든 바실러스, 다시 말하면, 활성 상태에 있는 바실러스와 비-활성 상태에 있는 바실러스를 모두 포함한다는 점을 고려하면, 본 발명의 리포좀성 면역치료제로 처리는 항생제 처리 횟수를 감소시킬 수 있는데, 그 이유는 본 발명의 리포좀성 면역치료제가 시간이 흐름에 따라 활성 상태로 변하게 되는 바실러스의 숫자를 현저하게 감소시키기 때문이다.
II) 리팜피신과 이소니아지드로 처리이후 리포좀성 면역치료제의 3회 투약으로 처리
감염된 129/Sv-유형 생쥐는 2가지 군으로 분할하였다:
- 4주 동안 주 5일간 일일 25 ㎎/㎏의 이소니아지드 1회 투약 및 4주 동안 주 5일간 일일 10 ㎎/㎏의 리팜피신 1회 투약으로 처리됨(대조), 또는
- 리팜피신과 이소니아지드로 처리이후, 피하 투여된 180 ㎍의 본 발명의 리포좀성 면역치료제의 3회 투약으로 처리됨.
항생제 이소니아지드 처리는 9주에 시작하고 4주 동안 지속하였다. 리팜피신 처리는 13주에 시작하고 17주에 종결하였다.
본 발명의 리포좀성 면역치료제는 3회(17주, 19주, 21주) 투여하였다.
22주에, 이들 동물은 희생시키고, 좌측 폐와 비장에서 바실러스 농도를 측정하였다.
바실러스 농도는 대조군과 비교하여 예방접종된 동물의 폐에서 유의하게 낮은 반면, 비장에서는 대조군 생쥐와 리포좀성 면역치료제로 추가 처리된 생쥐 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
이들 결과(log10UFC/㎖)는 표 2에 도시한다:
| 생쥐군 | 폐 | 비장 |
| 대조 | 2.67 ± 0.83 | 2.35 ± 1.18 |
| 피하 | 1.61 ± 0.58* | 1.37 ± 1.02 |
| * 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 수치, p<0.05 | ||
항생제 이소니아지드와 리팜피신으로 처리이후, 피하 투여된 본 발명의 리포좀성 면역치료제로 처리된 생쥐는 항생제 단독으로 처리된 생쥐보다 폐에서 바실러스의 총수가 현저하게 낮음을 확인할 수 있다.
섹션 I과 동일한 결론이 본 사례에 적용된다.
III) 이소니아지드와 동시에 리포좀성 면역치료제의 3회 투약으로 처리
감염된 C57BL/6-유형 생쥐는 2가지 군으로 분할하였다:
- 8주 동안 주 5일간 일일 25 ㎎/㎏의 이소니아지드 단독의 1회 투약으로 처리됨(대조), 또는
- 비강내 투여된 180 ㎍의 본 발명의 리포좀성 면역치료제의 3회 투약으로 동시 처리됨.
항생제 이소니아지드 처리는 9주에 시작하고 17까지 지속하였다.
본 발명의 리포좀성 면역치료제는 3회(13주, 15주, 17주) 투여하였다.
이들 동물은 15주와 28주에 희생시키고, 좌측 폐와 비장에서 바실러스 농도를 측정하였다.
바실러스 농도는 대조군과 비교하여 1회 또는 3회 투약(각각 15주와 28주에 해당)이후 예방접종된 동물의 폐에서 유의하게 낮았다.
면역치료제의 1회 투약(15주)과 3회 투약(28주)이후 폐에서 달성된 결과(log10UFC/㎖)는 표 3에 도시한다:
| 생쥐군 | 15주(1회 투약) | 28주(3회 투약) |
| 대조 | 2.34 ± 0.24 | 3.86 ± 0.41 |
| 비강내 | 1.59 ± 0.61* | 3.48 ± 0.18* |
| * 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 수치, p<0.05 | ||
항생제 이소니아지드 처리와 동시에, 비강내 투여된 본 발명의 리포좀성 면역치료제의 1회 투약으로 처리된 생쥐는 항생제 단독으로 처리된 생쥐보다 폐에서 바실러스의 총수가 현저하게 낮음을 확인할 수 있다.
섹션 I과 동일한 결론이 본 사례에 적용된다.
비장의 경우, 바실러스 농도는 대조군과 비교하여 3회 투약(28주에 해당)이후 예방접종된 동물의 폐에서 유의하게 낮았다.
비장에서 달성된 결과(log10UFC/㎖)는 표 4에 도시한다:
| 생쥐군 | 15주 | 28주 |
| 대조 | 1.47 ± 0.44 | 3.84 ± 0.48 |
| 비강내 | 1.41 ± 0.58 | 3.43 ± 0.29* |
| * 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 수치, p<0.05 | ||
항생제 이소니아지드 처리와 동시에, 비강내 투여된 본 발명의 리포좀성 면역치료제의 3회 투약으로 처리된 생쥐는 항생제 단독으로 처리된 생쥐보다 폐에서 바실러스의 총수가 현저하게 낮음을 확인할 수 있다.
섹션 I과 동일한 결론이 본 사례에 적용된다.
IV) 항생제, 리포좀성 면역치료제, 이들간 조합의 효과를 연구하는 비교 시험
표 5에 도시된 조건하에 22 요인 설계(factorial design)이후, DBA/2 생쥐에서 여러 시험을 수행하였다:
| 시험 | 항생제 | 리포좀성 면역치료제 |
| 1 | No | No |
| 2 | Yes | No |
| 3 | No | Yes |
| 4 | Yes | Yes |
시험 1에서, 감염된 생쥐는 어떤 처리도 하지 않았다.
시험 2에서, 감염된 생쥐는 감염이후 9주부터, 4주 동안 주 5일간 일일 25 ㎎/㎏의 이소니아지드 1회 투약 및 4주 동안 주 5일간 일일 10 ㎎/㎏의 리팜피신 1회 투약으로 처리하였다.
시험 3에서, 감염된 생쥐는 감염이후 9주, 11주, 15주에 피하 투여된 180 ㎍의 본 발명의 리포좀성 면역치료제의 3회 투약으로 처리하였다.
시험 4에서, 항생제 이소니아지드 처리는 9주에 시작하고 4주 동안 지속하였다. 리팜피신 처리는 13주에 시작하고 17주에 종결하였다. 본 발명의 리포좀성 면역치료제는 3회(17주, 19주, 21주) 투여하였다.
22주에, 이들 동물은 희생시키고, 좌측 폐에서 바실러스 농도를 측정하였다. 폐에서 달성된 결과(log10UFC/㎖)는 표 6에 도시한다:
| 시험 | 항생제 | 리포좀성 면역치료제 | log10UFC/㎖ |
| 1 | No | No | 5.37 ± 0.27 |
| 2 | Yes | No | 3.29 ± 0.8* |
| 3 | No | Yes | 5.69 ± 0.22 |
| 4 | Yes | Yes | 0.69 ± 0** |
| * 시험 1, 3, 4와 비교하여 통계학적으로 유의한 수치, p<0.05 ** 시험 1, 2, 3과 비교하여 통계학적으로 유의한 수치, p<0.05 |
|||
항생제 이소니아지드와 리팜피신 및 본 발명의 리포좀성 면역치료제의 복합 치료는 다른 2가지 요인(항생제와 리포좀성 면역치료제) 단독에서 관찰되는 감소와 비교하여, 바실러스 총수에서 현저하게 높은 감소를 유도한다는 것을 확인할 수 있다.
확립된 바실러스의 총수가 모든 바실러스, 다시 말하면, 활성 상태에 있는 바실러스와 비-활성 상태에 있는 바실러스를 모두 포함한다는 점을 고려하면, 다른 약물과 공동으로 본 발명의 리포좀성 면역치료제로 처리는 이들 약물의 처리 횟수를 감소시킬 수 있는데, 그 이유는 본 발명의 리포좀성 면역치료제가 시간이 흐름에 따라 활성 상태로 변하게 되는 바실러스의 숫자를 현저하게 감소시키기 때문이다.
Claims (12)
- 항결핵 약물과 함께 결핵 복합 치료를 위하여 악성 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis-complex)(MTB-C) 균주로부터 유래된 세포벽 단편을 함유하는 면역 치료제를 수득하는 방법에 있어서, 면역치료제를 수득하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:- 최소한 3주의 기간동안 악성 MTB-C 균주를 배양하는 단계;- 비-이온성 표면활성(tensioactive) 화합물의 존재하에 세포 배양액을 균질화시키는 단계.
- 제 1항에 있어서, 배양 기간은 3주 내지 4주인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 비-이온성 표면활성 화합물은 알킬페놀 에톡실레이트 기 또는 에톡실화된 솔비탄 에스테르에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 비-이온성 표면활성 화합물은 옥틸페놀 에톡실레이트 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 비-이온성 표면활성 화합물은 7-8 mol의 산화에틸렌을 보유하는 옥틸페놀 에톡실레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 균질화는 중성 pH를 보유하는 완충 매체에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 아래의 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법:- 비-단편화된 세포 및 용해된 화합물을 원심분리로 분리하는 단계;- 세포벽 단편을 보유하는 분획물을 화학적으로 또는 물리적으로 처리하여 남아있는 악성 균주 세포를 불활화시키는 단계;- 획득된 면역치료제를 냉동 건조시키는 단계.
- 항결핵 약물과 함께 결핵 복합 치료를 위하여 제 1항에 따른 방법으로 수득된 면역치료제.
- 결핵의 복합 치료를 위하여, 다른 항결핵 약물과 함께 제 8항에 따른 면역치료제를 함유하며, 이때 상기 항결핵 약물은 이소니아지드(isoniazid) 또는 리팜피신(rifampicin) 또는 이둘 모두인, 제약학적 조성물.
- 제 9항에 있어서, 리포좀 형태로 면역치료제를 함유하는 것을 특징하는 제약학적 조성물.
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