KR101132395B1 - 시스템 기법을 이용한 비브리오속 미생물의 약물 표적 예측 - Google Patents

시스템 기법을 이용한 비브리오속 미생물의 약물 표적 예측 Download PDF

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Abstract

본 발명은 컴퓨터를 이용해 Vibrio 속 미생물의 약물 표적을 예측하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Vibrio 속 미생물의 대사 네트워/크 모델을 구축한 다음, 쵸크포인트 분석(chokepoint analysis), 필수 효소 반응식 분석 (single enzyme deletion), 필수 대사산물 분석 (metabolite essentiality)의 세 가지 시뮬레이션 방법을 각각 대사 모델에 적용하여 약물 표적들을 예측하고, 나아가 상기 쵸크포인트 및 필수 효소 반응식 중 서로 중복되는 효소 반응식 그룹; 및 상기 필수 대사산물(essential metabolite)을 소비하는 효소 반응식(outgoing reaction) 그룹으로 차기 가능성 있는 후보군으로 수를 줄인 다음, 이들을 다양하게 조합하여 네트워크 구조 분석을 수행한 결과를 평가하여 상기 Vibrio 속 미생물을 효율적으로 제어할 수 있는 이상적인 조합을 예측하는 방법에 관한 것이다.
비브리오, 병원균, 대사흐름분석, 필수 효소 반응식, 필수 대사산물, 쵸크포인트, 약물 표적, 약물 표적 조합

Description

시스템 기법을 이용한 비브리오속 미생물의 약물 표적 예측{Systems-oriented Approach for Predicting Drug Targets in Vibrio family}
본 발명은 컴퓨터 시스템 기법를 이용해 Vibrio 속 미생물의 약물 표적을 예측하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 V. vulnificus의 대사 네트워크 모델을 구축한 다음, 쵸크포인트 분석(chokepoint analysis), 필수 효소 반응식 분석 (single enzyme deletion)및/또는 필수 대사산물 분석 (metabolite essentiality)의 시뮬레이션 방법을 각각 대사 모델에 적용하여 약물 표적들을 예측하는 방법에 관한 것이다.
현재까지 효과적인 항병원성 약물을 개발하기 위한 약물 표적을 찾는 노력이 활발히 진행 중에 있다.
그러나, 지금까지의 방법론은 현재 얻을 수 있는 생명체 정보를 충분히 활용하지 못하고 있다. 어떠한 유전자 산물이 이상적인 약물 표적이 되어 병원성 미생물을 사멸시킬 수 있는지를 확인하는 것은 어려운 일로서 병원성 미생물의 모든 단 일 유전자를 결실시켜가며 해당 유전자의 치사성(lethality)을 확인하는 것은 기술적으로 힘든 일이다. 또한 약물 표적은 대부분 하나의 유전자가 아닌 복잡한 세포 구성 요소간의 상호작용에 의해 결정되며 각각의 유전자는 치사성이 없는 경우에도 복수의 유전자 결실에서 치사성이 나타나는 등 그 조합은 매우 복잡하다.
따라서, 병원성 미생물을 표적으로 삼는 효과적인 약물을 개발하기 위하여 미생물 세포 구성 요소들 간의 세포 기작과 상호작용을 이해하는 것이 매우 중요하다. 이에 게놈정보와 기능 유전체학의 발전을 통한 대사산물과 대사 네트워크의 구축은 세포 구성 요소를 구성하기 위한 유전자와 단백질들의 상호작용을 이해하고 대사 네트워크를 구성하여 효과적인 약물을 개발하는데 있어 그 중요성을 더하고 있다.
실제로 게놈 정보를 통한 대사 네트워크 정보를 이용하여 병원성 미생물에서 포유동물의 세포에서 발견되지 않은 새로운 대사 경로가 동정되는 경우 이러한 대사 특성을 표적으로 삼는 치료법을 개발하여 인체 세포에는 부작용을 유발하지 않으면서 병원성 세포만 특이적으로 공격하는 것이 가능해진다. 한편 병원성 미생물이 생존하는데 특정 대사 경로가 필수적이라는 사실이 규명된 경우 해당 대사 경로를 억제하는 약물을 개발하는 것이 가능하다. 일단 병원성 미생물에 대한 약물이 개발되면 이와 유사한 화합물을 활용해 다른 유사한 병원성 미생물을 억제하는 약물이 쉽게 얻어질 수 있을 것으로 전망된다.
대사 네트워크를 통한 분석 및 예측기술은 최근에야 급속하게 증가하는 게놈정보와 함께 그 가능성을 보이고 있다. 특히 각 미생물의 대사 네트워크 모델들이 수학적 모델 및 최적화 기술 등과 결합되어 유전자의 제거 또는 추가 후에 일어나는 대사 네트워크의 반응을 예측하는 것이 가능해지고 있다 (Lee et al., Trends Biotechnol., 23:349, 2005). 또한 대사 네트워크를 이용한 대사흐름 분석기법은 동적 정보를 필요로 하지 않음에도 세포의 이상적인 대사흐름을 보여주며 실제적으로 세포의 행동을 정확히 모사하고 예측할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Papin, J. et al., Nat . Rev . Mol . Cell Biol ., 6:99, 2005).
대사흐름분석은 생화학 반응식의 질량수지와 세포조성 정보만을 이용하여 세포가 도달 가능한 이상적인 대사 흐름 공간을 구하며 특정한 목적함수를 최적화 방법을 통하여 최대화 하거나 최소화 하는 것을 목적으로 한다(세포성장속도 최대화 또는 특정 섭동에 의한 대사 조절의 최소화 등). 그 밖에, 대사흐름분석은 일반적으로 균주개량을 통하여 원하는 대사산물의 특정 유전자의 치사성을 확인하기 위하여 사용될 수 있으며, 이를 이용하여 균주내부의 대사 네트워크 특성을 파악할 수 있다. 또한, 유전자의 제거 또는 추가에 의해 일어나는 대사 네트워크의 흐름변화 등을 예측하기 위해 대사흐름분석 방법을 응용한 다양한 연구가 보고되고 있다.
병원성 미생물의 한 종류로서 인간에게 다양한 감염증을 일으키는 Vibrio는 통성 혐기성 그람음성 간균으로서 바다와 하구에 존재하며 담수, 강, 연못, 호수에서도 분리된다. Vibrio 속에는 30 균종 이상이 속해있으며 이 중 12 균종이 사람에게 감염을 일으킨다. 장내감염은 V. cholerae와 V. parahaemolyticus가 가장 흔한 원인균이다. 혈액, 창상, 눈, 귀, 담즙 등의 장외감염도 일으킬 수 있으며 우리나라에서는 여름철에 비브리오 패혈증이 종종 발생하는데, 이는 V. vulnificus에 의 해 일어나는 것으로 간경화증, 암 환자 등에서 주로 발생하며 예후가 불량하다고 알려져 있다.
상기 Vibrio vulnificus는 주로 하구에서 발견되며, 인간을 비롯한 다양한 동물 및 해산물을 전염하는 병원균 미생물이다(Gulig et al., J. Mcirobiol ., 43:118, 2005). V. vulnificus에 감염된 해산물을 섭취하거나 인체의 상처 부위가 상기 미생물과 접촉하면 폐혈증, 위장염, 상처감염 등을 일으킬 수 있다. 특히 V. vulnificus은 인체에 감염되면 인체 내에서의 복제 속도가 매우 빠른 것으로 알려져 있다. 상기 병원균에 접촉되면 24시간 이내에 사망할 수 있다. 폐혈증에 의한 사망률은 최고 75%에 달하는 것으로 알려져 있으며, 상처 감염에 의한 사망률은 최고 50%에 이르는 것으로 보고되고 있다.
그러나 현재 상기 병원균에 효과적으로 대처할 수 있는 항생제는 아직 개발되지 않은 것으로 알려져 있으며(전남대 의과대학), 따라서 체계적인 약물 표적 예측 및 그에 따른 항병원성 약물 개발이 시급한 실정이다.
특히, V. vulnificus의 경우 두 균주의 게놈 서열 해독이 완성된 상태(Chen et al., Genome Res ., 13:2577, 2003)이므로, 본 발명자들은 대사흐름분석 기법을 이용하여 부분적인 대사정보를 이용한 균주조작이 아닌 전체적인 관점에서 V. vulnificus의 대사를 살펴보고 특정 유전자에 대한 조작이 전체 대사흐름에 미치는 영향들을 파악하여 병원성 미생물의 약물표적을 정확하게 예측할 수 있는 방법의 개발의 가능성을 발견하였다.
이에 본 발명자들은 V. vulnificus의 대사 네트워크 모델을 구축한 다음, 쵸크포인트(chokepoint)와 대사흐름분석에 기반한 필수 효소 반응식 분석 (single enzyme deletion), 필수 대사산물 분석 (metabolite essentiality)의 세 가지 시뮬레이션 방법을 각각 대사 모델에 적용하여 약물 표적들을 예측하고, 나아가 상기 쵸크포인트 및 필수 효소 반응식 중 서로 중복되는 효소 반응식 그룹; 및 상기 필수 대사산물(essential metabolite)을 소비하는 효소 반응식(outgoing reaction) 그룹으로 차기 가능성 있는 후보군으로 수를 줄인 다음, 이들을 다양하게 조합하여 네트워크 구조 분석을 수행한 결과를 평가하여 상기 Vibrio 속 미생물을 효율적으로 제어할 수 있는 이상적인 조합을 만들 수 있음을 이론적으로 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비브리오(Vibrio ) 속 미생물 대사 네트워크 모델 구조를 바탕으로, 쵸크포인트(chokepoint), 대사흐름분석에 기반한 필수 효소 반응식 분석 (single enzyme deletion) 및/또는 필수 대사산물 분석 (metabolite essentiality)의 세 가지 시뮬레이션을 이용하여 상기 미생물의 약물 표적이 되는 효소 또는 이를 코딩하는 유전자를 스크리닝 하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 수득되는, 비브리오(Vibrio) 속 미생물에 대한 약물 표적 효소들 및 이들을 코딩하는 유전자군들을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는
(a) 비브리오(Vibrio ) 속 미생물의 대사 네트워크 모델을 구축하는 단계;
(b) 상기 구축된 비브리오(Vibrio ) 속 미생물 대사 네트워크에서 특정 대사산물을 유일하게 소비하거나 생산하는 효소들인 쵸크포인트를 약물 표적 효소 후보들 (I)로 선정하는 단계;
(c) 상기 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 효소 반응식들에 대하여 상기 효소 반응식들을 한 개씩 차단시키면서 선형계획법을 적용하였을 때, 세포 성장이 일어나지 않는 경우의 차단된 효소 반응식을 약물 표적 효소 후보들(II)로 선정하는 단계;
(d) 상기 (b)와 (c) 단계에서 얻은 결과인 약물 표적 효소 후보들 (I)과 (II)를 비교하여 중복되는 약물 표적 효소 후보들을 제1차 약물 표적 효소군으로 선정하는 단계;
(e) 상기 (d)에서 선정된 제1차 약물 표적 효소군 중에서
(i) 인간 단백질과 상동관계가 없고, 동질효소(isozyme)를 갖지 않는 것들을 제2차 약물 표적 효소군으로 선정하고, 상기 제2차 표적 효소들을 코딩하는 유전자들을 제1 약물 표적 유전자군으로 선정하거나,
(ii) 인간 단백질과 상동관계가 없고, 상기 비브리오(Vibrio ) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 한 개 이상의 효소 반응식에 관여하는 것들을 제2차 약물 표적 효소군으로 선정하고, 상기 제2차 표적 효소들을 코딩하는 유전자들을 제1 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
(f) 상기 (a) 단계에서 구축된 비브리오(Vibrio ) 속 미생물 대사 네트워크 상에서 특정 대사산물들의 소비하는 모든 효소 반응식을 차단시켰을 때, 세포의 성장속도가 0인 경우의 상기 특정 대사산물들을 필수 대사산물들(I)로 결정하는 단계;
(g) 상기 (f)에서 결정된 필수 대사산물들(I) 중 각각의 필수대사산물을 소비하는 모든 효소 반응식이 인간 단백질과 상동관계가 없는 것들로만 이루어지는 경우의 필수 대사산물들을 추가로 선별하고, 상기 추가로 선별된 필수 대사산물들(II)을 소비하는 효소 반응식에 사용되는 효소들을 코딩하는 유전자들을 제2 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
(h) 상기 (e)단계에서 선정된 제1 약물 표적 유전자군 및 상기 (g)단계에서 선정된 제2 약물 표적 유전자군으로 구성된 군에서 선택된 유전자의 다양한 조합을 만드는 단계; 및
(i) 상기 (h)단계에서 만든 조합들을 이루는 유전자들이 코딩하는 효소가 관여하는 반응식들에 대하여, 상기 대사 네트워크 상에서의 평균거리를 계산하여 상기 평균 거리가 먼 경우들의 조합을 이루는 유전자들을 약물 표적 유전자로 선정하거나, 이에 의해 코딩되는 효소들을 약물 표적 효소로 선정하는 단계를 포함하는, 비브리오(Vibrio ) 속 미생물의 약물 표적 효소 또는 그 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다.
이 때, 상기 (e)단계에서 선정된 제2차 약물 표적 효소군은 인간 단백질과 상동관계가 없고 동질효소(isozyme)를 갖지 않으면서, 상기 비브리오(Vibrio ) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 한 개 이상의 효소 반응식에 관여하는 경우의, 상기 3가지 조건을 만족하는 제1차 약물 표적 효소 후보들 중에서 선정하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 방법에 있어서, 상기 (b)단계 또는 (c)단계는 택일적으로 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 쵸크포인트(chokepoint), 대사흐름분석에 기반한 필수 효소 반응식 분석 (single enzyme deletion), 및 필수 대사산물 분석 (metabolite essentiality)의 세 가지 시뮬레이션은 각기 다른 접근법으로써 세포의 다른 면을 보는 것으로, 이들 약물 표적 방법들을 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 모델에 동시에 적용함으로써 체계적이고 합리적인 약물 표적들을 예측할 수 있다. 즉, 상기 세 가지 시뮬레이션 방법에 따른 결과를 추려내어 비브리오(Vibrio) 속 병원균에 의한 질병에 대한 차기 가능성 있는 약물 표적 후보군의 수를 더욱 좁히고, 이들로부터 효과적인 약물 표적 조합을 만들 수 있게 되어 상기 질병의 치료 및 예방에 유용하다.
본 발명은 일 관점에서, 비브리오(Vibrio ) 속 미생물의 약물 표적 효소 또는 그 유전자의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 개략적인 과정은 도 1에 도시하고 있으며, 각 단계에 대한 구체적인 설명은 이하와 같다.
(1) 우선, 비브리오(Vibrio ) 속 미생물의 대사 네트워크 모델을 구축한다.
본 발명의 일 구체예에서는 상기 비브리오(Vibrio ) 속 미생물 중에서 Vibrio vulnificus의 대사 네트워크 모델을 구축하여 이용하였다. 이하, V. vulnificus의 대사 네트워크 모델을 구축한 경우로 설명한다.
이 때, 공지되어 있는 다양한 데이터베이스 및 실험결과를 이용하여 게놈 수 준의 대사 네트워크를 구축하는 것이 바람직하다.
(2) 다음으로, 상기 구축된 V. vulnificus 대사 네트워크에서 특정 대사산물을 유일하게 소비하거나 생산하는 효소들인 쵸크포인트를 약물 표적 효소 후보(I)로 선정한다.
본 발명에서 “쵸크포인트”란 대사 네트워크 모델에서 특정 대사산물을 유일하게 소비하거나 생산하는 효소 반응식을 일컬으며, 약물 표적을 위해 본 발명자들에 의해 고안되었다(Yeh et al., Genome Res. 14(5):917, 2004). 상기 쵸크포인트는, 이들 효소 반응식을 억제하면 이 효소에 관여하는 특정 대사산물을 소비하거나 생산하는 것이 불가능하므로 결국 대상 미생물의 세포 성장을 멈출 수 있을 것이라는 가정에 기반을 둔다.
상기 구축된 V. vulnificus 대사 네트워크 모델을 구성하고 있는 모든 대사산물에 대하여 질량 보존식들을 정립하고, 이로부터 각 대사산물을 유일하게 소비, 생산하는 효소들을 쵸크포인트로 선정한다(도 2).
(3) 한편, 상기 V. vulnificus 대사 네트워크를 구성하고 있는 효소 반응식들에 대하여 상기 효소 반응식들을 한 개씩 차단시키면서 선형계획법을 적용하였을 때, 세포 성장이 일어나지 않는 경우의 차단된 효소 반응식(필수 효소 반응식)들을 약물 표적 효소 후보(II)로 선정한다.
이 때, 상기 구축된 대사 네트워크를 수학적으로 표현하기 위하여, 구축된 대사 네트워크 모델을 구성하고 있는 모든 대사산물, 상기 대사산물의 대사경로 및 상기 대사경로에서의 화학양론 매트릭스 S (stoichiometric matrix)(S ij , j 번째 반응에서 i 번째 대사산물의 시간에 따른 화학양론 계수)를 이용하여, 대사흐름 벡터(ν j , j 번째 대사반응의 대사흐름)를 계산할 수 있다.
여기서, 시간에 따른 대사산물 농도 X의 변화는 모든 대사 반응의 흐름의 합으로 나타낼 수 있다. 시간에 따른 X의 변화량이 일정하다고 가정하면, 즉 준정상 상태의 가정 하에서, 시간에 따른 대사산물 농도의 변화량은 아래의 수학식 1로 정의될 수 있다.
Figure 112008021122156-pat00001
(여기서, Sν : 시간에 따른 X의 변화량, X: 대사산물의 농도, t: 시간)
상기 구성된 화학량론 매트릭스에서 최적화, 즉 최대화 또는 최소화 하고자 하는 반응식을 목적함수로 설정하고 선형계획법 (Linear programming)을 이용하여 세포 내의 대사흐름을 예측한다 (Kim et al., Mol Biosyst . 4(2):113, 2008). 본 발명의 일 구현예에서는 매트릭스 S에서 세포의 구성성분을 나타내는 효소 반응식을 목적함수로서 설정함으로써, 세포 성장 속도를 최적화 하였다.
그리고, 상기 대사흐름분석을 위한 선형계획법을 적용함에 있어서는, 당해 세포가 성장하는 데에 필요한 모든 영양분을 섭취할 수 있다는 가정 하에 실행해야 한다. 이는 병원성 미생물이 숙주 내에서 성장할 경우 숙주로부터 다양한 영양분을 섭취할 수 있기 때문이다. 효소 반응식은 특정 조건에서만 필수적인 것으로 나타날 수 있는데, 이처럼, 상기 모든 영양분의 섭취가 가능하다는 가정 하에 대사 흐름분석을 적용하면, 모든 조건에서 항시 필수적인 효소 반응식을 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 구축된 대사 네트워크 모델에서 효소 반응식 차단 시뮬레이션은 상기 대사흐름 벡터(ν)에서 차단시키고자 하는 효소 반응식의 해당 대사흐름을 0(= ν j )으로 고정시킨 상태에서 세포 성장 속도를 목적함수로 설정하고 선형계획법을 실행한다.
모델을 구성하고 있는 모든 효소 반응식을 하나씩 차단시킨 상태에서 선형계획법을 실행하였을 때, 상기 세포 성장 속도를 최대화하는 반응식을 적용함에도 불구하고 세포 성장이 0이 되는 경우에, 차단된 효소 반응식을 필수 효소 반응식으로 정의하고, 이를 약물 표적 후보(II)로 선정한다. 이 단계의 개략적인 과정을 도 3에서 도시하고 있다.
(4) 상기 (2) 및 (3) 단계에서 얻은 결과들인 약물 표적 후보(I) 및 (II)을 비교하여 중복되는 약물 표적 효소 후보들을 1차 약물 표적 효소군으로 선정한다.
즉, 이 단계는 쵸크포인트 분석 및 대사흐름분석을 이용한 효소 반응식 차단 시뮬 레이션으로부터 수득한 약물 표적 효소 후보들을 통합하는 단계이다.
상기 (2)단계에서의 쵸크포인트 분석과 상기 (3)단계에서의 대사흐름분석에 기반한 필수 효소 반응식에 따른 약물 표적 결과들을 종합하여 중복되는 표적들만을 선별한다(1차 약물 표적 효소군). 이는 약물 표적 효소 후보들 중 생물학적으로 가장 가능성 있는 것들만으로 그 표적 수를 현격히 줄이기 위함이다.
이렇게 통합된 1차 약물 표적 효소군은 대사 네트워크의 구조(network topology)와 대사 네트워크를 구성하고 있는 각 효소 반응식의 대사흐름이 반영된 대사의 기능적인 요소(metabolic function)를 모두 고려된 결과라고 할 수 있다.
본 발명의 일 태양으로는 상기 (2)단계만을 실시하거나, 상기 (3)단계만을 실시하여 약물 표적 효소 후보들을 구할 수 있다. 즉, 상기 (2)단계 및 (3)단계는 택일적으로 선택하여 수행가능하다. 그러나, 가장 바람직하게는 상기 (2) 및 (3) 단계를 모두 실시하고 그 결과를 종합하는 상기 (4)단계를 거쳐 중복된 약물 표적 효소 후보들을 구하는 것이 좋다.
만약, (2)단계만을 실시하거나 (3)단계만을 실시한 경우에는 그 각각의 결과를 1차 약물 표적 효소군으로 선정하고, 이하 설명하는 (5)단계로 넘어가게 될 것이다.
(5) 위와 같은 방법으로 선정된 1차 약물 표적 효소군 중에서 인간 단백질과 상동관계가 없고; 동질효소(isozyme)를 갖지 않거나 및/또는 상기 비브리 오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 한 개 이상의 효소 반응식에 관여하는 것들을 선별하여 제2차 약물 표적 효소군으로 선정한다.
이 단계에서는 쵸크포인트 분석 및 대사흐름분석에 기반한 효소 반응식 차단 시뮬레이션의 방법에서 중복된 1차 약물 표적 효소들을 하기 3가지의 기준을 토대로 추가 스크리닝한다. 이는 약물 표적으로서 더욱 효과적인 효소들만으로 선별하기 위함이다.
(i) 우선, 필수적으로, 상기 1차 약물 표적 효소들을 코딩하는 유전자들 내지는 아미노산 서열이 인간에 존재하는 모든 단백질에 대해서 상동관계가 없는 것들로 선별한다.
본 발명은 숙주로서 인간을 대상으로 하였기 때문에, 인간의 게놈 정보를 데이터베이스로 이용한다.
특정 유전자나 효소를 표적으로 하여 개발된 약물은 그 유전자나의 효소의 서열에 기반하여 작용하므로 약물로 예측된 유전자나 효소가 인간에도 존재할 경우 개발된 약물은 인간 단백질에도 작용하게 되어 부작용을 일으킬 수 있기 때문이다. 상동관계를 검토함에 있어서는 아미노산 서열이든 유전자 서열이든 상관없이 당업자가 상동관계를 파악할 수 있는 데이터라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 이 때, 종래의 BLASTP(아미노산 서열 이용시) 또는 BLAST(유전자 서열 이용시) 프로그램을 이용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 BLASTP 프로그램을 이용하였다.
(ii) 상기 1차 약물 표적 효소들 중에서 동질효소(isozyme)들이 존재하는 것 들을 제거한다.
이는 세포의 성장을 억제하는 데에 있어서 필수적인 효소와 같은 생화학적 기능을 갖는 동질효소들일 경우, 이들 효소들을 동시에 제거해야 하므로 약물 표적으로는 매우 비효율적이기 때문이다.
(iii) 상기 1차 약물 표적 효소들 또는 이들을 코딩하는 유전자들 중에서, 앞서 구축한 V. vulnificus 대사 네트워크상에서 한 개 이상의 반응식에 관여하는 다기능성(multifunctionality)을 지닌 것만을 선별한다.
이에 의해서, 상기 표적 효소 또는 유전자들이 약물에 의해 결실될 경우 비브리오 병원균 대사 내에서 한 개 이상의 관련 반응식이 중지되므로, 더욱 효율적인 약물 타깃(targetting)이 가능하게 된다.
이 단계에서, 약물의 부작용을 방지하기 위해서, 상기 (i)의 조건은 필수적으로 만족해야 하지만, 상기 (ii) 및 (iii)의 조건은 택일적으로 만족하여도 무방하다. 다만, 가장 바람직하게는 상기 (i), (ii) 및 (iii) 조건을 모두 만족시키는 약물 표적 효소군을 선별하는 것이다.
상기 조건들을 만족시키는 약물 표적 효소들을 제2차 약물 표적 효소군으로 선정하고, 상기 2차 약물 표적 효소들을 코딩하는 유전자들을 제1 약물 표적 유전자군으로 선정한다.
(6) 앞서 기술하고 있는 바와 같이, 쵸크포인트 분석 및 필수 효소 반응식 결과를 종합하여 유력한 약물 표적 후보들을 추려내는 한편, 상기 (a) 단계에서 구축된 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크 상에서 특정 대사산물들의 소비하는 모든 효소 반응식을 차단시켰을 때, 세포의 성장속도가 0인 경우의 상기 특정 대사산물들을 필수 대사산물들(I)로 결정하는 단계를 수행한다.
일반적으로 기존의 대사흐름분석에서 특정 유전자 결실에 따른 세포 성장속도를 확인하는 방법은 각 해당 반응식을 불활성화시키는 방법을 사용한다. 그러나 이 경우 두 개 이상의 유전자 결실에 따른 세포 성장 저하 현상을 확인하기 위해서는 실제로 두 개 이상의 조합에 따른 경우를 모두 계산해야 하는 단점이 있어 왔다.
이에 반하여, 본 발명에서는 각 대사산물의 '필수도(essentiality)'를 정의하여 각 대사산물의 특성을 살펴봄으로써 두 개 이상의 유전자 결실에 따른 세포 성장 저하 현상을 쉽게 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에서는 대상 미생물의 대사 네트워크를 구성하는 대사산물들의 '필수도(essentiality)'를 이하와 같이 정의하고 사용하는 방법을 제공한다.
대사산물들의 '필수도(essentiality)'란 세포가 그 대사산물을 대사반응을 통해 소비하지 않을 때 세포의 성장에 미치는 영향으로서, 대사흐름분석을 통하여 일정 조건 하에 각 대사산물에 대한 세포의 성장 속도를 조사함으로써 대사산물의 essentiality를 결정할 수 있다(Kim et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U S A, 104:13638, 2007).
즉, 대상 미생물의 대사 네트워크를 구성하는 대사산물들의 대사흐름분석 과정 중 각 대사산물을 소비하는 모든 대사반응을 동시에 차단(결실)시킨 상태에서, 해당 소비반응식의 대사흐름값을 0으로 고정하고, 이때의 세포의 성장속도가 0인 경우를 필수 대사산물로 선별한다(도 4).
Figure 112008021122156-pat00002
여기서 j m 은 각 대사산물의 소비 반응식이며, V jm 은 해당 소비 반응식의 대사흐름값을 나타낸다.
필수 대사산물 분석은 상기 대사흐름분석에서 사용한 수학식 1, 즉, 화학량론 매트릭스에서 각 대사산물을 소비하는 모든 대사반응을 동시에 차단(결실)시킨 상태에서 상기 수학식 2를 추가의 제한조건으로 적용하여, 해당 소비반응식의 대사흐름값을 0으로 고정시킨 후, 세포의 성장속도가 0인 경우를 필수 대사산물로 선별하는 것이다.
필수도(essentiality)를 결정하기 위한 분석 과정 중, 주어진 대사산물을 소비하지 않고 생산하는 대사반응을 불활성화 시키지 않은 이유는 만약 대사산물이 non-essential이라고 하더라도, 그 대사산물을 생산하는 대사반응은 다른 필수적인 대사산물도 생산할 가능성이 있기 때문에, 상기 대사반응의 불활성화 때문에 세포성장이 억제된다면 그것은 원래 비필수적인(non-essential) 대사산물이 필수적이라고(essential) 잘못 이해될 수도 있기 때문이다.
(7) 다음으로, 상기 (6)에서 결정된 필수 대사산물들(I) 중 각각의 필수대사산물을 소비하는 모든 효소가 인간 단백질과 상동관계가 없는 것들로만 이루어지는 경우의 필수 대사산물들(II)을 선별하는 단계를 수행한다.
이 단계에서는 상기 대사흐름분석을 통해 예측된 필수 대사산물을 소비하는 효소 반응식에 대하여, 인간과의 상동관계를 기준으로 추가 스크리닝하여 차기 가능성 있는 필수 대사산물의 수를 더욱 줄이게 된다.
만일 필수 대사산물 중 소비 반응식들의 효소가 한 개라도 인간의 단백질과 통계적으로 유사할 경우, 해당 필수 대사산물 및 그의 소비 반응식은 더 이상 약물 표적으로서 고려하지 않는다.
상동관계를 검토함에 있어서, 인간의 게놈 정보를 데이터 베이스로 하여, 아미노산 서열 이용시에는 BLASTP 프로그램을, 또는 유전자 서열 이용시에는 BLAST 프로그램을 사용할 수 있다. 다만, 아미노산 서열이든 유전자 서열이든 상관없이 당업자가 상동관계를 파악할 수 있는 데이터라면 어느 것이든 사용해도 무방하다. 본 발명의 일 구체예에서는 BLASTP 프로그램을 이용하였다.
이렇게 추가로 선별된 각각의 필수 대사산물들(II)을 소비하는 모든 효소를 코딩하는 유전자들 및 아미노산 서열들은 숙주 단백질의 것과 현저히 다르게 되며, 그 결과, 인간 단백질과 구조적기능적으로 다르게 된다.
이 과정은 상기 대사산물 유사물질을 약물로서 사용할 경우와 같이, 한 개의 약물로 동시에 여러 효소 소비 반응식을 억제하되, 숙주인 인간에게는 해당 단백질이 존재하지 않아서 약물로부터 받을 수 있는 부작용의 가능성을 최소화하는 작업이다.
이 단계에서 추가로 선별된 각각의 필수 대사산물들(II)을 소비하는 모든 효소를 코딩하는 유전자들 그룹을 제2 약물 표적 유전자군으로 선정한다.
(8) 상기 (5)단계에서 선정된 제1 약물 표적 유전자군 및 상기 (7)단계에서 선정된 제2 약물 표적 유전자군으로 구성된 군에서 선택된 유전자을 이용하여 다양한 약물 표적 조합을 구성한다.
본 발명의 일 구체예로서, 약물 표적 유전자들의 조합은 도 5에 나타나 있는 바와 같이, (5)단계에서 예측된 제1 약물 표적 유전자군으로만 이루어진 조합(도 5A), 상기 (5)단계와 (7)단계에서 예측된 제1 및 제2 약물 표적 유전자군으로 이루어진 조합(도 5BCDE), 상기 (7)단계에서 예측된 제2 약물 표적 유전자군으로만 이루어진 조합(도 5F) 등을 만들 수 있다.
제(7)단계에서 예측된 유전자군을 이용하여 약물 표적 조합을 만들 때, 일부 필수 대사산물들 중에서 그들의 소비 반응식이 동시에 차단되어야 세포 성장이 억 제되는 비필수 반응식(nonessential reaction)인 경우에는, 상기 소비 반응식에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자들도 항시 같은 조합에 속하도록 구성한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "비필수 반응식"이라 함은 특정 필수 대사산물의 소비와 관련한 효소 반응식이 2개 이상이 되는 경우의 상기 효소 반응식을 일컫는 것으로, 이 때는 관련 효소 반응식을을 모두 동시에 차단 시켜야지만 세포 성장이 억제된다. 그러므로, 이들 효소들을 코딩하는 유전자들도 같은 조합에 속하도록 구성해야한다.
이처럼, 제(7)단계에서 예측된 유전자군 중 상기 비필수 반응식에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 반드시 같은 조합으로 구성해야 하지만, 그렇지 않은 경우에는 따로 분리하여 다른 조합으로 구성할 수도 있다.
그러나, 가장 바람직하게는 상기 (7)단계에서 예측된 필수 대사산물의 소비 반응식들에 관여하는 유전자들은 항시 같은 조합에 속하도록 동일한 세트로 구성하는 것이다. 왜냐하면, 대사산물 유사물질(metabolite analogue)을 약물로 사용할 경우, 상기 소비 효소들이 같은 그룹에 있어서 동시에 공격을 가할 수 있기 때문이다.
이와 같이, 본 발명의 약물 표적 유전자군으로 조합을 만들 경우는 비브리오 병원균 대사의 여러 군데를 동시에 공략할 수 있는 장점이 있다.
통상적으로 항병원균 약물의 가장 큰 문제점은 약물에 대한 병원균의 내성이 금방 생긴다는 것이고, 이는 주로 약물 표적인 효소 유전자의 한 개의 변이(single endogenous mutation)에 의해서 일어나기 때문에, 본 발명의 약물 표적 유전자군으로 조합은 비브리오 병원균 대사의 여러 군데를 동시에 공략할 수 있어 비브리오 병원균의 내성을 최소화할 수 있고, 비브리오 병원균의 인간 내 성장을 확실히 제어할 수 있다는 유리한 점이 있다.
(9) 마지막으로, 상기 (8)단계에서 만든 다양한 유전자 조합들에 대하여, 상기 대사 네트워크 상에서의 평균거리를 계산하고, 상기 평균 거리가 먼 경우의 조합을 이루는 유전자들을 약물 표적 유전자로 선정한다.
이 단계는 병원균의 대사 네트워크 구조를 이용하여 약물 표적 조합을 이루는 유전자들에 상응하는 효소 반응식들의 거리 계산 및 이상적인 조합 발견하는 단계이다.
대사 네트워크에서 일반적으로 거리가 먼 효소 반응식은 서로 다른 세포 대사 기능에 참여하는 것으로 여겨지고 있다(Ma et al. Bioinformatics, 20:1870, 2004). 세포 성장을 억제하는 데에 있어서, 서로 다른 기능을 가지는 세포 대사 내의 여러 부위를 동시에 공략하는 것이 세포 대사 내의 한 부분만을 집중적으로 공략하는 것보다 더욱 효과적이다(Kitano. Nat. Rev. Drug. Discov. 6:202, 2007). 따라서 상기 8에서 만든 약물 표적 조합들 중에서 조합 구성 반응식들 간의 평균 거리가 먼 것들을 이상적인 조합으로 간주한다. 그러므로 평균 거리가 가장 먼 조합이 가장 효과적인 약물 조합이 되는 것이다.
효소 반응식 간의 거리는 상기 병원균의 대사 네트워크 구조 분석을 통해서 계산할 수 있다(Ma et al. Bioinformatics, 20:1870, 2004)(도 6). 일반 대사 네트 워크는 노드(node)가 대사산물을 가리키며, 선(edge)은 효소 반응식을 나타낸다(도 6A).
본 발명에서, 네트워크 구조 분석에서 일컫는 "거리(shortest path)"란 두 개의 노드 사이에 존재하는 가능한 모든 경로들 중에서 가장 짧은 경로에서 지나치는 선의 개수를 일컫는다.
네트워크 구조를 이용한 두 반응식 간의 거리를 구하는 기준은 다양하게 적용될 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에서는 효소 반응식 간의 거리를 계산하기 위하여 대사산물들 간의 반응을 나타내는 선에 해당 반응식의 노드를 추가로 만들어서, 이 반응식 노드들의 거리를 구하였다(도 6B). 예를 들어, 도 6A에서 대사산물인 노드 A와 노드 F의 거리는 2이다. 결론적으로 각 약물 표적 조합들을 이루고 있는 효소 반응식들의 평균 거리는 각 반응식 사이의 거리들의 평균값으로 구한다.
본 발명에서 얻은 다양한 약물 표적 조합들 중 효소 반응식들의 평균 거리가 먼 것들을 더욱 가능성 있는 조합으로 고려한다.
이와 같은 방법에 의하여 선정된 효소 및 유전자들을 각각 비브리오 속 미생물에 대한 약물 표적 효소 및 약물 표적 유전자로 결정한다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 Vibrio 속 미생물의 약물 표적을 예측하는 방법에 관한 것으로, 일 구체예로서 V. vulnificus의 대사 네트워크 모델을 구축한 다음, (A) 쵸크포인트 분석으로 구축된 대사 네트워크에서 특정 대사산물을 유일하게 소비하거나 생산하는 효소 반응식만을 약물 표적으로 예측하며, (B) 대사 흐름분석을 이용한 효소 반응식 결실 방법을 이용하여 세포 내의 대사흐름 분포를 토대로 대사 네트워크 모델을 구성하고 있는 효소 반응식을 하나씩 차단시켜 나가면서 세포 성장에 필수적인 효소 반응식 및 그의 유전자를 판별하고, (C) 필수 대사산물 분석 방법을 이용하여 각 대사산물의 소비 반응식을 동시에 모두 차단시켜서 세포 성장을 유지하는데 필수가 되는 대사산물 및 이들에 관여하는 유전자를 스크리닝한다.
이러한 (A), (B) 및 (C) 방법들 중에서, 필요에 따라 (A)와 (C); 또는 (B)와 (C); 또는 (A), (B) 및 (C)의 조합에 의해 차기 가능성 있는 후보군으로 수를 줄인 다음, 이들을 다양하게 조합하여 네트워크 구조 분석을 수행한 결과를 평가하여 상기 Vibrio 속 미생물을 효율적으로 제어할 수 있는 이상적인 조합을 예측한다.
본 발명은 또한, 다른 관점에서 상기 (2)단계의 쵸크포인트 분석에 의해 선정되는 약물 표적 효소 후보 및 이를 코딩하는 유전자군; 상기 (3)단계의 대사흐름분석에 따른 선형계획법을 적용하여 선정되는 약물 표적 효소 후보 및 이를 코딩하는 유전자군; 그리고, 상기 (4)단계의 쵸크포인트 분석 및 선형계획법을 이용한 필수 효소 반응식 결과가 중복되는 약물 표적 효소 후보 및 이를 코딩하는 유전자군; 및 상기 (5)단계에서 동질효소의 유무, 인간 단백질과의 상동관계, 다기능성(multifunctionality) 등의 기준을 통하여 더욱 가능성 있는 것들로 선별된 약물 표적 효소 후보 및 이를 코딩하는 유전자군을 포함한다.
본 발명은 또한, 또 다른 관점에서 상기 (6)단계에서 대사흐름분석을 이용하여 결정된 필수 대사산물들, 이들을 소비하는데 사용되는 효소 및 이를 코딩하는 유전자군; 및 상기 (7)단계에서 추가 선별된, 인간 단백질과 상동관계가 없는 효소로 소비되는 필수 대사산물들, 이들을 소비하는데 사용되는 효소 및 이를 코딩하는 유전자군을 포함한다.
본 발명은 또한, 또 다른 관점에서 상기 (8)단계에서 만들어지는 다양한 약물 표적 조합; 및 상기 (9)단계에서 결정되는, 평균 거리가 먼 경우의 조합을 포함하고, 나아가 상기 조합들을 이루는 약물 표적 유전자 및 이에 의해 코딩되는 효소를 포함한다.
본 발명에 따른 약물 표적 후보들의 다양한 조합에 대하여, 네트워크 분석을 토대로 이상적인 조합을 선별하면 병원균을 효율적으로 억제할 수 있는 약물 표적 조합을 수득할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 V. vulnificus를 모델시스템으로 이용한 약물 표적 스크리닝 방법에 대하여만 예시되어 있으나, V. vulnificus 이외의 다른 비브리오 속 병원성 미생물의 경우에도 적용된다는 것은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 당업자에게 자명하다.
실시예 1: V. vulnificus 의 대사 네트워크의 구축
컴퓨터를 이용하여 V. vulnificus의 약물 표적을 예측하기 위하여 다양한 데이터베이스 및 실험결과를 이용하여 게놈 수준의 대사 네트워크를 구축하였다.
KEGG(Kanehisa et al.. Nucleic Acids Res, 34:D354, 2006), TransportDB(Ren et al., PLoS Comput . Biol ., 1:e27, 2005), MetaCyc(Caspi et al. Nucleic Acids Res., 36:D623, 2008)을 토대로 초기 버전의 대사 네트워크를 구축하였으며 게놈 정보를 토대로 효소 반응식의 방향성, 유전자?단백질의 상관관계를 명확히 하였다.
V. vulnificus의 대사 네트워크는 945개의 생화학 반응식과 765개의 대사산물로 구성되어 있다. 상기 대사 네트워크의 정보는 하기 670개의 유전자 정보가 담겨 있다. 하기 예측되는 약물 표적은 이들 유전자로부터 선별하였다.
VV10014 (dGTP triphosphohydrolase), VV10053 (Histidine ammonia-lyase), VV10060 (Putative beta-ketoacyl-ACP reductase), VV10061 (Putative beta-ketoacyl-ACP synthase), VV10136 (Long-chain-fatty-acid-CoA ligase), VV10143 (Formyltetrahydrofolate hydrolase), VV10145 (Arginyl-tRNA synthetase), VV10154 (Succinyl-CoA synthetase, alpha subunit), VV10155 (Succinyl-CoA synthetase, beta subunit), VV10156 (2-oxoglutarate dehydrogenase complex, E2 component, dihydrolipoamide succinyltransferase), VV10157 (2-oxoglutarate dehydrogenase complex, E1 component), VV10158 (Succinate dehydrogenase, iron-sulfur protein), VV10159 (Succinate dehydrogenase, flavoprotein subunit), VV10160 (Succinate dehydrogenase, hydrophobic membrane anchor protein), VV10161 (Succinate dehydrogenase, cytochrome b556 subunit), VV10162 (Citrate synthase), VV10169 (Phosphoglucomutase), VV10176 (Glutaminyl-tRNA synthetase), VV10177 (#N/A), VV10179 (PTS system, N-acetylglucosamine-specific IIBC component), VV10180 (N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase), VV10183 (Asparagine synthase B, glutamine-hydrolyzing), VV10187 (Ferrochelatase), VV10188 (Adenylate kinase), VV10209 (Cysteine synthase A), VV10212 (PTS system, glucose-specific IIA component), VV10236 (Glutamyl-tRNA synthetase), VV10246 (Pseudouridine synthase family 1 protein), VV10248 (5'-nucleotidase precursor), VV10249 (2-dehydro-3-deoxyphosphooctonate aldolase), VV10254 (Glutamyl-tRNA reductase), VV10256 (4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase (CMK)), VV10257 (Ribose-phosphate pyrophosphokinase), VV10265 (2-polyprenyl-6-methoxyphenol hydroxylase and related FAD-dependent oxidoreductase), VV10272 (Leucyl-tRNA synthetase), VV10286 (Serine hydroxymethyltransferase), VV10288 (Trehalose-6-phosphate hydrolase), VV10289 (PTS system, trehalose-specific IIBC component), VV10291 (Histidinol phosphatase and related phosphatase), VV10314 (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase), VV10315 (1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase), VV10316 (Phosphatidylglycerophosphatase A), VV10317 (Thiamine monophosphate kinase), VV10319 (Riboflavin synthase beta-chain), VV10321 (3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthaseGTP cyclohydrolase II), VV10322 (Riboflavin synthase alpha chain), VV10323 (Riboflavin-specific deaminase), VV10325 (Gamma-glutamyl phosphate reductase), VV10326 (Glutamate 5-kinase), VV10329 (Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase), VV10333 (Aminoacyl-histidine dipeptidase), VV10340 (Phosphoribosylformylglycinamidine (FGAM) synthase), VV10344 (Zn-dependent alcohol dehydrogenase, class III), VV10366 (Putative inorganic polyphosphateATP-NAD kinase), VV10414 (Transcriptional regulator, LysR family), VV10418 (GMP synthase (glutamine-hydrolyzing)), VV10419 (GMP synthase (glutamine-hydrolyzing)), VV10426 (Histidyl-tRNA synthetase), VV10427 (Enzyme involved in the deoxyxylulose pathway of isoprenoid biosynthesis GcpE), VV10430 (Nucleoside diphosphate kinase), VV10449 (Isocitrate lyase), VV10450 (Malate synthase A), VV10465 (Exopolyphosphatase), VV10484 (Pseudouridylate synthase, 23S RNA-specific), VV10487 (Chorismate mutasepephenate dehydratase), VV10494 (Chorismate mutaseprephenate dehydrogenase), VV10495 (Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase, tyr-sensitive), VV10504 (Penicillin tolerance protein LytB), VV10507 (Isoleucyl-tRNA synthetase), VV10508 (FAD synthase), VV10516 (Thymidylate synthase), VV10526 (Lysyl-tRNA synthetase (class II)), VV10543 (Threonine synthase), VV10544 (Homoserine kinase), VV10545 (Aspartokinasehomoserine dehydrogenase, threonine-sensitive), VV10553 (Glutamate synthase, large subunit), VV10554 (Glutamate synthase, small subunit), VV10555 (Glutamate synthase, large subunit), VV10556 (Glutamate synthase, small subunit), VV10558 (Nucleoside phosphorylase), VV10559 (Cobalamin biosynthesis protein CobDCbiB), VV10565 (Carbamoylphosphate synthase large subunit (split gene in MJ)), VV10566 (Carbamoylphosphate synthase small subunit), VV10567 (Dihydrodipicolinate reductase), VV10571 (UDP-3-O-acyl-N-acetylglucosamine deacetylase), VV10577 (UDP-N-acetylmuramate-alanine ligase), VV10578 (UDP-N-acetylglucosamine-N-acetylmuramyl-(pentapeptide) pyrophosphoryl-undecaprenol N-acetylglucosamine transferase), VV10580 (UDP-N-acetylmuramoylalanine-D-glutamate ligase), VV10581 (Phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide-transferase), VV10582 (UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2, 6-diaminopimelate-D-alanyl-D-alanyl ligase), VV10583 (UDP-N-acetylmuramylalanyl-D-glutamate--2, 6-diaminopimelate ligase), VV10591 (Phosphoheptose isomerase), VV10595 (Ubiquinol--cytochrome c reductase, cytochrome c1), VV10596 (Ubiquinol--cytochrome c reductase, cytochrome B), VV10597 (Ubiquinol--cytochrome c reductase, iron-sulfur subunit), VV10610 (MutTnudix family protein), VV10613 (ADP-heptose synthase, bifunctional sugar kinaseadenylyltransferase), VV10623 (Putative undecaprenol kinase (Bacitracin resistance protein)), VV10625 (Dihydroneopterin aldolase FolB), VV10638 (PTS system, 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IIBC component), VV13002 (Thymidylate kinase), VV13005 (4-amino-4-deoxychorismate lyase), VV13006 (3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase II), VV13007 (Hypothetical protein), VV13009 (3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase), VV13010 (Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase), VV13011 (3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase III), VV13016 (23S rRNA ribosomal pseudouridine synthase), VV13018 (Ribonuclease E), VV13022 (Cob(I)alamin adenosyltransferase), VV13025 (Uridine kinase), VV13028 (Methionyl-tRNA synthetase), VV13035 (Formate-dependent nitrite reductase, periplasmic cytochrome c552 subunit NrfA), VV13040 (3-demethylubiquinone-9 3-methyltransferase), VV13041 (Ribonucleoside-diphosphate reductase, alpha subunit), VV13042 (Ribonucleoside-diphosphate reductase, beta subunit), VV13050 (Diaminobutyrate-pyruvate transaminaseL-2,4-diaminobutyrate decarboxylase), VV13052 (Phosphatidylglycerophosphate synthase), VV13060 (Pseudouridine synthase family 1 protein), VV13064 (Anthranilate synthase component I), VV13065 (Anthranilate synthase component II), VV13066 (Anthranilate phosphoribosyltransferase), VV13067 (Indole-3-glycerol phosphate synthase IgpSphosphoribosylanthranilate isomerase TrpF), VV13068 (Tryptophan synthase beta chain), VV13069 (Tryptophan synthase alpha chain), VV13100 (Lactoylglutathione lyase), VV13111 (Alcohol dehydrogenaseacetaldehyde dehydrogenase), VV13115 (Aspartate-semialdehyde dehydrogenase), VV13135 (L-asparaginase I), VV13140 (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), VV13153 (Cysteine synthase), VV13168 (O-succinylbenzoic acid-CoA ligase), VV13169 (O-succinylbenzoate-CoA synthase), VV13170 (Dihydroxynaphthoic acid synthase), VV13172 (2-succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylate synthase), VV13173 (Menaquinone-specific isochorismate synthase), VV13174 (Putative aspartate aminotransferase), VV20005 (Phosphoenolpyruvate synthase), VV20010 (Anaerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase, subunit A), VV20011 (Anaerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase, subunit B), VV20012 (Anaerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase, subunit C), VV20019 (Alcohol dehydrogenase, class IV), VV20053 (L-allo-threonine aldolase), VV20065 (Ribokinase), VV20117 (Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase), VV20123 (Methylglyoxal synthase), VV20148 (Acetate kinase 2), VV20186 (Glycine cleavage system P protein (pyridoxal-binding)), VV20188 (Serine hydroxymethyltransferase), VV20190 (Glycine cleavage system T protein (aminomethyltransferase)), VV20198 (PTS system, fructose-specific IIBC component), VV20199 (1-Phosphofructokinase), VV20200 (PTS system, fructose-specific IIAFPR component), VV20206 (Pyruvate kinase II), VV20214 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase 2), VV20216 (Formate-tetrahydrofolate ligase), VV20217 (#N/A), VV20218 (Inosine-guanosine kinase), VV20237 (Putative 5'-nucleotidase), VV20256 (Glycosidase), VV20280 (D-alanine-D-alanine ligase), VV20315 (#N/A), VV20316 (NAD(P) transhydrogenase beta subunit), VV20317 (NAD(P) transhydrogenase alpha subunit), VV20330 (Cobyric acid synthase), VV20334 (Amino acid biosynthesis aminotransferase), VV20337 (Anareobic ribonucleoside-triphosphate reductase), VV20349 (3-Oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase III), VV20367 (Uroporphyrinogen-III methylase), VV20369 (Nitrite reductase {NAD(P)H}, small subunit), VV20370 (Nitrite reductase {NAD(P)H}, large subunit), VV20389 (Ferredoxin subunits of nitrite reductase and ring-hydroxylating dioxygenase), VV20390 (NAD(P)H-nitrite reductase), VV20397 (Uroporphyrinogen-III methylase), VV20398 (Anaerobic dehydrogenase, typically selenocysteine-containing), VV20400 (Alpha-amylase), VV20407 (Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase), VV20455 (Phenylalanine-4-hydroxylase), VV20456 (Acetyl-CoA synthase), VV20468 (Adenosine deaminase), VV20469 (Putative pyruvate dehydrogenase E1 component, alpha subunit), VV20470 (Putative pyruvate dehydrogenase E1 component, beta subunit), VV20471 (Putative dihydrolipoamide acetyltransferase), VV20478 (Alanine racemase 2), VV20488 (Putative short-hanin alcohol dehydrogenase), VV20489 (3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase), VV20490 (Enoyl-CoA hydrataseisomerase family), VV20491 (Enoyl-CoA hydrataseisomerase family), VV20493 (NAD-dependent aldehyde dehydrogenase), VV20494 (Acetyl-CoA acetyltransferase), VV20496 (Acyl-CoA dehydrogenase), VV20497 (Acetyl-CoA carboxylase, carboxyltransferase component), VV20498 (Enoyl-CoA hydratasecarnithine racemase), VV20499 (Putative hydroxymethylglutaryl-CoA lyase), VV20500 (#N/A), VV20514 (#N/A), VV20515 (Mannose-6-phosphate isomerase), VV20531 (Deoxycytidylate deaminase), VV20532 (Peptidase T), VV20543 (GTP cyclohydrolase I), VV20552 (Transaldolase B), VV20553 (Transketolase 1), VV20558 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase), VV20560 (Polyprenyltransferase (cytochrome oxidase assembly factor)), VV20561 (Uncharacterized protein required for cytochrome oxidase assembly), VV20565 (Cytochrome C oxidase, subunit III), VV20566 (Cytochrome C oxidase assembly factor CtaG), VV20567 (Cytochrome C oxidase, subunit I), VV20568 (Cytochrome C oxidase, subunit II), VV20569 (Phosphomannomutase), VV20712 (GMP reductase), VV20721 (Periplasmic nitrate reductase), VV20730 (Putative N-acetylneuraminate lyase), VV20734 (Putative N-acetylmannosamine-6-phosphate epimerase), VV20735 (Putative N-acetylmannosamine kinase), VV20736 (N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase), VV20741 (Acetyl-CoA acetyltransferase), VV20742 (Acetoacetyl-CoA reductase), VV20752 (Autoinducer 2 sensor kinasephosphatase LuxQ), VV20768 (Adenylosuccinate synthase), VV20789 (Cytosine deaminase), VV20833 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase), VV20835 (Vulnibactin-specific isochorismate synthase), VV20854 (Tryptophanase), VV20869 (NAD-dependent aldehyde dehydrogenase), VV20878 (Tyrosyl-tRNA synthetase), VV20903 (Alpha-amylase), VV20904 (2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase), VV20905 (2-keto-3-deoxygluconate kinase), VV20914 (2-deoxy-D-gluconate 3-dehydrogenase), VV20966 (Oxygen-insensitive NAD(P)H nitroreductase), VV20996 (Methionine synthase II (cobalamin-independent)), VV21024 (Predicted tagatose 6-phosphate kinase), VV21030 (Diaminopimelate decarboxylase), VV21050 (6-phospho-beta-glucosidase, Family 4 glycosyl hydrolase), VV21062 (Bifunctional PLP-dependent enzyme with beta-cystathionase and maltose regulon repressor activities), VV21064 (D-mannonate dehydratase), VV21069 (Mannonate oxidoreductase), VV21070 (Uronate isomerase), VV21071 (Sugar kinase, ribokinase family), VV21072 (2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase), VV21084 (3-hexulose-6-phosphate synthase SgbH), VV21085 (Putative hexulose-6-phosphate isomerase SgbU), VV21093 (Dehydrogenase with different specificities (related to short-chain alcohol dehydrogenases)), VV21094 (Galactose-1-phosphate uridylyltransferase), VV21095 (UDP-glucose 4-epimerase), VV21118 (Putative proline dehydrogenase), VV21122 (Pyridoxamine-phosphate oxidase), VV21136 (Putative acetyltransferase (isoleucine patch superfamily)), VV21142 (Putative PTS system sucrose-specific IIBC component), VV21180 (GTP cyclohydrolase II), VV21200 (Glucosamine-6-phosphate isomerase), VV21204 (Glutathione synthase), VV21235 (Ornithine decarboxylase, inducible), VV21237 (Putative pyridoxine kinase), VV21250 (Maltodextrin phosphorylase), VV21251 (4-alpha-glucanotransferase), VV21266 (NAD-dependent aldehyde dehydrogenase), VV21287 (Glycosyl hydrolase family 1), VV21318 (Pseudouridylate synthase, 23S RNA-specific), VV21327 (Beta-galactosidase LacZ), VV21330 (Alpha-galactosidase), VV21348 (Mannose-6-phosphate isomerase), VV21349 (PTS system, fructose-specific IIABC component), VV21352 (PTS system fructose-specific component IIB), VV21353 (PTS system, fructose-specific IIABC component), VV21356 (PTS system, fructose-specific IIBC component), VV21357 (PTS system, fructose-specific IIA component), VV21373 (Uridine phosphorylase), VV21395 (Probable taurine catabolism dioxygenase), VV21412 (Diacylglycerol kinase), VV21426 (3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase (DHBP synthase)), VV21432 (Putative membrane-associated phospholipid phosphatase), VV21433 (Phosphomethylpyrimidine kinase), VV21457 (Lactate dehydrogenase), VV21473 (Catalase KatE), VV21484 (2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase), VV21485 (L-threonine 3-dehydrogenase), VV21520 (Carbonic anhydrase), VV21540 (Purine-nucleoside phosphorylase), VV21596 (Dihydroorotase), VV21599 (NH(3)-dependent NAD(+) synthetase), VV21615 (Coproporphyrinogen III oxidase), VV21622 (Alpha-amylase), VV21635 (Spermidine synthase), VV21637 (3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase), VV21651 (Hexapeptide-repeat containing-acetyltransferase), VV21663 (4-aminobutyrate aminotransferase), VV21664 (2-aminoethylphosphonate:pyruvate aminotransferase), VV21677 (L-serine deaminase), VV21687 (NAD-dependent aldehyde dehydrogenase), VV21688 (Choline dehydrogenase),
실시예 2: 쵸크포인트(chokepoint)의 선정
상기 실시예 1에서 구축한 대사 네트워크에서, V. vulnificus의 765개의 대사산물을 대상으로 MetaFluxNet(Lee et al., Bioinformatics, 19:2144, 2003) 및 엑셀을 이용하여 쵸크포인트 분석을 수행하였다.
분석 결과, 특정 대사산물을 유일하게 소비하거나 생산하는 효소 반응식, 즉 쵸크포인트는 총 530개로 선정되었다. 이는 상기 670개의 유전자 중 하기 표 2의 487개의 유전자에 해당한다.
VV10053, VV10060, VV10061, VV10136, VV10145, VV10156, VV10157, VV10176, VV10177, VV10179, VV10187, VV10209, VV10236, VV10246, VV10248, VV10249, VV10254, VV10256, VV10265, VV10272, VV10288, VV10289, VV10291, VV10314, VV10315, VV10316, VV10319, VV10321, VV10322, VV10323, VV10325, VV10326, VV10333, VV10340, VV10344, VV10414, VV10426, VV10427, VV10430, VV10450, VV10465, VV10484, VV10487, VV10494, VV10495, VV10504, VV10507, VV10508, VV10526, VV10543, VV10544, VV10545, VV10558, VV10559, VV10565, VV10566, VV10571, VV10577, VV10578, VV10580, VV10581, VV10582, VV10583, VV10591, VV10610, VV10613, VV10623, VV10625, VV10638, VV10639, VV10647, VV10648, VV10649, VV10654, VV10655, VV10656, VV10657, VV10662, VV10665, VV10678, VV10679, VV10688, VV10705, VV10723, VV10725, VV10726, VV10727, VV10728, VV10774, VV10779, VV10796, VV10797, VV10799, VV10803, VV10804, VV10808, VV10814, VV10819, VV10828, VV10830, VV10831, VV10852, VV10854, VV10889, VV10902, VV10907, VV10909, VV10933, VV10935, VV10940, VV10963, VV10964, VV10978, VV10981, VV10982, VV10989, VV10990, VV11023, VV11029, VV11030, VV11031, VV11032, VV11047, VV11053, VV11054, VV11057, VV11077, VV11083, VV11100, VV11102, VV11120, VV11121, VV11122, VV11123, VV11127, VV11141, VV11153, VV11163, VV11164, VV11165, VV11195, VV11197, VV11198, VV11199, VV11200, VV11218, VV11226, VV11227, VV11234, VV11235, VV11236, VV11237, VV11257, VV11270, VV11276, VV11284, VV11291, VV11299, VV11306, VV11307, VV11311, VV11312, VV11313, VV11314, VV11315, VV11342, VV11345, VV11353, VV11364, VV11365, VV11370, VV11371, VV11372, VV11373, VV11374, VV11382, VV11383, VV11386, VV11396, VV11402, VV11403, VV11404, VV11423, VV11424, VV11425, VV11428, VV11461, VV11464, VV11465, VV11474, VV11485, VV11517, VV11530, VV11536, VV11537, VV11539, VV11546, VV11552, VV11568, VV11569, VV11575, VV11576, VV11579, VV11582, VV11583, VV11584, VV11593, VV11594, VV11606, VV11608, VV11621, VV11622, VV11627, VV11630, VV11631, VV11632, VV11637, VV11642, VV11643, VV11644, VV11653, VV11654, VV11664, VV11678, VV11683, VV11691, VV11692, VV11698, VV11716, VV11725, VV11726, VV11727, VV11728, VV11730, VV11766, VV11767, VV11770, VV11772, VV11787, VV11790, VV11799, VV11810, VV11838, VV11846, VV11855, VV11865, VV11866, VV11870, VV11872, VV11873, VV11876, VV11883, VV11896, VV11897, VV11900, VV11912, VV11916, VV11975, VV11976, VV11978, VV11981, VV11986, VV11988, VV11989, VV11992, VV11993, VV11994, VV11997, VV12002, VV12016, VV12022, VV12064, VV12074, VV12075, VV12086, VV12088, VV12116, VV12126, VV12127, VV12131, VV12132, VV12156, VV12173, VV12219, VV12220, VV12227, VV12234, VV12248, VV12254, VV12257, VV12260, VV12265, VV12341, VV12349, VV12355, VV12356, VV12357, VV12370, VV12371, VV12378, VV12379, VV12389, VV12390, VV12391, VV12392, VV12397, VV12448, VV12560, VV12599, VV12614, VV12641, VV12654, VV12682, VV12683, VV12699, VV12702, VV12730, VV12731, VV12732, VV12754, VV12755, VV12765, VV12768, VV12771, VV12772, VV12783, VV12785, VV12786, VV12787, VV12788, VV12797, VV12799, VV12810, VV12813, VV12824, VV12826, VV12843, VV12871, VV12872, VV12890, VV12908, VV12910, VV12913, VV12914, VV12915, VV12916, VV12917, VV12918, VV12919, VV12920, VV12924, VV12928, VV12940, VV12942, VV12943, VV12944, VV12945, VV12946, VV12977, VV12983, VV13005, VV13006, VV13007, VV13009, VV13010, VV13011, VV13016, VV13022, VV13028, VV13040, VV13050, VV13052, VV13060, VV13066, VV13067, VV13068, VV13069, VV13100, VV13111, VV13115, VV13140, VV13153, VV13168, VV13169, VV13170, VV13172, VV13173, VV13174, VV20019, VV20053, VV20065, VV20117, VV20123, VV20186, VV20190, VV20198, VV20200, VV20214, VV20218, VV20237, VV20256, VV20280, VV20330, VV20334, VV20349, VV20367, VV20397, VV20398, VV20407, VV20455, VV20456, VV20468, VV20469, VV20470, VV20471, VV20488, VV20490, VV20491, VV20493, VV20496, VV20497, VV20498, VV20499, VV20500, VV20532, VV20543, VV20552, VV20553, VV20558, VV20569, VV20721, VV20742, VV20752, VV20768, VV20789, VV20833, VV20835, VV20854, VV20869, VV20878, VV20904, VV20914, VV20996, VV21024, VV21050, VV21062, VV21064, VV21069, VV21070, VV21072, VV21084, VV21085, VV21093, VV21095, VV21118, VV21136, VV21142, VV21180, VV21204, VV21237, VV21250, VV21251, VV21287, VV21318, VV21327, VV21330, VV21349, VV21352, VV21353, VV21356, VV21357, VV21373, VV21395, VV21426, VV21432, VV21433, VV21457, VV21473, VV21520, VV21540, VV21596, VV21599, VV21635, VV21651, VV21663, VV21664, VV21677
실시예 3: 대사흐름분석을 이용한 효소 반응식 차단 시뮬레이션에 의한 필수 효소 반응식 선정
상기 실시예 1에서 구축한 V. vulnificus의 대사 네트워크를 이용하여 대사흐름분석에 기반한 필수 효소 반응식 분석을 실시하였다.
V. vulnificus의 대사 네트워크를 구성하는 945개의 효소 반응식의 모든 경우에 대해서, 세포 성장 속도를 최대화하는 것을 목적함수로 설정하였으며, 세포 성장을 멈추게 하는 필수 효소 반응식을 찾기 위하여, 매 대사흐름분석 시 모델을 구성하고 있는 모든 반응식, 즉 945개의 반응식을 한 개씩 결렬시키면서 선형계획법을 진행하였다.
인체가 V. vulnificus에 감염되면, V. vulnificus는 인체 내에 존재하는 다양한 영양분을 섭취할 수 있게 하는데, 본 발명에서는 이를 최대한 반영하기 위하여 컴퓨터 상의 세포가 표 3에 나온 22개의 탄소 성분과 41개의 질소 성분을 동시에 섭취하는 것을 가능하도록 설정하였다.
이 밖에서도 소량의 산소(O2), 인산염(phosphate), 황산염(sulfate), 질산염(nitrate), 아질산염(nitrite), 나트륨(sodium)의 섭취도 가능하도록 하였다.
탄소 성분 질소 성분
2-Oxoglutarate Adenosine*
2-Phospho-D-glycerate Cytidine*
3-Phospho-D-glycerate Cytosine
(S)-Lactate D-alanine*
(S)-Malate Deoxyadenosine*
Acetate Deoxycytidine*
alpha,alpha-Trehalose Deoxyguanosine*
alpha-D-Glucose Deoxyuridine*
Citrate D-Glutamate*
D-Fructose Glycine*
D-Gluconate Guanosine*
D-Mannitol L-Alanine*
Fumarate L-Arginine*
Glycerol L-Asparagine*
Glycolate L-Aspartate*
Isocitrate L-Cysteine
Isomaltose L-Glutamate*
Maltose L-Glutamine*
Melibiose L-Histidine
sn-Glycerol 3-phosphate L-Homoserine*
Succinate L-Isoleucine
Sucrose L-Leucine
L-Lysine
L-Methionine
L-Ornithine*
L-Phenylalanine
L-Proline*
L-Serine*
L-Threonine*
L-Tryptophan*
L-Tyrosine
L-Valine
N-Acetyl-D-glucosamine*
NH3
Putrescine*
Spermidine*
Thymidine
Uracil
Urea
Uridine*
Xanthine
결과적으로 총 945개의 반응식 중 138개가 세포 성장에 필수적인 것으로 예측되었다. 이는 대사 네트워크에 반영되어 있는 상기 670개의 유전자 중 하기 136개의 유전자에 해당한다.
VV10060, VV10061, VV10136, VV10256, VV10291, VV10314, VV10315, VV10316, VV10319, VV10321, VV10322, VV10323, VV10366, VV10427, VV10430, VV10495, VV10504, VV10508, VV10558, VV10577, VV10578, VV10580, VV10581, VV10582, VV10583, VV10591, VV10613, VV10623, VV10625, VV10649, VV10662, VV10678, VV10679, VV10796, VV10819, VV10828, VV10850, VV10854, VV10889, VV10909, VV10981, VV10982, VV11057, VV11083, VV11127, VV11165, VV11195, VV11197, VV11200, VV11234, VV11235, VV11236, VV11284, VV11311, VV11312, VV11353, VV11382, VV11383, VV11423, VV11536, VV11539, VV11547, VV11558, VV11568, VV11582, VV11583, VV11608, VV11621, VV11622, VV11627, VV11642, VV11643, VV11790, VV11810, VV11846, VV11865, VV11866, VV11876, VV11896, VV11897, VV11912, VV11916, VV11975, VV11976, VV11981, VV11986, VV11988, VV11993, VV11994, VV12098, VV12126, VV12127, VV12131, VV12132, VV12173, VV12234, VV12265, VV12560, VV12614, VV12654, VV12699, VV12799, VV12810, VV12813, VV12824, VV12983, VV13002, VV13005, VV13006, VV13007, VV13009, VV13010, VV13011, VV13052, VV13168, VV13169, VV13170, VV13172, VV13173, VV20065, VV20214, VV20280, VV20349, VV20488, VV20490, VV20491, VV20498, VV20543, VV20558, VV20752, VV20833, VV20835, VV21180, VV21426, VV21432, VV21599
실시예 4: 쵸크포인트 분석 및 효소 반응식 결실 시뮬레이션으로부터 나온 약물 표 적 후보들의 통합
상기 쵸크포인트 분석과 대사흐름분석에 기반한 효소 반응식 결실 시뮬레이션을 이용한 약물 표적 결과들을 종합하여 중복되는 표적들만을 선별하였다. 이를 통해 약물 표적들 중 생물학적으로 가장 가능성 있는 것들만으로 그 표적 수를 현격히 줄였다.
통합된 약물 표적은 대사 네트워크의 구조(network topology)와 대사 네트워크를 구성하고 있는 각 효소 반응식의 대사흐름이 반영된 대사의 기능적인 요소(metabolic function)를 모두 고려하였다.
상기 예측된 쵸크포인트는 총 530개의 효소 반응식과 필수 효소 반응식 분석에서 예측된 138개의 효소 반응식 중 126개가 중복되며, 이는 대사 네트워크에 반영되어 있는 상기 670개의 유전자 중 하기 표 5의 126개의 유전자에 해당하였다.
VV10060, VV10061, VV10136, VV10256, VV10291, VV10314, VV10315, VV10316, VV10319, VV10321, VV10322, VV10323, VV10427, VV10430, VV10495, VV10504, VV10508, VV10558, VV10577, VV10578, VV10580, VV10581, VV10582, VV10583, VV10591, VV10613, VV10623, VV10625, VV10649, VV10662, VV10678, VV10679, VV10796, VV10819, VV10828, VV10854, VV10889, VV10981, VV10982, VV11057, VV11083, VV11127, VV11165, VV11195, VV11197, VV11200, VV11234, VV11235, VV11236, VV11284, VV11311, VV11312, VV11382, VV11383, VV11423, VV11536, VV11539, VV11568, VV11582, VV11583, VV11608, VV11621, VV11622, VV11627, VV11642, VV11643, VV11790, VV11810, VV11846, VV11865, VV11866, VV11876, VV11896, VV11897, VV11912, VV11916, VV11975, VV11976, VV11981, VV11986, VV11988, VV11993, VV11994, VV12126, VV12127, VV12131, VV12132, VV12173, VV12234, VV12265, VV12560, VV12614, VV12654, VV12699, VV12799, VV12810, VV12813, VV13005, VV13006, VV13007, VV13009, VV13010, VV13011, VV13052, VV13168, VV13169, VV13170, VV13172, VV13173, VV20065, VV20214, VV20280, VV20349, VV20488, VV20490, VV20491, VV20498, VV20543, VV20558, VV20752, VV20833, VV20835, VV21180, VV21426, VV21432, VV21599
실시예 5: 쵸크포인트 분석과 필수 효소 반응식으로부터 공통적으로 나온 약물 표적의 추가 스크리닝
상기 쵸크포인트 분석과 대사흐름분석에 기반한 효소 반응식 결실 시뮬레이션의 방법으로부터 중복으로 예측된 약물 표적 후보들을 하기 3가지의 기준을 토대로 추가 스크리닝 하였다. 이에 의해 약물 표적으로서 더욱 효과적인 효소들만으로 선별하였다.
(i) 우선 약물 표적으로 선정된 효소 및 이에 상응하는 유전자들 중에서 동질효소(isozyme)들이 존재하는 것들을 제거하였다. (ii) 다음으로 약물 표적의 유전자 내지는 아미노산 서열은 인간에 존재하는 모든 단백질에 대해서 상동관계가 없는 것들로 선별하였다. (iii) 마지막으로 약물 표적으로 예측된 유전자나 효소는 한 개 이상의 반응식에 관여하는 다기능성(multifunctionality)를 지닌 것을 선별하였다.
그 결과, 상기 실시예 4에서 예측된 126개의 유전자 중 하기 VV10323 1개만이 가장 효과적인 약물로 예측되었다. VV10323은 동질효소를 가지지 않고, 인간 단백질과 상동관계가 없으며, 두 개의 반응을 촉진시킨다.
유전자 관여 대사 E.C. 번호 효소 이름
VV10323 Riboflavin metabolism 3.5.4.26 diaminohydroxyphosphoribosylaminopyrimidine deaminase
VV10323 Riboflavin metabolism 1.1.1.193 5-amino-6-(5-phosphoribosylamino)uracil reductase
실시예 6: 대사흐름분석을 이용한 필수 대사산물 분석 시뮬레이션에 의한 필수 대 사산물 결정
대사흐름분석을 통하여 각 대사산물에 대해, 세포가 그 대사산물을 대사반응을 통해 소비하지 않을 때 세포의 성장에 미치는 영향을 조사함으로써 대사산물의 필수도(essentiality)를 구하였다.
즉, 대상 미생물의 대사 네트워크를 구성하는 대사산물들의 대사흐름분석 과정 중 각 대사산물을 소비하는 모든 대사반응을 결실시킨 상태에서, 즉 해당 소비반응식의 대사흐름값을 0(= ν j )으로 고정하고, 이때의 세포의 성장속도가 0인 경우를 필수 대사산물로 선별하였다.
그 결과, 대사흐름분석을 통하여 하기 표 7의 총 107개의 대사산물들이 필수 대사산물로 결정되었다.
1,4-dihydroxy-2-naphthoate, 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate , 2,3-Dihydrodipicolinate, 2-Amino-4-hydroxy-6-(erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)-dihydropteridine triphosphate, 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine, 2-Demethylmenaquinone, 2-Oxobutanoate, 2-Oxoglutarate, 3-Dehydroshikimate, 3-Methyl-2-oxobutanoic acid, 4-Aminobenzoate, 5,10-Methylenetetrahydrofolate, 5-Phospho-alpha-D-ribose 1-diphosphate, Acetyl-[acyl-carrier protein], Acetyl-CoA, Acyl-carrier protein, all-trans-Octaprenyl diphosphate, AMP, ATP, beta-Alanine, beta-D-Fructose 6-phosphate, CDP-diacylglycerol, Chorismate, CO2, coenzyme A (CoA), CTP, D-alanine, dATP, dCTP, D-Erythrose 4-phosphate, D-Glucose 1-phosphate, D-Glutamate, D-Glyceraldehyde 3-phosphate, dGTP, Dihydrofolate, Dodecanoyl-[acyl-carrier protein], D-Ribose 5-phosphate, D-Ribulose 5-phosphate, dTMP, dTTP, Flavin adenine dinucleotide (FAD), Flavin mononucleotide (FMN), Fumarate, GDP, Glycerone phosphate, Glycine, Glycogen, GMP, GTP, Hexadecanoyl-[acyl-carrier protein], Hexadecenoyl-[acyl-carrier protein], Isopentenyl diphosphate, L-Alanine, L-Arginine, L-Asparagine, L-Aspartate, L-Aspartate 4-semialdehyde, L-Cysteine, L-Glutamate, L-Glutamine, L-Histidine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine, L-Valine, Malonyl-[acyl-carrier protein], menaquinol, menaquinone, meso-2,6-Diaminopimelate, NADH, NADPH, NH3, Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP+), Nicotinate D-ribonucleotide, Octadecanoyl-[acyl-carrier protein], Octadecenoyl-[acyl-carrier protein], O-Phospho-4-hydroxy-L-threonine, Pentadecanoyl-[acyl-carrier protein], Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylserine, Phosphoenolpyruvate, Propanoyl-[acyl-carrier protein], Propanoyl-CoA, Pyridoxine, Pyridoxine 5'-phosphate, Pyruvate, S-Adenosyl-L-methionine, Sedoheptulose 7-phosphate, sn-Glycerol 3-phosphate, Succinyl-CoA, Tetradecanoyl-[acyl-carrier protein], Tetrahydrofolate, Thioredoxin, UDP, UDPglucose, UDP-N-acetyl-D-glucosamine, UMP, UTP
실시예 7: 필수 대사산물의 추가 스크리닝
실시예 6에서 대사흐름분석을 통해 결정된 필수 대사산물에 대해서, 이들의 소비 반응식을 인간과의 상동관계를 기준으로 추가 스크링하여 차기 가능성 있는 필수 대사산물의 수를 더욱 줄였다.
만일 필수 대사산물 중 소비 반응식들의 효소가 한 개라도 인간의 단백질과 통계적으로 유사할 경우, 해당 필수 대사산물 및 그의 소비 반응식은 더 이상 약물 표적으로서 고려하지 않았다.
그 결과, 차기 선별된 각 필수 대사산물의 모든 소비 반응식과 관련된 유전자 및 아미노산 서열은 인간 단백질의 것과 현저히 다르게 되어 인간 단백질과 구조적기능적으로도 상이하다.
필수 대사산물 관여 대사 소비 반응식의 유전자 소비 반응식의 E.C. 번호 소비 반응식의 효소
2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine Folate biosynthesis VV11644 2.7.6.3 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridine
pyrophosphokinase
Folate biosynthesis VV11691 2.5.1.15 dihydropteroate synthase
D-Glutamate D-Glutamine and D-glutamate metabolism VV11175 5.1.1.3 glutamate racemase
Peptidoglycan biosynthesis VV10580 6.3.2.9 UDP-N-acetylmuramoylalanine--D-glutamate ligase
2,3-Dihydrodipicolinate Lysine biosynthesis VV10567 1.3.1.26 dihydrodipicolinate reductase
Lysine biosynthesis VV10567 1.3.1.26 dihydrodipicolinate reductase
1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate Biosynthesis of steroids VV11866 1.1.1.267 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase
Vitamin B6 metabolism VV11568 PdxJ pyridoxine 5-phosphate synthase
4-Aminobenzoate Folate biosynthesis VV11691 2.5.1.15 dihydropteroate synthase
Folate biosynthesis VV11691 2.5.1.15 dihydropteroate synthase
실시예 8: 선정된 약물 표적 효소들을 코딩하는 유전자들에 의한 다양한 약물 표적 조합
상기 실시예 5에서 최종적으로 선정된 약물 표적 유전자와 상기 실시예 7에서 최종적으로 선정된 필수 대사산물의 소비 반응식에 관여하는 유전자들로 구성된 군에서 선택되는 유전자들로 가능한 조합을 만들었다(도 5).
대표적으로, 약물 표적 조합은 상기 실시예 5에서 예측된 약물 표적들만으로 이루어진 조합(도 5A), 상기 실시예 5와 7에서 예측된 약물 표적들의 조합(도 5BCDE), 상기 실시예7에서 예측된 약물 표적들로만 이루어진 조합(도 5F)을 만들 었다. 이들을 각각 편의상 Type I, Type II, Type III라고 나타내었다.
약물 표적 조합을 만들 때, 상기 실시예 7에서 예측된 필수 대사산물의 소비 반응식들에 관여하는 유전자들은 항시 같은 조합에 속하도록 구성하였고, 본 발명에서 실시예 5에서 예측된 최종 약물 표적 유전자는 한 개이므로 Type I은 만들지 않았다. Type II와 Type III는 이하 표 9에 나타내었다. 각 조합을 이루는 유전자에 상응하는 효소가 소비하는 필수 대사산물도 함께 표시하였다. Type II에서 쵸크포인트 및 필수 효소 반응식 분석으로부터 나온 유전자는 이상 필수 효소 유전자로 표기하였다.
조합 ID 약물 표적 조합 Type II
II-1 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV11644, VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine)
II-2 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate)
II-3 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate)
II-4 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate)
II-5 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV11691(이상 4-Aminobenzoate)
조합 ID 약물 표적 조합 Type III
III-1 VV11644, VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine), VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate)
III-2 VV11644, VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine), VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate)
III-3 VV11644, VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine), VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate)
III-4 VV11644 (이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine), VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine, 4-Aminobenzoate)
III-5 VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate), VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate)
III-6 VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate), VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate)
III-7 VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate), VV11691(이상 4-Aminobenzoate)
III-8 VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate), VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate )
III-9 VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate), VV11691(이상 4-Aminobenzoate)
III-10 VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate), VV11691 (이상 4-Aminobenzoate)
실시예 9: V. vulnificus 의 대사 네트워크 구조 분석을 이용하여 약물 표적 조합을 이루는 유전자들에 상응하는 효소 반응식들의 거리 계산 및 이상적인 조합 발견
대사 네트워크에서 여러 부위를 동시에 공략할 수 있도록, 대사 네트워크 상 거리가 멀게 나타나는 조합을 찾고자 하였다. 즉, 상기 실시예 8에서 만든 약물 표적 조합들 중에서 조합 구성 반응식들 간의 평균 거리가 먼 것들을 이상적인 조합으로 간주하였다.
도 6에 나타나 있는 바와 같이, 효소 반응식 간의 거리를 계산하기 위하여 대사산물들 간의 반응을 나타내는 선에 해당 반응식의 노드를 추가로 만들어서, 이 반응식 노드들의 거리를 구하였다.
각 거리를 구한 후, 각 약물 표적 조합들을 이루고 있는 효소 반응식들의 평균 거리를 각 반응식 사이의 거리들의 평균값으로 구하였다. 효소 반응식들의 평균 거리가 높은 것들을 더욱 가능성 있는 조합으로 채택하였다. 약물 표적 조합을 이루는 유전자에 상응하는 효소 반등식들 간의 평균거리를 토대로 하기와 같이 정리하였다.
조합 ID 약물 표적 조합 Type II와 III 평균거리
II-1 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV11644, VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine) 7.33
II-2 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate) 7.33
II-3 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate) 6.67
II-4 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate) 6.67
II-5 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV11691(이상 4-Aminobenzoate) 6.67
III-5 VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate), VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate) 6.00
III-6 VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate), VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate) 6.00
III-2 VV11644, VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine), VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate) 5.33
III-3 VV11644, VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine), VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate) 5.33
III-1 VV11644, VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine), VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate) 4.67
III-8 VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate), VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate ) 4.67
III-9 VV10567(이상 2,3-Dihydrodipicolinate), VV11691(이상 4-Aminobenzoate) 4.67
III-10 VV11866, VV11568(이상 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate), VV11691 (이상 4-Aminobenzoate) 4.67
III-7 VV11175, VV10580(이상 D-Glutamate), VV11691(이상 4-Aminobenzoate) 2.00
III-4 VV11644 (이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine), VV11691(이상 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine, 4-Aminobenzoate) 2.00
그 결과, 조합 II-1의 VV10323(필수 효소 유전자), VV11644, 및 VV11691 (2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine의 소비 반응식 관여 유전자들)과 조합 II-2의 VV10323(이상 필수 효소 유전자), VV11175, VV10580(D-Glutamate의 소비 반응식 관여 유전자들)가 최적의 약물 표적 유전자들로 스크리닝 되었다.
또한, 이들 유전자에 의해 코딩되는 diaminohydroxyphosphoribosylaminopyrimidine deaminase, 5-amino-6-(5-phosphoribosylamino)uracil reductase, 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridine pyrophosphokinase, dihydropteroate synthase 효소 조합(II-1)과 diaminohydroxyphosphoribosylaminopyrimidine deaminase, 5-amino-6-(5-phosphoribosylamino)uracil reductase, glutamate racemase, UDP-N-acetylmuramoylalanine--D-glutamate ligase 효소조합(II-2)이 최적의 약물 표적 효소로 스크리닝 되었다.
도 1은 쵸크포인트, 대사흐름분석에 기반한 필수 효소 반응식 분석, 및 필수 대사산물 분석 시뮬레이션을 통하여 약물 표적 예측부터 이들의 조합을 만들어내는 과정을 설명하는 개략도이다.
도 2는 쵸크포인트의 정의를 설명하고 있는 그림으로, 타원형은 효소 반응식을 일컬으며, 사각형은 대사산물을 나타낸다.
도 3은 대사흐름분석을 이용한 효소 반응식 차단 시뮬레이션으로부터 얻은 필수 효소 반응식에 따른 약물 표적을 예측하는 방법을 설명하는 개략도이다.
도 4은 대사흐름분석을 이용한 필수 대사산물 분석 시뮬레이션을 설명하는 개략도로서, 타원형은 효소 반응식을 일컬으며, 사각형은 대사산물을 나타낸다.
도 5는 3 가지 유형의 약물 표적 조합을 만드는 방법을 나타낸다.
도 6은 각 약물 표적 조합 내에 존재하는 효소 반응식들 간의 평균 거리를 계산하기 위하여 대사산물 간의 반응식을 나타내는 선에 반응식 노드를 만드는 과정을 도시한 그림으로서, 타원형은 효소 반응식을 일컬으며, 사각형은 대사산물을 나타낸다

Claims (21)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 비브리오(Vibrio) 속 미생물의 약물 표적 효소 또는 그 유전자의 스크리닝 방법:
    (a) 비브리오(Vibrio) 속 미생물의 대사 네트워크 모델을 구축하는 단계;
    (b) 상기 구축된 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크에서 특정 대사산물을 유일하게 소비하거나 생산하는 효소들인 쵸크포인트를 약물 표적 효소 후보들 (I)로 선정하는 단계;
    (c) 상기 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 효소 반응식들에 대하여 상기 효소 반응식들을 한 개씩 차단시키면서 선형계획법을 적용하였을 때, 세포 성장이 일어나지 않는 경우의 차단된 효소 반응식을 약물 표적 효소 후보들(II)로 선정하는 단계;
    (d) 상기 (b)와 (c) 단계에서 얻은 결과인 약물 표적 효소 후보들 (I)과 (II)를 비교하여 중복되는 약물 표적 효소 후보들을 제1차 약물 표적 효소군으로 선정하는 단계;
    (e) 상기 (d)에서 선정된 제1차 약물 표적 효소군 중에서
    인간 단백질과 상동관계가 없고, 동질효소(isozyme)를 갖지 않는 것들을 제2차 약물 표적 효소군으로 선정하고, 상기 제2차 표적 효소들을 코딩하는 유전자들을 제1 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
    (f) 상기 (a) 단계에서 구축된 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크 상에서 특정 대사산물들의 소비하는 모든 효소 반응식을 차단시켰을 때, 세포의 성장속도가 0인 경우의 상기 특정 대사산물들을 필수 대사산물들(I)로 결정하는 단계;
    (g) 상기 (f)에서 결정된 필수 대사산물들(I) 중 각각의 필수대사산물을 소비하는 모든 효소 반응식이 인간 단백질과 상동관계가 없는 것들로만 이루어지는 경우의 필수 대사산물들을 추가로 선별하고, 상기 추가로 선별된 필수 대사산물들(II)을 소비하는 효소 반응식에 사용되는 효소들을 코딩하는 유전자들을 제2 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
    (h) 상기 (e)단계에서 선정된 제1 약물 표적 유전자군 및 상기 (g)단계에서 선정된 제2 약물 표적 유전자군으로 구성된 군에서 선택된 유전자의 다양한 조합을 만드는 단계; 및
    (i) 상기 (h)단계에서 만든 조합들을 이루는 유전자들이 코딩하는 효소가 관여하는 반응식들에 대하여, 대사산물들 간의 반응을 나타내는 선에 해당 반응식의 노드를 추가로 만들어서, 이 반응식 노드들의 거리를 구하여 , 상기 대사 네트워크 상에서의 평균거리를 계산하여 상기 평균 거리가 평균 거리가 다른 조합들의 평균거리와 비교하여 먼 경우들의 조합을 이루는 유전자들을 약물 표적 유전자로 선정하거나, 이에 의해 코딩되는 효소들을 약물 표적 효소로 선정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (e)단계에서 선정된 제2차 약물 표적 효소군은 인간 단백질과 상동관계가 없고 동질효소(isozyme)를 갖지 않으면서, 상기 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 한 개 이상의 효소 반응식에 관여하는 경우의 제1차 약물 표적 효소 후보들 중에서 선정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 다음의 단계를 포함하는, 비브리오(Vibrio) 속 미생물의 약물 표적 효소 또는 그 유전자의 스크리닝 방법:
    (a) 비브리오(Vibrio) 속 미생물의 대사 네트워크 모델을 구축하는 단계;
    (b) 상기 구축된 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크에서 특정 대사산물을 유일하게 소비하거나 생산하는 효소들인 쵸크포인트를 약물 표적 효소 후보들 (I)로 선정하는 단계;
    (c) 상기 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 효소 반응식들에 대하여 상기 효소 반응식들을 한 개씩 차단시키면서 선형계획법을 적용하였을 때, 세포 성장이 일어나지 않는 경우의 차단된 효소 반응식을 약물 표적 효소 후보들(II)로 선정하는 단계;
    (d) 상기 (b)와 (c) 단계에서 얻은 결과인 약물 표적 효소 후보들 (I)과 (II)를 비교하여 중복되는 약물 표적 효소 후보들을 제1차 약물 표적 효소군으로 선정하는 단계;
    (e) 상기 (d)에서 선정된 제1차 약물 표적 효소군 중에서
    인간 단백질과 상동관계가 없고, 상기 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 한 개 이상의 효소 반응식에 관여하는 것들을 제2차 약물 표적 효소군으로 선정하고, 상기 제2차 표적 효소들을 코딩하는 유전자들을 제1 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
    (f) 상기 (a) 단계에서 구축된 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크 상에서 특정 대사산물들의 소비하는 모든 효소 반응식을 차단시켰을 때, 세포의 성장속도가 0인 경우의 상기 특정 대사산물들을 필수 대사산물들(I)로 결정하는 단계;
    (g) 상기 (f)에서 결정된 필수 대사산물들(I) 중 각각의 필수대사산물을 소비하는 모든 효소 반응식이 인간 단백질과 상동관계가 없는 것들로만 이루어지는 경우의 필수 대사산물들을 추가로 선별하고, 상기 추가로 선별된 필수 대사산물들(II)을 소비하는 효소 반응식에 사용되는 효소들을 코딩하는 유전자들을 제2 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
    (h) 상기 (e)단계에서 선정된 제1 약물 표적 유전자군 및 상기 (g)단계에서 선정된 제2 약물 표적 유전자군으로 구성된 군에서 선택된 유전자의 다양한 조합을 만드는 단계; 및
    (i) 상기 (h)단계에서 만든 조합들을 이루는 유전자들이 코딩하는 효소가 관여하는 반응식들에 대하여, 대사산물들 간의 반응을 나타내는 선에 해당 반응식의 노드를 추가로 만들어서, 이 반응식 노드들의 거리를 구하여 , 상기 대사 네트워크 상에서의 평균거리를 계산하여 상기 평균 거리가 평균 거리가 다른 조합들의 평균거리와 비교하여 먼 경우들의 조합을 이루는 유전자들을 약물 표적 유전자로 선정하거나, 이에 의해 코딩되는 효소들을 약물 표적 효소로 선정하는 단계.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비브리오(Vibrio) 속 미생물은 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계에서의 대사 네트워크 구축은 VV10014 (dGTP triphosphohydrolase), VV10053 (Histidine ammonia-lyase), VV10060 (Putative beta-ketoacyl-ACP reductase), VV10061 (Putative beta-ketoacyl-ACP synthase), VV10136 (Long-chain-fatty-acid-CoA ligase), VV10143 (Formyltetrahydrofolate hydrolase), VV10145 (Arginyl-tRNA synthetase), VV10154 (Succinyl-CoA synthetase, alpha subunit), VV10155 (Succinyl-CoA synthetase, beta subunit), VV10156 (2-oxoglutarate dehydrogenase complex, E2 component, dihydrolipoamide succinyltransferase), VV10157 (2-oxoglutarate dehydrogenase complex, E1 component), VV10158 (Succinate dehydrogenase, iron-sulfur protein), VV10159 (Succinate dehydrogenase, flavoprotein subunit), VV10160 (Succinate dehydrogenase, hydrophobic membrane anchor protein), VV10161 (Succinate dehydrogenase, cytochrome b556 subunit), VV10162 (Citrate synthase), VV10169 (Phosphoglucomutase), VV10176 (Glutaminyl-tRNA synthetase), VV10177 (#N/A), VV10179 (PTS system, N-acetylglucosamine-specific IIBC component), VV10180 (N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase), VV10183 (Asparagine synthase B, glutamine-hydrolyzing), VV10187 (Ferrochelatase), VV10188 (Adenylate kinase), VV10209 (Cysteine synthase A), VV10212 (PTS system, glucose-specific IIA component), VV10236 (Glutamyl-tRNA synthetase), VV10246 (Pseudouridine synthase family 1 protein), VV10248 (5'-nucleotidase precursor), VV10249 (2-dehydro-3-deoxyphosphooctonate aldolase), VV10254 (Glutamyl-tRNA reductase), VV10256 (4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase (CMK)), VV10257 (Ribose-phosphate pyrophosphokinase), VV10265 (2-polyprenyl-6-methoxyphenol hydroxylase and related FAD-dependent oxidoreductase), VV10272 (Leucyl-tRNA synthetase), VV10286 (Serine hydroxymethyltransferase), VV10288 (Trehalose-6-phosphate hydrolase), VV10289 (PTS system, trehalose-specific IIBC component), VV10291 (Histidinol phosphatase and related phosphatase), VV10314 (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase), VV10315 (1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase), VV10316 (Phosphatidylglycerophosphatase A), VV10317 (Thiamine monophosphate kinase), VV10319 (Riboflavin synthase beta-chain), VV10321 (3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthaseGTP cyclohydrolase II), VV10322 (Riboflavin synthase alpha chain), VV10323 (Riboflavin-specific deaminase), VV10325 (Gamma-glutamyl phosphate reductase), VV10326 (Glutamate 5-kinase), VV10329 (Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase), VV10333 (Aminoacyl-histidine dipeptidase), VV10340 (Phosphoribosylformylglycinamidine (FGAM) synthase), VV10344 (Zn-dependent alcohol dehydrogenase, class III), VV10366 (Putative inorganic polyphosphateATP-NAD kinase), VV10414 (Transcriptional regulator, LysR family), VV10418 (GMP synthase (glutamine-hydrolyzing)), VV10419 (GMP synthase (glutamine-hydrolyzing)), VV10426 (Histidyl-tRNA synthetase), VV10427 (Enzyme involved in the deoxyxylulose pathway of isoprenoid biosynthesis GcpE), VV10430 (Nucleoside diphosphate kinase), VV10449 (Isocitrate lyase), VV10450 (Malate synthase A), VV10465 (Exopolyphosphatase), VV10484 (Pseudouridylate synthase, 23S RNA-specific), VV10487 (Chorismate mutasepephenate dehydratase), VV10494 (Chorismate mutaseprephenate dehydrogenase), VV10495 (Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase, tyr-sensitive), VV10504 (Penicillin tolerance protein LytB), VV10507 (Isoleucyl-tRNA synthetase), VV10508 (FAD synthase), VV10516 (Thymidylate synthase), VV10526 (Lysyl-tRNA synthetase (class II)), VV10543 (Threonine synthase), VV10544 (Homoserine kinase), VV10545 (Aspartokinasehomoserine dehydrogenase, threonine-sensitive), VV10553 (Glutamate synthase, large subunit), VV10554 (Glutamate synthase, small subunit), VV10555 (Glutamate synthase, large subunit), VV10556 (Glutamate synthase, small subunit), VV10558 (Nucleoside phosphorylase), VV10559 (Cobalamin biosynthesis protein CobDCbiB), VV10565 (Carbamoylphosphate synthase large subunit (split gene in MJ)), VV10566 (Carbamoylphosphate synthase small subunit), VV10567 (Dihydrodipicolinate reductase), VV10571 (UDP-3-O-acyl-N-acetylglucosamine deacetylase), VV10577 (UDP-N-acetylmuramate-alanine ligase), VV10578 (UDP-N-acetylglucosamine-N-acetylmuramyl-(pentapeptide) pyrophosphoryl-undecaprenol N-acetylglucosamine transferase), VV10580 (UDP-N-acetylmuramoylalanine-D-glutamate ligase), VV10581 (Phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide-transferase), VV10582 (UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2, 6-diaminopimelate-D-alanyl-D-alanyl ligase), VV10583 (UDP-N-acetylmuramylalanyl-D-glutamate--2, 6-diaminopimelate ligase), VV10591 (Phosphoheptose isomerase), VV10595 (Ubiquinol--cytochrome c reductase, cytochrome c1), VV10596 (Ubiquinol--cytochrome c reductase, cytochrome B), VV10597 (Ubiquinol--cytochrome c reductase, iron-sulfur subunit), VV10610 (MutTnudix family protein), VV10613 (ADP-heptose synthase, bifunctional sugar kinaseadenylyltransferase), VV10623 (Putative undecaprenol kinase (Bacitracin resistance protein)), VV10625 (Dihydroneopterin aldolase FolB), VV10638 (PTS system, mannitol-specific IIABC component), VV10639 (Mannitol-1-phosphate 5-dehydrogenase), VV10641 (Glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase), VV10644 (Pyruvate kinase), VV10647 (Acetolactate synthase, small (regulatory) subunit), VV10648 (Acetolactate synthase III, large subunit), VV10649 (Long-chain acyl-CoA synthetase (AMP-forming)), VV10654 (2-isopropylmalate synthase), VV10655 (3-isopropylmalate dehydrogenase), VV10656 (3-isopropylmalate dehydratase, large subunit), VV10657 (3-isopropylmalate dehydratase, small subunit), VV10662 (Pyridoxal phosphate biosynthesis protein PdxA), VV10665 (Bis(5`-nucleosyl)-tetraphosphatase), VV10666 (Dihydrofolate reductase), VV10673 (Malate dehydrogenase), VV10678 (1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase), VV10679 (UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase), VV10688 (Low specificity phosphatase (HAD superfamily)), VV10705 (3-polyprenyl-4-hydroxybenzoate decarboxylase), VV10707 (Fructose-1,6-bisphosphatase), VV10708 (Inorganic pyrophosphatase), VV10723 (Adenylylsulfate kinase), VV10725 (Sulfate adenylate transferase subunit 1), VV10726 (Sulfate adenylate transferase, subunit 2), VV10727 (Uroporphyrinogen-III methylase), VV10728 (2`,3`-cyclic-nucleotide 2`-phosphodiesterase), VV10774 (Nucleotide sugar dehydrogenase), VV10779 (UDP-N-acetyl-D-mannosaminuronate dehydrogenase), VV10780 (UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase), VV10796 (ADP-L-glycero-D-mannoheptose-6-epimerase), VV10797 (Lipid A biosynthesis (kdo)2-(lauroyl)-lipid IVA acyltransferase), VV10799 (3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase (KDO transferase)), VV10803 (CMP-N-acetylneuraminic acid synthetase), VV10804 (Putative nucleoside-diphosphate-sugar pyrophosphorylase containing CBS domain), VV10808 (Sialic acid synthase), VV10814 (Putative KDO kinase WavC), VV10815 (Diacylglycerol kinase), VV10819 (Phosphopantetheine adenylyltransferase), VV10828 (DNApantothenate metabolism flavoprotein), VV10830 (Lipid A biosynthesis lauroyl acyltransferase), VV10831 (Orotate phosphoribosyltransferase), VV10850 (Guanylate kinase), VV10852 (Guanosine-3',5'-bis(diphosphate) 3'-pyrophosphohydrolase SpoT), VV10854 (ATP-dependent DNA helicase RecG), VV10881 (Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP)), VV10889 (Glutamine synthetase (glutamate-ammonia ligase)), VV10894 (Oxygen-independent coproporphyrinogen III oxidase), VV10902 (Delta-aminolevulinic acid dehydratase), VV10907 (Putative ubiquinone biosynthesis protein AarF), VV10909 (Ubiquinonemenaquinone biosynthesis methlytransferase UbiE), VV10933 (NAD(P)H-flavin reductase), VV10935 (3-polyprenyl-4-hydroxybenzoate decarboxylase and related decarboxylase), VV10940 (Guanosine-5'-triphosphate,3'-diphosphate pyrophosphatase), VV10963 (Thiamine monophosphate synthase ThiE), VV10964 (Thiamine biosynthesis protein ThiC), VV10978 (Protoporphyrinogen oxidase), VV10981 (Fatty oxidation complex, alpha subunit), VV10982 (Fatty oxidation complex, beta subunit), VV10989 (Glycyl-tRNA synthetase, alpha subunit), VV10990 (Glycyl-tRNA synthetase, beta subunit), VV10992 (Valine-pyruvate aminotransferase), VV11015 (ATP synthase F0, A subunit), VV11016 (ATP synthase F0, C subunit), VV11017 (ATP synthase F0, B subunit), VV11018 (ATP synthase F1, delta subunit), VV11019 (ATP synthase F1, alpha subunit), VV11020 (ATP synthase F1, gamma subunit), VV11021 (ATP synthase F1, beta subunit), VV11022 (ATP synthase F1, epsilon subunit), VV11023 (UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase), VV11028 (Threonine dehydratase), VV11029 (Dihydroxy-acid dehydratase (DAD)), VV11030 (Branched-chain amino acid aminotransferase), VV11031 (Acetolactate synthase II, small (regulatory) subunit), VV11032 (Acetolactate synthase II, large subunit), VV11047 (Methionyl-tRNA formyltransferase), VV11053 (Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, ATPase subunit), VV11054 (Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, catalytic subunit), VV11056 (Coproporphyrinogen III oxidase, aerobic), VV11057 (Shikimate 5-dehydrogenase), VV11077 (Ketol-acid reductoisomerase IlvC), VV11083 (#N/A), VV11099 (Phosphogluconate dehydratase), VV11100 (Thermoresistant gluconokinase), VV11102 (2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase), VV11105 (Glutathione reductase), VV11120 (Uncharacterized enzyme of heme biosynthesis HemX), VV11121 (Uroporphyrinogen-III synthase HemD), VV11122 (Porphobilinogen deaminase), VV11123 (Adenylate cyclase Cya), VV11126 (Diaminopimelate decarboxylase), VV11127 (Diaminopimelate epimerase DapF), VV11141 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), VV11153 (N6-adenine-specific_methylase), VV11163 (Chorismate-pyruvate lyase), VV11164 (4-hydroxybenzoate octaprenyltransferase), VV11165 (Glycerol-3-phosphate acyltransferase), VV11168 (Pyridine nucleotide-disulfide oxidoreductase, class I), VV11175 (Glutamate racemase), VV11195 (Phosphatidylserine synthase), VV11197 (UDP-N-acetylenolpyruvoylglucosamine reductase), VV11198 (BirA bifunctional protein), VV11199 (#N/A), VV11200 (Pantothenate kinase), VV11218 (Uroporphyrinogen decarboxylase), VV11226 (Phosphoribosylamine-glycine ligase PurD), VV11227 (Phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransperaseIMP cyclohydrolase PurH), VV11234 (Acetyl-CoA carboxylase, biotin carboxylase), VV11235 (Acetyl-CoA carboxylase, biotin carboxyl carrier protein), VV11236 (3-dehydroquinate dehydratase II), VV11237 (Acetyl-coenzyme A synthetase), VV11249 (Aspartate ammonia-lyase), VV11257 (6-phosphofructokinase, isozyme I), VV11266 (Fumarate reductase, 13 kDa hdrophobic protein), VV11267 (Fumarate reductase, 15 kDa hdrophobic protein), VV11268 (Fumarate reductase, Fe-S protein), VV11269 (Fumarate reductase, flavoprotein subunit), VV11270 (Putative lysyl-tRNA synthetase), VV11276 (Serine acetyltransferase), VV11277 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase), VV11281 (2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase), VV11284 (Phosphatidylserine decarboxylase), VV11291 (N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase), VV11299 (Adenylosuccinate synthetase), VV11306 (Phosphoglycolate phosphatase), VV11307 (Tryptophanyl-tRNA synthetase), VV11311 (Para-aminobenzoate synthase glutamine amidotransferase, component II), VV11312 (#N/A), VV11313 (Acetylornithine aminotransferase), VV11314 (Arginineornithine N-succinyltransferase beta subunit), VV11315 (NAD- dependent aldehyde dehydrogenase), VV11328 (Asparaginase 2), VV11342 (UDP-glucose 4-epimerase), VV11343 (Triosephosphate isomerase), VV11345 (5-carboxymethyl-2-hydroxymuconate isomerase), VV11349 (Glycerol metabiolism protein GlpX), VV11353 (1,4-dihydroxy-2-naphthoate octaprenyltransferase), VV11361 (Putative malate oxidoreductase), VV11364 (Cystathionine gamma-synthase), VV11365 (Aspartokinase IIhomoserine dehydrogenase, methionine-sensitive), VV11366 (5,10-methylenetetrahydrofolate reductase), VV11369 (Phosphoenolpyruvate carboxylase), VV11370 (Acetylornithine deacetylase), VV11371 (N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase), VV11372 (Acetylglutamate kinase), VV11373 (Argininosuccinate synthase), VV11374 (Bifunctional protein ArgH {Includes: Argininosuccinate lyase (Arginosuccinase) (ASAL); Probable acetyltransferase }), VV11382 (Shikimate kinase), VV11383 (3-dehydroquinate synthetase), VV11386 (Ribulose-phosphate-3-epimerase), VV11393 (Alanine racemase), VV11396 (Glucose-6-phosphate isomerase), VV11402 (Sulfite reductase (NADPH) flavoprotein alpha subunit), VV11403 (Sulfite reductase (NADPH) hemoprotein beta subunit), VV11404 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate sulfotransferase (PAPS reductase)), VV11423 (Cobalamin-dependent methionine synthase), VV11424 (Aspartokinase III, lysine-sensitive), VV11425 (Aminotransferase, class V), VV11428 (UDP--glucose-1-phosphate uridylyltransferase), VV11453 (Ribonucleases G and E), VV11461 (Ribosomal large subunit pseudouridine synthase A), VV11464 (Aspartate carbamoyltransferase, regulatory subunit), VV11465 (Aspartate carbamoyltransferase, catalytic chain), VV11466 (Ornithine carbamoyltransferase), VV11467 (Arginine deiminase), VV11474 (Valyl-tRNA synthetase), VV11485 (6-phospho-beta-glucosidase), VV11517 (Glutaminase family protein), VV11519 (Putative oxygen-independent coproporphyrinogen III oxidase), VV11524 (Pyrroline-5-carboxylate reductase), VV11530 (Glutathione synthetase), VV11536 (S-adenosylmethionine synthetase), VV11537 (Transketolase 1), VV11539 (Erythrose-4-phosphate dehydrogenase), VV11540 (3-phosphoglycerate kinase), VV11541 (Fructose-bisphosphate aldolase, class II), VV11546 (D-3-phosphoglycerate dehydrogenase), VV11547 (Ribose 5-phosphate isomerase), VV11552 (2-Polyprenyl-6-methoxyphenol hydroxylase UbiH), VV11558 (L-aspartate oxidase), VV11568 (Pyridoxal phosphate biosynthesis protein PdxJ), VV11569 (Holo-(acyl-carrier-protein) synthase), VV11575 (GTP pyrophosphokinase (ppGpp synthetase) SpoT), VV11576 (#N/A), VV11578 (CTP synthase (UTP-ammonia lyase)), VV11579 (Enolase), VV11582 (4-diphosphocytidyl-2-methyl-D-erythritol synthase), VV11583 (2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (MECPS)), VV11584 (tRNA pseudouridine synthase D), VV11585 (Acid phosphatase SurE (survival protein SurE)), VV11593 (Alanyl-tRNA synthetase), VV11594 (Aspartokinase, alpha and beta subunits), VV11600 (Oxaloacetate decarboxylase, gamma subunit), VV11601 (Oxaloacetate decarboxylase, alpha subunit), VV11602 (Oxaloacetate decarboxylase, beta subunit), VV11606 (Glutamate--cysteine ligase), VV11608 (Autoinducer-2 synthase LuxS), VV11621 (#N/A), VV11622 (Dephospho-CoA kinase), VV11627 (Nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase, NadC), VV11630 (Pyruvate dehydrogenase complex E1 component), VV11631 (Pyruvate dehydrogenase complex E2 component, dihydrolipoamide acyltransferase), VV11632 (Pyruvate dehydrogenase complex E3 component, dihydrolipoamide dehydrogenase), VV11635 (#N/A), VV11636 (Hypoxanthine phosphoribosyltransferase), VV11637 (Putative carbonic anhydrase), VV11642 (Pantoate--beta-alanine ligase), VV11643 (3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase), VV11644 (2-amino-4-hydroxy-6- hydroxymethyldihydropteridine pyrophosphokinase), VV11653 (Aconitase hydratase B), VV11654 (Glycerate kinase), VV11664 (Phosphomannomutase), VV11678 (Glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase (GSA)), VV11683 (Tyrosyl-tRNA synthetase), VV11691 (Dihydropteroate synthase), VV11692 (Phosphomannomutase), VV11698 (tRNA pseudouridine synthase B), VV11716 (Predicted acetyltransferase), VV11725 (Deoxyribose-phosphate aldolase), VV11726 (Thymidine phosphorylase), VV11727 (Phosphopentomutase), VV11728 (Purine-nucleoside phosphorylase), VV11730 (Phosphoserine phosphatase), VV11766 (Evolved beta-D-galactosidase, beta subunit), VV11767 (Evolved beta-D-galactosidase, alpha-subunit), VV11770 (UDP-glucose 4-epimerase), VV11771 (Galactose-1-phosphate uridylyltransferase), VV11772 (Galactokinase), VV11773 (Galactose-1-epimerase), VV11785 (Aerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase), VV11787 (Glycerol kinase), VV11790 (Tetrahydrodipicolinate N-succinyltransferase), VV11799 (Amino-acid acetyltransferase (N-acetylglutamate synthase)), VV11810 (2-dehydropantoate 2-reductase), VV11838 (Prolyl-tRNA synthetase), VV11846 (FabH, 3-oxoacyl-{acyl-carrier-protein}), VV11855 (tRNA pseudouridine synthase C (Pseudouridylate synthase)), VV11865 (CDP-diglyceride synthetase), VV11866 (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase), VV11870 (UDP-3-O-{3-hydroxymyristoyl} glucosamine N-acyltransferase), VV11872 (Acyl-(acyl-carrier-protein)--UDP-N-acetylglucosamine O-acyltransferase), VV11873 (Lipid A disaccharide synthetase), VV11876 (Acetyl-CoA carboxylase alpha subunit), VV11883 (Putative hydroxyacylglutathione hydrolase GloB), VV11896 (Oxidoreductase, acyl-CoA dehydrogenase family), VV11897 (Phosphoheptose isomerase), VV11899 (Folate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase PurN), VV11900 (Phosphoribosylformylglycinamidine cyclo-ligase), VV11901 (Uracil phosphoribosyltransferase), VV11912 (Dihydrodipicolinate synthase DapA), VV11916 (Succinyl-diaminopimelate desuccinylase), VV11975 (Fatty oxidation complex, beta subunit), VV11976 (Fatty oxidation complex, alpha subunit), VV11978 (Phosphohistidine phosphatase SixA), VV11981 (Chorismate synthase (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate phospholyase)), VV11986 (3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase I), VV11988 (Erythronate-4-phosphate dehydrogenase), VV11989 (Aspartate-semialdehyde dehydrogenase Asd), VV11992 (tRNA pseudouridine synthase A), VV11993 (Acetyl-CoA carboxylase, carboxyl transferase beta subunit), VV11994 (Folylpolyglutamate synthasedihydrofolate synthase), VV11997 (Glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase), VV12002 (Adenine phosphoribosyltransferase), VV12016 (Putative lactoylglutathione lyase), VV12022 (5,10-methylene-tetrahydrofolate dehydrogenasemethenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), VV12064 (Uridine phosphorylase), VV12074 (NADH dehydrogenase, FAD-containing subunit), VV12075 (#N/A), VV12086 (Tetraacyldisaccharide 4`-kinase), VV12088 (3-deoxy-manno-octulosonate cytidylyltransferase), VV12098 (Formate acetyltransferase), VV12116 (Pseudouridine synthase family 1 protein), VV12118 (Isocitrate dehydrogenase), VV12126 (#N/A), VV12127 (3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase), VV12131 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase), VV12132 (Glycogen synthase), VV12156 (Aspartyl-tRNA synthetase), VV12162 (Cytochrome d ubiquinol oxidase, subunit I), VV12163 (Cytochrome d ubiquinol oxidase, subunit II), VV12173 (Quinolinate synthetase A), VV12200 (D-Lactate dehydrogenase), VV12219 (5-Methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase), VV12220 (Phosphate acetyltransferase), VV12221 (Acetate kinase), VV12227 (Glycosidase), VV12234 (GTP cyclohydrolase II), VV12248 (Aspartate aminotransferase), VV12254 (Asparaginyl-tRNA synthetase (Asparagine-tRNA ligase) (AsnRS)), VV12257 (6-pyruvoyl tetrahydrobiopterin synthase), VV12260 (L-serine dehydratase 1), VV12265 (Para-Aminobenzoate synthase, component I), VV12266 (Fumarate hydratase, class I), VV12341 (Acyl carrier protein phosphodiesterase), VV12349 (Lactonizing lipase), VV12355 (Agmatinase), VV12356 (Biosynthetic arginine decarboxylase), VV12357 (#N/A), VV12370 (Phenylalanyl-tRNA synthetase, alpha chain), VV12371 (Phenylalanyl-tRNA synthetase, beta chain), VV12372 (Nicotinate phosphoribosyltransferase), VV12374 (Nicotinamidasepyrazinamidase), VV12378 (Phosphoribosylglycinamide formyltransferase 2), VV12379 (Cytidine deaminase), VV12389 (Histidine ammonia-lyase), VV12390 (Urocanate hydratase), VV12391 (Formiminoglutamase), VV12392 (Imidazolonepropionase), VV12397 (Threonyl-tRNA synthetase), VV12448 (Putative acetyltransferase), VV12560 (Riboflavin synthase alpha chain), VV12590 (Putative formate dehydrogenase large subunit), VV12591 (Formate dehydrogenase, iron-sulfur subunit), VV12592 (Formate dehydrogenase, cytochrome b556 subunit), VV12599 (NAD-dependent protein deacetylase, SIR2 family), VV12614 (Cation transport ATPase), VV12617 (Cytochrome c oxidase, subunit CcoP), VV12618 (Cytochrome c oxidase, subunit CcoQ), VV12619 (Cytochrome c oxidase, subunit CcoO), VV12620 (Cytochrome c oxidase, subunit CcoN), VV12637 (Dihydroorotate dehydrogenase), VV12641 (Aminopeptidase N), VV12654 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase), VV12682 (6-phosphogluconate dehydrogenase), VV12683 (6-phosphogluconolactonase), VV12684 (Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase), VV12699 (1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase), VV12702 (Uroporphyrinogen-III methylase), VV12711 (Acylphosphatase), VV12730 (Aconitate hydratase 1), VV12731 (Methylcitrate synthase), VV12732 (Carboxyphosphonoenolpyruvate phosphonomutase), VV12754 (Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase), VV12755 (Catalase-peroxidase KatG), VV12765 (Glutathione S-transferase), VV12768 (Hemolysin VllY), VV12771 (Putative 2',3'-cyclic-nucleotide 2'-phosphodiesterase), VV12772 (Homoserine O-succinyltransferase), VV12783 (Succinylglutamate desuccinylase), VV12785 (Fructose-2,6-bisphosphatase), VV12786 (Adenosyl cobinamide kinaseadenosyl cobinamide phosphate guanylyltransferase), VV12787 (Cobalamin-5-phosphate synthase), VV12788 (NaMN:DMB phosphoribosyltransferase), VV12797 (Phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide (SAICAR) synthase), VV12799 (Outer membrane phospholipase A), VV12801 (Malate oxidoreductase), VV12810 (Thioredoxin reductase), VV12813 (Phosphoserine aminotransferase), VV12824 (Putative glutamate decarboxylase), VV12826 (Alcohol dehydrogenase), VV12843 (Ribosomal small subunit pseudouridine synthase A), VV12871 (Cardiolipin synthase), VV12872 (Cystathionine beta-lyase), VV12888 (Inorganic pyrophosphataseexopolyphosphatase), VV12890 (Putative alpha-1, 6-galactosidase), VV12907 (Thymidine kinase), VV12908 (Cysteinyl-tRNA synthetase), VV12910 (Conserved hypothetical protein), VV12913 (Phosphoribosyl-AMP cyclohydrolasephosphoribosyl-ATP pyrophosphohydrolase), VV12914 (Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisF), VV12915 (Phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (ProFAR) isomerase), VV12916 (Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisH), VV12917 (Histidine biosynthesis bifunctional protein HisB {Includes: Histidinol-phosphatase ; Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase (IGPD)}), VV12918 (Histidine biosynthesis bifunctional protein HisB {Includes: Histidinol-phosphatase ; Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase (IGPD)}), VV12919 (Histidinol dehydrogenase), VV12920 (ATP phosphoribosyltransferase), VV12924 (Inosine-guanosine kinase), VV12928 (Adenylosuccinate lyase), VV12940 (Dethiobiotin synthetase), VV12942 (8-amino-7-oxononanoate synthase), VV12943 (Biotin synthase), VV12944 (Adenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate aminotransferase), VV12945 (#N/A), VV12946 (Seryl-tRNA synthetase), VV12952 (Alanine dehydrogenase), VV12977 (Orotidine-5'-phosphate decarboxylase), VV12983 (Cytidylate kinase), VV12992 (Pyruvate kinase II), VV12999 (PTS system, glucose-specific IIBC component), VV13002 (Thymidylate kinase), VV13005 (4-amino-4-deoxychorismate lyase), VV13006 (3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase II), VV13007 (Hypothetical protein), VV13009 (3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase), VV13010 (Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase), VV13011 (3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase III), VV13016 (23S rRNA ribosomal pseudouridine synthase), VV13018 (Ribonuclease E), VV13022 (Cob(I)alamin adenosyltransferase), VV13025 (Uridine kinase), VV13028 (Methionyl-tRNA synthetase), VV13035 (Formate-dependent nitrite reductase, periplasmic cytochrome c552 subunit NrfA), VV13040 (3-demethylubiquinone-9 3-methyltransferase), VV13041 (Ribonucleoside-diphosphate reductase, alpha subunit), VV13042 (Ribonucleoside-diphosphate reductase, beta subunit), VV13050 (Diaminobutyrate-pyruvate transaminaseL-2,4-diaminobutyrate decarboxylase), VV13052 (Phosphatidylglycerophosphate synthase), VV13060 (Pseudouridine synthase family 1 protein), VV13064 (Anthranilate synthase component I), VV13065 (Anthranilate synthase component II), VV13066 (Anthranilate phosphoribosyltransferase), VV13067 (Indole-3-glycerol phosphate synthase IgpSphosphoribosylanthranilate isomerase TrpF), VV13068 (Tryptophan synthase beta chain), VV13069 (Tryptophan synthase alpha chain), VV13100 (Lactoylglutathione lyase), VV13111 (Alcohol dehydrogenaseacetaldehyde dehydrogenase), VV13115 (Aspartate-semialdehyde dehydrogenase), VV13135 (L-asparaginase I), VV13140 (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), VV13153 (Cysteine synthase), VV13168 (O-succinylbenzoic acid-CoA ligase), VV13169 (O-succinylbenzoate-CoA synthase), VV13170 (Dihydroxynaphthoic acid synthase), VV13172 (2-succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylate synthase), VV13173 (Menaquinone-specific isochorismate synthase), VV13174 (Putative aspartate aminotransferase), VV20005 (Phosphoenolpyruvate synthase), VV20010 (Anaerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase, subunit A), VV20011 (Anaerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase, subunit B), VV20012 (Anaerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase, subunit C), VV20019 (Alcohol dehydrogenase, class IV), VV20053 (L-allo-threonine aldolase), VV20065 (Ribokinase), VV20117 (Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase), VV20123 (Methylglyoxal synthase), VV20148 (Acetate kinase 2), VV20186 (Glycine cleavage system P protein (pyridoxal-binding)), VV20188 (Serine hydroxymethyltransferase), VV20190 (Glycine cleavage system T protein (aminomethyltransferase)), VV20198 (PTS system, fructose-specific IIBC component), VV20199 (1-Phosphofructokinase), VV20200 (PTS system, fructose-specific IIAFPR component), VV20206 (Pyruvate kinase II), VV20214 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase 2), VV20216 (Formate-tetrahydrofolate ligase), VV20217 (#N/A), VV20218 (Inosine-guanosine kinase), VV20237 (Putative 5'-nucleotidase), VV20256 (Glycosidase), VV20280 (D-alanine-D-alanine ligase), VV20315 (#N/A), VV20316 (NAD(P) transhydrogenase beta subunit), VV20317 (NAD(P) transhydrogenase alpha subunit), VV20330 (Cobyric acid synthase), VV20334 (Amino acid biosynthesis aminotransferase), VV20337 (Anareobic ribonucleoside-triphosphate reductase), VV20349 (3-Oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase III), VV20367 (Uroporphyrinogen-III methylase), VV20369 (Nitrite reductase {NAD(P)H}, small subunit), VV20370 (Nitrite reductase {NAD(P)H}, large subunit), VV20389 (Ferredoxin subunits of nitrite reductase and ring-hydroxylating dioxygenase), VV20390 (NAD(P)H-nitrite reductase), VV20397 (Uroporphyrinogen-III methylase), VV20398 (Anaerobic dehydrogenase, typically selenocysteine-containing), VV20400 (Alpha-amylase), VV20407 (Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase), VV20455 (Phenylalanine-4-hydroxylase), VV20456 (Acetyl-CoA synthase), VV20468 (Adenosine deaminase), VV20469 (Putative pyruvate dehydrogenase E1 component, alpha subunit), VV20470 (Putative pyruvate dehydrogenase E1 component, beta subunit), VV20471 (Putative dihydrolipoamide acetyltransferase), VV20478 (Alanine racemase 2), VV20488 (Putative short-hanin alcohol dehydrogenase), VV20489 (3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase), VV20490 (Enoyl-CoA hydrataseisomerase family), VV20491 (Enoyl-CoA hydrataseisomerase family), VV20493 (NAD-dependent aldehyde dehydrogenase), VV20494 (Acetyl-CoA acetyltransferase), VV20496 (Acyl-CoA dehydrogenase), VV20497 (Acetyl-CoA carboxylase, carboxyltransferase component), VV20498 (Enoyl-CoA hydratasecarnithine racemase), VV20499 (Putative hydroxymethylglutaryl-CoA lyase), VV20500 (#N/A), VV20514 (#N/A), VV20515 (Mannose-6-phosphate isomerase), VV20531 (Deoxycytidylate deaminase), VV20532 (Peptidase T), VV20543 (GTP cyclohydrolase I), VV20552 (Transaldolase B), VV20553 (Transketolase 1), VV20558 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase), VV20560 (Polyprenyltransferase (cytochrome oxidase assembly factor)), VV20561 (Uncharacterized protein required for cytochrome oxidase assembly), VV20565 (Cytochrome C oxidase, subunit III), VV20566 (Cytochrome C oxidase assembly factor CtaG), VV20567 (Cytochrome C oxidase, subunit I), VV20568 (Cytochrome C oxidase, subunit II), VV20569 (Phosphomannomutase), VV20712 (GMP reductase), VV20721 (Periplasmic nitrate reductase), VV20730 (Putative N-acetylneuraminate lyase), VV20734 (Putative N-acetylmannosamine-6-phosphate epimerase), VV20735 (Putative N-acetylmannosamine kinase), VV20736 (N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase), VV20741 (Acetyl-CoA acetyltransferase), VV20742 (Acetoacetyl-CoA reductase), VV20752 (Autoinducer 2 sensor kinasephosphatase LuxQ), VV20768 (Adenylosuccinate synthase), VV20789 (Cytosine deaminase), VV20833 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase), VV20835 (Vulnibactin-specific isochorismate synthase), VV20854 (Tryptophanase), VV20869 (NAD-dependent aldehyde dehydrogenase), VV20878 (Tyrosyl-tRNA synthetase), VV20903 (Alpha-amylase), VV20904 (2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase), VV20905 (2-keto-3-deoxygluconate kinase), VV20914 (2-deoxy-D-gluconate 3-dehydrogenase), VV20966 (Oxygen-insensitive NAD(P)H nitroreductase), VV20996 (Methionine synthase II (cobalamin-independent)), VV21024 (Predicted tagatose 6-phosphate kinase), VV21030 (Diaminopimelate decarboxylase), VV21050 (6-phospho-beta-glucosidase, Family 4 glycosyl hydrolase), VV21062 (Bifunctional PLP-dependent enzyme with beta-cystathionase and maltose regulon repressor activities), VV21064 (D-mannonate dehydratase), VV21069 (Mannonate oxidoreductase), VV21070 (Uronate isomerase), VV21071 (Sugar kinase, ribokinase family), VV21072 (2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase), VV21084 (3-hexulose-6-phosphate synthase SgbH), VV21085 (Putative hexulose-6-phosphate isomerase SgbU), VV21093 (Dehydrogenase with different specificities (related to short-chain alcohol dehydrogenases)), VV21094 (Galactose-1-phosphate uridylyltransferase), VV21095 (UDP-glucose 4-epimerase), VV21118 (Putative proline dehydrogenase), VV21122 (Pyridoxamine-phosphate oxidase), VV21136 (Putative acetyltransferase (isoleucine patch superfamily)), VV21142 (Putative PTS system sucrose-specific IIBC component), VV21180 (GTP cyclohydrolase II), VV21200 (Glucosamine-6-phosphate isomerase), VV21204 (Glutathione synthase), VV21235 (Ornithine decarboxylase, inducible), VV21237 (Putative pyridoxine kinase), VV21250 (Maltodextrin phosphorylase), VV21251 (4-alpha-glucanotransferase), VV21266 (NAD-dependent aldehyde dehydrogenase), VV21287 (Glycosyl hydrolase family 1), VV21318 (Pseudouridylate synthase, 23S RNA-specific), VV21327 (Beta-galactosidase LacZ), VV21330 (Alpha-galactosidase), VV21348 (Mannose-6-phosphate isomerase), VV21349 (PTS system, fructose-specific IIABC component), VV21352 (PTS system fructose-specific component IIB), VV21353 (PTS system, fructose-specific IIABC component), VV21356 (PTS system, fructose-specific IIBC component), VV21357 (PTS system, fructose-specific IIA component), VV21373 (Uridine phosphorylase), VV21395 (Probable taurine catabolism dioxygenase), VV21412 (Diacylglycerol kinase), VV21426 (3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase (DHBP synthase)), VV21432 (Putative membrane-associated phospholipid phosphatase), VV21433 (Phosphomethylpyrimidine kinase), VV21457 (Lactate dehydrogenase), VV21473 (Catalase KatE), VV21484 (2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase), VV21485 (L-threonine 3-dehydrogenase), VV21520 (Carbonic anhydrase), VV21540 (Purine-nucleoside phosphorylase), VV21596 (Dihydroorotase), VV21599 (NH(3)-dependent NAD(+) synthetase), VV21615 (Coproporphyrinogen III oxidase), VV21622 (Alpha-amylase), VV21635 (Spermidine synthase), VV21637 (3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase), VV21651 (Hexapeptide-repeat containing-acetyltransferase), VV21663 (4-aminobutyrate aminotransferase), VV21664 (2-aminoethylphosphonate:pyruvate aminotransferase), VV21677 (L-serine deaminase), VV21687 (NAD-dependent aldehyde dehydrogenase), VV21688 (Choline dehydrogenase)으로 구성된 유전자 군에 기반한 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (c)단계의 선형계획법의 적용은 세포의 성장에 필요한 모든 영양분 조건을 반영하여 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 영양분은 (S)-Lactate, (S)-Malate, 2-Oxoglutarate, 2-Phospho-D-glycerate, 3-Phospho-D-glycerate, Acetate, Adenosine, alpha,alpha-Trehalose, alpha-D-Glucose, Citrate, Cytidine, Cytosine, D-alanine, Deoxyadenosine, Deoxycytidine, Deoxyguanosine, Deoxyuridine, D-Fructose, D-Gluconate, D-Glutamate, D-Mannitol, Fumarate, Glycerol, Glycine, Glycolate, Guanosine, Isocitrate, Isomaltose, L-Alanine, L-Arginine, L-Asparagine, L-Aspartate, L-Cysteine, L-Glutamate, L-Glutamine, L-Histidine, L-Homoserine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine, L-Methionine, L-Ornithine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine, L-Valine, Maltose, Melibiose, N-Acetyl-D-glucosamine, NH3, Nitrate, Nitrite, O2, phosphate, Putrescine, sn-Glycerol 3-phosphate, sodium, Spermidine, Succinate, Sucrose, sulfate, Thymidine, Uracil, Urea, Uridine, Xanthine으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3중 어느 한 항에 있어서, 상기 (h)단계에서 유전자의 조합을 만들 때, 제2 약물 표적 유전자군을 이루는 유전자들 중에서 비필수 반응식(nonessential reaction)에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 동일한 조합에 속하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3중 어느 한 항에 있어서, 상기 (h)단계에서 유전자의 조합을 만들 때, 제2 약물 표적 유전자군에서 선택되는 유전자는 동일한 조합에 속하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제3중 어느 한 항에 있어서, 상기 쵸크포인트 분석에 의해 선정된 약물 표적 효소 후보들은 VV10053, VV10060, VV10061, VV10136, VV10145, VV10156, VV10157, VV10176, VV10177, VV10179, VV10187, VV10209, VV10236, VV10246, VV10248, VV10249, VV10254, VV10256, VV10265, VV10272, VV10288, VV10289, VV10291, VV10314, VV10315, VV10316, VV10319, VV10321, VV10322, VV10323, VV10325, VV10326, VV10333, VV10340, VV10344, VV10414, VV10426, VV10427, VV10430, VV10450, VV10465, VV10484, VV10487, VV10494, VV10495, VV10504, VV10507, VV10508, VV10526, VV10543, VV10544, VV10545, VV10558, VV10559, VV10565, VV10566, VV10571, VV10577, VV10578, VV10580, VV10581, VV10582, VV10583, VV10591, VV10610, VV10613, VV10623, VV10625, VV10638, VV10639, VV10647, VV10648, VV10649, VV10654, VV10655, VV10656, VV10657, VV10662, VV10665, VV10678, VV10679, VV10688, VV10705, VV10723, VV10725, VV10726, VV10727, VV10728, VV10774, VV10779, VV10796, VV10797, VV10799, VV10803, VV10804, VV10808, VV10814, VV10819, VV10828, VV10830, VV10831, VV10852, VV10854, VV10889, VV10902, VV10907, VV10909, VV10933, VV10935, VV10940, VV10963, VV10964, VV10978, VV10981, VV10982, VV10989, VV10990, VV11023, VV11029, VV11030, VV11031, VV11032, VV11047, VV11053, VV11054, VV11057, VV11077, VV11083, VV11100, VV11102, VV11120, VV11121, VV11122, VV11123, VV11127, VV11141, VV11153, VV11163, VV11164, VV11165, VV11195, VV11197, VV11198, VV11199, VV11200, VV11218, VV11226, VV11227, VV11234, VV11235, VV11236, VV11237, VV11257, VV11270, VV11276, VV11284, VV11291, VV11299, VV11306, VV11307, VV11311, VV11312, VV11313, VV11314, VV11315, VV11342, VV11345, VV11353, VV11364, VV11365, VV11370, VV11371, VV11372, VV11373, VV11374, VV11382, VV11383, VV11386, VV11396, VV11402, VV11403, VV11404, VV11423, VV11424, VV11425, VV11428, VV11461, VV11464, VV11465, VV11474, VV11485, VV11517, VV11530, VV11536, VV11537, VV11539, VV11546, VV11552, VV11568, VV11569, VV11575, VV11576, VV11579, VV11582, VV11583, VV11584, VV11593, VV11594, VV11606, VV11608, VV11621, VV11622, VV11627, VV11630, VV11631, VV11632, VV11637, VV11642, VV11643, VV11644, VV11653, VV11654, VV11664, VV11678, VV11683, VV11691, VV11692, VV11698, VV11716, VV11725, VV11726, VV11727, VV11728, VV11730, VV11766, VV11767, VV11770, VV11772, VV11787, VV11790, VV11799, VV11810, VV11838, VV11846, VV11855, VV11865, VV11866, VV11870, VV11872, VV11873, VV11876, VV11883, VV11896, VV11897, VV11900, VV11912, VV11916, VV11975, VV11976, VV11978, VV11981, VV11986, VV11988, VV11989, VV11992, VV11993, VV11994, VV11997, VV12002, VV12016, VV12022, VV12064, VV12074, VV12075, VV12086, VV12088, VV12116, VV12126, VV12127, VV12131, VV12132, VV12156, VV12173, VV12219, VV12220, VV12227, VV12234, VV12248, VV12254, VV12257, VV12260, VV12265, VV12341, VV12349, VV12355, VV12356, VV12357, VV12370, VV12371, VV12378, VV12379, VV12389, VV12390, VV12391, VV12392, VV12397, VV12448, VV12560, VV12599, VV12614, VV12641, VV12654, VV12682, VV12683, VV12699, VV12702, VV12730, VV12731, VV12732, VV12754, VV12755, VV12765, VV12768, VV12771, VV12772, VV12783, VV12785, VV12786, VV12787, VV12788, VV12797, VV12799, VV12810, VV12813, VV12824, VV12826, VV12843, VV12871, VV12872, VV12890, VV12908, VV12910, VV12913, VV12914, VV12915, VV12916, VV12917, VV12918, VV12919, VV12920, VV12924, VV12928, VV12940, VV12942, VV12943, VV12944, VV12945, VV12946, VV12977, VV12983, VV13005, VV13006, VV13007, VV13009, VV13010, VV13011, VV13016, VV13022, VV13028, VV13040, VV13050, VV13052, VV13060, VV13066, VV13067, VV13068, VV13069, VV13100, VV13111, VV13115, VV13140, VV13153, VV13168, VV13169, VV13170, VV13172, VV13173, VV13174, VV20019, VV20053, VV20065, VV20117, VV20123, VV20186, VV20190, VV20198, VV20200, VV20214, VV20218, VV20237, VV20256, VV20280, VV20330, VV20334, VV20349, VV20367, VV20397, VV20398, VV20407, VV20455, VV20456, VV20468, VV20469, VV20470, VV20471, VV20488, VV20490, VV20491, VV20493, VV20496, VV20497, VV20498, VV20499, VV20500, VV20532, VV20543, VV20552, VV20553, VV20558, VV20569, VV20721, VV20742, VV20752, VV20768, VV20789, VV20833, VV20835, VV20854, VV20869, VV20878, VV20904, VV20914, VV20996, VV21024, VV21050, VV21062, VV21064, VV21069, VV21070, VV21072, VV21084, VV21085, VV21093, VV21095, VV21118, VV21136, VV21142, VV21180, VV21204, VV21237, VV21250, VV21251, VV21287, VV21318, VV21327, VV21330, VV21349, VV21352, VV21353, VV21356, VV21357, VV21373, VV21395, VV21426, VV21432, VV21433, VV21457, VV21473, VV21520, VV21540, VV21596, VV21599, VV21635, VV21651, VV21663, VV21664 및 VV21677로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제3중 어느 한 항에 있어서, 상기 선형계획법을 적용하여 선정된 약물 표적 효소 후보들은 VV10060, VV10061, VV10136, VV10256, VV10291, VV10314, VV10315, VV10316, VV10319, VV10321, VV10322, VV10323, VV10366, VV10427, VV10430, VV10495, VV10504, VV10508, VV10558, VV10577, VV10578, VV10580, VV10581, VV10582, VV10583, VV10591, VV10613, VV10623, VV10625, VV10649, VV10662, VV10678, VV10679, VV10796, VV10819, VV10828, VV10850, VV10854, VV10889, VV10909, VV10981, VV10982, VV11057, VV11083, VV11127, VV11165, VV11195, VV11197, VV11200, VV11234, VV11235, VV11236, VV11284, VV11311, VV11312, VV11353, VV11382, VV11383, VV11423, VV11536, VV11539, VV11547, VV11558, VV11568, VV11582, VV11583, VV11608, VV11621, VV11622, VV11627, VV11642, VV11643, VV11790, VV11810, VV11846, VV11865, VV11866, VV11876, VV11896, VV11897, VV11912, VV11916, VV11975, VV11976, VV11981, VV11986, VV11988, VV11993, VV11994, VV12098, VV12126, VV12127, VV12131, VV12132, VV12173, VV12234, VV12265, VV12560, VV12614, VV12654, VV12699, VV12799, VV12810, VV12813, VV12824, VV12983, VV13002, VV13005, VV13006, VV13007, VV13009, VV13010, VV13011, VV13052, VV13168, VV13169, VV13170, VV13172, VV13173, VV20065, VV20214, VV20280, VV20349, VV20488, VV20490, VV20491, VV20498, VV20543, VV20558, VV20752, VV20833, VV20835, VV21180, VV21426, VV21432 및 VV21599로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제3중 어느 한 항에 있어서, 상기 (f)단계에서 수득된 필수 대사산물은 1,4-dihydroxy-2-naphthoate, 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate , 2,3-Dihydrodipicolinate, 2-Amino-4-hydroxy-6-(erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)-dihydropteridine triphosphate, 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine, 2-Demethylmenaquinone, 2-Oxobutanoate, 2-Oxoglutarate, 3-Dehydroshikimate, 3-Methyl-2-oxobutanoic acid, 4-Aminobenzoate, 5,10-Methylenetetrahydrofolate, 5-Phospho-alpha-D-ribose 1-diphosphate, Acetyl-[acyl-carrier protein], Acetyl-CoA, Acyl-carrier protein, all-trans-Octaprenyl diphosphate, AMP, ATP, beta-Alanine, beta-D-Fructose 6-phosphate, CDP-diacylglycerol, Chorismate, CO2, coenzyme A (CoA), CTP, D-alanine, dATP, dCTP, D-Erythrose 4-phosphate, D-Glucose 1-phosphate, D-Glutamate, D-Glyceraldehyde 3-phosphate, dGTP, Dihydrofolate, Dodecanoyl-[acyl-carrier protein], D-Ribose 5-phosphate, D-Ribulose 5-phosphate, dTMP, dTTP, Flavin adenine dinucleotide (FAD), Flavin mononucleotide (FMN), Fumarate, GDP, Glycerone phosphate, Glycine, Glycogen, GMP, GTP, Hexadecanoyl-[acyl-carrier protein], Hexadecenoyl-[acyl-carrier protein], Isopentenyl diphosphate, L-Alanine, L-Arginine, L-Asparagine, L-Aspartate, L-Aspartate 4-semialdehyde, L-Cysteine, L-Glutamate, L-Glutamine, L-Histidine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine, L-Valine, Malonyl-[acyl-carrier protein], menaquinol, menaquinone, meso-2,6-Diaminopimelate, NADH, NADPH, NH3, Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP+), Nicotinate D-ribonucleotide, Octadecanoyl-[acyl-carrier protein], Octadecenoyl-[acyl-carrier protein], O-Phospho-4-hydroxy-L-threonine, Pentadecanoyl-[acyl-carrier protein], Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylserine, Phosphoenolpyruvate, Propanoyl-[acyl-carrier protein], Propanoyl-CoA, Pyridoxine, Pyridoxine 5'-phosphate, Pyruvate, S-Adenosyl-L-methionine, Sedoheptulose 7-phosphate, sn-Glycerol 3-phosphate, Succinyl-CoA, Tetradecanoyl-[acyl-carrier protein], Tetrahydrofolate, Thioredoxin, UDP, UDPglucose, UDP-N-acetyl-D-glucosamine, UMP 및 UTP로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제3중 어느 한 항에 있어서, (g)단계에서 수득된, 인간 단백질과 상동관계가 없는 필수 대사산물은 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine, D-Glutamate, 2,3-Dihydrodipicolinate, 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate, 4-Aminobenzoate으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제3중 어느 한 항에 있어서, 상기 (d)단계에서 수득된 제1차 약물 표적 효소는 VV10060, VV10061, VV10136, VV10256, VV10291, VV10314, VV10315, VV10316, VV10319, VV10321, VV10322, VV10323, VV10427, VV10430, VV10495, VV10504, VV10508, VV10558, VV10577, VV10578, VV10580, VV10581, VV10582, VV10583, VV10591, VV10613, VV10623, VV10625, VV10649, VV10662, VV10678, VV10679, VV10796, VV10819, VV10828, VV10854, VV10889, VV10981, VV10982, VV11057, VV11083, VV11127, VV11165, VV11195, VV11197, VV11200, VV11234, VV11235, VV11236, VV11284, VV11311, VV11312, VV11382, VV11383, VV11423, VV11536, VV11539, VV11568, VV11582, VV11583, VV11608, VV11621, VV11622, VV11627, VV11642, VV11643, VV11790, VV11810, VV11846, VV11865, VV11866, VV11876, VV11896, VV11897, VV11912, VV11916, VV11975, VV11976, VV11981, VV11986, VV11988, VV11993, VV11994, VV12126, VV12127, VV12131, VV12132, VV12173, VV12234, VV12265, VV12560, VV12614, VV12654, VV12699, VV12799, VV12810, VV12813, VV13005, VV13006, VV13007, VV13009, VV13010, VV13011, VV13052, VV13168, VV13169, VV13170, VV13172, VV13173, VV20065, VV20214, VV20280, VV20349, VV20488, VV20490, VV20491, VV20498, VV20543, VV20558, VV20752, VV20833, VV20835, VV21180, VV21426, VV21432 및 VV21599로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제2항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 수득된 제2차 약물 표적 효소는 VV10323 유전자에 의해 코딩되는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제2항에 있어서, (h)단계에서 만들어진 조합은 VV10323, VV11644, 및 VV11691(조합 ID: II-1); VV10323, VV11175 및 VV10580(조합 ID: II-2); VV10323 및 VV10567(조합 ID: II-3); VV10323, VV11866 및 VV11568(조합 ID: II-4); VV10323 및 VV11691(조합 ID: II-5); VV11644, VV11691, VV11175 및 VV10580(조합 ID: III-1); VV11644, VV11691 및 VV10567(조합 ID: III-2); VV11644, VV11691, VV11866 및 VV11568(조합 ID: III-3); VV11644, VV11691(조합 ID: III-4); VV11175, VV10580 및 VV10567(조합 ID: III-5); VV11175, VV10580, VV11866 및 VV11568(조합 ID: III-6); VV11175, VV10580 및 VV11691(조합 ID: III-7); VV10567, VV11866 및 VV11568(조합 ID: III-8); VV10567 및 VV11691(조합 ID: III-9); VV11866, VV11568 및 VV11691 (조합 ID: III-10)으로 구성된 군에서 선택되는 유전자 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 삭제
  18. 다음의 단계를 포함하는, 비브리오(Vibrio) 속 미생물의 약물 표적 효소 또는 그 유전자의 스크리닝 방법:
    (a) 비브리오(Vibrio) 속 미생물의 대사 네트워크 모델을 구축하는 단계;
    (b) 상기 구축된 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크에서 특정 대사산물을 유일하게 소비하거나 생산하는 효소들인 쵸크포인트를 제1차 약물 표적 효소 후보군으로 선정하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 선정된 제1차 약물 표적 효소 후보군 중에서
    인간 단백질과 상동관계가 없고, 동질효소(isozyme)를 갖지 않으며, 상기 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 한 개 이상의 효소 반응식에 관여하는 것들을 제2차 약물 표적 효소군으로 선정하고, 상기 2차 약물 표적 효소들을 코딩하는 유전자들을 제1 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
    (d) 상기 (a) 단계에서 구축된 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크 상에서 특정 대사산물들을 소비하는 모든 효소 반응식을 차단시켰을 때, 세포의 성장속도가 0인 경우의 상기 특정 대사산물을 필수 대사산물(I)로 결정하는 단계;
    (e) 상기 (d)에서 결정된 필수 대사산물들(I) 중 각각의 필수대사산물을 소비하는 모든 효소 반응식이 인간 단백질과 상동관계가 없는 것들로만 이루어지는 경우의 필수 대사산물들을 추가로 선별하고, 상기 선별된 필수 대사산물들(II)을 소비하는 효소 반응식에 사용되는 효소들을 코딩하는 유전자들을 제2 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
    (f) 상기 (c)단계에서 선정된 제1 약물 표적 유전자군 및 상기 (e)단계에서 선정된 제2 약물 표적 유전자군으로 구성된 군에서 선택된 유전자의 다양한 조합을 만드는 단계; 및
    (g) 상기 (f)단계에서 만든 조합들을 이루는 유전자들이 코딩하는 효소가 관여하는 반응식들에 대하여, 대사산물들 간의 반응을 나타내는 선에 해당 반응식의 노드를 추가로 만들어서, 이 반응식 노드들의 거리를 구하여 , 상기 대사 네트워크 상에서의 평균거리를 계산하여 상기 평균 거리가 평균 거리가 다른 조합들의 평균거리와 비교하여 먼 경우들의 조합을 이루는 유전자들을 약물 표적 유전자로 선정하거나, 이에 의해 코딩되는 효소들을 약물 표적 효소로 선정하는 단계.
  19. 다음의 단계를 포함하는, 비브리오(Vibrio) 속 미생물의 약물 표적 효소 또는 그 유전자의 스크리닝 방법:
    (a) 비브리오(Vibrio) 속 미생물의 대사 네트워크 모델을 구축하는 단계;
    (b) 상기 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 효소 반응식들에 대하여 상기 효소 반응식들을 한 개씩 결실시키면서 선형계획법을 적용하였을 때, 세포 성장이 일어나지 않는 경우의 결실된 효소 반응식을 제1차 약물 표적 효소 후보로 선정하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 선정된 제1차 약물 표적 효소 후보들 중에서
    인간 단백질과 상동관계가 없고, 동질효소(isozyme)를 갖지 않으며, 상기 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크를 구성하고 있는 한 개 이상의 효소 반응식에 관여하는 것들을 제2차 약물 표적 효소군으로 선정하고, 상기 2차 약물 표적 효소들을 코딩하는 유전자들을 제1 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
    (d) 상기 (a) 단계에서 구축된 비브리오(Vibrio) 속 미생물 대사 네트워크 상에서 특정 대사산물들을 소비하는 모든 효소 반응식을 차단시켰을 때, 세포의 성장속도가 0인 경우의 상기 특정 대사산물을 필수 대사산물(I)로 결정하는 단계;
    (e) 상기 (d)에서 결정된 필수 대사산물들(I) 중 각각의 필수대사산물을 소비하는 모든 효소 반응식이 인간 단백질과 상동관계가 없는 것들로만 이루어지는 경우의 필수 대사산물들을 추가로 선별하고, 상기 선별된 필수 대사산물들(II)을 소비하는 효소 반응식에 사용되는 효소들을 코딩하는 유전자들을 제2 약물 표적 유전자군으로 선정하는 단계;
    (f) 상기 (c)단계에서 선정된 제1 약물 표적 유전자군 및 상기 (e)단계에서 선정된 제2 약물 표적 유전자군으로 구성된 군에서 선택된 유전자의 다양한 조합을 만드는 단계; 및
    (g) 상기 (f)단계에서 만든 조합들을 이루는 유전자들이 코딩하는 효소가 관여하는 반응식들에 대하여, 대사산물들 간의 반응을 나타내는 선에 해당 반응식의 노드를 추가로 만들어서, 이 반응식 노드들의 거리를 구하여 , 상기 대사 네트워크 상에서의 평균거리를 계산하여 상기 평균 거리가 평균 거리가 다른 조합들의 평균거리와 비교하여 먼 경우들의 조합을 이루는 유전자들을 약물 표적 유전자로 선정하거나, 이에 의해 코딩되는 효소들을 약물 표적 효소로 선정하는 단계.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 비브리오(Vibrio ) 속 미생물은 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus)인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제2항의 방법에 의하여 수득된, VV10323, VV11644, VV11691, VV11175, VV10580, VV10567, VV11866 및 VV11568으로 구성된 군에서 선택되는 유전자를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 비브리오 속 미생물에 대한 항생제를 제조하는 방법.
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