KR101687902B1 - Pyk 및 HPr 단백질의 상호작용을 표적으로하는 비브리오균에 대한 항생제 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비브리오 피루베이트 키나아제 vPyK와 탈인산화된 vHPr 단백질의 상호작용을 표적으로 하여 비브리오균에 특이적으로 작용하는 항생제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본원에 따른 방법은 비브리오균에만 특이적으로 작용하는 종-특이성을 지닌 것으로, 내성을 유발하지 않는 비브리오균에 항생제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Pyk 및 HPr 단백질의 상호작용을 표적으로하는 비브리오균에 대한 항생제 스크리닝 방법 {Method for screening antibiotics against Vibrio sp. targeting interaction between Pyk and HPr}

본 발명은 비브리오균에 유효한 항생물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

비브리오균에는 콜레라의 원인인 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 패혈증의 원인균인 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 등을 포함하는 인체 감염 병원체이다. 비브리오 콜레라는 급성 설사질환을 일으키는데, 적절히 치료하지 않으면 수 시간내에 몸의 수분이 급속히 빠져나가는 탈수현상과 이로 인한 쇼크로 사망할 수 있는데, 특히 매우 심각한 탈수 환자들에게는 항생제를 투여하는 것이 필요하다. 비브리오 패혈증은 주로 비브리오균이 함유된 해산물을 날것으로 섭취하거나 상처부위를 통해 감염된다. 1차적 패혈증은 V. 불니피쿠스에 의해 야기된 가장 치명적인 감염으로, 전격적 감염은 감염후 48시간 내에 사망하게 되는 등, 평균 치사율이 50%를 넘는다. 비브리오 패혈증의 치료에 주로 항생제가 이용되고 있다.

그런데 비브리오균은 대부분의 다양한 항생제에 감수성이 있고, 기존의 항생제를 함부로 사용하면 인체에 상주하는 다른 유익한 세균들까지 죽어버릴 수 있고, 인체의 세포도 손상될 위험이 있기 때문에 병원성 비브리오균에만 특이적으로 작용할 수 있는 항생제 개발이 절실한 상황이다.

대한민국 공개특허 제2007-0050206호는 패혈증 비브리오균의 생체 내 발현 생존 필수 인자 PyrH에 관한 것으로, PyrH 단백질을 이용한 항생물질의 탐색 및 개발에 대하여 개시하고 있다.

그러나, 병원성 비브리오균에만 특이적으로 작용할 수 있는 항생물질을 타겟으로 하는 물질의 스크리닝 방법에 대하여 알려져 있는 바가 없다.

본 발명은 비브리오 피루베이트 키나아제(vPyk, Vibrio Pyruvate Kinase) 및 탈인산화된 비브리오 히스티딘 포스포캐리어 단백질 (vHPr, Vibrio Histidine Phosphocarrier Protein)의 상호작용을 기본으로 하는 비브리오균에 유효한 항생물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

한 양태에서 본원은 비브리오균에 특이적인 항생물질 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 방법은 비브리오 피루베이트 키나아제(vPyk, Vibrio Pyruvate Kinase) 및 탈인산화된 비브리오 히스티딘 포스포캐리어 단백질 (vHPr, Vibrio Histidine Phosphocarrier Protein)을 제공하는 단계; 상기 vPyk와 탈인산화된 vHPr 단백질과의 상호작용을 선택적으로 억제할 수 있을 것으로 기대되는 물질과 상기 단백질을 접촉시키는 단계; 및 상기 vPyK와 탈인산화된 vHPr 단백질과의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 vPyK와 탈인산화된 HPr 단백질의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 비브리오균에 대한 항생제 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 단백질은 전장 또는 그 일부가 사용될 수 있으며, 일 구현예에서는 전장으로 서열번호 1의 vPyK 또는 서열번호 1의 서열을 기준으로 334 내지 482 잔기로 표시되는 vPyK C-말단이 사용된다.

본원에 따른 방법에서 사용되는 vPyK 단백질은 서열번호 1의 서열로 표시되고, vHPr는 서열번호 3으로 표시된다.

본원에 따른 방법에서 vPyK 및/또는 탈인산화된 HPr 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다.

본원에 따른 방법에서 상기 vPyK와 탈인산화된 HPr 단백질과의 상호작용은 상기 vPyK와의 활성의 변화 또는 세포내 포스포에놀피루베이트 및 피루베이트의 세포내 농도 변화로 검출될 수 있다.

본원에 따른 방법에 따라 스크리닝된 후보물질은 글루코스의 존재하에서 비브리오균의 과산화수소(H₂O₂)에 대한 저항성을 감소시키거나, 또는 이에 대한 민감성을 증가시켜, 비브리오균을 제어할 수 있어, 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다. 본원에서 항생제는 비브리오균의 성장을 억제, 지연, 저해시키거나 또는 살균하는 것을 포함하는 것이다.

본원에 따른 항생제 스크리닝 방법은 비브리오균에 특이적인 것으로, 상기와 같은 상호작용에 기반한 시스템을 가지고 있는 다양한 비브리오균에 적용될 수 있다. 따라서 비브리오균은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 또는 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 스크리닝 방법은 다른 종, 예를 들어 E. coli에서는 가능하지 않은 것으로 비브리오균에만 특이적인 PyK 및 HPr 사이의 상호작용을 기반으로 하는 것이다. 이러한 종-특이적 상호작용은 vPyK, 특히 C-말단 도메인에 있는 알로스테릭 부위에 탈인산화된 HPr이 결합하여 나타나는 것으로, 이로 인해 이 부분에 작용하는 항생제가 비브리오균에만 특이적으로 작용하고 내성을 유발하지 않게 된다. 따라서, 본원의 스크리닝 방법은 종-특이성을 지닌 것으로, 내성을 유발하지 않는 비브리오균에 유효한 항생제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 V. 불니피쿠스에서의 HPr과 PykA의 특이적 상호작용을 나타난다. H-vHPr (A) 및 H-vPykA (B)와 상호작용하는 단백질을 탐색하기 위한 리간드 피싱 실험을 실시예 4와 같이 수행하였다. V. 불니피쿠스 CMCP6 세포에서 제조된 조추출물을 정제된 His-태그 단백질 베이트 존재(레인 +) 또는 부존재(레인 -)하에서 TALON 금속 친화 레진과 혼합하여 메탈 친화 크로마토그래피를 수행하였다. 간략히 세척한 후, 레진에 결합된 단백질을 용출시키고, 4-20% 농도구배 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 용출액을 분석한 후 코마씨 브릴리언트 블루로 염색하였다. H-vHPr 및 H-vPykA에 특이적으로 결합하는 단백질을 겔에서 분리하여, 트립신으로 처리하고 펩타이드 맵핑을 수행하였다. EzWay 단백질 블루 MW 메이터(KOMA Biotech)을 분자 매스 마커로 사용하였다(레인 M).
도 2는 vPykA 및 vHPr 사이의 상호작용이 인산의 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 도 2A는 vPykA의 vHPr와의 상호작용에 대한 다양한 화합물의 효과를 나타낸다. 다양한 화합물의 존재 또는 부존재하에서 150 mM NaCl을 함유한 20 mM HEPES?NaOH (pH 7.6)에서 정제된 vPykA (100 mg)를 정제된 H-vHPr (60 mg)와 혼합하여 TALON 금속 친화 크로마토그래피를 하였다. 4?20% 농도구배 SDS-PAGE와 쿠마씨 브릴리언트 블루로 염색하여 결과를 분석하였다. 레인은 다음과 같다: M, 분자 매스 마커(Koma Biotech, Inc.); 레인 1, 대조군으로 vPykA를 단독으로 첨가하였다; 레인 2, vPykA 및 H-vHPr; 레인 3, vPykA, H-vHPr, 및 50ml의 도1에 사용된 V. 불니피쿠스 조추출물 ; 레인 4, vPykA, H-vHPr, 및 50ml의 V. 불니피쿠스 조추출물 3-kDa 여과액; 레인 5, vPykA, H-vHPr, 및 포타슘 글루타메이트(10 mM까지); 레인 6, vPykA, H-vHPr, 및 포타슘 아세테이트(10 mM까지); 레인 7, vPykA, H-vHPr, 및 포타슘 포스페이트(10 mM까지) ; 레인 8, vPykA, H-vHPr, 및 아세틸 포스페이트(10 mM까지). 도 2B는 vPykA의 vHPr와의 상호작용에 대한 다양한 농도의 소디움 포스페이트(Pi)의 효과를 나타낸다. 150mM NaCl를 함유하는 20mM HEPES?NaOH(pH7.6)내의 vPykA(100μg) 및 H-vHPr(60μg)을 Pi양을 증가시켜 가며(0,0.5,1,2,5,10 및 50mM; 레인 2-8) Pi와 함께 배양하여 풀-다운(pull-down) 어세이를 하였다. 레인 1 및 9에서, vPykA 단독을 0 및 50mM Pi와 함께 각각 배양하여 로딩(loading) 대조군으로서 풀-다운 어세이를 하였다. 도 2C는 H-vHPr에 대한 vPykA의 Pi 농도-의존적 결합을 그래프로 나타낸 것이다. 도 2B의 쿠마씨 블루-염색 겔을 스캔하여, vPykA의 밴드 강도를 멀티 게이지 프로그램으로 측정하였다. 특이적 결합에 근거하여, 나타나있는 Pi 각 농도에서 H-vHPr에 결합된 vPykA양에서 0mM Pi에서 H-vHPr에 결합된 vPykA양을 뺌으로써 H-vHPr에 결합된 vPykA의 상대적 양을 계산하였다. 도 2D는 도 2C에 있는 데이터를 사용하여 1/[Bound vPykA] 대 1/[Pi]의 이중 역비례선으로 나타낸 것이다.
도 3은 표면 플라즈몬 공명(SPR)로 vHPr 및 vPykA 사이의 상호작용을 분석한 결과이다. 도 3A는 vPykA(센서그램 a) 또는 vPykF(센서그램 b)를 vHPr 표면위로 흘러 지나가도록 한 것이다. 도 3B는 vPykA 및 vHPr 사이의 해리 상수(KD)를 측정한 것이다. 표시된 양의 vPykA를 vHPr 표면위로 흘러 지나가도록 하였다. vPykA 및 vHPr 사이의 상호작용에 대한 KD 수치는 ~ 4.484 X 10^-7M로 결정되었다. 도 3C는 vPykA 및 vHPr 사이의 인산화-의존적 상호작용을 나타낸 것이다. 센서그램 a는 vPykA가 고정된 vHPr 표면에 결합한다는 것을 나타낸다. 센서그램 b는, 고정된 vHPr 표면에 EI 및 포스포에놀 피루베이트(PEP) 혼합물을 노출시켜 인산화가 이루어진 후 vPykA를 주입하고, 그후 러닝버퍼로 씻어 PEP 및 EI를 제거한 것이다. 센서그램 c는, 탈인산화된 EIIA^Glc를 센서그램 b에서 생성된 인산화된 vHPr 표면위로 흘러넘치도록 하여 vPykA가 주입되기 전에 표면을 탈인산화한 것이다.
도 4는 PyK 및 HPr 단백질 사이의 상호작용 및 알로스테릭 효과를 테스트한 결과이다. 도 4A는 정제된 vPykF, vPykA, 및 ePykA (각각 60 ㎍)를 50㎕의 TALON 레진 존재하에서 버퍼 대조군(레인 C), 100㎍의 H-eHPr(레인 E) 또는 H-vHPr(레인 V)와 혼합한 후 금속 친화 크로마토그래피 후, 각 컬럼에 결합된 단백질은 4-2: 0% 농도구배 SDS-PAGE 및 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색으로 분석하였다. PyK 밴드 상의 숫자는, 멀티 게이지 소프트웨어로 측정된 각각의 PyK에 대하여 레인 C의 레벨에 비례하는 HPr 단백질에 결합된 PyKs의 레벨을 나타낸다. 레인 M: 분자 매스 마커(Koma Biotech, Inc.). 도 4B는 부분 정제후, H-vHPr의 부존재(홀수 레인) 및 존재(짝수 레인) 하에서 vPykA (레인 1 및 2), vePykA (레인 3 및 4), evPykA (레인 5 및 6), 및 ePykA (레인 7 및 8)를 TALON 친화 크로마토그래피를 수행하였다. 레인 M: 분자 매스 마커(Koma Biotech, Inc.). 도 4C 및 D는 4개의 다른 PyK [(C)에서는 ePykA 및 vPykA의 천연 형 및 (D)에서는 두 도메인-스왑된 PyK, 각각 20nM]가 촉매한 PEP의 피루베이트로의 전환률을 20μM의 eHPr 또는 vHPr 존재하에서 락테이트 데하이드로제나아제(LDH)-결합 에세이로 측정한 결과이다.
도 5a는 vPykA의 알로스테릭 조절을 나타낸다. 도 5A는 ePykA(사각) 및 vPykA(원) 활성에 대한, 다양한 농도의 AMP(0-8 mM)의 영향을 나타낸 것이다. vPykA(삼각형)에 대한 다양한 농도의 프락토오즈 1,6-비스포스페이트(0-8 mM)의 효과 또한 측정하였다. 도 5B는 vPykA 활성에 대한 다양한 양의 데포스포-vHPr(원) 및 포스포-vHPr(삼각형)의 효과를 나타낸 것이다. 결과는 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다. 도 5C는 20μM 데포스포-vHPr의 부존재(삼각형) 및 존재(원) 하에서 PEP(0-16 mM)에 대한 vPykA의 항정상태 반응속도(Steady-state kinetics)를 결정하였다. 결과는 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다. 얻은 반응속도 파라미터는 표 1에 나타내었다.
도 5b는 V. 불니피쿠스 세포는 PTS 슈가인 글루코스를 보충한 배지에서는 탈인산화 상태가 우세한 것을 보여주는 결과로, vHPr 은 LBS 배지 및 비-PTS 슈가인 갈락토오즈를 보충한 LBS 배지에서 주로 인산화형태로 존재하지만, 반면 V. 불니피쿠스 세포에 있는 PTS 슈가인 글루코스를 보충한 배지에서는 탈인산화 상태가 우세한 것으로 나타났다.
도 6은 글루코스 또는 갈락토스 첨가 후의 PEP 및 피루베이트의 세포내 농도 변화를 나타낸 것이다. 도 6A-D는 피루베이트(A 및 C) 및 PEP(B 및 D)의 세포내 농도를 측정한 것이다. 야생형 CMCP6(회색 바), pykA 결실 돌연변이(흰색 바), 및 10mM 글루코스(A 및 B) 또는 갈락토오스(C 및 D)의 첨가 후 지시된 시점에 vPykA 발현 벡터(검은색 바)를 하버링한 pykA 결실 돌연변이에서 샘플을 제조하였다. 결과는 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다.
도 7은 야생형 V. 불니피쿠스 CMCP6 및 pykA 결실 돌연변이의 성장률 및 배양가능성(culturability)을 비교한 것이다. 도 7A는 야생형 V. 불니피쿠스 CMCP6(원) 및 pykA 결실 돌연변이(삼각형)의 냉동된 배양 스톡에서의 세포의 성장 커브를 나타낸 것이다. 배양 스톡은 LBS로 희석하여 0.001의 출발 A600에서 후레쉬 LBS 배지에 접종하였다. LBS 배지에서 200rpm으로 쉐이킹하면서 30℃에서 산소 하에서 세포를 배양하였다. 도 7B는 야생형 CMCP6(원) 및 pykA 결실 돌연변이(삼각형)의 서브컬처의 생장 곡선을 나타낸다. (A)에서 정지상까지 성장한 두 균주의 세포를 0.01의 출발 A600에서 후레쉬 LBS 배지에 접종하였다. 도 7C는 이후 4℃에서 배양한 V. 불니피쿠스의 배양가능성에 대한 vPykA의 효과를 나타낸다. 로그기 야생형 CMCP6 세포(원), pykA 결실 돌연변이(삼각형) 및 vPykA 발현 벡터를 하버링한 pykA 결실 돌연변이(아스테리스크)를 4℃에서 배양하였다. 알리쿼트를 그후 지정된 시간에 LBS 아가 플레이트에 플레이트하고 30℃에서 밤새 배양하여 배양 가능성을 결정하였다. 모든 실험은 3배수로 수행하였다.
도 8은 H₂O₂에의 저항에 대한 vPykA 활성 및 피루베이트의 효과를 나타낸다. 도 8A 및 B에서 지시된 균주의 정지기 세포를 0.25 x 10⁸ 세포 ml^-1 (A) 또는 10⁸ 세포 ml^-1 (B)에서 순차적으로 4배 희석하고, 지시된 H₂O₂ 및 피루베이트의 서로 다른 조합을 함유하는 LBS 배지에 2㎕를 스팟하였다. 30℃에서 24시간동안 배양한 후, 상기 플레이트를 스캔하였다.
도 9는 ePykA(E.coli PvkA) 및 vPykA의 아미노산 서열 배열(Alignment)을 나타낸 것으로, N-말단 아미노산은 78% 동일성으로 매우 잘 보존되어 있는 반면 C-말단은 57%로 동일성이 낮음을 나타내며, 이는 본원의 비브리오 피루베이트 키나아제가 비리오균주 특이적으로 작용할 수 있음을 나타내는 것이다.

본원은 비브리오균에 존재하는 비브리오 피루베이트 키나아제(vPyK, Vibrio Pyruvate Kinase)가 탈인산화된 비브리오 히스티딘 포스포캐리어 단백질 (vHPr, Vibrio Histidine Phosphocarrier Protein)과 상호작용하여, vPyK의 포스포에놀피루베이트(PEP)에 대한 친화성을 증가시키고, 글루코스의 존재 중에서 과산화수소에 대한 저항성을 부여한다는 발견에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 상기 상호작용에 근거한 병원성 비브리오균에 유효한 항생물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 방법은 일 구현예에서, 비브리오 피루베이트 키나아제(vPyk, Vibrio Pyruvate Kinase) 및 탈인산화된 비브리오 히스티딘 포스포캐리어 단백질 (vHPr, Vibrio Histidine Phosphocarrier Protein)을 제공하는 단계; 상기 vPyk와 탈인산화된 vHPr 단백질과의 상호작용을 선택적으로 억제할 수 있을 것으로 기대되는 물질과 상기 단백질을 접촉시키는 단계: 및 상기 vPyK와 탈인산화된 vHPr 단백질과의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 vPyK와 탈인산화된 HPr 단백질의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 일 구현예에서는 바닷물에 서식할 수 있는 호염성의 그람음성균을 사용하였으며 수행하였지만 비브리오균의 Pyk 유전자 염기서열 및 단백질 서열을 높은 상동성을 나타내기 때문에, 다른 종류의 비브리오 균에도 적용될 수 있으며, 따라서 본원의 비브리오(Vibrio)균은 콜레라의 원인인 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 장염세균(Vibrio parahaemolyticus)와 패혈증의 원인균인 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원의 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 ‘비브리오 피루베이트 키나아제(vPyK)’는 대사경로 중 PEP(Phosphoenolpyruvate)와 ADP(adenosine diphosphate)로부터 ATP(adenosine triphosphate)와 피루베이트를 생성하는 반응을 촉매하는 효소로 알콜기를 수용체로 갖으며, 반응과정에서 인산을 함유하는 기를 전달한다. 본원의 방법에 사용될 수 있는 PyK는 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 숙주 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 전장 또는 잘린 형태의 것이 모두 포함된다. 본원에 따른 일 구현예에서는 Vibrio vulnificus 유래의 각각 서열번호 1 로 표시되는 PyKA (VV1_2992) 서열의 단백질이 사용되며, 상기 단백질은 각각 서열번호 2의 핵산서열로 표시된다. 상기 vPykF는 프럭토즈-1,6-비스포스페이트에 의해 활성화되며, 상기 PykA는 아데노신 모노포스페이트에 의해 활성화된다. 비브리오균에서 PykF가 제대로 기능을 못하면 비브리오균이 살아남을 수 없으며, PykA가 제대로 기능을 못하면 산화스트레스에 저항성이 약해진다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 비브리오 불니피쿠스에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사용될 수 있다.

본원의 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 비브리오 히스티딘 포스포캐리어 단백질 (vHPr, Vibrio Histidine Phosphocarrier Protein)은 세포막을 통한 당의 전달에 중요한 역할을 하는 박테리아 포스포에놀피루베이트(PEP) : 당 포스포트랜스퍼라아제 시스템의 구성성분으로 PEP로부터 다른 효소로의 인산기를 전달을 매개한다. 본원의 방법에 사용될 수 있는 HPr은 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 숙주 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 전장 또는 잘린 형태의 것이 모두 포함된다. 본원에 따른 일 구현예에서는 Vibrio vulnificus 유래 것이 사용되며, 예를 들면 서열번호 3의 서열로 표시되고, 상기 단백질은 예를 들면 서열번호 4의 핵산서열을 가진다.

본원의 PyK 및 HPr 사이의 상호작용은 다른 종, 예를 들어 E. coli에서는 가능하지 않은 것으로 비브리오균에만 있는 특이한 상호작용이다. 이러한 특이적 상호작용은 vPyK의 C-말단 도메인에 있는 알로스테릭 부위에 탈인산화된 HPr이 결합하여 나타나는 것으로, 이로 인해 비브리오균에만 특이적으로 작용하고 내성을 유발하지 않게 된다.

따라서 일 구현예에서 본원에 사용되는 vPyK 단백질은 서열번호 1의 서열을 기준으로 334-482의 C-말단부위가 사용된다.

상기 본원에 사용되는 피루베이트 키나아제(vPyK) 및 탈인산화된 HPr 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 스크리닝에 사용되는 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작한 후 상기 플라스미드를 원핵세포에 과발현 시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 본원의 예시적 실시예에서 사용한 것과 같은 벡터에 해당 유전자를 클로닝하여 세포주에 전달이입한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

또는 스크리닝에 사용되는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 파쇄물을 만들거나 상기 스크리닝 단백질의 mRNA를 시험관내에서 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 스크리닝 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 예를 들면 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 들 수 있다.

상기 정제된 단백질의 접촉은 시험관내에서 이들을 직접 사용하여 시험물질의 부재 또는 존재 하에서 결합여부를 확인할 수 있다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 단백질 태그, 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면 세포내 단백질의 결합/상호작용을 확인하는 이스트투하이브리드법, 콘포칼현미경법, 공동면역침전법, 표면플라즈마공명 (SPR) 및 스펙트로스코피법을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 이러한 방법에 관한 비교 및 자세한 실험법에 관한 추가의 참고문헌은 Berggard et al., (2007) "Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions", PROTEOMICS Vol7: pp 2833 - 2842에 기재된 것을 참고할 수 있다.

한 구현예에서, 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면 본원의 스크리닝에 사용되는 단백질을 발현하는 세포 예를 들면 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus). 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(V. parahaemolyticus)가 사용될 수 있다.

세포를 세포배양 플레이트에 배양한 후, 여기에 시험물질을 첨가한 후, 일정 시간 후에 세포로부터, 총 단백질을 추출하여, 예를 들면 공동면역침전법, 면역형광법을 통하여 단백질간의 상호작용 여부를 확인할 수 있다. 대조군(시험물질을 처리하지 않은 경우)와 비교하여, 단백질간의 상호작용을 억제한 것을 항생제 후보물질로 선별할 수 있다.

본 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재 하에서 피루베이트 키나아제(vPyK) 및 탈인산화된 HPr 단백질간의 상호작용의 감소를 가져오는 물질을 상호작용을 억제하는 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본 발명에서 상호작용은 단백질 간의 접촉/결합을 일컫는 것으로서, 공유 및 비공유 결합에 의한 상호작용을 모두 포함하는 것이다. 본 발명에서 "시험물질"은 피루베이트 키나아제(vPyK) 및 탈인산화된 HPr 단백질과의 상호작용(결합)을 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 단백질은 피루베이트 키나아제(vPyK) 및 탈인산화된 HPr 단백질에 대한 항체를 포함할 수 있다.

비브리오균에 유효한 항생물질의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

본원에 따르면, vPyK와 탈인산화된 HPr 단백질과의 상호작용에서 Hpr 단백질이 촉매로서 작용해서, 피루베이트의 세포내 농도를 증가시키고, 따라서 상호작용의 검출은 피루베이트의 농도 변화, 특히 피루베이트의 농도 감소로 검출될 수 있다. 대조군에서의 피루베이트 농도를 비교하여 PEP 농도를 감소시키지 못한 물질 또는 피루베이트 농도를 증가시키지 못한 물질을 상기 단백질간의 상호작용을 억제할 수 있는 후보물질로 선별한다. 이러한 물질은 비브리오균에 유효한 항생물질로서 유용할 수 있다.

또한 본원에 따르면 vPyK와 탈인산화된 HPr 단백질과의 상호작용은 상기 vPyK의 활성의 변화를 가져오고, 따라서 상호작용의 검출은 특히 vPyK의 활성 감소로 검출될 수 있다. 일 구현예에서는 PyK 활성을 측정하여 결정할 수 있다. PyK의 활성은 μmol min^-1mg^-1로 표현되는데, 이는 분당 1 μmol의 피루베이트 형성을 촉진시키는 PyK 양으로 정의된다. 상호작용을 세포내에서 실험하는 경우 시험물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 PyK의 활성을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 피루베이트 키나아제(vPyK) 및 탈인산화된 HPr 단백질이 상호작용이 저해되는 경우, PEP와 ADP로부터 ATP와 피루베이트를 생성하는 반응이 방해되어 결국 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 비브리오균이 살아남지 못하거나 산화스트레스에 저항성이 약해지므로, 이러한 효과를 갖는 화합물은 비브리오균에 유효한 항생물질의 후보물질로 선별할 수 있다.

다양한 인간 병원균을 포함한 많은 박테리아는 다양한 환경 스트레스에 대응하여 살아있지만 배양할 수 없는(viable but nonculturable (VBNC)) 상태로 들어간다고 알려져 있다(Oliver, 2010, FEMS Microbiol Rev 34: 415-425). 박테리아 종에 따라 서로 다른 화학적 및 환경적 요인이 VBNC 상태를 유도한다고 보고되어 있다. 기회 감염성 인간 병원균인 V. 불니피쿠스에서 H₂O₂가 VBNC에서 중요한 역할을 하기 때문에, 불리한 환경 상태 하에서 생존을 촉진시키기 위하여 카탈라아제 및 피루베이트와 같은 수소 스캐빈져 생산은 매우 정교한 방식으로 조절되어야 한다. 피루베이트 키나아제(PyK)는 해당과정의 마지막 단계를 촉매하는데, 특히 ADP의 ATP로의 인산화와 동시에 PEP가 피루베이트로 비가역적으로 전환되는 단계를 촉매하며, 반면 PTS는 해당과정의 첫 단계인 당의 수송 및 인산화를 촉매한다. PTS 요소의 탈인산화 형태는 글루코스와 같은 PTS 기질의 수송동안 증가하기 때문에, PTS 또한 영양분 이용가능성과 같은 환경 변화를 모니터링하는 센서시스템으로 작용한다.

본원에 따르면 PTS의 vHPr이 글루코스를 감지하여 그럼으로써 V. 블니피쿠스 세포가 H₂O₂에 저항하는 것을 증가시킨다. vHPr을 추가하지 않은 대조군 분석에서의 농도와 비교하여 대략 16μM의 vHPr일 때 탈인산-vHPr에 의해 vPykA 활성이 7배 이상까지 최대한 자극되었다(도 5B). HPr의 세포내 농도는 이전에 E. coli 및 살모넬라 티피뮤리움에서 20-100μM인 것으로 계산되었다(Mattoo & Waygood, 1983, Can J Biochem Cell Biol 61: 29-37; Rohwer et al., 2000, J Biol Chem 275: 34909-34921). E. coli 세포에서 eHPr과 유사하게(Park et al., 2013), vHPr 은 LBS 배지 및 비-PTS 슈가인 갈락토오즈를 보충한 LBS 배지에서 주로 인산화형태로 존재하지만, 반면 V. 불니피쿠스 세포에 있는 PTS 슈가인 글루코스를 보충한 배지에서는 탈인산화 상태가 우세한 것으로 나타났다(도 5b). 이러한 데이터는, 탈인산화된 HPr의 농도가 0 내지 100μM로 다양할 수 있고, vPykA의 총 활성은 탄소원에 따라 세포내에서 7배까지 변할 수 있다는 것을 말한다. 이러한 조절은 E. coli에서는 나타나지 않기 때문에, 이에 PTS 조절 역할이 종-특이적인 것임을 나타낸다.

본원에 따른 이러한 종-특이적인 현상은 매우 특이한 것으로 E. coli 및 V. 불니피쿠스 모두 g-프로테오박테리아에 속하고, 따라서 두 종에 있는 이종상동성(orthologous) 단백질은 아미노산 서열 동일성이 매우 높다(33% for Rsd, 47% for glycogen phosphorylase, 71% for PykA, 및 76% for HPr)는 사실에도 불구하고, 베이트로 vHPr을 사용한 반복된 리간드 피싱 실험에서 V. 불니피쿠스 추출물에서 Rsd 또는 글리코겐 포스포릴라아제를 탐지할 수 없었다.

또한 본원에서 두 PykA 단백질의 특이적 피루베이트 키나제 활성이, 알로스테릭 효능기가 위치하고 있는 결합부위인 C-도메인을 스왑핑한 후 상반되게 변한다는 것은 매우 특이한 것이다. 불활성 T-상태 및 활성 R-상태 사이의 알로스테릭 전이에는, 테트라머 강직성(rigidity)을 변경하기 위하여 4개 서브유닛 각각에 A- 및 C-도메인 코어의 대칭적 6°강직체(rigid-body) 락킹 모션(rocking motion)이 포함되어 있다는 것이 기존에 알려져 있다(Morgan et al., 2010, J Biol Chem 285: 12892-12898). 따라서 C-도메인 스왑핑 이후 두 개의 PykA 단백질의 특이적 PyK 활성에서의 상호적 변화에 의해 테트라머 강직에서의 변화가 생기는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험재료 및 방법

박테리아 균주, 플라스미드 및 배양 조건 : 본원에 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드는 표 1에 기재되어 있다.

[표 1]

V. 불니피쿠스 균주는 2.5% NaCl를 함유하는 루리아-베르타니 배지(LBS) 또는 0.2% 카스아미노산 및 2.5% NaCl를 함유하는 M9 최소 배지(M9S)에서 배양하였다. 모든 E. Coli 균주는 LB 배지에서 배양하였다. V. 불니피쿠스 CMCP6 균주의 pykA 결실 돌연변이를 구축하기 위하여, 하기 두개의 프라이머를 사용하여 V. 불니피쿠스 CMCP6의 pykA 상향 부위를 함유하는 1,079-bp DNA 를 증폭시켰다; ; 5′- GACCGTCTCGAGGCACCCTCTGTTGCCACAG-3′ (밑줄 부분은 합성 XhoI 사이트) 및 5′- TGGCTGTCTAGAAGCTTCTCCTGCGATAGAC-3′ (밑줄 부분은 합성 XbaI 사이트). 이어 PCR 생성물을 pDM4 벡터로 클론하여 pDM-PyKAup을 생산하였다. pykA 유전자의 하향 부위를 함유하는 881-bp DNA 분획을 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰고; 5’-GTTTTTTCTAGACTCGCTTCATTAGTGATAG-3′ (밑줄 친 부분은 XbaI 사이트) 및 5′- AAAATTAGATCTTATCCCTATAAGTTGGATC-3′ (밑줄 친 부분은 BglII 사이트), 상응하는 pDM-DPyKA 사이트로 클로하여 pDM-DPyK를 얻었다. pDM-DPyK를 V. 불니피쿠스 CMCP6와 같이 접합하여, 트랜스접합체를 선택하였고 인터그레이션은 PCR로 확인하였다. pykA 결실 돌연변이를 형성하기 위하여, 8% 수크로즈를 함유한 LBS에서 엑소컨쥬게이트를 그후 선택하였다(Lee et al., 2011). 선택된 콜로니에서 pykA 결실은 PCR로 확인하였다.

pRK-PyKA를 구축하기 위하여, V. 불니피쿠스를 함유하는 1,879-bp DNA 분획 및 자신의 프로모터를 사용하여 증폭하였다; 5′- CATCTTGGATCCCAACATTCTATAACGGAGC-3′ (밑줄친 부분은 유전자조작된 BamHI 사이트) 및 5′- CCAGTTCTGCAGTCAGCGGCCGAGACGAATTG-3′ (밑줄친 부분은 유전자조작된 PstI 사이트).

pRK-PyKA를 구축하기 위하여, V. 불니피쿠스 pykA 유전자 및 이들 자신의 프로모터를 함유하는 1,879-bp DNA 분획을 하기 두개의 프라이머를 사용하여 증폭하였다; 5′- CATCTTGGATCCCAACATTCTATAACGGAGC-3′ (밑줄친 부분은 유전자조작된 BamHI 사이트) 및 5′- CCAGTTCTGCAGTCAGCGGCCGAGACGAATTG-3′ (밑줄친 부분은 유전자조작된 PstI 사이트). PCR 생성물을 광역 숙주 범위 (broad-host-range) 플라스미드 pRK415로 클론하였다. 얻은 플라스미드, pRK-PyKA는 E. coli SM10 λpir로 형질전환하였고 그후 접합으로 V. 불니피쿠스 pykA 돌연변이로 전사하였다.

모든 플라스미드는 표준 PCR-기초 클로닝 기술을 사용하여 구축하였고 서열로 입증하였다.

키메라 PykA 단백질 발현 플라스미드 구축 : V. 불니피쿠스 pykA 유전자를 함유하는 998-bp DNA인 pET-vePykA를 하기 두개의 프라이머를 사용하여 V. 불니피쿠스 CMCP6의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다; 5′- AGGAGAACATATGACTCAGCCATTAAGAAG-3′ (밑줄 친 부분은 유전자조작된 NdeI 사이트) 및 5′- ACTTCTGCCATGGAGCGCACCGTTTCGACTGG-3′ (밑줄 친 부분은 유전자조작된 NcoI 사이트). PCR 생성물을 그후 pET3a 벡터로 클론하여 pET-vPykAup를 생산하였다. E. coli pykA 유전자를 함유하는 446-bp DNA 분획은 하기 프라이머를 사용하여 E. coli MG1655의 게놈 DNA로부터 증폭시켰고; 5′- TTGCAGCCATGGCGCGCGTTTGCCTGGGTGC-3′ (밑줄 친 부분은 유전자조작된 NcoI 사이트) 및 5′- CCGGCAGGATCCTTACTCTACCGTTAAAATACG-3′ (밑줄 친 부분은 유전자조작된 BamHI 사이트), pET-vPykAup의 상응하는 사이트로 클론하여 pET-vePykA가 되었다.

pET-evPykA를 구축하기 위하여, 하기 두개의 프라이머를 사용하여 E. coli pykA 유전자를 함유하는 840-bp DNA 분획을 E. coli MG1655의 게놈 DNA에서 증폭시켰다 ; 5′- AGTATTCCATGGGCTCCAGAAGGCTTCGCAGAAC-3′ (프라이머 A, 밑줄친 부분은 유전자조작된 NcoI 사이트) 및 5′- GTGTTGCCGTGATTACCGCTCGGTTTAGCTGAC-3′. V. 불니피쿠스 pykA 유전자를 함유하는 609-bp DNA 분획은 하기 두개의 프라이머를 사용하여 V. 불니피쿠스 CMCP6의 게놈 DNA에서 증폭시켰다; 5′- CTAAACCGAGCGGTAATCACGGCAACACAAATG -3′ 및 5′- TAATGAGGATCCTTAGTCAAAAACAGGCAGG-3′ (프라이머 B, 밑줄 친 부분은 유전자조작된 BamHI 사이트). 상기 두개의 PCR 생성물은 프라이머 A 및 B를 사용하여 두번째 라운드 PCR에 퓨전하였고, 얻은 분획을 pETDuet-1의 NcoI 및 BamHI 사이트에 클론시켜 pET-evPykA를 생산하였다.

단백질 정제 : 본원에 사용된 N-말단 His 태그가 있는 단백질을 E. coli BL21 (DE3) 균주에서 과발현시키고, 매뉴얼에 따라 TALON 금속 친화 레진(Takara Bio, Japan)을 사용하여 정제하였다. 상기 단백질을 200 mM 이미다졸을 사용하여 용출시켜, 150 mM NaCl를 함유한 20 mM HEPES-NaOH (pH 7.6)으로 HiLoad 16/60 Superdex 75 prep 그레이드 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 태그되지 않은 단백질이 E. coli BL21 (DE3) (vPykA, vPykF, ePykA, evPykA, vePykA, 및 vHPr) 또는 E. coli GI698Δpts 균주에서 과발현되었다(Nosworthy et al., 1998) (eEI 및 eHPr). BL21 (DE3) 세포는 1 mM IPTG로 인덕션한 후 4시간 하베스트하였고, GI698 Dpts 세포는 1 mM 트립토판으로 인덕션한 후 20시간 하베스트하였다. 그후 10,000 psi에서 French 압력 세포를 거쳐 2번 통과하여 세포를 파괴시켰고 4℃에서 30분간 100,000 g로 원심분리하였다. 상층액의 단백질을 Mono Q 10/100 및 HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade (GE Healthcare) 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제시켰다. 단백질 농축은 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 어세이(Pierce) 또는 브래드포드 어세이(Bio-Rad)로 결정하였다.

vHPr과 상호작용하는 단백질을 검색하기 위한 리간드 피싱 : LBS (100 ml)에서 30℃에서 밤새 키운 V. 불니피쿠스 CMCP6 세포를 하베스트하고, 세척하여 3ml의 버퍼 A(150 mM NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 포스페이트, pH 7.0)에 재서스펜젼하였다. 10,000 psi에서 French 압력 세포를 거쳐 2번 통과하여 세포를 파괴시켰고 4℃에서 30분간 100,000 g로 원심분리하였다. 상층액(1 ml)를 0.5mg의 His-태그된 단백질 베이트와 혼합하고, 상기 혼합물을 100㎕의 TALON 메탈 친화 레진으로 4℃에서 30분간 배양하였다. 배양 후, 상기 레진을 하베스트하여 1ml의 버퍼 A로 세 번 세척하였고, 레진에 결합된 상기 단백질을 100㎕의 2X SDS 샘플 버퍼로 용출시켰다. 용출된 단백질 샘플 알리쿼트를 SDS-PAGE로 분석하였고 CBB(Coomassie brilliant blue)로 염색하였다.

RNA 분리 및 qRT-PCR : 0.2% 글루코스 또는 갈락토오스를 함유하는 LBS 및 M9S 배지에서 대수기(logarithmic phase)로 성장한 V. 불니피쿠스 CMCP6 세포로부터 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 제조하였고, 문헌(Park et al..(2013) Proc Natl Acad Sci U S A 110: 21142-21147.)에 기재된 바와 같이 qRT-PCR를 수행하였다. RNase-free DNase (Promega)를 사용하여 DNA를 제거하였다.

표면 플라즈몬 공명 분광기(Surface plasmon resonance spectroscopy): 상기(Lee et al.,(2007) Proc Natl Acad Sci U S A 104: 4124-4129.; Park et al., 2013)에 기재한 바와 같이 BIAcore 3000 (BIAcore AB)를 사용하여 SPR 탐지로서 vPykA 또는 vPykF를 지닌 vHPr의 실시간 상호작용을 모니터하였다. NHS/EDC 반응을 사용하여 CM5 센서 칩의 카복시메틸화 덱스트란 표면에 정제된 vHPr를 고정시켰다. 표준 러닝 버퍼는 10 mM 포타슘 포스페이트(pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 및 1mM DTT(dithiothreitol)이고, 모든 시약은 10㎕/분의 유속으로 도입되었다. KD 수치는 BIA evaluation 2.1 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

피루베이트 키나아제 활성의 측정 : PyK(Pyruvate kinase) 활성은 젖산탈수소효소(LDH)와 결합된 연속 어세이로 결정하였는데, NADH의 산화에 기인한 340 nm에서의 흡광도 변화는 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 측정하였다. 상기 반응에는 총 부피 1ml의 6유닛의 LDH (Sigma-Aldrich), 100 mM HEPES, pH 7.5, 200 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10mM 소디움 포스페이트, 1mM DTT 및 0.2mM NADH이 포함되어 있다. 2 밀리몰의 ADP 및 0-16 mM PEP를 기질로 첨가하여, 20μM 데포스포-HPr의 존재 또는 부존재하에서 PEP에 대한 vPykA의 S_0.5를 결정하였다. 총 농도 20nM의 vPykA를 첨가하여 반응을 개시하여 30℃에서 5분간 지속하였다. PyK 활성은 비활성(μmol min^-1mg^-1)으로 표현되는데, 이는 분 당 1 μmol의 피루베이트 형성을 촉진시키는 PyK의 양으로 정의된다. 겉보기 S_0.5, Hill coefficient(h), 및 V_max or k_cat 수치는 프리즘 소프트웨어 팩키지(GraphPadInc., San Diego, CA)를 사용하여 데이터를 알로스테릭 시그모이달 비선형 회구분석하여 결정하였다.

세포내 PEP 및 피루베이트 농도의 결정 : PEP 및 피루베이트의 세포내 농도를 결정하기 위하여, 800ml의 세포를 A₆₀₀＝1로 성장시키고, 원심분리로 하베스트하여, 탄소원 없는 아이스콜드 M9S로 세척하였다. M9S로 최종 부피 2.6ml로 세포를 희석하여, 5분간 실온으로 조정하여 지시된 탄소원을 첨가하기 전에 2분간 에어레이트하였다. 실험 전반동안 에어레이션을 지속하였다. 지정된 시간에 샘플(500㎕)을 취하여, 즉시 250㎕의 5M HClO₄와 혼합하여, 5초간 볼텍스하고 4℃에서 20분간 5,000g에서 원심분리하였다. 상층액(500㎕)을 170㎕의 5M K₂CO₃로 중성화하였다. 침전된 KClO₄는 냉각 에펜도르프 센트리퓨즈에서 5분간 원심분리하여 제거하였다. PEP 및 피루베이트는 분광광도기를 사용하여 분석하였다. 반응 혼합물(총 1ml)에는 200 ㎕의 각 샘플에 더하여 200 mM HEPES (pH7.5), 20 mM MgCl₂, 400mM KCl, 2 mM DTT 및 10㎕의 즉석 제조된 20 mM NADH가 함유되어 있다. 피루베이트를 측정하기 위하여, 1.5 유닛의 LDH (Sigma-Aldrich)를 첨가하여 각 반응을 시작하였다. 30℃에서 20분간 배양한 후 A340를 측정하였다. 연속하여, PEP를 결정하기 위하여 PyK (1 unit)/LDH (1.4 units) 혼합물 (Sigma-Aldrich)에 ADP를 첨가하였고(2 mM이 되도록 함), 30℃에서 20분간 배양한 후 A340를 관찰하였다.

실시예 1. 비브리오 불니피쿠스 에서의 HPr 및 피루베이트 키나아제 A의 특이적 상호작용 규명

비브리오 불니피쿠스 HPr(이하, HPr)과 상호작용하는 단백질을 찾기 위하여, 본 발명자는 리간드 피싱 전략을 이용하였다(Kim et al., 2011,Biochem Biophys Res Commun 409: 556-561.; Kim et al., 2010, Vibrio vulnificus. FEBS Lett 584: 4537-4544; Lee et al., 2007, Proc Natl Acad Sci U S A 104: 4124-4129; Park et al., 2013, Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 110: 21142-21147). V. 불니피쿠스 CMCP6 조 추출물을 N-말단 His- 태그 형태의 vHPr(H-vHPr)과 혼합하여 풀-다운 어세이를 하였다. 반복된 실험을 통해 H-vHPr과 항상 같이 용출되는 52 kDa의 분자량의 단백질 밴드를 확인하였다(도 1A). MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리 분석을 적용하여 본 단백질 밴드를 맵핑한 후 트립신으로 겔중에서 소화한 결과 상기 단백질은 VV1_2992로 코딩되는 피루베이트 키나아제와 일치하는 것으로 확인하였다.

피루베이트 키나아제(PyK)가 해당과정의 마지막 단계에서 촉매작용하기 때문에, 동물, 식물, 균류, 원생생물 뿐만 아니라 박테리아를 포함한 거의 모든 유기체에 널리 퍼져있다. BLAST 분석을 통해, V. 불니피쿠스 균주는 다른 비브리오처럼 PyK 효소를 인코딩하는 세 개의 유전자(VV1_2992, VV1_0644, 및 VV2_0206)를 가지고 있다는 것이 밝혀졌다. 반대로 E. coli 균주는 두 개의 PyK 이소자임을 가지고 있다: PykA (ePykA)는 AMP에 의해 알로스테릭하게 활성화되는 반면, PykF (ePykF)는 프럭토오즈 1,6-비포스페이트에 의해 알로스테릭하게 활성화되는 것으로 알겨졌다. VV1_0644에 의해 인코딩되는 PyK는, E. coli K-12 균주의 ePykF 및 ePykA와 각각 78 및 38% 아미노산을 공유하는 반면, VV1_2992에 의해 인코딩되는 단백질은 ePykF 및 ePykA와 각각 37 및 71% 동일성을 나타낸다. 비록 VV2_0206로 인코딩되는 PyK는 ePykF (40%)보다는 ePykA (52%)와 다소 더 많은 서열 동일성을 보여주는 반면, V. 불니피쿠스 CMCP6 균주를 서로 다른 배지에서 배양하였을 때 VV2_0206의 mRNA 전사는 거의 존재하지 않는다는 것은 VV2_0206 발현이 복잡할 수도 있다는 것을 나타낸다. 이에 본 발명자는 VV1_0644 및 VV1_2992로 인코딩되는 PyK를 각각 vPykF 및 vPykA로 칭하였다.

vPykA 및 vHPr 사이의 상호작용을 확인하기 위하여, 본 발명자는 His₆-태그된 vPykA(H-vPykA)를 구축하여 정제하였다. H-vPykA로 충진된 TALON 금속 친화 레진을 사용하여 풀-다운 에세이를 수행하여 V. 불니피쿠스 CMCP6 조추출물에서 vPykA-결합 단백질을 확인하였다. 간략히 세척한 후, 레진에 결합된 단백질을 200mM 이미다졸로 용출시켜 SDS-PAGE로 분석하였다. 도 1B에 나타난 바와 같이, H-vPykA 존재시에 조추출물이 로딩된 컬럼의 용출액에서는 6.5 kDa 폴리펩타이드보다 다소 더 천천히 이동하는 단백질 밴드만이 탐지할 수 있었다. 인-겔 트립신 다이제스트를 한 후 펩타이드 매스(mass) 핑거프린팅으로 상기 단백질을 vHPr로 확인하였다. 이러한 결과는 vHPr 및 vPykA 사이의 특이적 상호작용을 뒷받침해준다.

실시예 2. vHPr 및 vPykA 사이의 상호작용에서 인산기의 중요성

vHPr 및 vPykA 사이의 상호작용에 필요한 요소를 규명하기 위하여, 정제된 vPykA를 정제된 H-vHPr와 혼합하여 금속 친화 크로마토그래피를 수행하였다. 조 세포 추출물의 vPykA와는 달리, 조 세포 추출물을 첨가하지 않는 한, 정제된 단백질 단독으로는 H-vHPr에 거의 결합하지 않았는데 (도 2A, 레인 1-3), 이는 vHPr 및 vPykA 사이의 상호작용은 추가 요인에 의해 좌우된다는 것을 의미한다. 이러한 추가 요인이 단백질인지 또는 기타 대사물질인지 조사하기 위하여, 세포 추출물은 Microsep 3K 멤브레인을 사용하여 여과하여, 상기 상호작용에 대한 여과액의 효과를 측정하였다. vPykA가 여과액에 존재할 때 H-vHPr에 결합하는 것으로 나타났으며, 이는 vPykA-vHPr 상호작용에 필요한 인자는 저분자물질임을 나타낸다 (도 2A, 레인 4).

이에, 상기 상호작용에 대한 다양한 세포 대사물질의 효과를 실험하였다. 포타슘 글루타메이트, 포타슘 아세테이트, 및 아세틸 포스페이트가 vHPr-vPykA 결합에 거의 영향을 미치지 않지만, 포타슘 포스페이트는 vPykA의 vHPr로의 결합을 현저히 증가시켰는데(도 2A, 레인 5-8), 이는 무기 인산염(Pi)이 vHPr-vPykA 상호작용의 매개자라는 것을 의미한다. vHPr의 새로운 결합 파트너를 찾기 위한 초기 피싱 실험에서 50mM 소디움 포스페이트 버퍼가 사용된 것이 중요한 것으로 나타났다 (도 1).

Pi의 세포내 농도는, 인 비보 ³¹P-NMR 연구(Ugurbil et al., 1982, Escherichia coli cells. Biochemistry 21: 1068-1075)에서 정상 상태에서 자란 E.coli에서 3 내지 9 mM인 것으로 보고되었지만, 글리세롤-3-포스페이트가 배지에 첨가되었을때 내부 Pi가 더 높은 레벨로 증가될 수 있다(Xavier et al., 1995, J Bacteriol 177: 699-704). 따라서 vHPr 및 vPykA 사이의 상호작용에 대한 Pi 농도의 효과를 테스트하였다. 도 2A의 결과에 나타난 바와 같이, vPykA는 Pi 부존재시 H-vHPr과 특이적 결합을 거의 나타내지 않았다(도 2B, 레인 1 및 2). 그러나, 반응 혼합물에서 Pi 농도가 증가함에 따라, H-vHPr에의 vPykA의 특이적 결합 또한 증가하였다(도 2B 및 C). 이중 역비례선을 통해 vPykA-vHPr 상호작용의 반수최대(half-maximal) 자극에 대한 Pi 농도는 대략 3.95mM이었다(도 2D). 이러한 결과와 E.coli에서 보고된 Pi 세포내 농도(상기 Ugurbil et al., 1982)를 고려하여, 본원에서는 달리 언급되지 않는 한, Pi를 최종 농도 10 mM까지 첨가하여 약 70% 최대 자극이 생기도록 하였다.

실시예 3. vHPr 및 vPykA 간의 인산화-상태 의존적 상호작용

vHPr 및 vPykA 간의 결합 특이성을 BIAcore 시스템 및 표면 플라즈몬 공명(SPR) 바이오센터 기술을 사용하여 측정하였다 (Seok et al., 1997, J Biol Chem 272: 26511-26521). 구체적으로 vHPr을 CM5 센서 칩에 고정시키고, vPykA 또는 vPykF가 표면 위로 흐르도록 하였다. 정제된 vPykF를 고정된 vHPr에 노출시켰을 때, 아무런 상호작용도 탐지되지 않았다(도 3A, 센서그램 a). 반대로, 정제된 vPykA는 SPR 공명에서 유의하게 증가하였는데(도 3A, 센서그램 b), 이는 vHPr이 vPykA와 상호작용하지만 vPykF와는 그렇지않다는 것을 의미한다. vPykA에의 vHPr의 결합에 대한 동력학적 계수를 측정하기 위하여, 서로 다른 농도(31.25 - 500 μM)의 정제된 vPykA를 센서칩의 vHPr 표면에 적용하였다. vPykA 농도 기능으로 작용하는 시그널이 증가하였다(도 3B). vHPr-vPykA 상호작용에 대한 해리상수 (KD)를 BIA 소프트웨어를 사용하여 결정하였는데 대략 4.5 x 10^-7 M이었으며, 이는 1:1 상호작용을 나타낸다.

대체적으로, PTS의 조절 기능은 관여한 단백질의 인산화 상태에 좌우된다(Deutscher et al., 2006, Microbiol Mol Biol Rev 70: 939-1031). 따라서, vPykA와의 상호작용에 대한 vHPr 인산화의 효과를 SPR로 측정하였다. 인산화 및 탈인산화 vHPr 표면은 EI, vHPr 및 EIIA^Glc 사이의 가역적 인산화 이동 반응에 의해 생성된다 (Nam et al., 2001, EMBO J 20: 491-498). 정제된 vPykA를 고정된 vHPr에 적용시켰을 때, 높은 친화력의 상호작용이 탐지되었다(도 3C, 센서그램 a). 반대로, EI 및 포스포에놀피루베이트(PEP)를 표면위로 흘려 고정된 vHPr을 인산화시키고 연속적으로 러닝버퍼로 세척하고 난 후에는, vPykA와의 상호작용은 거의 탐지되지 않았다(도 3C, 센서그램 b). 더욱이, 상기 동일 vHPr 표면에서, 플로우 세포(flow cell)를 통과하여 탈인산화된 EIIA^Glc를 플로잉하고 러닝 버퍼로 플러시한 후에는 vPykA 결합 활성이 회복된 것으로 입증되었다(도 3C, 센서그램 c). 이러한 결과는 인산화 형태가 아닌 탈인산화-vHPr만이 vPykA와 상호작용할 수 있다는 것을 말한다.

vHPr 및 vPykA 사이의 상호작용에 대한 인산화 상태의 특이성 및 의존성 또한 TALON 금속 친화 레진에 흡수된 H-vHPr과의 풀-다운 어세이를 통하여 조사하였다. vHPr의 인산화 형태는 반응혼합물에 EI 및 PEP를 첨가함으로써 생성되었다. 보조인자로서 이가 양이온을 필요로 하는 효소인 것으로 예상한 바와 같이(Muirhead, 1990, Biochem Soc Trans 18: 193-196), vPykA 및 vPykF 모두 TALON 금속 친화 레진에의 몇몇 비특이적 결합이 관찰되었다. 정제된 vPykA의 일정양이 탈인산화된 H-vHPr와 서로 다른 농도로 혼합될 때, H-vHPr에 의해 폴-다운된 vPykA 양은 H-vHPr의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 반대로, EI 및 PEP와 함께 배양하여 H-vHPr를 인산화하였을 때, 레진에 결합된 vPykA의 양은 반응 혼합물에 첨가된 vHPr의 농도에 영향을 받지 않았다. 도 3A의 데이타에 나타난 바와 같이, TALON 금속 친화 레진에 흡수된 H-vHPr은, vHPr의 인산화 상태에도 불구하고 vPykF를 풀 다운하지 않았다. 이러한 결과는 vHPr-vPykA 상호작용의 인산화 상태에 대한 특이성 및 의존성을 뒷받침한다.

실시예 4. vPykA의 C-말단 도메인에 의한 vHPr-vPykA 복합체의 결합 특이성 분석

HPr 및 PykA 사이의 상호작용이 V. 불니피쿠스에게서 특이한 것인지 또는 교차-상호작용이 다른 종의 단백질 사이에서도 가능한 것인지를 테스트하기 위하여, E. coli 및 V. 불니피쿠스에서 HPr 및 PyK 단백질을 준비하여 이들 단백질의 교차-상호작용을 측정하였다. 특히, vHPr 또는 eHPr 어느 것도 vPykF 및 ePykA와 상호작용하지 않는 반면, vPykA는 비록 vHPr과는 친화력이 낮지만 eHPr과는 상호작용하였다(도 4). 이러한 데이타는 HPr 및 PykA 단백질 사이의 상호작용이 종-특이적이고 PykA의 표면 구조에 좌우된다는 것을 말한다. PyK는 원핵생물에서부터 진핵생물까지 모든 유기체 내에 매우 잘 보존되어 있다. 박테리아, 이스트 및 포유동물의 다양한 종에서 몇몇 PyK에 대한 크리스탈 구조 형성은 일반적으로 보존된 것으로 나타났다(Mattevi et al., 1995, Structure 3: 729-741; Rigden et al., 1999, J Mol Biol 291: 615-635; Valentini et al., 2002, J Biol Chem 277: 23807-23814; Zoraghi et al., 2011, J Biol Chem 286: 44716-44725). PyK는 호모-테트라머로 존재하며, 각 서브유닛은 셋 내지 네개의 도메인(N, A, B, 및 C 도메인)으로 구성되어 있다. N 도메인은 원핵생물 PyK에는 존재하지 않고, 이들 박테리아 효소의 N-말단에 있는 A 및 B 도메인은 70%를 이루며, 여기에는 ADP, PEP 및 이가 양이온에 대한 결합 부위가 존재한다. 나머지 30%는 C 도메인에 일치하는데, 알로스테릭 조절자에 대한 결합 부위가 존재한다. ePykA 및 vPykA의 아미노산 서열 배열(Alignment)을 통해 333개 N-말단 아미노산이 78% 동일성을 지녀 매우 잘 보존되어 있고, 반면 C-말단은 다소 덜 보존되어 있다는 것을 알 수 있다(도 9). 따라서, vPykA의 C-말단 도메인이 vHPr에 대한 결합 특이성을 결정에 중요한 것으로 가정하였고, PykA 및 HPr 사이의 종-특이적 상호작용의 결정요인을 규명하기 위하여, 두 개의 키메릭 PyK를 도메인-스와핑 접근을 통해 구축하였다. vePykA 단백질은 vPykA의 N-말단 도메인(아미노산 1-333)을 ePykA의 C-말단 도메인(아미노산 334-480)에 융합하여 만들어지는 반면, evPykA 단백질은 ePykA의 N-말단 도메인(아미노산 1-318) 및 vPykA의 C-말단 도메인(아미노산 319-482)으로 이루어졌다. 모든 구축물의 서열은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 부분 정제후, 각 키메릭 PyK를 H-vHPr의 일정양과 혼합하였고 TALON 금속 친화 레진을 사용하여 풀-다운 어세이를 하였다. vePykA 및 ePykA를 H-vHPr와 혼합하였을 때, 아무러 상호작용이 탐지되지 않았다(도 4B, 레인 3, 4, 7 및 8). 이러한 결과는 vPykA의 C-말단 도메인이 vHPr-vPykA 복합체의 결합 특이성을 결정하는 것을 나타낸다.

실시예 5. vPykA 활성에 미치는 HPr의 인산화 상태

앞서 규명한 대로 vPykA의 C-말단 도메인이 HPr-PykA 상호작용의 특이성을 결정하기 때문에, HPr이 PykA의 알로스테릭 조절자로 작용할 수 있는 것인지 분석하였다. PyK 활성은 락테이트 데히드로게나아제(LDH)-결합 어세이로 결정하였는데, 이는 NADH가 NAD⁺가 산화될 때 나오는 340nm에서의 흡광도가 감소하는 것을 측정한다. 이러한 어세이는 PyK에 의해 PEP가 피루베이트로 전환하는 것을 기본으로 하는 것으로, NADH를 소비하면서 LDH에 의해 피루베이트가 락테이트로 전화되는 것과 연관되어 있다(Zoraghi et al., 2010, Staphylococcus aureus. Biochemistry 49: 7733-7747). HPr 및 PykA의 특이적 상호작용이 PyK 활성의 특이적 조절과 직접 관련되어 있는지를 조사하기 위하여, 네 개의 서로 다른 PyK(vPykA, evPykA, vePykA, 및 ePykA)를 정제하였고, 이들 활성은 eHPr 또는 vHPr 존재 또는 부재하에서 비교하였다(도 4C 및 D). vPykA는 대략 ePykA와 동일한 특이적 활성을 나타낸다. 그러나 연결된 3분의 1의 C-말단은 ePykA에서 유래되고, 3분의 2의 N-말단은 vPykA 유래의 것을 포함하는 키메라 단백질 vePykA는 유의하게 낮은 특이성을 나타내는 반면, ePykA에서 온 3분의 2의 N-말단 및 vPykA에서 온 3분의 1의 C-말단으로 구성된 evPykA는 vPykA 및 ePykA보다 유의하게 높은 특이 활성을 나타낸다. 결합 에세이에서 나타난 바와 같이(도 4A), ePykA 활성은 eHPr 또는 vHPr 어느 것에도 거의 영향을 받지 않는 반면, vPykA 활성은 vHPr에 의해 유의하게 자극받는다. eHPr 또한 vPykA 활성을 자극하지만, 그럼에도 불구하고 vHPr보다는 훨신 적게 자극받는다(도 4C). 특히 vHPr 또는 eHPr에 의한 활성 조절 측면에서는, vePykA의 효소 활성은 eHPr 또는 vHPr 둘다에 의해 자극받지 않는 반면, evPykA는 vPykA와 동일한 방식으로 행동한다(도 4D). 이러한 결과는 결합 분석 결과와 일치하며(도 4A 및 B), HPr이 vPykA의 C-말단에 있는 알로스테릭 부위에 결합함으로써 효소 활성을 자극한다는 것을 나타낸다.

다양한 농도의 AMP, 프럭토오즈 1,6-비스포스페이트(FBP), 및 탈인산화 vHPr가 vPykA 활성에 영향을 미치는 것으로 나타났다(도 5). ePykA와는 서열 동일성이 높고(71%) ePykF와는 서열 동일성이 낮은(37%) 것으로 예상한 바와 같이, vPyKA 활성은 FBP에 의해 유의하게 영향을 받지 않는다. 흥미롭게도, 그러나 vPykA는 8mM AMP에 의해 대략 2배정도 활성화되는 반면, ePykA는 10배 이상 활성화되었다(도 5A). 탈인산-vHPr은 농도의존적 방식으로, 대조군의 결과와 비교하여 약 7배 정도로 vPykA 활성을 증가시켰다(도 5B). 이러한 결과는, vPykA의 인비보 알로스테릭 효능 기가 AMP보다는 탈인산화 vHPr임을 나타내는 것이다. 탈인산-vHPr에 의한 vPykA활성 자극은, 16μM의 vHPr에서 최대 활성화되고 약 4μM에서 반수 최대 활성화되어 포화되는 것으로 나타났다.

이어 vPykA 활성 조절에 대한 vHPr의 인산화 상태의 효과를 연구하였다. 이를 위해 PEP (1 mM), EI (2 μg ml-1), 및 다양한 농도의 vHPr을 결합 효소 분석(coupled enzyme assay)에 사용하였으며, vPykA 추가 5분전에 미리 준비하였다. 인산화-vHPr을 첨가하면 vHPr의 양과 관계없이 vPykA 활성에 자극이 전혀 없었으며, 이는 탈인산화-vHPr 만이 상호작용할 수 있고 따라서 vPykA 활성을 자극한다는 것을 나타낸다.

vPykA의 촉매 기능에 대한 vHPr의 효과를 평가하기 위하여, 20μM의 탈인산화-vHPr의 존재 및 부재하에서 PEP에 대하여 vPykA의 항정상태 카이네틱스(steady-state kinetics)을 측정하였다(도 5C). 분석에서 수득한 파라미터는 표 1에 요약하였다. vHPr은 vPykA의 V _max , 힐 상수(Hill coefficient(h)) 및 촉매 활성 (k _cat )에 대한 효과를 거의 나타내지 않는 반면, vHPr이 존재하면 불포화 상태하에서 PEP의 S _0.5 는 대략 3.7배 감소하게 된다. 이러한 결과는 vHPr의 인산화 상태는 PEP에 대한 vPykA의 친화력에 영향을 미침으로써 vPykA 활성을 조절한다는 것을 알 수 있다.

실시예 6. vHPr의 인비보 인산화 상태 및 vPykA 활성에 대한 글루코스 효과

PTS 요소의 인산화 상태는 PTS 기질의 이용률(availability) 및 상기 세포의 대사 상태에 따라 달라진다(Deutscher et al., 2014, Microbiol Mol Biol Rev 78: 231-256). 실지로, 최근 E. coli에서 eHPr이 PTS 당 글루코스가 같이 보충된 LB 배지에서 거의 완전히 탈인산화된 것으로 나타난 반면, 비(non)-PTS 당이 보충된 LB 배지에서는 주로 인산화 형태로 존재하였다. vHPr의 인산화 상태가 또한 PTS 당의 이용가능성에 좌우되는 것인지 결정하기 위하여, 본 발명자는 글루코스 또는 갈락토오스를 보충한 2.5% NaCl을 함유한 LB 배지(LBS)에서 성장한 세포에서 vHPr의 인산화 정도를 측정하였다. vHPr은 글루코스를 보충한 LBS 배지에서는 대부분 탈인산화되었고, 반면 LBS 배지 및 갈락토오즈를 보충한 LBS 배지에서는 인산화 상태가 우세하였다. 따라서, vHPr은 선호하는 PTS 당의 이용가능성에 대응하여 vPykA 활성을 조절하여, vHPr의 인산화 상태를 결정하는 것을 나타낸다.

인비보에서 vPykA 활성에 대한 vHPr의 인산화 상태-의존적 효과를 확인하기 위하여, 야생형 CMCP6, 및 탄소원을 각각 첨가한 후 글루코스 또는 갈락토오스에서 성장한 pykA 돌연변이 세포에서의 PEP 및 피루베이트의 세포내 농도를 측정하였다. 야생형 균주에서는, 10mM의 글루코스를 첨가한 후 5분 이내에 PEP 농도가 감소한 동시에 피루베이트 농도가 극적으로 증가하였다(도 6A 및 B). 특히, pykA 결실 돌연변이 세포에서 피루베이트 농도 또한 글루코스 첨가 후에 증가하였지만 야생형 세포보다는 유의하게 적었으며, PEP 농도는 다소 감소하였다. vPykA 발현이 자신의 프로모터의 조절 하에 있는 플라스미드 pRK-PyKA와 같이 변형된 pykA 돌연변이 균주에서, 피루베이트 농도는 야생형 균주에서와 유사한(또는 다소 높은) 레벨까지 증가하였고, 10mM 글루코스를 첨가한 후 PEP 레벨에서는 다소 약간 감소하였다. 그러나, 비-PTS 당 갈락토오즈를 첨가하면 세 개의 균주 모두에서 피루베이트 및 PEP의 세포내 농도 모두 현저한 변화를 일으키지 않았다(도 6C 및 D). V. 불니피쿠스에서 탄소원에 좌우되는 피루베이트 농도에서 유의하게 다른 것은 pykA 발현에 대한 두 당의 차별 효과에 기인하지 않는다는 것이다. 따라서, 이러한 결과는 최소한 일부분은, vPykA는 탈인산-vHPr과 상호작용하여 PTS 기질의 존재하에서 증가하는 피루베이트의 세포내 농도를 조절하는 역할을 하는 것을 나타낸다.

실시예 7. vPykA 활성에 의한 H2O2에 대한 저항성

pykA 결실 돌연변이는 성장에 영향을 받는다. 새로운 배지에 세포를 접종하면, pykA 돌연변이는 야생형 CMCP6보다 더 긴 래그타임을 나타내었다(도 7A). 그러나, 상기 돌연변이의 서브컬쳐는 야생형 균주의 서브타임과 유사한 성장을 나타냈다(도 8B). 다른 많은 그램-음성 박테리아처럼, V. 불니피쿠스를 저온에서 배양하여 생존가능하지만 배양할 수 없는(VBNC) 상태로 유도하였다(Oliver, 2010, FEMS Microbiol Rev 34: 415-425). V. 불니피쿠스는 따뜻한 시기에는 강 어귀(estuaries)에서 물과 조개에서 쉽게 분리되지만, 차가운 시기에는 분리가 어렵다(Whitesides & Oliver, 1997, Appl Environ Microbiol 63: 1002-1005). 이러한 배양가능성의 감소는 상기 박테리아가 VBNC 상태로 진입하기 때문인 것으로 알려졌다. 따라서, 본 발명자는 저온에서 저장한 pykA 돌연변이에서 관찰된 래그타임이 더 긴 것이 VBNC 상태와 관련이 있는 것인지 조사하였다. 도 7C에 나타난 바와 같이, 5 x 10⁶의 pykA 돌연변이 세포와 야생형 세포 각각을 4℃에서 LBS에서 배양할 때 야생형 세포보다 pykA 돌연변이 세포가 더 빨리 VBNC 상태로 진입하였다. 상기 돌연변이 세포에서 13일 동안 배양가능한 세포는 거의 탐지되지 않았고, 반면 야생형 균주에서는 콜로니가 100개 이상 형성되었다. 야생형 유전자(pRK-PyKA)를 지닌 플라스미드를 돌연변이 균주에게 도입하면 야생형 레벨까지 VBNC 상태가 회복되었는데, 이는 상기 돌연변이를 VBNC 상태로 더 빨리 진입하는 것이 단지 vPykA의 손실에 기인하기 때문이라는 것을 나타낸다.

종전 연구에서 카탈라아제 또는 피루베이트가 배양 배지에 존재하면 V. 불니피쿠스의 VBNC 집단이 상당 부분 회생될수 있다는 것을 나타남으로써 V. 불니피쿠스의 VBNC 상태에서 활성산소종이 개입된다는 것이 입증되었다(Bogosian et al., 2000, J Bacteriol 182: 5070-5075; Kong et al., 2004, FEMS Microbiol Ecol 50: 133-142.; Troxell et al., 2014, PLoS One 9: e84625). 카탈라아제 및 피루베이트 모두 H₂O₂를 제거하는 것으로 알려져 있기 때문에, 돌연변이가 VBNC 상태로 더 빨리 진입하는 것이, 피루베이트의 생산이 감소되는 것이 정상 대사과정 및 영양분이 많은 배지의 고압살균시에 생성될 수 있는 H₂O₂에 대한 저항을 제한하기 때문인 것으로 설명할 수 있다. 돌연변이 세포의 H₂O₂ 민감성을 야생형 세포의 민감성과 비교하여 이러한 가능성을 시험할 수 있다. 두 개의 균주가 LBS 배지에서는 성장이 서로 다르게 나타나지 않는 반면, 돌연변이는 동일한 배지에서 생존이 유의하게 감소하는 것으로 나타났지만, 0.25 mM의 H₂O₂이 존재할 때에는 그러하지 않았다(도 8A). 이들 균주 중 어떠한 것도 피루베이트를 H₂O₂와 함께 보충한 배지에서는 성장 결함을 나타내지 않았다. pRK-PyKA 플라스미드를 포함하는 돌연변이 균주는 야생형 농도까지 H₂O₂ 저항을 회복하였는데, 이는 돌연변이의 H₂O₂ 민감성이 증가하는 것이 vPykA이 소실되었다는 것을 직접적으로 반영하였다는 것을 나타낸다.

탈인산화된 vHPr가 인 비보에서 vPykA와의 상호작용을 통해 H₂O₂에 대한 저항에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 본 발명자는 vHPr(H15A)의 인산화될 수 없는 형태를 발현하는 벡터인 pRK-H15A, 및 vPykA 및 vHPr (H15A)을 동시에 발현하는 벡터인 pRK-PyKA&H15A를 구축하였다. 도 8B에 나타난 바와 같이, pRK-PyKA를 가진 돌연변이 균주가 pRK-H15A를 가진 돌연변이보다 H₂O₂에 더 저항하였고, 반면 pRK-PyKA&H15A를 지난 돌연변이가 pRK-PyKA를 지닌 균주보다 훨씬 더 저항하였다. 따라서, 탈인산화된 vHPr은 인비보에서 vPykA와 상호작용하고, 글루코스와 같은 PTS 당의 존재 하에서는 H₂O₂ 스트레스에 대한 저항을 부여하기 위한 vPykA-매개 피루베이트 생산을 활성화시키는 것으로 나타났다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Method for screening antibiotics against Vibrio sp. targeting interaction between Pyk and HPr <130> DP201502014P <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 482 <212> PRT <213> Vibrio vulnificus <400> 1 Met Thr Gln Pro Leu Arg Arg Thr Lys Ile Val Thr Thr Leu Gly Pro 1 5 10 15 Ser Thr Asp Lys Asp Asn Val Leu Glu Glu Ile Ile Arg Ala Gly Ala 20 25 30 Asn Val Val Arg Met Asn Phe Ser His Gly Ser Ala Glu Asp His Lys 35 40 45 Thr Arg Ala Glu Lys Val Arg Asn Ile Ala Ala Arg Leu Gly Arg Gln 50 55 60 Val Ala Ile Leu Gly Asp Leu Gln Gly Pro Lys Ile Arg Val Ser Thr 65 70 75 80 Phe Lys Glu Gly Lys Ile Phe Leu Ser Val Gly Asp Leu Phe Thr Leu 85 90 95 Asp Ser Asp Leu Pro Lys Gly Glu Gly Asp Gln Lys Ser Val Gly Leu 100 105 110 Asp Tyr Lys Ala Leu Pro Gln Asp Val Gly Pro Glu Asp Ile Leu Leu 115 120 125 Leu Asp Asp Gly Arg Val Gln Leu Gln Val Leu Thr Val Asp Gly Asn 130 135 140 Lys Val Asn Thr Arg Val Ile Val Gly Gly Pro Leu Ser Asn Asn Lys 145 150 155 160 Gly Ile Asn Lys Lys Gly Gly Gly Leu Ser Ala Asp Ala Leu Thr Glu 165 170 175 Lys Asp Lys Gln Asp Ile Leu Leu Ala Ala Glu Ile Lys Val Asp Tyr 180 185 190 Leu Ala Ile Ser Phe Pro Arg Asn Gly Ala Asp Met Asp Tyr Ala Arg 195 200 205 Arg Leu Ala Arg Asp Ala Gly Leu Glu Ala Lys Leu Val Ala Lys Val 210 215 220 Glu Arg Ala Glu Thr Val Arg Asn Asp Glu Asn Ile Asp Asp Ile Ile 225 230 235 240 Met Ala Ser Asp Val Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu 245 250 255 Ile Gly Asp Pro Glu Leu Ile Gly Val Gln Lys Lys Leu Ile Lys Arg 260 265 270 Ala Lys Glu Leu Asn Arg Val Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Met Glu 275 280 285 Ser Met Ile Glu Asn Pro Met Pro Thr Arg Ala Glu Val Met Asp Val 290 295 300 Ala Asn Ala Val Leu Asp Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Gly Glu 305 310 315 320 Thr Ala Ala Gly Lys Tyr Pro Val Glu Thr Val Arg Ser Met Ala Glu 325 330 335 Val Cys Ile Gly Ala Glu Lys Thr Trp Glu Pro Gly Ser Gln Asn Tyr 340 345 350 Arg Ile Asp Lys Ser Phe Val Thr Ala Glu Glu Thr Ile Ala Met Ser 355 360 365 Thr Ile Tyr Ala Ala Asn His Met Glu Gly Val Lys Ala Met Val Thr 370 375 380 Leu Thr Glu Ser Gly Arg Thr Ala Leu Met Thr Ser Arg Leu Asn Ser 385 390 395 400 Thr Leu Pro Ile Phe Ala Leu Ser Pro Asn Glu Arg Thr Leu Asn Arg 405 410 415 Cys Ser Leu Tyr Arg Gly Val Thr Pro Val Phe Phe Asp Thr Lys Val 420 425 430 Glu Thr Gly Phe Asp Val Ala Met Ala Ala Leu Ser Thr Leu Arg Lys 435 440 445 Lys Lys Leu Leu Asp Phe Gly Asp Leu Val Ile Ile Thr Gln Gly Asp 450 455 460 Ile Met Asp Val Glu Gly Ser Thr Asn Cys Met Arg Ile Leu Pro Val 465 470 475 480 Phe Asp <210> 2 <211> 1449 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 2 atgactcagc cattaagaag aacaaaaatc gtgaccactt taggtccttc aactgacaaa 60 gataatgtac tagaagaaat tattcgagcc ggcgcgaatg tggtcaggat gaatttttct 120 cacggcagcg cagaggatca taaaactcgc gcagaaaaag tgcgcaatat tgccgccaga 180 cttggcagac aagtggctat tttaggtgat ttacaaggcc cgaagatccg agtatcaacc 240 tttaaagaag ggaaaatttt cctttcagtg ggtgacctct tcactttaga cagtgacttg 300 cccaaaggcg aaggcgatca aaaatcagtg ggattagact ataaagcact gcctcaggat 360 gtgggaccag aagatattct gctgcttgat gatggacgtg tacaactgca agtgctgacg 420 gtcgatggca acaaggtgaa cactcgtgtg atagtgggcg gaccgctgtc aaacaataaa 480 ggtatcaata aaaaaggggg cggcctctct gctgacgctc taacggaaaa agacaaacaa 540 gacatcttgc tcgccgccga gatcaaagtc gattatctcg cgatctcctt tccacgtaat 600 ggtgccgaca tggactatgc tcgtcgcttg gccagagatg ccggcttgga agccaaactt 660 gttgccaaag ttgaacgagc agaaaccgtt cgaaacgatg aaaacatcga cgatattatc 720 atggcttccg atgtcattat ggttgctcgt ggcgatctag gggtagaaat cggcgatccg 780 gaattgatcg gtgtacagaa aaaactcatc aaacgagcca aagaactcaa tcgtgtcgtc 840 atcacggcaa cacaaatgat ggaatcgatg attgaaaatc caatgcccac tcgagcagaa 900 gtcatggacg tagccaacgc ggtgctggat ggcaccgatg ccgtgatgct ttcaggggaa 960 accgccgctg gtaaataccc agtcgaaacg gtgcgctcta tggcagaagt ctgcattggg 1020 gcagaaaaaa cgtgggaacc gggcagccag aattatcgca tcgataaatc ctttgtcacc 1080 gccgaagaaa ccattgcaat gtcgacaatc tacgccgcaa atcatatgga aggcgtcaaa 1140 gcgatggtga cgttgactga atcgggaaga accgcattaa tgacgtcaag attgaactca 1200 acactgccca tttttgcgct ttcgcctaat gagcgaaccc ttaatcgctg ctctctctat 1260 cgtggcgtca ctcccgtatt ttttgatacc aaagtagaaa ctggatttga tgtcgcaatg 1320 gccgcattga gcacgcttag aaagaaaaaa ctgctcgatt ttggggattt agtgatcatc 1380 acacaggggg acatcatgga tgttgaaggc tcgactaact gcatgagaat cctgcctgtt 1440 tttgactaa 1449 <210> 3 <211> 85 <212> PRT <213> Vibrio vulnificus <400> 3 Met Tyr Glu Lys Gln Val Glu Ile Thr Ala Glu Asn Gly Leu His Thr 1 5 10 15 Arg Pro Ala Ala Gln Phe Val Lys Glu Ala Lys Ala Phe Asp Ala Asp 20 25 30 Ile Thr Val Thr Ser Asn Gly Lys Ser Ala Ser Ala Lys Ser Leu Phe 35 40 45 Lys Leu Gln Thr Leu Gly Leu Val Lys Gly Thr Val Val Thr Ile Ser 50 55 60 Ala Glu Gly Pro Gln Ala Gln Gln Ala Val Asp His Leu Val Ala Leu 65 70 75 80 Met Asp Gln Leu His 85 <210> 4 <211> 258 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 4 atgtacgaga agcaagtaga aatcacagca gaaaacggcc ttcacactcg cccagctgct 60 caattcgtaa aagaagctaa agcttttgac gcggatatca ctgtgacttc taacggcaaa 120 agcgcaagcg ctaagagtct gttcaaacta caaactctag gtcttgtaaa aggcactgta 180 gttacaatct ctgctgaagg cccacaagca cagcaagcag ttgatcacct agttgctcta 240 atggatcaac tacactaa 258

Claims (7)

1. 비브리오균에 특이적인 항생제 스크리닝 방법으로,
   비브리오 피루베이트 키나아제(vPyK, Vibrio Pyruvate Kinase) 및 탈인산화된 비브리오 히스티딘 포스포캐리어 단백질 (vHPr, Vibrio Histidine Phosphocarrier Protein)을 제공하는 단계;
   상기 vPyK와 탈인산화된 vHPr 단백질과의 상호작용을 선택적으로 억제할 수 있을 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉시키는 단계; 및
   상기 vPyK와 탈인산화된 vHPr 단백질과의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 vPyK와 탈인산화된 vHPr 단백질의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 비브리오균에 대한 항생제 스크리닝 방법.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 vPyK는 서열번호 1의 서열로 표시되고, vHPr는 서열번호 3으로 표시되는 것인, 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 vPyK 및 탈인산화된 vHPr 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되는 것인, 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 vPyK와 탈인산화된 vHPr 단백질과의 상호작용은 상기 vPyK와의 활성의 변화 또는 세포내 포스포에놀피루베이트 및 피루베이트의 세포내 농도 변화로 검출되는 것인, 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 후보물질은 글루코스의 존재하에서 비브리오균의 과산화수소(H₂O₂)에 대한 저항성을 감소시키는 것인, 방법.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 비브리오균은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 장염세균(Vibrio parahaemolyticus) 또는 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 인, 방법.

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