CN102663272A - 氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法 - Google Patents

Abstract

一种氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法：利用KEGG数据库中氧化葡萄糖酸杆菌的基因注释信息和对应酶的生物化学信息构建反应列表草图；对草图进行修改；添加生物量合成、运输和交换反应形成代谢网络；将代谢网络转化为SBML格式，利用Matlab和COBRA Toolbox对代谢网络进行调试，分析存在的缺口和无效循环，并根据调试结果进行修正；根据代谢网络，利用Pajek绘制代谢网络图，并进行网络拓扑结构分析；根据代谢网络，利用Matlab和COBRA Toolbox进行鲁棒性、基因必要性和通量可变性分析中的一种或多种分析。本发明分析氧化葡萄糖酸杆菌在生产二羟基丙酮、维生素C和葡萄糖酸等各种产物时的代谢状态。

Description

氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法

技术领域

本发明涉及一种网络构建和分析方法。特别是涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌属醋酸杆菌科，革兰氏阴性。可以将多种醇类、多元醇和碳水化合物不完全氧化成相应的酮类和糖酸。例如，将甘油氧化为二羟基丙酮，葡萄糖氧化成葡萄糖酸，山梨醇氧化成2-酮基-古洛酸等。

由于其独特且高效的不完全氧化能力，氧化葡萄糖酸杆菌在工业上已经获得广泛地应用。其生产的产品在作为药物或药物合成前体物质领域具有良好的应用价值。对氧化葡萄糖酸杆菌的研究日益受到人们的重视。自2005年氧化葡萄糖酸杆菌的基因组得到测序并且大部分基因被注释以来，对该菌的认识变得更加深入，与其相关的研究也取得了很多非常有价值的成果。不过这些成果大部分只是关于氧化葡萄糖酸杆菌的一种产品或一条代谢途径，而没有从整体角度研究氧化葡萄糖酸杆菌，缺乏一个能够系统的分析该菌代谢行为的工具。本发明所涉及的基因组尺度代谢网络正好填补了这一空缺。

基因组尺度代谢网络包含一种生物体内的全部与小分子代谢有关的基因、酶、代谢物和代谢反应，能够在系统水平上对生物中的各组分进行整体分析，能体现各组分的相互作用关系，对生物的生理功能有全面的了解。利用网络拓扑结构分析可以找到代谢的中心代谢物和关键节点，利用鲁棒性分析可以分析内部或外部扰动对生物代谢状态的影响，基因必要性分析可以分析一个或多个基因对生物量或目标产物合成的必要性，通量可变性分析可以确定在相同表型下特定反应的通量所能达到的最大和最小值。对于氧化葡萄糖酸杆菌目前还没有基因组尺度代谢网络的报道，因此构建氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络，分析它在生产各种产品时的代谢行为，能够更好地指导对氧化葡萄糖酸杆菌的研究和应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用所构建的基因主尺度代谢网络分析氧化葡萄糖酸杆菌的中心代谢物，找到对氧化葡萄糖酸杆菌的代谢状态有显著影响的代谢扰动，找到对菌体生长和合成产物所必须的基因和重要代谢反应的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法。

本发明所采用的技术方案是：一种氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，包括如下步骤：

1)利用KEGG数据库中氧化葡萄糖酸杆菌的基因注释信息和对应酶的生物化学信息构建反应列表草图，为了确保准确性也需要参考其他数据库和相关文献；

2)对反应列表草图进行修改；

3)添加生物量合成反应、运输反应和交换反应，形成代谢网络；

4)将代谢网络转化为SBML格式，利用Matlab和COBRA Toolbox对代谢网络进行调试，分析其中存在缺口和无效循环，并根据调试结果修正所述的缺口和无效循环；

5)根据步骤4)生成的最终代谢网络，利用Pajek绘制代谢网络图，并进行网络拓扑结构分析；

6)根据步骤4)生成的最终代谢网络，利用Matlab和COBRA Toolbox进行鲁棒性分析、基因必要性分析和通量可变性分析中的一种或多种分析。

步骤1)所述的草图中包括有反应的ID、反应名称、反应方程式、催化该反应的酶和与该反应对应的基因ID的信息。

步骤2)所述的修改包括删去蛋白质、DNA、RNA、肽聚糖和碳水化合物这些大分子的合成与修饰反应；同时存在总反应形式和分反应形式的多步反应只能保留其中一种形式；统一各代谢物的ID，确保同一种代谢物只保留一种ID；确定参与反应的辅因子和反应方向。

步骤3)所述的生物量合成反应是：首先将生物量分解成几种成分：蛋白质、DNA、RNA、脂质、肽聚糖和碳水化合物，再按各成分所占的mol比组合而成，最后再分别添加各组分的合成反应。

步骤3)所述的运输反应是根据培养基的成分和氧化葡萄糖酸杆菌产生的胞外发酵产物来添加，所述的交换反应是对所有的胞外代谢物添加交换反应，用来平衡胞外代谢物的合成与消耗，形成系统的边界。

步骤4)所述的代谢网络是由1007个代谢物、860个反应、433个基因和403种酶组成，分类于72个子代谢途径或子系统。

步骤5)所述的Pajek绘制的代谢网络图包括918个节点和1223条连接线。

步骤6)所述的鲁棒性分析，是分析反映生物体的代谢状态对内部或外部扰动的敏感性。

步骤6)所述的基因必要性分析是模拟生物体在基因敲除下的性状，分析各个基因对选定的目标函数的必要性。

步骤6)所述的通量可变性分析是用来分析各反应对选定的目标函数的通量可变范围。

本发明的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，可以利用所构建的基因主尺度代谢网络分析氧化葡萄糖酸杆菌的中心代谢物，找到对氧化葡萄糖酸杆菌的代谢状态有显著影响的代谢扰动，找到对菌体生长和合成产物所必须的基因和重要的代谢反应。本发明可以分析氧化葡萄糖酸杆菌在生产二羟基丙酮、维生素C和葡萄糖酸等各种产物时的代谢状态，为研究氧化葡萄糖酸杆菌提供了一个新的工具。

附图说明

图1是本发明构建的基因组尺度代谢网络图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法做出详细说明。

本发明的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，包括如下步骤：

1)利用KEGG数据库中氧化葡萄糖酸杆菌的基因注释信息和对应酶的生物化学信息构建反应列表草图，为了确保准确性也需要参考其他数据库如NCBI；

所述的草图中包括有反应的ID、反应名称、反应方程式、催化该反应的酶和与该反应对应的基因ID的信息。

2)对反应列表草图进行修改；反应列表草图可能会存在错误和冗余的信息，也有可能遗失一部分反应。所述的修改包括删去蛋白质、DNA、RNA、肽聚糖和碳水化合物这些大分子的合成与修饰反应，因为这部分反应最后会合并到生物量反应中；

同时存在总反应形式和分反应形式的多步反应只能保留其中一种形式；统一各代谢物的ID，确保同一种代谢物只保留一种ID；确定参与反应的辅因子和反应方向。

3)添加生物量合成反应、运输反应和交换反应；

所述的生物量合成反应是：首先将生物量分解成几种主要成分：蛋白质、DNA、RNA、脂质、肽聚糖和碳水化合物，再按各成分所占的mol比组合而成，最后再分别添加各组分的合成反应。

所述的运输反应是根据培养基的成分和氧化葡萄糖酸杆菌产生的胞外发酵产物来添加，所述的交换反应是对所有的胞外代谢物添加交换反应，用来平衡胞外代谢物的合成与消耗，形成系统的边界。

4)将代谢网络转化为SBML(Systems Biology Markup Language，生物系统标记语言)格式，利用Matlab和COBRA Toolbox对代谢网络进行调试，分析其中存在缺口和无效循环，并根据调试结果修正所述的缺口和无效循环；所述的代谢网络是由1007个代谢物、860个反应、433个基因和403种酶组成，分类于72个子代谢途径或子系统。

5)根据步骤4)生成的最终代谢网络，利用Pajek绘制代谢网络图，并进行网络拓扑结构分析；所述的Pajek绘制的代谢网络图包括918个节点和1223条连接线。

6)根据步骤4)生成的最终代谢网络，利用Matlab和COBRA Toolbox进行鲁棒性分析、基因必要性分析和通量可变性分析中的一种或多种分析。

其中，所述的鲁棒性分析，是分析反映生物体的代谢状态对内部或外部扰动的敏感性；所述的基因必要性分析是模拟生物体在基因敲除下的性状，分析各个基因对选定的目标函数的必要性；所述的通量可变性分析是用来分析各反应对选定的目标函数的通量可变范围。

实施例一：

根据KEGG数据库以及其他相关数据库和文献报道的信息构建氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络。该代谢网络由1007个代谢物、860个反应、433个基因和403种酶组成，分类于72个子代谢途径或子系统，这部分反应包括胞内外小分子代谢反应、生物量合成反应及运输反应。

利用Pajek绘制代谢网络图，需要将代谢网络进行修改并转化为Pajek可识别的格式。修改内容如下：删去ATP、ADP、NADH、NAD+、NADPH、NADP+、THF、等流通代谢物，因为它们虽然参与了大量的代谢反应，但是并不直接参与底物至产物的物质转化过程。删去聚合反应和大分子参与的反应，如蛋白质、DNA的合成等。用节点代表代谢物，连接线代表代谢物之间的反应。所绘制的代谢网络图包括918个节点和1223条连接线(如图1所示)。根据所绘制的代谢图可以分析网络拓扑结构特性，例如各节点的连接度。节点的连接度直接反应该代谢物参与的反应个数，连接度越高的代谢物往往对该生物的代谢越重要，可以认为是潜在的中心代谢物。本发明对氧化葡萄糖酸杆菌代谢网络进行连接度分析，找到8个可能的中心代谢物，分别是丙酮酸、乙酰-CoA、谷氨酸、3-磷酸甘油醛、乙酸、甘氨酸、6-磷酸葡萄糖和5-磷酸核糖-1-焦磷酸。

鲁棒性分析可以反映生物的代谢状态(如菌体生长、产物合成)对内部或外部扰动的敏感性。以计算生物量合成随甘油速率的变化为例，在模拟过程中选择生物量的交换反应为目标函数，保持模型中其他条件不变，而甘油吸收速率由0变化到50mmol/gDW-1·h-1，计算每个甘油吸收速率值下对应的生物量合成速率。根据所得数据绘制生物量随甘油的变化趋势图。模拟过程中可以同时设定其他约束条件，如对氧气吸收速率上限设制约束。也可以同时模拟多个因素对目标函数的影响。如产物二羟基丙酮的合成量随生物量和甘油吸收速率两个因素的变化，可获得相应表型相平面图。

对所构建的代谢网络进行了通量可变性分析，先在以生物量合成为目标函数，甘油速率选取20mmol/gDW-1·h-1下，计算生物量最大合成速率为9.24mmol/gDW-1·h-1，然后将生物量速率的上下限都设定在9.24mmol/gDW-1·h-1，然后分别以每个反应为目标函数计算每个反应的最大最小通量值。由通量可变性分析结果可知，在包含交换反应在内的953个反应中，最大与最小通量值相等的反应有750个，其他203个反应是可变的。也可以用来分析除生物量合成以外的目标函数的通量可变性。

对代谢网络中包含的433个基因在以生物量合成为目标下进行基因必要性分析，模拟单基因敲除和双基因敲除下的性状。根据单基因敲除结果，有92个基因是致死基因，这些基因的敲除导致生物前体物质不能合成，细胞将不能生长。根据双基因敲除结果，除单基因敲除致死型之外，双基因敲除致死型有55种。将目标函数改为其他反应，例如二羟基丙酮的交换反应，则可以用来分析对合成二羟基丙酮所必须的基因。

Claims (10)

1.一种氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)利用KEGG数据库中氧化葡萄糖酸杆菌的基因注释信息和对应酶的生物化学信息构建反应列表草图；

2)对反应列表草图进行修改；

3)添加生物量合成反应、运输反应和交换反应，形成代谢网络；

4)将代谢网络转化为SBML格式，利用Matlab和COBRA Toolbox对代谢网络进行调试，分析其中存在缺口和无效循环，并根据调试结果修正所述的缺口和无效循环；

5)根据步骤4)生成的最终代谢网络，利用Pajek绘制代谢网络图，并进行网络拓扑结构分析；

6)根据步骤4)生成的最终代谢网络，利用Matlab和COBRA Toolbox进行鲁棒性分析、基因必要性分析和通量可变性分析中的一种或多种分析。

2.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，步骤1)所述的草图中包括有反应的ID、反应名称、反应方程式、催化该反应的酶和与该反应对应的基因ID的信息。

3.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，步骤2)所述的修改包括删去蛋白质、DNA、RNA、肽聚糖和碳水化合物这些大分子的合成与修饰反应；同时存在总反应形式和分反应形式的多步反应只能保留其中一种形式；统一各代谢物的ID，确保同一种代谢物只保留一种ID；确定参与反应的辅因子和反应方向。

4.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，步骤3)所述的生物量合成反应是：首先将生物量分解成几种成分：蛋白质、DNA、RNA、脂质、肽聚糖和碳水化合物，再按各成分所占的mol比组合而成，最后再分别添加各组分的合成反应。

5.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，步骤3)所述的运输反应是根据培养基的成分和氧化葡萄糖酸杆菌产生的胞外发酵产物来添加，所述的交换反应是对所有的胞外代谢物添加交换反应，用来平衡胞外代谢物的合成与消耗，形成系统的边界。

6.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，步骤4)所述的代谢网络是由1007个代谢物、860个反应、433个基因和403种酶组成，分类于72个子代谢途径或子系统。

7.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，步骤5)所述的Pajek绘制的代谢网络图包括918个节点和1223条连接线。

8.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，步骤6)所述的鲁棒性分析，是分析反映生物体的代谢状态对内部或外部扰动的敏感性。

9.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，步骤6)所述的基因必要性分析是模拟生物体在基因敲除下的性状，分析各个基因对选定的目标函数的必要性。

10.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌的基因组尺度代谢网络构建和分析方法，其特征在于，步骤6)所述的通量可变性分析是用来分析各反应对选定的目标函数的通量可变范围。

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