KR101128058B1

KR101128058B1 - 톨나프테이트를 포함하는 ａｔｍ 키나아제 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101128058B1
Application number: KR1020090098418A
Authority: KR
Inventors: 송지영; 윤연숙; 안지연; 정인성; 이기호; 박세라; 임민진; 김미형; 이새로움
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2009-10-15
Publication date: 2012-04-12
Also published as: KR20110041318A

Abstract

본 발명은 톨나프테이트(tolnaftate) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, ATM(ataxia telangiectasia mutated) 키나아제 억제용 조성물에 관한 것이다.

톨나프테이트, 항암제, 병용 치료제, p53, ATM 키나아제.

Description

톨나프테이트를 포함하는 ＡＴＭ 키나아제 억제용 조성물{Composition comprising tolnaftate for inhibiting ATM kinase}

본 발명은 교육과학기술부의 방사선기술개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다.

[과제고유번호: M2070202000108N020200110 및 20090062246, 과제명: 방사선 병용치료제 및 유효성 평가기술 개발]

ATM 키나아제의 돌연변이를 갖는 환자가 방사선에 민감하다는 것이 알려지면서 현재 ATM 키나아제의 암 치료에서의 이용에 관해 활발하게 연구가 수행되고 있다. 산화적 스트레스나 자외선, 방사선, 항암제, 독성 물질 등과 같은 자극에 의해 DNA가 손상되면 세포는 우선 세포주기를 중단시키고 DNA 손상의 복구에 집중한다. 이때 사용되는 신호전달 시스템은 주로 ATM (ataxia telangiectasia mutated) 단백질에 의해 주관된다. ATM 단백질은 키나아제 효소로서 세포 외부에서 오는 자극에 대해 매우 민감하게 반응하며 DNA 손상의 복구에서 중요하다. 또한, ATM 단백질에 돌연변이가 일어날 경우 방사선에 대한 감수성이 증가되는 것으로 보고되었다(Cancer Res. 2004. 64:9152-59). ATM 키나아제로부터 신호전달을 받는 p53 전사인자는 암세포의 50% 이상에서 돌연변이된 상태로 존재하므로, p53을 표적으로 작용하는 항암제는 p53이 정상인 암세포에만 작용할 것이다. 따라서, p53의 상위 수준에서 DNA 손상의 복구에 관여하는 ATM 키나아제의 활성을 억제하는 것이 암 치료에서 보다 효과적으로 작용할 것으로 사료된다.

ATM 키나아제의 억제는 p53의 억제와 연관되며 유전체 불안정성(Genomic instability)을 증가시켜 세포사멸을 초래하므로 ATM 키나아제의 억제가 항암제 및 방사선 치료에 대한 암세포의 감수성을 증가시켜 치료 효과를 증진시킬 수 있다는 것이 시사되었다(Can Res. 2006 66;10861).

독소루비신은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 유발하고 토포이소머라아제II 억제제로서 암세포의 DNA를 손상시키는 작용메카니즘을 갖는 항암제이다. 방사선 치료도 직접적으로 DNA의 손상을 유발하거나 세포내 활성산소종의 생성을 증가시킴으로써 암세포의 사멸을 가져온다. 이러한 항암제 및 방사선치료는 폐암, 대장암 및 유방암 등 고형암 뿐만 아니라 백혈병 등의 혈액암의 치료에도 매우 효과적이다. 그러나, 암세포는 정상세포에 비해 ATM 키나아제를 통한 DNA 손상의 복구가 보다 신속하게 이루어지므로 ATM 키나아제의 활성을 억제시켜야항암제 또는 방사선에 의한 암세포 사멸을 증가시킬 수 있다. 이에 본 발명자들은 ATM 키나아제의 활성을 억제하는 물질에 대한 연구를 수행하여 항암제나 방사선 치 료와 병용 투여했을 때, 암세포의 사멸에 대해 상승 혹은 상가적 작용을 나타내는 물질을 발굴하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 ATM(ataxia telangiectasia mutated) 키나아제 활성의 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암제 또는 방사선의 치료 효과를 증진시키는, ATM 키나아제 억제제를 포함하는 항암치료 보조용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식의 톨나프테이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, ATM 키나아제 억제용 조성물을 제공한다:

ATM 키나아제는 손상된 DNA의 복구를 위한 신호전달 시스템을 주도하는 단백질이다. ATM 키나아제의 작용에 의해, 암세포에서 항암 치료, 예를 들면, 독소루비신을 포함한 화학요법제와 같은 항암제나 방사선의 적용에 의해 DNA에 손상이 발생해도 신속하게 복구되므로 암세포의 사멸이 일어나지 않을 수 있다. 따라서, 암과 같은 질환의 치료에서 ATM 키나아제 활성의 억제가 다른 치료제의 적용과 병행되면 치료 효과를 증진시킬 수 있다. ATM 키나아제 억제제는 ATM 키나아제로부터 신호전달을 받아 작용하는 하위 단백질인 p53 전사인자를 이용한 세포 기반 검색법인 루시퍼라아제 리포터 시스템에 의한 1차 탐색 후 ATM 키나아제 활성의 억제 여부를 조사하는 것에 의해 선별되었다. ATM 키나아제 억제제의 탐색에서, 항진균제로 이용되고 있는 톨나프테이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이 ATM 키나아제 억제제로 선별되었다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 방사선 또는 항암제의 치료 효과를 증진시키기 위한 보조제로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "방사선 또는 항암제 보조용 조성물" 또는 "방사선 또는 항암제 보조제"는 방사선 또는 항암제와 병용 투여시 방사선 또는 항암제에 대한 암세포의 감수성을 증가시켜 방사선 또는 항암제의 치료 효과를 상승적으로 증가시키는 조성물 또는 작용제를 의미한다.

ATM 키나아제 활성이 억제되면 방사선이나 항암제에 의해 유발된 DNA 손상의 복구가 억제 또는 지연되므로 암세포의 사멸효과가 증진된다. 따라서, 본 발명의 조성물을 방사선 치료 또는 항암제 치료와 병용하는 경우 DNA 손상 세포에서 자발적으로 작동되는 DNA 손상 복구 기전을 방해하여 암세포의 방사선이나 항암제에 대한 감수성을 증진시키므로 항암 효과를 높일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 톨나프테이트는 그 자체로 이용되거나, 또는 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산, 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산에 의한 산 부가염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 필요에 따라, 약제학적으로 허용가능한 보조제, 예를 들면, 담체나 안정화제, 완충제, 유화제 등과 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 비경구, 경구 등으로 투여할 수 있으며, 주사제, 산제, 과립제, 정제 등을 포함한 약제학적 제제에 적합한 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 조성물이 항암제 또는 방사선 치료와 함께 병용될 수 있는 암은 위암, 폐암, 대장암, 뇌암, 유방암, 및 난소암 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 조성물은 ATM 키나아제 활성을 억제하여, DNA 손상의 복구를 억제 또는 지연시켜서 방사선 또는 항암제에 대한 암세포의 감수성을 증가시키므로, 항암 치료시 보조제로 병용되어 항암 효과를 증진시킬 수 있다.

실시예 1. ATM 키나아제 억제제의 탐색

ATM 키나아제는 350 KDa의 고분자량 단백질로 순수하게 정제하기가 어렵고 세포를 이용한 ATM 키나아제 억제제의 탐색법이 개발되어 있지 않으므로 화합물 라이브러리의 고속검색에는 적당하지 않다. 따라서, ATM 키나아제로부터 신호전달을 받아 작용하는 하위 단백질인 p53 전사인자를 이용한 루시퍼라아제 리포터 시스템으로 p53 억제제를 1차 탐색하여 선택된 화합물을 대상으로 ATM 키나아제의 활성을 억제시키는 물질을 탐색하였다.

(1) p53 전사인자 억제제의 선별

p53 전사인자가 결합할 수 있는 p53 결합부위가 포함된 루시퍼라아제 리포터 플라스미드는 인제대학교 오상택 교수로부터 공여받았다. 리포펙타민 2000(Invitrogen, Calsbad, CA, USA)을 이용하여, 제조사의 설명서에 따라 상기 플라스미드를 HCT116 대장암 세포주에 형질전환시켜 루시퍼라아제의 활성 측정을 통해 p53에 대한 억제 효과를 탐색할 수 있는 탐색 시스템을 구축하였다. 도 1은 12개의 p53 결합 부위(p53BP)가 포함된 루시퍼라아제 리포터 벡터(p53BP-pGL3 루시퍼라아제 플라스미드)가 안정적으로 삽입된 HCT116 세포의 구성을 개략적으로 보여준다. 루시퍼라아제의 활성은 듀얼 루시퍼라아제 분석 키트(Promega, Medison, WI, USA)를 이용하여 측정하였다. HCT116 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구매하였으며, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 units/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 5% CO₂ 및 37℃에서 배양하였다. 상기 세포주의 형질전환은 리포펙타민 2000(Invitrogen, Calsbad, CA, USA)을 이용하여, 제조사의 설명서에 따라, HCT116세포에 p53-pGL3 루시퍼라아제 플라스미드 외에, G418(네오마이신)을 선택인자로 이용하여 형질전환된 세포를 선택하기 위해, Neo 유전자를 갖는 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 플라스미드를 선택 플라스미드로 함께 사용하여 수행하였다. 상기 DMEM 배지에 네오마이신(600 ㎍/ml)을 첨가하여 안정적으로 형질전환된 세포주 1번, 4번, 6번 및 11번을 선택하였다. 그 후, 선택된 세포들에서 루시퍼라아제 활성을 측정하기 위하여 각각의 세포주를 3배수로 웰당 20,000개의 세포로 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 동안 배양한 후, 독소루비신을 0.5μM 농도로 첨가하고 다시 18시간 배양한 후 반딧불 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 루시퍼라아제의 활성은 루시퍼라아제 분석 키트(Promega, Medison, WI, USA)를 이용하여 측정하였다. 독소루비신 처리에 의해 리포터인 루시퍼라아제 활성이 4번 형질전환 세포주에서 독소루비신이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 30-40배 증가되었다. 도 2는 선별된 형질전환 세포주들에 독소루비신을 처리하면 루시퍼라아제 활성이 증가되므로 구축된 p53 억제제를 위한 탐색 시스템이 유효하다는 것을 보여준다. 상기 형질전환된 세포들 중에서 가장 높은 루시퍼라아제 활성을 보인 4번 세포주를 선택하여 이후의 p53 억제제 탐색에서 이용하였다.

상기에서 구축된 탐색 시스템을 이용하여 화합물 라이브러리 중의 8,000개의 화합물을 대상으로 p53 억제 효과를 탐색하였다. 각각 화합물의 최종농도가 10 μM 이 되도록 상기 형질전환된 HCT116 세포가 접종된 96-웰 플레이트에 첨가하고, 2시간 배양 후 독소루비신을 0.15μM 농도로 첨가하고 상기에 기재된 방법으로 루시퍼라아제 활성을 측정하여, p53 억제 효능이 우수한 저분자 화합물로 확인된 톨나프테이트를 선별하였다.

(2) ATM 키나아제 억제제의 선별

상기 (1)에서 선별된 톨나프테이트가 ATM 키나아제 활성을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 ATM 키나아제 효소반응을 수행하였다. ATM 키아나제 효소는 톨나프테이트로 처리된 세포들을 프로테아제 저해제(1 mM PMSF, 1 M/mL 아프로티닌, 1g/mL 류펩틴, 및 1 mM Na₃VO₄)가 포함된 완충액 (20 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.2% Tween 20, 1.5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0.2% Tween 20, 1 mM EDTA)에 용해시키고 항-ATM 항체(EMD Biosciences, CA, 미국)를 이용하여 A/G-agarose (Santa Cruz Biotechnology, 미국)에 결합시킨 후 인산화효소 완충액 (20 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM 디티오트레이콜, 10 mM MnCl₂)으로 세척하는 면역침전법에 의해 추출하였다. 상기에서 추출된 ATM 키나아제를 p53 펩타이드 (EPPLSQEAFADLWKK) (BD 바이오사이언스, 미국) 2㎍, 50 μM ATP, 및 10 μCi의 [γ-³²P] ATP 동위원소와 30℃에서 30분간 반응 후 10% SDS-전기영동에 의해 반응 생성물을 분리하고, 인산화된 p53 펩타이드를 덴시토미터(Bio-Rad, USA)에 의해 정량하였다.

p53 펩타이드를 기질로 사용한 경우, ATM 키나아제에 의한 p53의 인산화가 ATM 키나아제가 포함되지 않은 대조군 대비 약 12배 증가한 반면, 톨나프테이트 5μM 처리시 ATM 키나아제에 의한 p53의 인산화가 대조군 수준으로 억제되었다. 도 3은 톨나프테이트가 농도 의존적으로 p53의 인산화를 억제한다는 것을 보여준다.

도 4에 도시된 바와 같이, 톨나프테이트는 독소루비신에 의해 증가된 루시퍼라아제 활성을 농도 의존적으로 감소시킴으로써 ATM 키나아제를 통한 p53으로의 신호 전달을 차단한다는 것을 시사한다. 한편, 톨나프테이트가 자체적으로 세포 독성을 가질 수 있기 때문에, CCK-8 (도진도, 일본) 생존율 분석키트를 이용하여 분광분석계(랩시스템즈, 미국)로 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포수를 분석하였다. 도 5는 톨나프테이트가 유의성 있는 세포수 감소를 초래하지 않았다는 것을 보여준다. 표시된 값은 3회의 독립적인 실험으로부터 수득된 평균값이다.

실시예 2. 톨나프테이트의 ATM 키나아제 및 p53과의 작용

실시예 1에서 선별된 ATM 키나아제 억제제인 톨나프테이트가 독소루비신 0.15μM 처리에 의해 증가된 ATM 키나아제 및 p53의 발현을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다.

상기 형질전환된 HCT116 세포에 톨나프테이트를 각각 0, 0.2, 1, 5 및 10 μM 적용하고, 2시간 후에 독소루비신을 0.15μM 적용한 후, ATM 키나아제와 p53의 활성 정도를 나타내는 인산화된 ATM 및 인산화된 p53 단백질의 양을 측정하였다. 상기와 같이 톨나프테이트 및 독소루비신으로 처리된 HCT116 세포를 프로테아제 저 해제(1 mM PMSF, 1 M/mL 아프로티닌, 1g/mL 류펩틴, 및 1 mM Na₃VO₄)가 포함된 RIPA 완충액(50 mM Tris-Cl (pH7.4), 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)으로 용해시켜 세포질 분획을 준비하고, 6-10% 구배 SDS-PAGE(Invitrogen)를 수행하여 단백질을 분리하였다. 상기 SDS-PAGE 겔 상에 분리된 단백질을 니트로셀룰로오즈 막(BioRad, Hercules, CA, USA)으로 옮기고, 상기 막을 5% 무지방 밀크로 블록킹(blocking)시켰다. 그 후, 항-인산화 p53 항체 (Cell Signaling, USA), 항-인산화 ATM 항체 (CellSignaling, USA) 및 항-GAPDH 항체(Ab Frontier, 한국)를 상기 막에 처리하였다. 그 후, 상기 막을 호스레디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 연결 이차항체로 항온 반응시킨 후, ECL 키트(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 이용하여 시각화시켰다. 도 6은 독소루비신 처리에 의해 인산화된 ATM 키나아제와 p53 단백질이 현저히 증가하였으며 톨나프테이트에 의해 농도 의존적으로 상기 단백질의 발현량이 감소했다는 것을 보여준다.

실시예 3. 톨나프테이트와 항암제의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과

H1299 폐암세포, SKOV3 난소암세포, MB231 유방암세포, U87-MG 뇌암세포 및 HT29 대장암세포를 각각 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신과 100 unit/ml 페니실린이 첨가된 RPMI 1640 (Rosewell Park Memorial Institute medium 1640) 배지가 담긴 96-웰 플레이트에 접종하고, 5% CO₂ 및 37℃ 조건 하에 24시간 배양하였다. 톨나프테이트를 각각 0.2, 1, 5, 및 10μM 의 농도로 적용한 후 2시간 뒤에 항암제인 독소루비신 0.15μM 적용하고 48시간 후 세포 사멸 효과가 증가되는지 여부를 CCK-8 키트(일본)를 통하여 분석하였다. 상기 폐암세포, 난소암세포, 유방암세포, 뇌암세포 및 대장암세포에서 톨나프테이트 단독처리시 세포 사멸은 유의성있게 관찰되지 않았으나, 항암제인 독소루비신 단독처리 대비 독소루비신과 톨나프테이트 10μM의 병용 투여시, 세포살상 효과가 50% 이상 증가했다. 도 7a 내지 7e는 암세포에 대한 톨나프테이트 단독 적용, 독소루비신 단독 적용 및 톨나프테이트와 독소루비신의 병용시의 세포 사멸 효과를 보여준다. 상기 결과는, 톨나프테이트가 항암제 사용시 병용 투여되어 세포 사멸 효과를 증가시킬 수 있는 항암제 보조제로 사용가능하다는 것을 시사한다.

실시예 4. 톨나프테이트와 방사선의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과

H1299 폐암세포, SKOV3 난소암세포, MB231 유방암세포, U87-MG 뇌암세포 및 HT29 대장암세포를 각각 10% 우태아 혈청, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신과 100 unit/ml 페니실린이 첨가된 RPMI 1640 배지가 담긴 6cm 세포배양 플레이트에 접종하고, 톨나프테이트를 1, 5, 및 10μM로 농도별로 3배수로 처리한 후, 감마 방사선을 2, 4, 6 또는 8 Gy 를 조사하여 7일 동안 5% CO₂및 37℃ 조건에서 배양하였다. 배양된 세포를 회수하여, 100% 메탄올 중의 1% 메틸렌블루 혼합액으로 염색한 후 콜로니를 형성한 생존 세포를 계수하였다. 도 8a 내지 8e는 각각 폐암세포, 난소암세포, 유방암세포, 뇌암세포 및 대장암세포에 톨나프테이트와 방사선 조사를 병용 하여 적용했을 때 생존 분획(survival fraction)이 감소했다는 것을 보여준다. 따라서, 톨나프테이트는 방사선과의 병용처리시 종양세포에 있어서 세포사멸의 상가 혹은 상승효능을 나타내므로 방사선 치료의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 사용가능하다는 것을 시사한다.

도 1은 HCT116 세포에 p53 결합 단백질이 결합할 수 있는 부위(p53BP)를 12개 포함하는 루시퍼라아제 리포터 벡터를 안정적으로 형질전환하여 구축된, 루시퍼라아제 활성을 측정하여 p53 억제제를 탐색하는 시스템을 도식화한 것이다.

도 2는 p53 결합 부위-루시퍼라아제 리포터 벡터를 포함한 탐색 시스템에서 항암제 독소루비신의 자극에 의해 루시퍼라아제 활성이 증가된다는 것을 보여주어, 탐색 시스템의 유효성을 확인한다. X축은 형질전환된 세포주의 시료 번호를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 일 구체예에서 사용된 탐색 시스템을 이용하여 선별된 p53 억제제인 톨나프테이트가 ATM 키나아제 억제 활성을 갖는다는 것을 보여준다.

도 4는 톨나프테이트가 농도 의존적으로 p53 신호전달을 저해한다는 것을 보여준다.

도 5는 톨나프테이트가 HCT116 세포에 대한 자체 독성이 없다는 것을 보여준다.

도 6은 항암제 독소루비신처리에 의해 증가된 ATM과 p53 활성이 톨나프테이트에 의해 억제된다는 것을 보여준다.

도 7a 내지 7e는 각각 폐암세포, 난소암세포, 대장암세포, 유방암세포, 및 뇌암세포에 톨나프테이트가 항암제인 독소루비신과 병용 적용되었을 때, 세포사멸이 증가되었다는 것을 보여준다.

도 8a 내지 8e는 각각 폐암세포, 난소암세포, 유방암세포, 뇌암세포, 및 유 방세포에 톨나프테이트가 방사선 조사와 병용 적용되었을 때, 세포사멸이 증가되었다는 것을 보여준다.

Claims

삭제
톨나프테이트(tolnaftate) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 방사선 또는 항암제의 치료 효과를 증진시키기 위한 보조제로서 사용되는 약제학적 조성물.
톨나프테이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 폐암, 대장암, 뇌암, 유방암, 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택된 암의 치료를 위한 약제학적 조성물.