KR101116872B1 - 면역원성이 증가된 펩티드 항원 및 이를 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역원성이 증가된 펩티드 항원 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 면역원성이 증가된 펩티드 항원, 이를 코딩하는 핵산 또는 본 발명의 펩티드항원에 대한 항체를 포함하는 백신 조성물 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 목표항원에 대한 항체를 보다 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 목표 항원(들)의 에피토프 영역이 일렬반복(tandem repeat)된 폴리펩티드 또는 상기 에피토프 영역이 일렬반복된 서열 사이에 프롤린이 도입된 폴리펩티드 및 이를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 에피토프 영역이 직렬반복된 폴리펩티드는 모노-에피토프 펩티드보다 면역원성이 더 높으며, 프롤린이 도입될 경우 면역원성이 더 높아져 항체 생산 효율이 더욱 증가한다.

Description

면역원성이 증가된 펩티드 항원 및 이를 생산하는 방법{Peptide Antigen with enhanced immunogenicity and preparation method thereof}

본 발명은 면역원성이 뛰어난 펩티드 항원의 제조방법, 이 방법으로 제조된 펩티드 항원, 이 항원을 포함하는 백신 조성물, 이 항원을 사용하여 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명을 위한 연구는 교육과학기술부 한국학술진흥재단 기초연구과제지원 사업 [과제고유번호: KRF-2008-314-C00231 과제명: 세포사멸과정에서 microsomal monooxygenase(MMO)의 생물학적 역할 및 미토콘드리아와 소포체와의 cross-talk 규명] 및 학술진흥재단 중점연구소지원사업 [과제고유번호 :KRF-2006-005-J03003 과제명:호르몬성 대사질환의 조절기전연구] 에 의하여 지원되었다.

천연 단백질 또는 재조합 단백질이 항체를 생산하기 위하여 사용되어져 왔다. 그러나, 천연 단백질 항원은 순수한 형태로 얻기가 힘들며, 재조합 단백질은 숙주세포에서의 발현, 폴딩과 관련된 문제, 정제 과정 등으로 인해 이상적인 항원으로서 사용되기엔 제한이 많다.

반면, 펩티드 항원은 전체 단백질의 특정 영역(들)을 타겟으로 할 수 있으며, 에피토프(항원결정기)의 수를 최소화하여 다른 항원으로 생산된 항체와의 교차반응성을 줄일 수 있으며, 합성 펩티드는 고도로 순수한 형태로 얻을 수 있어 정제가 되지 않고 cDNA나 EST 클론에 의해서만 확인되는 단백질에 대한 항체를 생산할 수도 있다는 장점을 가지고 있다(1). 그러나 전체 단백질 서열로부터 에피토프 영역을 알아내는 것이 쉽지 않고, 펩티드합성, 정제, 캐리어 단백질에의 컨쥬게이션, 펩티드 길이로 인하여 상대적으로 항원성이 낮다는 점, 펩티드서열의 선택 등의 문제로 펩티드 항원을 널리 사용하는데 제약이 있어 왔다.

백신은 항원을 인체에 주입하여 면역반응에 필요한 항체를 형성하게 하여 질병에 저항, 면역성을 가지게 하는 의약품이다. 백신은 병원균에서 발견되는 결정기(epitope)를 가지는 해롭지 않은 항원의 도입을 말하기도 한다. 백신과정은 면역계가 병원균에 대하여 자신의 면역성을 발달시키도록 자극하는 것이기 때문에 능동적 면역과정이라고도 불린다. 이에 비해서 수동적 면역성은 즉각적이지만 일시적으로 보호를 하기 위해 다른 동물이 만든 항체를 주사해서 얻는 경우를 의미한다.

백신으로는 사멸시키거나 또는 약독화시킨 미생물, 이들로부터 정제한 물질, 면역반응을 일으키는 미생물의 단백질의 서브유니트 등이 사용되며, 최근에는 합성펩티드로 구성되는 합성백신이 개발되었다. 합성백신은 병원체의 에피토프(항원결정기)와 아미노산 배열이 같은 펩티드를 합성하여 중합시키거나 또는 다른 단백질과 결합시켜 만들며, 유전공학의 유전자 조작기술이 응용되기도 한다.

에피토프계 백신의 사용은 종래의 백신을 사용하는 경우에 비하여 보다 유리한 몇 가지 장점을 갖는다. 에피토프계 백신의 사용으로, 전항원(full antigen) 내에 존재할 수 있는 면역억제성 에피토프를 피할 수 있으며, 필요한 에피토프를 선택적으로 결합시킬 수 있고, 향상된 면역원성을 달성하도록 에피토프 조성물을 개량할 수 있어 표적 질병에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다. 에피토프계 면역 자극 백신의 다른 주요 장점은 안전성이다. 고유한 생물학적 활성을 보유할 수 있는 감염성 제제 또는 전(全) 단백질 항원에 의해 유발될 가능성이 있는 병리학적 부작용을 제거한다.

또한 항원을 코드하는 DNA를 투여하는 DNA 백신이 개발되었다. 보통 DNA 백신은 플라스미드 형태로 근육에 주사된다.

일반적으로 백신에는 항체의 형성을 증가시킬 목적으로 항원 외에도 알럼, 프로인트 부형제(Freund's adjuvant)와 같은 면역 활성제를 첨가하여 사용하고 있다.

본 발명의 명세서에 인용되는 선행문헌의 내용은 모두 본 명세서에 도입된다. 또한 이곳에 기재된 정보들은 단지 본 발명의 기술적 배경에 대한 이해를 돕고자 하는 것으로서, 본 발명에 대한 선행기술로써 작용할 수 없음은 당연하다.

펩티드 항원 및 이를 포함하는 백신은 많은 장점이 있으나 펩티드 길이로 인하여 상대적으로 면역원성이 낮다는 문제점이 있다. 따라서 본 발명에서는 면역원성이 향상된 펩티드 항원의 제조방법을 개발하는 것이 해결하고자 하는 과제이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 목표 항원의 에피토프 영역이 일렬반복(tandem repeat)된 폴리펩티드 및 상기 에피토프 영역이 일렬반복된 서열 사이에 프롤린이 도입된 폴리펩티드 및 이를 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 에피토프 영역이 일렬반복된 폴리펩티드는 모노-에피토프 펩티드보다 면역원성이 더 높으며, 프롤린이 도입될 경우 면역원성이 더 높아져 항체 생산 효율이 더 증가한다. 따라서 본 발명에 의한 폴리펩티드는 목표항원에 대한 항체를 보다 효율적으로 생산할 수 있도록 하며, 보다 효과적인 백신 조성물 을 제조하는데 사용될 수 있다.

도 1은 에피토프의 일렬반복 펩티드 서열의 항체생산량에 미치는 효과(A) 및 상기 일렬반복펩티드에 대한 항체를 사용한 웨스턴블롯팅 결과(B)를 나타낸 것이다.
도2는 CYP1A2 또는 3A4 에피토프 펩티드에 프롤린을 도입할 때 항체 생산에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도3은 CYP1A2의 에피토프의 일렬반복서열 사이에 알라닌 또는 글리신을 도입할 때 펩티드 항원에 의하여 생산된 항체를 스페이서가 도입되지 않은 경우와 비교한 결과이다.

본 발명의 발명자들은 실험을 통하여 펩티드 항원에서 에피토프 영역이 직렬반복된 폴리펩티드는 모노-에피토프 펩티드보다 면역원성이 더 높으며, 프롤린이 도입될 경우 면역원성이 더 높아져 항체 생산 효율이 더 증가한다는 것을 밝혔다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 발명자들은 CYP1A2 또는 CYP 3A4 로부터의 에피토프 영역의 일렬반복 펩티드와 모노-에피토프 펩티드를 항원으로 사용할 때 항체 생산 효과를 비교하였다. 그 결과, 에피토프 영역의 일렬반복 펩티드는 모노-에피토프 펩티드에 비하여 폴리클로날 항체 생성에 있어서 2.2-2.6 배 더 효율적이라는 것을 밝혔다 (도 1A). CYP1A2 및 3A4 의 탠덤 펩티드로부터 제조된 항체는 사람 간 마이크로좀의 해당 펩티드를 특이적으로 인식하였다 (도 1B). 이러한 결과는 반복된 에피토프 펩티드가 통상적인 에피토프 서열과 비교하여 폴리클로날항체의 생산 증가를 촉진한다는 것을 의미한다.

본 발명의 발명자들은 또한 에피토프 영역 사이의 거리와 항원성과의 관계를 조사하기 위하여, 아미노산 프롤린을 반복되는 서열 사이에 도입하고 항체 생산량을 프롤린이 도입되지 않은 경우와 비교하였다. 프롤린의 도입은 항체 생산을 촉진하여, ELISA 어세이의 흡광도 값이 프롤린이 도입되지 않은 경우를 100%로 하였을 때 약 2.0-2.5 배가 되었다 (도 2). 이 결과는 프롤린의 도입이 CYP1A2 및 3A4 에피토프 반복 서열의 항원성을 향상시킨다는 것을 암시한다. 프롤린을 2개 도입할 경우 더 많은 항체를 생산하였다.

일렬반복서열 사이에 스페이서로서 다른 아미노산을 도입할 때 항체생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여, CYP1A2의 반복서열 사이에 프롤린 대신 알라닌 (Ala) 또는 글리신 (Gly) 을 도입하고, 동일한 어세이를 하였다. 알라닌을 스페이서를 사용할 경우 특이적인 항체생산 증가효과를 나타내지 않았다. 반면, 글리신을 도입할 경우, ELISA 어세이에서 흡광도가 현저하게 감소하여 펩티드의 항원성이 감소하였음을 보여주었다 (도 3).

이와 같은 실험결과를 바탕으로 본 발명은 면역원성이 증가된 펩티드 항원 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 표적항원(들)의 에피토프에 해당하는 아미노산 서열을 결정하고, 상기 아미노산의 단위가 2개 이상 일렬 반복(tandem repeat)되는 아미노산 서열로 구성되도록 폴리펩티드를 제조하거나, 상기 반복되는 아미노산 서열 단위의 사이에 프롤린이 더 추가로 포함되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 제조하여, 면역원성이 높은 펩티드항원을 제조하는 방법을 포함한다.

본 발명에 의한 폴리펩티드는 표적항원(들)의 에피토프에 해당하는 아미노산 서열의 단위가 2개 이상 일렬 반복(tandem repeat)되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드이다. 또한 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 표적항원(들)의 에피토프에 해당하는 아미노산 서열의 단위가 2개 이상 일렬 반복(tandem repeat)되는 아미노산 서열로 구성되며, 반복되는 아미노산 서열 단위의 사이에 0-3개, 바람직하게는 0-2개의 프롤린이 추가로 포함되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함한다.

각 에피토프 영역은 2-10개, 필요에 따라서는 그 이상 반복될 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성에 의하거나 또는 천연 종양 또는 병원성 유기물과 같은 천연 소스로부터 합성적으로 제조할 수 있다. 펩티드는 다른 천연 발생 숙주 세포 단백질 및 그것의 단편이 실질적으로 없는 것이 바람직하지만, 일부 구체예에서, 펩티드는 천연 단편 또는 입자에 합성적으로 콘주게이트 될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 길이가 다양할 수 있으며, 그것의 중성(전하를 띠지 않는) 형태 또는 염 형태일 수 있다.

본 발명의 펩티드는 매우 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 비교적 짧은 크기의 경우, 그 펩티드는 통상의 기술에 따라 용액 내에서 또는 고형 지지체 상에서 합성할 수 있다. 다양한 자동 합성기는 시판되고 있으며, 공지 프로토콜에 따라 사용할 수 있다.(예컨대, Stewart amp: Young, SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2D. ED.. Pierce Chemical Co.. 1984 참조). 또는, 제조하고자 하는 면역원성 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 세포, 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충,식물 또는 포유류 세포로 트랜스펙트시켜 발현에 적당한 조건 하에서 배양하는 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 절차는 문헌(Sambrook 등, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. New York(1989))에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 펩티드 에피토프에 대한 뉴클레오티드 암호화 서열은 화학 기술, 예를 들면 문헌(Matteucci, 등, J. Am. Chem. Soc. 103:3185(1981))의 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성할 수 있다.

본 발명의 면역원성이 향상된 펩티드 항원은 고분자나 다른 단백질에 결합되어 사용될 수 있다. 이때 사용할 수 있는 고분자로는 폴리스티렌, 폴리락틱-글리콜릭산 등을 예로 들 수 있으나 이로 제한 되는 것은 아니다. 또한 본 발명이 펩티드항원에 결합될 수 있는 단백질로는 키홀림펫헤모시아닌, 소혈장단백질, 오발브민, 테타너스 독소 등을 들 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 본 발명에서 제공하는 면역원성이 향상된 펩티드 항원, 즉 목표 항원의 선택된 에피토프 영역의 아미노산 서열을 2개 이상 일렬로 반복(tandem repeat)하여 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 에피토프 영역이 일렬반복된 서열 사이에 프롤린을 도입된 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 면역원성이 향상된 펩티드 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 백신 조성물 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명에서 제공하는 면역원성이 향상된 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 백신 조성물 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 백신 조성물은 감염성 질병, 악성 질병 또는 자가면역 질병을 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체는 당업계 널리 알려져 있으며, 예를 들면 티로글로불린, 알부민, 예컨대 사람 혈청 알부민, 테타누스 톡소이드, 폴리아미노산, 예컨대 폴리 L-리신, 폴리 L-글루탐산, 인플루엔자, B형 간염 바이러스 코어 단백질 등이 있다. 백신은 생리학적으로 내성이 있는(즉, 허용 가능한) 희석제, 예컨대 물 또는 염수, 바람직하게는 인산염 완층 염수를 함유할 수 있다. 또한, 통상적으로 백신은 아쥬반트를 포함한다. 불완전 프로인트 아쥬반트, 인산알루미늄, 수산화 알루미늄 또는 명반과 같은 아쥬반트가 당업계에 널리 알려져 있는 물질의 예이다.

또한, 본 발명의 백신은 본 발명의 펩티드를 제공하기 위한 비히클로서 항원 제시 세포(APC), 예컨대 수지상 세포(DC)를 포함할 수 있다. 백신 조성물을 시험관 내에서 생성한 후, 수지상 세포를 고정하고, 수거함으로써 수지상 세포의 로딩이 시험관내에서 일어난다. 예를 들면, 수지상 세포는 예컨대, 본 발명에 따른 미니유전자로 트랜스펙트시키거나, 또는 펩티드로 펄스화한다. 그 다음, 수지상 세포를 환자에게 투여하여 생체내 면역 반응을 도출할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 본 발명의 펩티드 항원을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이를 위한 방법은 예를 들면 문헌(Woff등, Science 247:1465(1990), 뿐만 아니라 미국 특허 제 5,580,859호, 제5,589,466호, 제5,804,566호, 제5,739,118호, 제5,736,524호, 제5,679,647호, WO 98/04720호)에 기재되어 있으며 본 명세서에 도입된다.

본 발명에 따른 펩티드는 주사, 에어로졸, 경구, 경피, 경막, 늑막내, 포막내 또는 기타 경로에 의하여 숙주를 면역화시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드 및/또는 그 펩티드를 암호하는 핵산은 리포솜을 이용하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 백신 조성물은 예방약으로서 사용할 수도 있다. 통상, 최초 예방 접종용 투여량은 일반적으로 단위 투여 범위가 저투여치로는 약 1, 5, 50, 500 또는 1000μg, 고투여치로는 약 10,000, 20,000, 30,000 또는 50,000μg범위이다. 인간에게 투여하기 위한 투여치는 통상 70kg 환자에 대하여 약 500μg 내지 약 50,000μg 범위이다. 상기 최초 백신 투여 후, 약 4주 내지 6개월의 규정 간격을 두고, 펩티드 약 1.0μg 내지 약 50,000μg의 부스팅 투여량(boosting dosage)을 투여한다.

본 발명의 펩티드 및 핵산 조성물은 백신 투여를 위한 지시서와 함께 키트 형태로 제공할 수 있다. 통상, 키트는 용기내, 바람직하게는 단위 제형 내의 소정 펩티드 조성물 및 투여를 위한 지시서를 포함한다. 또한 그외 키트 성분으로 예를 들어 멸균 시린지, 부스터 투여량 및 기타 부형제 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 목표항원에 대한 항체를 보다 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다. 이를 위하여 목표 항원의 선택된 에피토프 영역의 아미노산 서열을 2개 이상 일렬로 반복(tandem repeat)하여 포함되도록 제조된 폴리펩티드 또는 상기 에피토프 영역이 일렬반복된 서열 사이에 프롤린이 도입된 폴리펩티드를 사용한다. 항체는 이 기술분야에서 알려진 통상의 방법을 사용하여 제조한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화항체를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062(1995)); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다. 항체를 파파인 (papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 그 나머지인 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab ')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.

폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 피하 주사 또는 복강내 주사로 수회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다. 사용할 수 있는 면역보강제에는 프로인트 완전 보조제 (Freund's complete adjuvant) 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl Lipid A), 합성 트레할로오스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 면역화 방법은 과도한 실험없이 당업자가 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al.,Nature, 256:495 (1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌 (Clackson et al., Nature,352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체를 포함한다 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열) 이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간면역글로불린 영역의 일부를 포함한다 (Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).

"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커도 포함한다. "디아바디(diabody)"는 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편 (VH-VL)을 말한다. 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인을 결합시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 결합시켜 2개의 항원 결합부위를 생성시킨다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 발명에 사용한 BALB/c 마우스 (5 - 7 주령) 은 샘타코(오산, 한국)로부터 구입하였다. 표1에 기재된 펩티드항원은 펩트론(대전, 한국)에서 합성하였다. 키홀림펫헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin: KLH)은 Pierce Biotechnology (Rockford, IL)로부터, 사람간 마이크로좀은 BD Biosciences (San Jose, CA)으로부터 구입하였다.

펩티드와 KLH 의 결합

펩티드를 글루탈아데하이드(glutaraldehyde)를 크로스링커로 사용하여 KLH에 결합시켰다(8). KLH: 펩티드항원의 몰비는 1:100이었다. KLH와 펩티드를 0.01M 인산완충액(pH 7.4) 2 mL 에 용해시켰다. 글루탈알데히드(20 mM, 1 mL) 을 반응시료에 첨가하여 펩티드-KLH 결합을 시켰다. 반응하지 않은 글루탈알데히드는 과량의 인산완충액 생리식염수로 투석하여 제거하였다. 펩티드농도는 fluorescamine assay (9)로 결정하였다.

면역

펩티드-KLH 복합체를 완전 또는 불완전 Freund's adjuvant 와 1:1 (v/v) 에멀젼으로 섞어 주입시료를 제조하였다. 각 마우스의 면역화를 위한 주입부피는 약 0.4 mL이었다. 항원을 마우스(한 그룹당 5마리씩)의 털을 제거한 등의 피부로 28게이지 표준 일회용 게이지를 사용하여 4회 피부내 투여 (100 ㎕/injection) 하였다. 2주 후에 같은 방법으로 동물을 부스팅하였다. 마지막 주입 후 2주 후에 각 마우스의 꼬리 정맥으로부터 총 약300㎕의 혈액 시료를 채취하였다.

웨스턴 블롯 어세이

시토크롬 P450 1A2 (CYP1A2) 및 3A4 (CYP3A4) 단백질을 검출하기 위하여 사람 간 마이크로좀을 사용하여 웨스턴블롯팅 분석을 행하였다.

ELISA 어세이

항-펩티드 항체의 수준은 통상적인 ELISA 방법을 사용하여 결정하였다. 각 펩티드를 먼저 제조자의 지침에 따라 활성화된 우혈청 알부민(activated bovine serum albumin ; Imject Maleimide Activated BSA, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) 과 결합시키고, 펩티드-우혈청알부민(BSA) 복합체를 ELISA의 항원으로 사용하였다.

통계분석

5번의 독립적인 실험 결과를 평균 ±S.E.로 나타내었으며, Student's t testes 를 실시하였다.

< 실시예1 > 일렬반복된 에피토프를 포함하는 항원의 항체 생산 효과

시토크롬 1A2 (CYP1A2) 및 3A4의 펩티드 항원(표1)이 에피토프 영역으로 확립되었다 (2,3). 본 발명의 발명자들은 펩티드를 고분자 캐리어에 결합시킬 경우 토끼에서 폴리클로날항체를 생산할 수 있다는 것을 보고한 바 있다(4). 본 발명에서는 에피토프 영역을 일렬로 반복 (tandem repeat)시킬 때의 항체 생산 효과에 대하여 연구하였다.

항원을 주입하여 면역화된 마우스로부터 혈액을 채취하고, 2000배로 희석된 혈청시료를 앞에 설명된 펩티드-BSA 결합체를 항원으로 사용하여 통상적인 ELISA 방법으로 분석하였다. 항-마우스 IgG 퍼옥시다제 결합체 및 2,2'-azino-di-(3 ethylbenzthiazoline sulfonic acid) 를 각각, 이차 항체 및 퍼옥시다제의 기질로서 사용하였다. 웰에 비특이적으로 결합하는 항원에 의한 값은 빼주었다(도1 A). CYP1A2 또는 3A4의 일렬반복 펩티드로부터 제조된 anti-sera를 사용한 사람 간 마이크로좀의 웨스턴 블롯분석을 하였다. 블롯결과는 통상적인 방법에 의하여 ECL^TM 로 develop 되었다. 두 개의 마이크로좀 단백질시료 (CYP1A2 검출을 위해서는 80 ㎍, and CYP3A4 검출을 위해서는 40 ㎍)를 이뮤노블롯팅을 위하여 사용하였다(도1 B).

항원 주입 후 항체 분석을 한 결과, CYP1A2 또는 3A4 로부터의 에피토프 영역의 일렬반복 펩티드(각각 표1의 1A2-TR 및 3A4-TR)는 모노-에피토프 펩티드(1A2-M and 3A4-M)에 비하여 폴리클로날 항체 생성에 있어서 2.2-2.6 배 더 효율적이었다 (도 1A). CYP1A2 및 3A4 의 탠덤 펩티드로부터 제조된 항체는 사람 간 마이크로좀의 해당 펩티드를 특이적으로 인식하였다 (도 1B). 이러한 결과는 반복된 에피토프 펩티드가 통상적인 에피토프 서열과 비교하여 폴리클로날항체의 생산 증가를 촉진한다는 것을 의미한다.

< 실시예 2> 일렬반복되는 에피토프 영역 사이에 아미노산 프롤린의 도입효과

에피토프 영역 사이의 거리와 항원성과의 관계를 조사하기 위하여, 아미노산 프롤린을 반복되는 서열 사이에 도입하고 항체 생산량을 프롤린이 도입되지 않은 경우와 비교하였다.

펩티드항원은 하나 또는 두개의 프롤린을 반복되는 에피토프 사이에 포함하도록 합성되었으며, 생산된 항체의 양을 프롤린이 도입되지 않은 에피토프 일렬반복서열(control: 1A2-TR and 3A4-TR)의 경우와 비교하였다. 모든 실험 조건은 실시예1에서와 동일하였다.

프롤린의 도입은 항체 생산을 촉진하여, ELISA 어세이의 흡광도 값이 프롤린이 도입되지 않은 경우(1A2-TR 펩티드(control) 사용)를 100%로 하였을 때 약 2.0-2.5 배가 되었다 (도 2). 이 결과는 프롤린을 도입한 경우(1A2-TR/P, 3A4-TR/P), CYP1A2 및 3A4 에피토프 반복 서열의 항원성을 향상시킨다는 것을 암시한다. 프롤린을 2개 도입할 경우(1A2-TR/PP, 3A4-TR/PP) 더 많은 항체를 생산하였다.

프롤린은 폴리펩티드의 알파-헬릭스 영역에서 헬릭스-파괴 아미노산으로 알려져 있으므로, 프롤린의 이러한 효과는 펩티드의 이차 구조로부터 연유하는 것으로 생각되었다. 예를 들어, network protein sequence analysis (5) 방법을 통하여 3A4-TR 펩티드가 알파-헬릭스 함량이 높으며, 반면 3A4-TR/P 및 3A4-TR/PP 펩티드는 거의 랜덤구조를 갖는 것으로 예측이 되었는데, 이는 펩티드 서열에 프롤린이 존재하기 때문일 것이다. 따라서, 본 실험결과는 chicken riboflavin carrier protein 의 C-말단에서의 헬릭스의 안정화에 의하여 펩티드 항원성이 향상된다는 종전의 보고 (6,7)와 상반되는 것이다.

< 실시예 3> 일렬반복되는 에피토프 영역 사이에 아미노산 알라닌 또는 글리신의 도입효과

에피토프의 일렬반복서열 사이에 스페이서로서 다른 아미노산을 도입할 때 항체생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여, CYP1A2의 반복서열 사이에 프롤린 대신 알라닌 (Ala) 또는 글리신 (Gly) 을 도입하고, 동일한 어세이를 하였다. 실험은 실시예1에서 기재된 것과 동일한 조건에서 수행되었다.

알라닌을 스페이서를 사용할 경우(1A2-TR/A, 1A2-TR/AA), 스페이서를 도입하지 않은 에피토프의 일렬반복서열(1A2-TR)에 비하여 특이적인 항체생산 증가효과를 나타내지 않았다. 반면, 역시 헬릭스-파괴 아미노산으로 알려져 있는 글리신을 도입할 경우(1A2-TR/G, 1A2-TR/GG), 스페이서를 도입하지 않은 에피토프의 일렬반복서열(1A2-TR)에 비하여 ELISA 어세이에서 흡광도가 현저하게 감소하여 펩티드의 항원성이 감소하였음을 보여주었다 (도 3).

참고문헌

1. Angeletti, R. H. (1999) Design of useful peptide antigens. J. Biomol . Tech. 10, 2-10.

2. Edwards, R.J., Singleton, A. M., Murray, B. P., Davies, D. S., and Boobis, A. R. (1995) Short synthetic peptides exploited for reliable and specific targeting of antibodies to the C-termini of cytochrome P450 enzymes. Biochem . Pharmacol. 49, 39-47.

3. Wang, R. W., Newton, D. J., Liu, N. Y., Shou, M., Rushmore, T., and Lu, A. Y. (1999) Inhibitory anti-CYP3A4 peptide antibody: mapping of inhibitory epitope and specificity toward other CYP3A isoforms. Drug Metab . Dispos . 27, 167-172.

4. Kim, M., Yun, C-H., Park, S. K., Seo, J. H., and Ahn, T. (2007) Production of polyclonal antibodies against peptide antigens using polystyrene beads as a carrier. Biotechnol . Lett . 29, 1735-1740.

5. Combet, C., Blanchet, C., Geourjon, C., and Deleage, G. (2000) NPS@: network protein sequence analysis. Trends Biochem . Sci . 25, 147-150.

6. Gurunath, R., Beena, T. K., Adiga, P. R., and Balaram, P. (1995) Enhancing peptide antigenicity by helix stabilization. FEBS Lett . 361, 176-178.

7. Subramanian, S., Karande, A. A., and Adiga, P. R. (2001) Helix stabilization in the C-terminal peptide of chicken riboflavin carrier protein enhances immunogenicity and prolongs contraceptive potential as an epitope-based vaccine in female rats. Biochem . Biophys . Res . Commun . 14, 236-243.

8. Reichlin, M. (1980) Use of glutaraldehyde as a coupling agent for proteins and peptides. Methods Enzymol . 70, 159-165.

9. Castell, J. V., Cervera, M., and Marco, R. (1979) A convenient micromethod for the assay of primary amines and proteins with fluorescamine. A re-examination of the conditions of reaction. Anal . Biochem . 99, 379-391.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

1. LEDTQKH의 아미노산 서열의 단위가 2개 이상 일렬 반복(tandem repeat)되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드.
2. LEDTQKH의 아미노산 서열의 단위가 2개 이상 일렬 반복(tandem repeat)되는 아미노산 서열로 구성되며, 반복되는 아미노산 서열 단위의 사이에 프롤린이 추가로 포함되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드.
3. 제2항에 있어서, 상기 반복되는 아미노산 서열 단위의 사이에 추가되는 프롤린이 1-2개 추가되는 것인 폴리펩티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 폴리스티렌 및 폴리락틱-글리콜릭산으로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자 또는 키홀림펫헤모시아닌, 소혈장단백질, 오브알부민 및 테타너스독소로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 결합되어 있는 것인 폴리펩티드.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 대한 항체.
7. (i) LEDTQKH의 아미노산 서열의 단위가 2개 이상 일렬 반복(tandem repeat)되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드;
   (ii) LEDTQKH의 아미노산 서열의 단위가 2개 이상 일렬 반복(tandem repeat)되는 아미노산 서열로 구성되며, 반복되는 아미노산 서열 단위의 사이에 프롤린이 추가로 포함되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드;
   (iii) 상기 (i) 또는 (ii)의 폴리펩티드에 폴리스티렌 및 폴리락틱-글리콜릭산으로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자 또는 키홀림펫헤모시아닌, 소혈장단백질, 오브알부민 및 테타너스독소로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질이 결합된 폴리펩티드;
   (iv) 상기 (i) 또는 (ii)의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 및
   (v) 상기 (i) 또는 (ii)의 폴리펩티드에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 백신조성물.

Images