KR101144885B1 - 에스트로겐, 다이옥신, 및 이들의 유사물질 검출용 이중바이오센서 및 이의 용도 - Google Patents

에스트로겐, 다이옥신, 및 이들의 유사물질 검출용 이중바이오센서 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 검출하는 형질전환 세포주를 이용한 바이오센서 및 그의 효능에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1개 이상의 에스트로겐 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제1의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 1개 이상의 다이옥신 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제2의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 모두 포함하는 형질전환 세포주를 이용하여 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 그리고 신속하게 검출할 수 있는 바이오센서 및 그의 효능에 관한 것이다.
에스트로겐, 다이옥신, 바이오센서

Description

에스트로겐, 다이옥신, 및 이들의 유사물질 검출용 이중 바이오센서 및 이의 용도{DUAL BIOSENSOR FOR DETECTING ESTROGEN, DIOXIN, AND DERIVATIVES THEREOF AND USES THEREOF}
본 발명은 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 그리고 신속하게 검출할 수 있는 바이오센서 및 그의 효능에 관한 것이다.
에스트로겐 (Estrogen)은 인간의 생리적 기능에 중요한 역할을 하는 내인성 호르몬으로, 여성의 생식 또는 성조직의 기능에 영향을 주며, 유방암 및 자궁암 형성과 관련되어 있고, 또한 최근에는 이러한 기능 외에 다수의 항상성 기능을 갖는다고 알려져 있다.
환경 중에는 상기 에스트로겐과 매우 유사하며 사람 또는 동물의 내분비계에 치명적인 영향을 미치는 화학물질이 존재하는데, 이러한 화합물질로는 염소성 살충제, 동물용 건강제품, 플라스틱, 연소시 생산된 부산물, 항균제, 제초제와 같은 공업용 화학물질 등이 있다. 이러한 화학물질은 호르몬 수용체의 결합부위를 점령하여 생체내 호르몬과 동일하게 작용하거나, 호르몬과 경합(competition)하여 그 작 용을 방해하거나, 또는 호르몬의 합성이나 사이토크롬(cytochrome) P450 등의 대사효소 작용을 방해하여 그 농도를 변화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 화학물질은 여러 호르몬 중 성호르몬 즉, 에스트로겐에 의한 체내 조절계의 혼란을 야기시켜 야생생물 및 인간의 생식에 악영향을 미치는 심각한 문제를 유발하게 된다.
다이옥신(Dioxin)은 인류가 만들어낸 환경 호르몬 중 그 독성 및 위험성이 매우 높은 화학물질로서, 통상적으로 다이옥신류를 일컫는다.
다이옥신은 인위적으로 제조되거나 사용되는 물질은 아니며, 제초제, 살충제, 방부제 등을 제조하는 과정에서 불순물로 생성되거나, 제지 산업에서 펄프를 소독하는 과정, 금속을 정련하는 과정에서 부산물로 생성되며, 염소나 브롬을 함유하는 산업공정 또는 염소가 함유되어 있는 화합물을 소각하는 과정에서 생성된다(Hutzinger, O. et al., Chemospere, 14, 581, 1995). 다이옥신은 화학적으로 매우 안정된 구조를 지니므로 화학적 방법이나 생물학적 방법 즉, 미생물에 의한 분해가 거의 일어나지 않는 반면, 비산재, 토양, 하천 퇴적물 등에 흡착하여 환경 중에 오랜 기간 남아있게 되고, 환경 중에 존재하는 다이옥신은 다시 생물체에 유입되어 생물체내에서 거의 대사되지 않으며 지질친화성이 높기 때문에 지방조직에 녹아 생체내에 지속적으로 축적되어 최종 소비자인 인간에게서 가장 높은 농도로 축적하게 된다(Cook, P.M., Banbury Reports 35, cold Spring Harber, NY, 193, 143).
이에, 본 발명자들은 본 발명에 앞선 발명에서 환경시료 중에 존재하는 에스 트로겐 유사물질 및 다이옥신의 유사물질을 분석하기 위한 생물학적 분석방법으로, 리포터 유전자가 결합된 에스트로겐 반응 인자 및 리포터 유전자가 결합된 다이옥신 반응 인자를 각각 포함하는 리포터 벡터를 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제조 및 이를 이용한 환경시료 중에 존재하는 에스트로겐 및 다이옥신의 유사물질을 분석하는 방법을 이미 개발한 바 있다(대한민국 등록특허 제10-0334130호 및 대한민국 등록특허 제10-0355301호).
따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 앞선 발명에서 제조한 리포터 벡터 내에 삽입된 에스트로겐 반응 인자 및 다이옥신 반응 인자의 유도 효율을 증진시키고, 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 검출할 수 있는 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 기술적 과제는 상기 형질전환 세포주를 이용한 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질 동시검출용 바이오센서를 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 기술적 과제는 상기 바이오센서를 이용한 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 기술적 과제는 상기 바이오센서를 이용한 에스트로겐 또는 에스트로겐 유사물질의 억제제, 및 다이옥신 또는 다이옥신 유사물질의 억제제를 동시에 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 1개 이상의 에스트로겐 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제1의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 1개 이상의 다이옥신 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제2의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 모두 포함하는 형 질전환 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 이용한 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질 동시검출용 바이오센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 이용한 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 이용한 에스트로겐 또는 에스트로겐 유사물질의 억제제, 및 다이옥신 또는 다이옥신 유사물질의 억제제를 동시에 스크리닝하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
'바이오센서(Biosensor)'라 함은 효소나 항체 등 생물체의 기능물질 또는 미생물 등 생물체가 특정 물질과 예민하게 반응하는 생물 감지 기능을 이용하여 시료에 함유되어 있는 화학물질을 선택적으로 검출하거나 계측할 수 있는 센서를 의미한다. '이중 바이오센서'라 함은 2가지 이상의 서로 다른 특징을 가진 유해물질을 동시에 검출할 수 있는 바이오센서를 의미한다.
바이오센서는 감지 기능을 하는 검지소자의 종류에 따라 효소센서, 항체센서, 미생물센서 등으로 분류되며, 이 중 살아있는 미생물을 검지소자로서 막 등에 고정?장치하여 사용하는 미생물센서는, 알코올 발효나 글루탐산 발효 등 발효공업의 공정 관리, 수질 오염의 지표인 BOD(생물학적 산소요구량)의 측정 등에 이용되고 있다.
최근에는 특정 미생물 세포를 바이오센서의 구성요소로서 이용하는 미생물 바이오센서를 이용하는 기술이 연구되고 있다. 미생물 바이오센서는 실시간 분석, 조작의 간편성, 휴대가능성, 민감성 및 특이성이 우수하므로 널리 관심의 대상이 되고 있으며, 일반적으로 흡착(adsorption), 포획(entrapment), 공유결합(covalent bond), 가교결합(cross-linking) 또는 상기 방법의 조합이 생체물질의 고정에 이용되는데, 살아있는 세포를 이용할 경우 포획이나 흡착 방법이 유용하다.
따라서, 본 발명에서는 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 검출하는데 있어서 상기와 같은 특징을 가진 미생물 세포, 바람직하게는 에스트로겐 또는 이의 유사물질이 결합하는 에스트로겐 수용체; 및 다이옥신 또는 이의 유사물질이 결합하는 다이옥신 수용체가 모두 존재하는 인간 유방암 세포주를 이용할 수 있고, 이때 상기 유방암 세포주는 에스트로겐 및 다이옥신의 유사물질에 의해 발현되는 유전자 서열 즉, 에스트로겐 수용체가 인지하는 유전자 서열인 에스트로겐 반응 인자(Estrogen Responsive Element, ERE)(Wilson et al., 2004), 및 다이옥신 수용체가 특이적으로 인지하는 유전자 서열인 다이옥신 반응 인자(Dioxin Responsive Element, DRE) (Garrison et al., 1996)를 상기 두 유사물질을 검출하는 검지소자로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 본 발명에 앞서 대한민국등록특허 제10-0334130호 및 대한민국등록특허 제10-0355301호에서 환경시료 중에 존재하는 에스트로겐 및 다이옥신의 유사물질을 분석하기 위한 생물학적 분석방법을 이미 개발한 바 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 선행문헌을 기초로 하여 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 그리고 보다 신속하게 검출할 수 있는 방법을 찾고자 연구한 끝에, 하나의 세포주 안에 1개 이상의 에스트로겐 반응 인자(Estrogen Responsive Element, ERE), 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제1의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 그리고 1개 이상의 다이옥신 반응 인자(Dioxin Responsive Element, DRE), 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제2의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 모두 포함하는 형질전환 세포주를 제조하고, 상기 형질전환 세포주를 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 그리고 신속하게 검출할 수 있는 바이오센서로 이용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 1개 이상의 에스트로겐 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제1의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 1개 이상의 다이옥신 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제2의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 모두 포함하는 형질전환 세포주를 제공한다. 상기 각 재조합 벡터 내에 삽입된 제1의 리포터 유전자와 제2의 리포터 유전자는 서로 상이한 리포터 유전자를 이용하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "에스트로겐 반응 인자"는 에스트로겐 수용체가 인지하는 11 개의 보존서열(consensus sequence; GGTCACAGTGACC, 서열번호 1)일 수 있으며, 상기 보존서열의 본래의 작용에 영향을 주지 않는 한 상기 보존서열의 N-말단과 C-말단에 각각 1 내지 10 개, 바람직하게는 2 내지 5 개의 올리고뉴클레오타이드 서열이 연결된 것일 수 있다.
또한, "다이옥신 반응 인자"는 다이옥신 수용체가 인지하는 6 개의 보존서 열(consensus sequence; CACGC(A or T), 서열번호 2 또는 서열번호 3)일 수 있으며, 상기 보존서열의 본래의 작용에 영향을 주지 않는 한 상기 보존서열의 N-말단과 C-말단에 각각 1 내지 10 개, 바람직하게는 2 내지 5 개의 올리고뉴클레오타이드 서열이 연결된 것일 수 있다.
상기 프로모터는 사용되는 숙주 세포에서 작동 가능한 프로모터가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 인핸서 부위가 제거된 최소 프로모터, SV 40 최소 프로모터 및 HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 "인핸서"는 전사인자(transcriptional factor)들이 결합하는 전사조절서열을 일컬으며, 상기 "최소 프로모터"는 전사개시복합체를 형성하는데 필요한 최소의 서열로 구성된 프로모터를 일컫는다. 즉, 상기 최소 프로모터는 다른 전사조절서열, 즉 인핸서를 갖지 않는다. 따라서, 상기 인핸서 부위가 없는 최소 프로모터를 사용하는 경우, 리포터 유전자의 전사활성 수준은 최소 프로모터의 상부(upstream)에 인접한 인핸서 또는 시스-엘리먼트의 활성에 의해서만 결정되기 때문에, 본 발명의 바람직한 구체예에서는 상기 인핸서 또는 시스-엘리먼트와 유사한 기능을 수행하는 에스트로겐 반응 인자 및 다이옥신 반응 인자의 효과를 분석함에 있어서, 상기와 같은 최소 프로모터를 사용함으로써 상기 리포터 유전자의 전사활성에 영향을 미치는 다른 요소의 효과를 완전하게 차단할 수 있게 된다. 이는, 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질에 의해 유도된 본 발명의 에스트로겐 반응 인자 및 다이옥신 반응 인자의 전사활성을 보다 정확하게 측정하기 위함이다.
또한, 상기 리포터 유전자는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 특정 위치 유전자의 발현 여부를 확인 가능하게 하는 유전자로서 루시퍼라제, 형광단백질 및 광단백질로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있고, 바람직하게는 상기 루시퍼라제는 반딧불(Firefly) 루시퍼라제, 바다팬지(Renilla) 루시퍼라제 및 가우시안(Gaussian) 루시퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(Green Fluorescence Protein), 황색형광단백질(Yellow Fluorescence Protein) 및 적색형광단백질(Red Fluorescence Protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 상기 광단백질은 클리틴(Clytin), 에쿼린(Aequorin), 탈라시콜린(Thalassicolin), 미토크로민(Mitocromin), 네미옵신(Mnemiopsin) 및 베로빈(Berovin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 검출할 수 있도록 상기 리포터 유전자 중 2개를 선택하여 이용할 수 있으며, 일 예로서 본 발명의 바람직한 실시예에서는 반딧불(Firefly) 루시퍼라제 유전자와 바다팬지(Renilla) 루시퍼라제 유전자를 각각 이용하였다.
본 발명의 형질전환체로 사용가능한 세포주는 에스트로겐 또는 이의 유사물질이 결합하는 에스트로겐 수용체; 및 다이옥신 또는 이의 유사물질이 결합하는 다이옥신 수용체가 존재하는 식물 또는 동물 세포일 수 있고, 바람직하게는 상기 두 수용체를 모두 포함하는 있는 세포인 유방암, 자궁암, 난소암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간 유방암 세포주인 MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, SK-BR-3 및 T47D로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 본 발명의 일 예로서는 상기 MCF-7를 이용할 수 있다.
또한, 상기 에스트로겐 반응 인자 및 다이옥신 반응 인자는 각각 그 복제수(copy number)가 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질 처리에 따른 리포터 벡터의 발현 효율을 증가시키기 위하여 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개, 더욱 바람직하게는 3개인 것이 좋다. 이는, 생물학적 기능을 조절하는 많은 전사인자들은 이들의 목적 유전자의 발현을 유도하기 위하여 유전자 내에 존재하는 특정 프로모터의 반응인자에 결합하게 되는데, 이때 이러한 반응인자의 복제수(copy number)는 목적 유전자의 발현 양상과 밀접하게 연관되어 있고, 특히 반응인자의 복제수가 3개 이상일 경우 우수한 발현 효율을 줄 수 있기 때문이다(ASSAY and Drug Development Technologies, Chunfai Lai et al., vol 4, number 3, 307-315, 2006; J. Invest. Dermatol., 120, 308-312, 2003). 상기 반응인자의 "복제수"란 반응인자가 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터에 연속적으로 연결되어 있는 수를 의미한다.
본 발명에서는 상기 형질전환 세포주를　2007년 10월 9일 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11210BP를 부여받았다.
또한, 본 발명은 1개 이상의 에스트로겐 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 리포터 유전자를 포함하는 리포터 유전자 벡터; 및 1개 이상의 다이옥신 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 리포 터 유전자를 포함하는 리포터 유전자 벡터를 모두 포함하는 형질전환 세포주를 포함하는 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질 동시검출용 바이오센서를 제공한다.
상기 에스트로겐 유사물질은 폴리클로리네이티드 바이페닐류(Polychlorinated biphenyls; PCBs), 2,2',4,6,6'-펜타클로로바이페닐(Pentachlorobiphenyl), 노닐 페놀(Nonyl phenol), p-노닐페놀(p-Nonyl phenol), 비스페놀 A(Bis phenol A), p,p'-DDT(p,p'-Bis(4-chlorophenyl)-2,2,2-trichloroethane), 프탈레이트류(Phthalates), 프탈레이트 에스테르(Phthalate ester), 페스티사이드(Pesticide) 및 파이토에스트로겐(phytoestrogen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물일 수 있으며,
상기 다이옥신 유사물질은 폴리클로리네이티드 디벤조다이옥신류(polychlorinated dibenzo-dioxins; PCDDs), 폴리클로리네이티드 디벤조퓨란류(Polychlorinated dibenzo-furans; PCDFs), 폴리클로리네이티드 바이페닐류(PCBs), 폴리사이클릭 아로마틱 하이드로카본류(Polycyclic aromatic hydrocarcons; PAHs), 플라보노이드류(Flavonoids) 및 페스티사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되어 있는 것은 아니며, 환경 시료중에 존재하는 에스트로겐 및 다이옥신과 유사한 기능을 갖는 화합물을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 1개 이상의 에스트로겐 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프 로모터 및 제1의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 1개 이상의 다이옥신 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제2의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 모두 포함하는 형질전환 세포주를 배양한 후 리포터 유전자의 발현량을 측정하는 단계;
2) 배양된 상기 형질전환 세포주에 에스트로겐 후보물질과 다이옥신 후보물질을 첨가한 후, 리포터 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및
3) 상기 단계 1) 및 2)에서 측정된 리포터 유전자의 발현량을 비교하여 단계 2)의 값이 증가하는 경우, 상기 후보물질을 각각 에스트로겐 유사물질 및 다이옥신 유사물질로 판정하는 단계를 포함하는, 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
상기 검출 방법에서, 단계 3)의 에스트로겐 유사물질은 에스트로겐 유사물질은 폴리클로리네이티드 바이페닐류(Polychlorinated biphenyls; PCBs), 2,2',4,6,6'-펜타클로로바이페닐(Pentachlorobiphenyl), 노닐 페놀(Nonyl phenol), p-노닐페놀(p-Nonyl phenol), 비스페놀 A(Bis phenol A), p,p'-DDT(p,p'-Bis(4-chlorophenyl)-2,2,2-trichloroethane), 프탈레이트류(Phthalates), 프탈레이트 에스테르(Phthalate ester), 페스티사이드(Pesticide) 및 파이토에스트로겐(phytoestrogen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물일 수 있으며,
단계 3)의 다이옥신 유사물질은 다이옥신 유사물질은 폴리클로리네이티드 디벤조다이옥신류(polychlorinated dibenzo-dioxins; PCDDs), 폴리클로리네이티드 디 벤조퓨란류(Polychlorinated dibenzo-furans; PCDFs), 폴리클로리네이티드 바이페닐류(PCBs), 폴리사이클릭 아로마틱 하이드로카본류(Polycyclic aromatic hydrocarcons; PAHs), 플라보노이드류(Flavonoids) 및 페스티사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 1개 이상의 에스트로겐 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제1의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 1개 이상의 다이옥신 반응 인자, 이와 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 및 제2의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 모두 포함하는 형질전환 세포주를 배양한 후 에스트로겐 유사물질 및 다이옥신 유사물질을 첨가하여 리포터 유전자의 발현량을 측정하는 단계;
2) 배양된 상기 형질전환 세포주에 에스트로겐의 억제제 후보물질과 다이옥신의 억제제 후보물질을 첨가한 후, 리포터 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및
3) 상기 단계 1) 및 2)에서 측정된 리포터 유전자의 발현량을 비교하여 단계 2)의 값이 감소하는 경우, 상기 후보물질을 각각 에스트로겐 유사물질의 억제제 및 다이옥신 유사물질의 억제제로 판정하는 단계를 포함하는, 에스트로겐 또는 에스트로겐 유사물질의 억제제, 및 다이옥신 또는 다이옥신 유사물질의 억제제를 동시에 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에서, 단계 3)의 에스트로겐 또는 에스트로겐 유사물질의 억제제는 ICI 182,780, 바제독시펜 아세테이트(Bazedoxifene acetate), 풀베스트란 트(Fulvestrant) 및 타목시펜(Tamoxifen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되어 있는 것은 아니며, 에스트로겐 수용체를 억제할 수 있는 화합물은 모두 포함할 수 있다.
또한, 단계 2)의 다이옥신 또는 다이옥신 유사물질의 억제제는 2-메틸(methyl)-2H-피라졸(pyrazole)-3-카르복시산(carboxylic acid)(2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)-amide (CH-223191), 알파-나프토플라본(Alpha-naphthoflavone), 레스베라트롤(Resveratrol) 및 3'-메톡시(methoxy)-4'-니트로플라본(nitroflavone) 및 비오차닌 A(Biochanin A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 다이옥신 수용체 즉, 아릴 탄화수소 수용체(Aryl hydrocarbon receptor)를 억제할 수 있는 화합물은 모두 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질을 동시에 검출하는 생물학적 바이오센서는 조작이 간편하고, 비용이 저렴하며, 감도가 높고, 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질의 동시 검색이 가능하며, 에스트로겐 또는 이의 유사물질, 및 다이옥신 또는 이의 유사물질에 의한 세포독성뿐 아니라 서로 다른 작용 기전을 가진 유사물질들간의 상호작용을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발 명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 재조합 리포터 벡터의 제조
양 말단에 제한효소 절단부위인 Kpn I과 Hind III를 가지고 있고 에스트로겐 수용체가 인지하는 에스트로겐 수용체 내의 유전자 부위인 서열번호 1(GGTCACAGTGACC)의 올리고뉴클레오타이드 서열을 갖는 에스트로겐 반응 인자(Estrogen Responsive Element, ERE) 1개 또는 연속적으로 3개가 연결된 부위(Wilson et al., 2004)를 각각 제한효소 Kpn I과 Hind III로 절단한 pGL4.18[luc2P/Neo] 벡터(Promega, 미국)의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site)에 클로닝하여 재조합 리포터 벡터인 pGL4.18(ERE)-Firefly-Luc 및 pGL4.18(ERE)3-Firefly-Luc 벡터를 제조하였다(도 1a 및 1b). 상기 에스트로겐 반응 인자는 Klein-Hitpass 등의 논문을 토대로 하여 합성한 올리고뉴클레오타이드 서열이다(Klein-Hitpass, et al., Nucleic Acids Res., 16, 647-663, 1988).
또한, 양 말단에 제한효소 절단부위인 Kpn I과 Hind III를 가지고 있고 다이옥신 수용체가 인지하는 다이옥신 수용체 내의 유전자 부위인 서열번호 2(CACGCA) 또는 서열번호 3(CACGCT)의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 다이옥신 반응 인자(Dioxin Responsive Element, DRE) 1개 또는 연속적으로 3개가 연결된 부위(Garrison et al., 1996)를 각각 제한효소 Kpn I과 Hind III로 절단한 pGL4.77[hRlucP/Hygro] 벡터(Promega, 미국)의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site)에 클로닝하여 재조합 리포터 벡터인 pGL4.77(DRE)-Renilla-Luc 및 pGL4.77(DRE)3-Renilla-Luc 벡터를 제조하였다(도 2a 및 2b). 상기 다이옥신 반응 인자는 Fujjsawa-Sehara A. 등의 논문을 토대로 하여 합성한 올리고뉴클레오타이드 서열이다(Fujjsawa-Sehara A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85(16), 5859-5863, 1988).
실시예 2: 형질전환 인간 유방암 세포주 제조
2-1: 인간 유방암 세포주 배양
인간 유방암 세포주인 MCF-7(ATCC)를 10% 소혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 RPMI 1640 배양액(Roswell Park Memorial Institute 1640 medium, Gibco, 미국)으로 37℃, 5% 이산화탄소가 유지되는 세포 배양기에서 배양하였다.
2-2: pGL4 .18( ERE )3- Firefly - Luc 및 pGL4 .77( DRE )3- Renilla - Luc 리포터 벡터로 형질전환된 형질전환 세포주 제조
실시예 2-1에서 배양한 인간 유방암 세포주 MCF-7(2×105 cells/ml)에 상기 실시예 1에서 제조한 2 ug의 pGL4.18(ERE)3-Firefly-Luc 리포터 벡터와 10 ul의 리포펙타민(2.4 mg/mL)(Invitrogen, 미국)을 이용하여 형질감염시켰다. 특히, 상기 리포터 벡터에는 형질전환된 세포를 용이하게 선별할 수 있도록 네오마이신 내성 유전자를 포함하고 있기 때문에, 상기 형질감염된 세포를 37℃, 5% 이산화탄소 조 건하에서 48시간 동안 배양한 후, 750 ㎍/ml의 G418 (네오마이신)(Calbiochem, 미국)을 처리하여 상기 벡터로 형질전환되지 않은 세포를 제거하였다.
상기 형질전환 세포주의 선별 방법으로, 단일 세포가 만든 세포군을 얻어 96-웰 플레이트에 옮겨 증식시킨 후, 세포수가 증가하면 각 세포군을 두 개의 새로운 웰에 나누고 0.1% DMSO, 1 nM 에스트로겐(17beta-estradiol, Sigma, 미국)을 각각 24시간 동안 처리한 다음 세포 단백질을 수득하였다. 수득된 단백질의 루시퍼라제 효소 활성을 측정하여 pGL4.18(ERE)3-Firefly-Luc 벡터가 형질전환된 세포주를 선별하였다.
상기에서 1차적으로 선별된 형질전환 세포주(2×105 cells/ml)는 다시 실시예 1에서 제조한 2 ug의 pGL4.77(DRE)3-Renilla-Luc 리포터 벡터와 2 ul의 리포펙타민(2.4 mg/mL)(Invitrogen, 미국)를 이용하여 형질감염시켰고, 상기 리포터 벡터내에 존재하는 하이그로마이신 내성 유전자를 이용한 선별 방법 즉, 상기 형질감염된 세포를 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 48시간 동안 배양한 후, 500 ㎍/ml의 하이그로마이신(Calbiochem, 미국)을 처리함으로써 상기 벡터로 형질전환되지 않은 세포를 제거하였다.
상기 형질전환 세포주의 선별 방법은 1 nM(네오마이신, Calbiochem, 미국) 대신 1 nM 다이옥신(TCDD, Chembridge Isotope, 미국)을 처리하는 것을 제외하고는, 상기 pGL4.18(ERE)3-Firefly-Luc 벡터가 형질전환된 세포주의 선별 방법과 동일하게 수행하였다.
한편, 본 발명의 실시예에서는 1개의 에스트로겐 반응 인자를 포함하는 pGL4.18(ERE)-Firefly-Luc 리포터 벡터 및 1개의 다이옥신 반응 인자를 포함하는 pGL4.77(DRE)-Renilla-Luc 리포터 벡터를 각각 형질전환시킨 형질전환 세포주를 상기와 동일한 방법으로 선별하였다.
특히, 본 발명자들은 상기 pGL4.18(ERE)3-Firefly-Luc 및 pGL4.77(DRE)3-Renilla-Luc 리포터 벡터를 모두 포함하는 형질전환 세포주를 MCF-7(DRE/ERE) 동물 세포주로 명명하였고, 상기 세포주를　2007년 10월 9일 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11210BP를 부여받았다.
실시예 3: 에스트로겐 및 다이옥신의 처리에 따른 루시퍼라제 효소활성 비교실험
에스트로겐에 의해 발현되는 pGL4.18(ERE)3-Firefly-Luc 리포터 벡터 및 다이옥신에 의해 발현되는 pGL4.77(DRE)3-Renilla-Luc 리포터 벡터가 모두 형질전환된 세포주(이하에서는, '세포주 1'로 칭함), pGL4.18(ERE)-Firefly-Luc 리포터 벡터로 형질전환된 세포주(이하에서는, '세포주 2'로 칭함) 및 pGL4.77(DRE)-Renilla-Luc 리포터 벡터로 형질전환된 세포주(이하에서는, '세포주 3'으로 칭함)의 에스트로겐 및 다이옥신이 처리에 따른 루시퍼라제 효소활성을 비교하기 위하여, 상기 세포주 1, 세포주 2, 및 세포주 3을 각각 1×104 cells/ml의 농도로 96-웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양한 다음, 0.1% DMSO에 각각 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 nM 농도로 희석하여 용해시킨 에스트로겐(17beta-estradiol, Sigma, 미국)과 다이옥신(TCDD, Chembridge Isotope, 미국)을 개별적으로 또는 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
배양 후, 배양액을 제거한 다음 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco, 미국)로 2회 세척하였고, 50 ㎕의 분쇄용액(1% Triton X-100, 20 mM Tris HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM DTT)을 첨가하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄된 세포액 중 5 ㎕를 수취하여 25 ㎕의 반딧불(Firefly) 루시퍼라제 기질(Promega, 미국) 및/또는 바다 팬지(Renilla) 루시퍼라제 기질(Promega, 미국)을 혼합한 후 루미노미터를 이용하여 루시퍼라제의 발현량을 측정하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 각각 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 에스트로겐의 처리 농도에 따른 Firefly 루시퍼라제의 발현량에 있어서, 세포주 1(도 3a)은 세포주 2(도 3b)에 비하여 약 3-4 배 정도 루시퍼라제 발현량이 증가됨을 확인할 수 있었고,
도 4에 나타낸 바와 같이, 다이옥신의 처리 농도에 따른 Renilla 루시퍼라제의 발현량에 있어서, 세포주 1(도 4a)은 세포주 3(도 4b)에 비하여 약 4-6 배 정도 루시퍼라제 발현량이 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, Renilla 루시퍼라제 분석 시 에스트로겐에 의해서도 루시퍼라제 발현량이 일부 증가하였는데, 이는 에스트로겐이 다이옥신의 유사 기능을 가지고 있기 때문이다(도 4a).
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 pGL4.18(ERE)3-Firefly-Luc 벡터(도 1a) 및 pGL4.18(ERE)-Firefly-Luc 벡터(도 1b)의 유전자 지도를 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 pGL4.77(DRE)3-Renilla-Luc 벡터(도 2a) 및 pGL4.77(DRE)-Renilla-Luc 벡터(도 2b)의 유전자 지도를 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 에스트로겐 및/또는 다이옥신 처리에 따른 본 발명의 세포주 1(도 3a) 및 세포주 2(도 3b)의 반딧불(Firefly) 루시퍼라제의 발현량을 비교 분석한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 에스트로겐 및/또는 다이옥신 처리에 따른 본 발명의 세포주 1(도 4a) 및 세포주 3(도 4b)의 바다 팬지(Renilla) 루시퍼라제의 발현량을 비교 분석한 그래프이다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> DUAL BIOSENSOR FOR DETECTING ESTROGEN, DIOXIN, AND DERIVATIVES THEREOF <130> DPP-2007-1545-KR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Consensus sequence for Estrogen Response Element(ERE) <400> 1 ggtcacagtg acc 13 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Consensus sequence for Dioxin Response Element(DRE) <400> 2 cacgca 6 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Consensus sequence for Dioxin Response Element(DRE) <400> 3 cacgct 6

Claims (11)

  1. 2 내지 5개의 에스트로겐 반응 인자, 프로모터 및 제1의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및
    2 내지 5개의 다이옥신 반응 인자, 프로모터 및 제2의 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터
    를 모두 포함하고,
    상기 에스트로겐 반응 인자는 서열번호 1의 서열로 구성되고, 프로모터에 2 내지 5개가 연속적으로 연결되어 있고,
    상기 다이옥신 반응 인자는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열로 구성되고, 프로모터에 2 내지 5개가 연속적으로 연결되어 있으며,
    상기 제1의 리포터 유전자와 제2의 리포터 유전자는 서로 상이한 것인,
    형질전환 세포주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라제, 형광단백질 및 광단백질로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자인, 세포주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 기탁번호 KCTC 11210BP인 세포주.
  7. 제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 형질전환 세포주를 포함하는 에스트로겐 및 다이옥신의 동시검출용 바이오센서.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 1) 제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 형질전환 세포주를 배양한 후 리포터 유전자의 발현량을 측정하는 단계;
    2) 배양된 상기 형질전환 세포주에 환경시료를 첨가한 후, 리포터 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및
    3) 상기 단계 1) 및 2)에서 측정된 리포터 유전자의 발현량을 비교하여 단계 2)의 값이 증가하는 경우, 상기 환경시료에 에스트로겐 및 다이옥신이 존재하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는,
    에스트로겐 및 다이옥신을 동시에 검출하는 방법.
  11. 1) 제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 형질전환 세포주를 배양한 후 에스트로겐 및 다이옥신을 첨가하여 리포터 유전자의 발현량을 측정하는 단계;
    2) 배양된 상기 형질전환 세포주에 에스트로겐의 억제제 후보물질과 다이옥신의 억제제 후보물질을 첨가한 후, 리포터 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및
    3) 상기 단계 1) 및 2)에서 측정된 리포터 유전자의 발현량을 비교하여 단계 2)의 값이 감소하는 경우, 상기 후보물질을 각각 에스트로겐의 억제제 및 다이옥신의 억제제로 판정하는 단계를 포함하는,
    에스트로겐의 억제제 및 다이옥신의 억제제를 동시에 스크리닝하는 방법.
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