KR101125695B1 - 협죽도（Ｎｅｒｉｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 협죽도(Nerium indicum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 협죽도(Nerium indicum) 추출물 중 알부틴(Arbutin)의 함량이 일정범위로 포함되도록 규격화 및 표준화시키고, 진통억제, 급성염증억제 및 급성부종억제 및 등의 염증성 변화에 의하여 나타나는 제증상의 억제 효과가 우수하게 발현되어 관절염 등의 염증성 변화에 의한 질환 치료 및 예방에 유용한 약제로 사용할 수 있는 협죽도(Nerium indicum) 추출물에 관한 것이다.

Description

협죽도（Ｎｅｒｉｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물{Nerium indicum extracts compositions for treating or preventing inflammatory diseases}

본 발명은 협죽도(Nerium indicum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 협죽도(Nerium indicum) 추출물 중 알부틴(Arbutin)의 함량이 일정범위로 포함되도록 규격화 및 표준화시키고, 진통억제, 급성염증억제 및 급성부종억제 및 등의 염증성 변화에 의하여 나타나는 제증상의 억제 효과가 우수하게 발현되어 관절염 등의 염증성 변화에 의한 질환 치료 및 예방에 유용한 약제로 사용할 수 있는 협죽도(Nerium indicum) 추출물에 관한 것이다.

관절염은 의학적으로 세균이나 외상과 같은 어떤 원인에 의해서 관절 내에 염증성 변화가 생긴 것을 총괄해서 지칭하는 병명이다. 이러한 관절염은 크게 급성과 만성으로 나뉜다.

관절염은 의학적으로 세균이나 외상과 같은 어떤 원인에 의해서 관절 내에 염증성 변화가 생긴 것을 총괄해서 지칭하는 병명이다. 이러한 관절염은 크게 급성과 만성으로 나뉜다.

급성 관절염은 다음과 같이 분류한다. ①장액성(奬液性) 관절염:보통 외상(外傷)에 의해서 일어나는데 원인불명의 것도 있으며, 대개 하나의 관절에만 발생한다. ②장액섬유소성(奬液纖維素性) 관절염:급성관절류머티즘 때에 일어나는데, 관절강 내에 혼탁한 삼출액(渗出液)이 괸다. 섬유소의 위막(僞膜)이 생겨 염증이 가라앉아도 심한 운동장애를 남긴다. ③ 화농성(化膿性) 관절염:관절의 개방창(開放創) 또는 임질, 장티푸스, 성홍열, 패혈증(敗血症) 같은 전염병에 다발성을 보인다. 생후 1 ~ 2개월의 유아는 뼈가 심하게 상하여 치료할 수 없는 탈구(脫臼)를 일으킨다. 성인에서는 골막골수염에 걸려 화농부가 터져 고름이 관절로 들어가는 것이 많은데, 이를 2차 화농관절염이라고 한다.

만성 관절염은 다음과 같이 분류한다. ①특수성(特殊性) 염증: 결핵성, 매독성 혹은 중년 이후의 남자에 많은 요산(尿酸)의 대사 장애로 인한 통풍성(痛風性) 관절염이 있다. ②다발성 관절염:만성관절류머티즘에 의한 것이 많은데 급성장액성 관절염에서 이행(移行)되거나 결핵, 매독, 임질의 경과 중에 다발성으로 나타나기도 하며 패혈증의 하나인 것도 있다. 그밖에 스틸병(病)이라는 관절염도 포함된다. ③변형성 골관절염:뼈나 관절의 노화 또는 외상이 원인이다. ④혈우병성(血友病性) 관절염:혈우병을 앓을 때 관절 내의 출혈에 의한 것이다.

상기한 바와 같은 관절염으로 대표되는 염증성 변화에 의한 질환의 치료를 목적으로 많은 약제들이 개발되고 있다.

한편, 협죽도(Nerium indicum)는 햇볕이 잘 쬐고 습기가 많은 사질토에서 잘 자라지만 아무데서나 자라며 공해에 대해서도 매우 강하다. 높이 2m 이상 자라고 밑에서 가지가 총생하여 포기로 되며 수피는 검은 갈색이고 밋밋하다. 잎은 3개씩 돌려나고 선상 피침형이며 가장가리가 밋밋하다. 질이 두껍고 표면은 짙은 녹색이며 양면에 털이 없다. 꽃은 7~8월에 피지만 가을까지 계속되고 홍색,백색, 자홍색 및 황백색이 있고 겹꽃도 있다.

화관은 지름 3~4cm로서 밑은 긴 통으로 되고 윗부분은 5개로 갈라져서 수평으로 퍼진다. 갈래조각은 꼬이면서 한쪽이 겹쳐진다. 화관의 통부와 갈래조각 사이에 실 같은 부속물이 있다. 꽃받침은 5개로 갈라지고 5개의 수술은 화관통에 붙어 있다. 꽃밥 끝에는 털이 있는 실 같은 부속물이 있다. 열매는 골돌이며 갈색으로 성숙하여 세로로 갈라진다.

종자는 양 끝에길이 1cm 정도의 털이 있다. 가지, 잎, 꽃을 강심제 및 이뇨제로 사용한다. 번식은 포기나누기와 꺾꽂이로 한다. 한국을 비롯하여 인도와 페르시아에 걸쳐 널리 분포한다. 꽃이 여러 겹인 것을 만첩협죽도(for. plenum), 꽃이 연한 황색인 것을 노랑협죽도(for. lutescens), 꽃이 백색인 것을 흰협죽도(for. leucanthum)라고 한다.

또한, 예로부터 동의보감, 향약집성방 및 광제비급 등의 기성 한약서나 관련문헌에서 상기한 협죽도를 단방 생약으로서의 처방하고 있으나, 이러한 처방은 협죽도의 외형상의 형태 감별 방법 및 한방의학적 약효와 탕액의 제조방법에 관한 간단한 언급에 불과하였다. 즉, 상기 제시된 방법을 통해 추출된 성분 중 약효를 발현하는 유효활성 성분들에 관한 의견은 얻을 수 없었다.

그리고, 협죽도는 산지 및 채취시기별로 지표성분의 함량편차가 크게 나타나기 때문에 추출물의 규격화가 어렵고, 소염진통, 혈액순환 개선, 관절염 치료 등의 활성이 우수한 활성 분획을 재현성 있게 얻을 수 없어서 상품화가 곤란하다는 사실도 해결하여야할 문제점으로 남아있다.

이에 본 발명의 발명자들의 상기와 같은 문제점을 해결하여, 특정 성분 및 이의 함량 조절에 따른 협죽도 추출물의 규격화를 달성하기 위하여 연구 노력하였고, 그 결과 염증성 변화에 의한 제증상의 억제로서, 소염 진통작용, 면역세포증식 억제 작용, 급성염증억제, 만성염증억제 및 급성부종억제 등의 효과가 우수하면서 규격화된 협죽도 추출물을 본 발명으로 완성하였다.

이러한 본 발명의 연구 결과에 따르면, 협죽도 추출물 중 알부틴을 일정함량 포함하는 협죽도 추출물을 용이하고 재현성 있게 얻을 수 있고, 따라서 상품화가 가능함을 알게 되었다.

따라서, 본 발명은 협죽도 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료 및 예방용, 약학조성물 및 식품조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 지표물질로서 알부틴의 함량이 특정 범위로 포함된 협죽도 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 협죽도(Nerium indicum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 협죽도(Nerium indicum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료 및 예방용 식품조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 지표물질로 알부틴이 0.3 내지 1.0 중량% 함유되어 있는 협죽도(Nerium indicum) 추출물을 제공한다.

본 발명에 의하면 협죽도 추출물은 TPA 유도성 부종, 아라키돈산 유도성 부종 및 카라기난 유도성 급성 족부 부종에서 염증 억제 효과가 매우 우수하였으므로, 소염 진통작용, 관절조직 분해효소 억제작용, 면역세포증식 억제 작용, 급성염증억제, 만성염증억제 및 급성부종억제 등의 효과가 우수하며, 지표물질로서 알부틴의 함량 조절로 규격화를 달성할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 협죽도 추출물은 협죽도로부터 추출 조제된 것으로 알부틴을 지표물질로서 선정하여 지표물질의 함량 조절을 통하여 규격화하면 관절염 치료제 등의 염증질환 치료제 및 건강기능식품으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 오랫동안 한약재로 이용되고 있는 협죽도 추출물을 유효성분으로 포함하기 때문에 안전성이 우수하다.

도 1은 협죽도 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 협죽도 추출물의 TPA 유도 귀부종 억제 테스트(TPA-induced mouse ear edema.)이다.
도 3은 협죽도 추출물의 아라키돈산(Arachidonic acid) 유도 귀 부종억제 테스트(Arachidonic acid-induced mouse ear edema assay) 이다.
도 4는 협죽도 추출물의 아세트산 유도 스트레칭 억제 테스트(Acetic acid-induced writhing response in mice.) 이다.
도 5는 협죽도 추출물의 급성 관절염 치료효과 검정이다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 협죽도 추출물 중 알부틴의 함량이 일정범위로 포함되도록 규격화 및 표준화시켜 진통억제, 급성염증억제, 만성염증억제, 급성부종억제 및 만성부종억제 등의 염증성 변화에 의하여 나타나는 제증상의 억제 효과가 우수하게 발현되어 관절염 등의 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용한 약제에 적용할 수 있는 협죽도 추출물에 관한 것이다.

협죽도의 원 생약에 함유된 유효 생리 활성물질의 함량이 산지, 채취시기, 보관기간 및 보관상태 등에 따라 크게 달라질 수 있으므로, 생약조성물의 조성을 한정함에 있어 사용성분의 중량비의 한정보다는 특정 유효물질의 함량을 한정하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 유효 생리 활성물질의 함량에 따라 관절보호 생리활성에 커다란 차이를 나타낸다.

따라서, 본 발명에서는 약효 발현을 극대화하는 협죽도 추출물을 얻기 위한 지표물질로서 종래 제안된 바 없는 알부틴(Arbutin)을 선정한 것이다.

본 발명에서 상기 지표물질로 선정한 알부틴(arbutin)은 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 중요한 성분이며, 일정 함량범위로 함유되어 있을 때 약효 상승효과를 발현하여 보다 강력한 약효를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에서 얻은 약제의 유효성분으로서 상기 성분 이외에의 기타 다른 성분의 작용을 배제할 수는 없다.

본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제 중에 사용되는 협죽도 추출물은 협죽도의 수피 및 잎으로부터 추출한 추출물 자체(생약 엑기스)나, 협죽도 추출물로부터 특정 활성분획을 추출하여 선택 사용할 수 있다. 이 때의 배합비율은 원생약인 협죽도의 함량과는 관계없이 지표물질인 알부틴(Arbutin)의 함량으로 결정되는 것이 바람직하다. 상기 지표물질인 알부틴(Arbutin)은 협죽도 추출물 중 0.3 중량% 이상 함유되는 것이 바람직하고, 0.3 내지 1.0 중량% 함유되어 있는 것이 더욱 바람직하며, 0.3 내지 0.58 중량% 함유되어 있는 것이 더더욱 바람직하고, 0.58 중량% 함유되어 있는 것이 가장 바람직하다. 알부틴(Arbutin) 함량이 0.3 중량% 미만인 경우 관절염 등의 치료에 상대적으로 저조한 결과를 얻게 된다. 또한 본 발명에서 상기 알부틴(Arbutin)의 함량의 상한 범위에 대해 특별한 제한은 두지 않으나, 다만 일정수준 이상을 초과하여 알부틴(Arbutin)을 함유하게 되면 효과가 더 이상 증가하지 않을 뿐만 아니라 제조하기에도 기술적, 경제적 측면에서 바람직하지 않은 경향이 있다.

본 발명에서 상기 지표물질로 선정한 알부틴(Arbutin)은 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 중요한 성분이며, 일정 함량범위로 함유되어 있을 때 약효 상승효과를 발현하여 보다 강력한 약효를 나타낼 수 있다. 본 발명에서 얻은 협죽도 추출물의 유효성분으로서 알부틴(Arbutin) 이외에도 기타 다른 성분들의 작용으로서 염증성 질환의 치료 및 예방 효과를 나타내는 것으로 추정된다. 즉, 본 발명에서 얻은 약제의 유효성분으로서 상기 성분 이외에의 기타 다른 성분의 작용을 배제할 수는 없다.

본 발명은 물, 알콜 및 알콜 수용액으로 이루어진 군중에서 하나를 선택하여 추출한 것을 특징으로 하는 협죽도 추출물을 제공한다.

상기 추출물은,

1) 협죽도 원생약 중량의 5 ~ 8 배량의 물, 알콜, 알콜 수용액으로 이루어진 군중에서 하나를 선택하여 추출하고 냉각 및 여과하는 단계,

2) 상기에서 얻어진 여액을 알콜 수용액으로 층분리한 후 50 ~ 90 ℃ 로 감압 농축하는 단계, 및

3) 상기에서 얻어진 농축물에, 알콜을 가한 후 700 ~ 1,200 rpm으로 원심분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여 제조된다.

상기 추출물의 제조방법을 더욱 자세히 설명하면 다음과 같다.

1) 세척, 건조 및 절단한 협죽도 원생약 중량의 6 ~ 8 배량의 물 또는 알콜 수용액으로 추출, 냉각 및 여과하고, 다시 잔사에 상기 혼합 생약 중량의 5 ~ 8 배량의 물 또는 알콜 수용액을 가하고 가온하여 재추출한 후 여과한 다음, 이전의 여액과 혼합하여 여과하는 단계; 2) 상기 1)에서 얻어진 여액을 동량의 알콜 수용액으로 층분리한 후 50 ~ 90℃ 로 감압 농축하는 단계, 및, 3) 상기 2)의 농축물에 상기 2)의 감압 농축시 회수된 알콜을 가한 후 700 ~ 1,200 rpm으로 원심분리한 여액을 감압 농축, 진공건조, 분쇄 및 멸균하는 단계를 포함하여 이루어진다.

이를 상세하게 설명하면, 세척 및 건조하고, 세절한 협죽도 원생약에 물 또는 알콜 수용액을 가하고 2 ~ 4 시간, 2 ~ 4 회 반복하여 추출하며, 상온에서 서서히 냉각시킨 후 원심분리 등의 방법으로 여과하여 잔사와 분리한다. 상기 잔사에 상기 혼합 생약 중량의 6 ~ 8 배량의 물 또는 알콜 수용액을 가하고 가온하여 재추출한 후 여과한 다음, 이전의 여액과 혼합하여 여과한다. 상기와 같이 잔사에 물 또는 알콜 수용액을 가하여 재추출 및 여과함으로써 추출 효율을 높일 수 있다. 이때, 추출에 사용되는 물 또는 알콜 수용액의 사용량이 너무 적으면 추출물의 용해도가 나빠져서 추출효율이 떨어지고, 사용량이 너무 많으면 층분리에 사용하는 알콜 수용액의 사용량이 증가하고, 감압 농축 시간이 오래 걸리는 등의 경제적이지 못하거나 취급상의 문제가 생길 수 있다.

본 발명에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택하였는데, 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 ~ 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌고, 3차 이상의 다단계 추출은 경제성이 없는 것으로 판단된다.

상기와 같이 1, 2차에 걸쳐 물 또는 알콜 수용액로 추출하여 얻은 추출액은 여과 및 농축한 다음, 여액 중에 함유된 불필요한 단백질, 다당류 및 지방산 등의 불순물을 정제하는데, 본 발명에서는 여액과 동량의 알콜 수용액을 용매로 사용량 2 ~ 5 회 층 분리를 실시하여 용매 분획을 얻음으로써 불순물을 정제한다.

상기 알콜로는 탄소수 1 내지 6개의 알콜이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30 % 에탄올 수용액을 사용하는데, 저급 알콜 수용액 사용량이 여액에 비하여 적을 경우에는 지방산 등의 불필요한 성분들에 의한 미립자가 형성되어 층 분리가 원활하지 못할 뿐만 아니라 유효활성성분의 추출 함량이 낮아지게 되므로 효율적이지 못하다.

상기 알콜은 당 분야에서 일반적으로 사용되는 지방족, 방향족 알콜이 모두 사용 가능하며, 바람직하기로는 지방족 알콜 보다 바람직하기로는 탄소수 1 ~ 6의 저급 알콜을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 층분리한 추출액은 50 ~ 90℃ 에서 감압 농축하여 잔존하는 용매를 제거하며, 이렇게 얻어진 농축물에 상기 감압 농축시 회수된 알콜을 가한 후 700 ~ 1,200 rpm으로 원심분리한 여액을 가하여 농축물을 혼탁시킨 다음 재차 감압 농축시킨다.

이렇게 얻어진 농축물을 50 ~ 90℃ 에서 0.08 ~ 0.3 pa로 진공건조시킨 후 30 ~ 200 메쉬로 분쇄 및 멸균하여 분말상의 협죽도 추출물을 얻는데, 이러한 협죽도 추출물은 관절염 등의 치료 작용이 우수하여, 이 추출물을 포함하는 생약제는 관절 보호제로 유용하리라 기대된다.

본 발명에 따른 협죽도 추출물을 통상의 제조방법으로 제형화하여 정제, 캅셀제 주사제 등을 제조하는데, 이들 중 정제 제조시 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘 등을 합한 것과 상기 협죽도 추출물을 1 : 1의 비율로 사용하면 관절염 등의 염증성 변화에 의한 질환 치료에 활성을 갖는 정제를 제조할 수 있다.

이러한 의약물로 제조시에는 생약추출 그 자체로도 사용할 수 있지만, 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(dilute)등과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 또는 주사제 등으로 제조가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 협죽도 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 협죽도 추출물은 체중 1kg당 0.1 ~ 10 mg 정도를 투여하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 유효성분을 포함하는 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 협죽도 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 및 치료용 식품, 특히 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에서, "건강기능식품"이란 질병의 예방 및 치료, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

본 발명의 협죽도 추출물이 상기와 같은 염증질환 예방 및 치료를 위한 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.

본 발명의 건강기능식품은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 식물 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 염증질환 예방 및 치료를 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01g 내지 10.0g로 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 항 염증 효과를 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 : 협죽도 추출물의 제조

물로 세척하고 잘 건조시킨 후 협죽도를 30% 에탄올 수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 2시간 단위로 2회 열탕추출하였다. 상기 추출 물질을 상온으로 서서히 냉각한 후 원심여과하여 찌꺼기를 제거 후 여액을 병합하여 50 ~ 90℃ 에서 감압 농축 하였다.

상기한 에탄올 분획을 통하여 회수된 에탄올을 상기 농축물에 가한 후 농축물을 충분히 현탁시킨 후 5000 rpm으로 원심여과한 여액을 다시 감압농축한 다음 60℃ , 0.08pa 조건으로 진공건조시킨 후 80 메쉬로 분쇄 과정을 거쳐 멸균시켰다. 상기한 방법으로 추출, 정제한 협죽도 추출물 중 알부틴의 함량은 0.58 중량% 이었다. 또한, 상기 방법으로 얻어진 협죽도 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC 분석하였다.

1) 전개용매(Eluent) :

9:1 (Methanol 20% : Phosphoric acid water pH3)

2) 컬럼 : C18 역상(Agilent Eclipse XDB-C18 / 1.75㎛, 2.1 * 50mm)

3) 유속 : 0.4 ml/min

4) 컬럼온도 : 28℃

5) 검출기 : UV 280 nm

실험예 1 : TPA 유도 귀부종 억제 테스트(TPA-induced mouse ear edema.)

상기 실시예에 의해 제조된 협죽도 추출물에 대한 TPA 유도 귀부종 억제 테스트(TPA-induced mouse ear edema.)를 실시하였고, 그 결과는 표 1 및 그림 2에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 1]

7 주령된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 아스피린(Aspirin)을 150 mg/Kg, 협죽도 추출물 100, 200, 400 mg/Kg 을 경구 투여 후 1 시간 뒤 TPA(2.5㎍ /20㎕ )는 아세톤(Aceton)에 녹인 후, 쥐의 귀에 부종을 유발하였다. 부종 유발 시 실험자는 실험체를 뒤에서 완전히 고정 후 2차 실험자가 마이크로 피펫(micro pipet)을 이용하여 귀에 부종 유발 물질을 자극해 주었다. 그 후 4 시간 뒤 각 실험구 별로 귀 부종을 측정하였다. 측정 시에는 경골 탈추법을 이용하여 실험체를 도태 시킨 후 정확한 측정을 유도하였다.

처리	귀의 두께	염증억제정도(%)
무처리구	0.43 ± 0.026	0 %
아스피린(150 mg/kg)	0.32 ± 0.003	25.58 %
협죽도 추출물(100 mg/kg)	0.36 ± 0.02	16.30 %
협죽도 추출물(200 mg/kg)	0.32 ± 0.01	25.58 %
협죽도 추출물(400 mg/kg)	0.31 ± 0.03	27.91 %
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ±S.E.M (n=12) 2. 무처리구 : 부종유발후 약제 무처리 실험 구

상기 표 1에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 협죽도 추출물을 사용한 경우 TPA 유도 귀부종 억제효과가 우수하며, 특히 협죽도 추출물 400 mg/kg 농도일 경우 TPA 유도 귀부종 염증 억제율이 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 2 : 아라키돈산(Arachidonic acid) 유도 귀 부종억제 테스트(Arachidonic acid-induced mouse ear edema assay)

상기 실시예에 의해 제조된 협죽도 추출물에 대한 아라키돈산 유도 귀 부종억제 테스트(Arachidonic acid-induced mouse ear edema assay)를 실시하였고, 그 결과는 다음 표 2 및 그림 3에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 2]

7주령된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 아스피린을 150 mg/Kg, 협죽도 추출물 100, 200, 400 mg/Kg 을 경구 투여 후 1 시간 뒤 아라키돈산은 아세톤(2 mg/20㎕ )에 녹여 주어 귀에 부종을 유발하였다. 부종 유발 시 실험자는 실험체를 뒤에서 완전히 고정 후 2차 실험자가 마이크로 피펫을 이용하여 귀에 부종 유발 물질을 자극해 주었다. 그 후 1 시간 뒤 각 천연물 별로 귀 부종을 측정하였다. 측정 시에는 경골 탈추법을 이용하여 실험체를 도태 시킨 후 정확한 측정을 유도하였다.

처리	귀의 두께	염증억제정도(%)
무처리구	0.47 ± 0.01	0 %
아스피린(150 mg/kg)	0.39 ± 0.05	17.02 %
협죽도 추출물(100 mg/kg)	0.31 ± 0.02	34.04 %
협죽도 추출물(200 mg/kg)	0.31 ± 0.02	34.04 %
협죽도 추출물(400 mg/kg)	0.32 ± 0.02	31.91 %
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ±S.E.M (n=12) 2. 무처리구 : 부종유발후 약제 무처리 실험 구

상기 표 2에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 협죽도 추출물을 사용한 경우 아라키돈산 유도 귀부종 억제효과가 우수하며, 특히 협죽도 추출물 100 mg/kg 농도일 경우 아라키돈산 유도 귀부종 염증 억제율이 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 3 : 아세트산 유도 스트레칭 억제 테스트(Acetic acid-induced writhing response in mice.)

상기 실시예에 의해 제조된 협죽도 추출물에 대한 아세트산 유도 스트레칭 억제 테스트(Acetic acid-induced writhing response in mice)를 실시하였고, 그 결과는 다음 표 3에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 3]

본 실험은 "Siegmund" 실험 방법을 참조하여 7주령된 ICR 마우스를 각 생약 후보별로 분리한 후 아스피린을 150 mg/Kg, 협죽도 추출물 100, 200, 400 mg/Kg을 경구 투여 1시간 후 아세트산(0.075 %)의 복강 내 투여(0.1 ml/10 g)로 장기의 염증을 유발하였다. 10분후 10 분 동안 마우스의 스트레칭(streching)을 관찰하였는데, 그 이유는 부종 시 가려움증을 유발하기 때문이며 이러한 현상을 통해서 통증의 정도를 짐작할 수 있다.

처리	비틀림 횟수 (Writhing number)	통증억제정도(%)
무처리구	17.00 ± 0.00	0 %
아스피린(150 mg/kg)	13.00 ± 0.00	23.53 %
협죽도 추출물(100 mg/kg)	12.00 ± 0.00	29.41 %
협죽도 추출물(200 mg/kg)	8.50 ± 1.50	50.00 %
협죽도 추출물(400 mg/kg)	12.00 ± 0.00	29.41 %
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ±S.E.M (n=12) 2.무처리구 : 스트레칭 유발 후 약제 무처리 실험 구

상기 표 3에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 협죽도 추출물을 사용한 경우 아세트산 유도 스트레칭 억제효과가 우수하며, 특히 협죽도 추출물 200 mg/kg 농도일 경우 아세트산 유도 스트레칭 억제 효과가 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 4 : 급성 관절염 치료효과 검정

상기 실시예에 의해 제조된 협죽도 추출물에 대한 급성 관절염 치료효과 검정을 실시하였고, 그 결과는 다음 표 4 및 그림 5에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 4]

수컷 SD계 레트(200 g 내외)에 미리 아스피린을 150 mg/Kg, 협죽도 추출물 100, 200, 400 mg/Kg을 1ml 경구 투여하고 1% 카라기난 생리식염수 100㎕ 를 좌측 족저부에 주사하여 급성 족부 부종을 유도하였다. 부종은 플레티스모메터(plethysmometer, LE 7500)를 이용하여 4시간 후의 발 용적을 측정 하였다.

처리	부종증가율(%)	부종억제정도(%)
무처리구	89.36	0
아스피린(150 mg/kg)	27.04	69.74
협죽도 추출물(100 mg/kg)	34.57	61.31
협죽도 추출물(200 mg/kg)	74.29	16.86
협죽도 추출물(400 mg/kg)	71.61	19.86
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ±S.E.M (n=12) 2.무처리구 : 스트레칭 유발 후 약제 무처리 실험 구

상기 표 4에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 협죽도 추출물을 사용한 경우 급성 관절염 치료효과가 우수하며, 특히 협죽도 추출물 100 mg/kg 농도일 경우 급성 관절염 치료효과가 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 5 : NO 에 미치는 영향

상기 실시예에 의해 제조된 협죽도 추출물에 대한 급성 관절염 치료효과 검정을 실시하였다.

[실험방법 5]

마우스 유래 대식세포인 Raw 264.7 세포주에 LPS(1 /ml)로 처리 한 후 24시간 경과 후에 배양액을 모아 효소법 및 라디칼 크로마토그래피(radical chromatography)법을 이용하여 체내 염증유발 분자인 산화질소(nitric oxide, NO) 의 생성량에 미치는 협죽도 추출물의 영향을 검색하였다. NO의 측정은 배양액 50㎕ 를 취하고 그리스(Griess)시액 1, 2를 25㎕ 씩 혼합하여 OD 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 흡광치는 ELISA kit( R&D systems, USA)를 사용하여 측정하였다.

협죽도 추출물 (㎍/ml)	0		0.5		5		50		500
결과내용	흡광치	억제율 (%)	흡광치	억제율 (%)	흡광치	억제율 (%)	흡광치	억제율 (%)	흡광치	억제율 (%)
수치	0.220±0.025	0	0.199±0.019	9.56	0.185±0.022	15.93	0.195±0.033	11.08	0.152±0.030	30.96

마우스 유래 대식세포인 Raw 264.7 세포주에 LPS(1 /ml)와 협죽도 추출물(0, 0.5, 5, 50, 500 ㎍/ml)를 처리한 후 24시간 경과 후에 배양액을 모아 효소법 등을 이용하여 체내 염증유발 분자인 NO를 정량한 결과, 협죽도 추출물을 처리한 세포주에서 LPS에 의한 대식세포의 NO 생성을 효과적으로 억제하였다.

제조예 1 : 정제의 제조

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 협죽도 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조하였다.

[조성]

협죽도 추출물 200 mg, 경질 무수규산 10 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 미세결정 셀룰로오즈 50 mg, 전분 글리콜산 나트륨 25 mg, 유당 101 mg, 포비돈 12 mg, 무수에탄올 적량.

제조예 2 : 연고제의 제조

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 협죽도 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

협죽도 추출물 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알콜 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량.

제조예 3 : 주사제의 제조

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 협죽도 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

[조성]

협죽도 추출물 100 mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트류 25 mg, 주사용 정제수 2974 mg

제조예 4 : 경피제의 제조

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 협죽도 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경피제를 제조하였다.

[조성]

협죽도 추출물 0.4 g, 폴리아크릴산 나트륨 1.3 g, 글리세린 3.6 g, 수산화알루미늄 0.004 g, 메틸 파라벤 0.2 g, 물 14 g.

제조예 5 : 음료의 제조

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 협죽도 추출물을 이용하여 다음과 같이 음료를 제조하였다. 협죽도 추출물 200mg, 비타민C 75 mg, 비타민B2 4 mg, 비타민B6 3 mg, 식이섬유 1,000 mg, 액상과당 20000 mg, 유화제 100mg, 향료 50mg에 용량이 50 ml이 되도록 정제수를 혼합한다. 혼합액을 2~3 ㎛의 필터를 통과시켜 청징화한 최종혼합액을 90~93℃ 에서 15~20초간 전 살균하여 50 ml병에 충진하고 80~85℃에서 15~20분간 후 살균하여 음료제품을 완성하였다.

Claims (14)

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8. 1) 협죽도(Nerium indicum) 원생약 중량의 5 ~ 8 배량의 물, 알콜, 알콜 수용액으로 이루어진 군중에서 하나를 선택하여 추출하고 냉각 및 여과하는 단계,
   2) 상기에서 얻어진 여액을 알콜 수용액으로 층분리한 후 50 ~ 90℃ 로 감압 농축하되, 알부틴(Arbutin)을 지표물질로 하여 상기 알부틴이 0.3 내지 1.0 중량% 함유되도록 농축하는 단계, 및
   3) 상기에서 얻어진 농축물에, 알콜을 가한 후 700 ~ 1,200 rpm으로 원심분리하는 단계를 포함하는, 알부틴(Arbutin)을 지표물질로 하는 협죽도(Nerium indicum) 추출물의 제조방법.
   
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