KR101105564B1 - 핵산의 검출 - Google Patents

Abstract

본 발명은 작은 핵산 분자(예를 들어, RNA(예를 들어 마이크로 RNA(miRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같이 작은 RNA) 및 기타 짧은 핵산 분자)의 검출 및 특성조사를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 RNA 발현의 검출 및 정량분석을 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 miRNA 및 siRNA 변이체의 검출을 추가로 제공한다.

Description

핵산의 검출 {DETECTION OF NUCLEIC ACIDS}

본 발명은 핵산 분자(예를 들어, RNA(예를 들어, 마이크로 RNA(miRNA: microRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA: small interference RNA)와 같이 작은 RNA 및 기타 짧은 핵산 분자)의 검출 및 특성조사(characterization)를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 RNA 발현의 검출 및 정량분석을 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 miRNA 및 siRNA 돌연변이체(예를 들어 결실 돌연변이체) 및 변이체의 검출을 추가로 제공한다.

마이크로RNA(miRNAs)는 비암호화(noncoding) RNAs의 새로운 분류로서, 무척추 동물 및 척추 동물의 게놈에 짧은 역위반복서열 (inverted repeat)로 암호화되어 있다(Ambros, (2001) Cell 107, 823-826; Moss (2002) Curr. Biol. 12, R138-140). miRNA는 표적 mRNA의 번역(translation) 및 안정성의 조절자(modulator)이나, 대부분의 표적 mRNA는 아직 동정되지 않았다. miRNA는 3' 비번역 영역(UTR: untranslated region) 내의 안티센스(antisense) 상보적 영역에 결합함으로써 표적 mRNA의 번역을 서열-특이적으로 제어한다(Ambros, supra; Moss, supra; Lagos- Quintana et al., (2001) Science 294, 853-858; Lau et al., (2001) Science 294, 858-862; Lee et al., (2001) Science 294, 862-864). miRNA는 다른 기전에 의해서도 유전자 발현을 저해할 수 있다(예를 들어, Pillai et al., Science 309, 1573-1576 (2005); Humphreys et al., Proc Natl Acad Sci USA 102, 16961-16966 (2005)).

몇 가지 miRNA, 예를 들어 let-7 RNA, miR-1, miR-34, miR-60 및 miR-87은 무척추 동물 및 척추 동물 사이에서 매우 잘 보존되어 있으며, 이는 아마도 보존된기능의 다중 영역 및/또는 다중 표적을 그들이 인지할 수 있음을 시사한다(Lagos-Quintana et al., supra; Lau et al., supra; Lee et al., supra; Pasquinelli et al., (2000) Nature 408:86). 작은 일시적 RNA(stRNA: small temporal RNA) lin-4 및 let-7은 캐노르하브디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans)에서 유전학적 분석에 의해 동정된 miRNAs의 대표적인 하위 분류로서, 이들은 발생 단계에서 조절되며 그 자체로 예를 들어 신경 배선(neuronal rewiring) 시기 조절, 영속 유충(Dauer larva) 형성, 음문(vulva) 형성, 및 진피 세포의 말단 분화와 같은 발생 프로그램을 제어한다.

통상적으로 miRNA는 60- 내지 70-뉴클레오티드 폴드백(foldback) RNA 전구체 구조로부터 절제되며, 이는 miRNA 전구체 발현이 개시될 때에(Grishok et al., (2001) Cell 106, 23-34; Hutvagner et al. (2001) Science 93, 834-838; Ketting et al., (2001) Genes Dev. 15, 2654-2659) 또는 매우 다량의 miRNA 발현 중에(Lagos-Quintana et al., supra; Lau et al., supra; Lee et al., supra) 간혹 검출된다. 일반적으로, 헤어핀(hairpin) 전구체 분자의 한쪽 가닥만이 절제되어 축적되며, 이는 RNA 분해로부터 연계된 단백질들에 의해 보호되기 때문인 것으로 추정된다. 이처럼 추정되는 단백질은 번역 억제를 매개할 수 있다. miRNA 전구체 가공(processing) 반응은 다이서(Dicer) RNase III 및 아르고노트 패밀리 멤버(Argonaute family member)를 필요로 한다(Grishok et al., supra; Hutvagner et al., supra; Ketting et al., supra).

유전자 발현에 대한 그의 효과뿐만 아니라, 작은 RNAs(예를 들어, 18-25 뉴클레오티드 범위의 miRNA 또는 siRNA)는 치료제 및 약물 발견 분야에서도 유용할 수 있다(예를 들어, 약물 표적 또는 약제학적 제제로서). 따라서 어떤 경우에는, 세포 내에 각 miRNA가 대략적으로 얼만큼씩 존재하는지 아는 것이 중요하다(예를 들어, 치료 전, 중 또는 후에).

추가로, miRNA 유전자의 결실 및 하향조절(down regulation)은 암(예를 들어, B-세포 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia))과 연관되어 왔으며, 이로 인해 당업계에는 miRNA 발현을 검출 및 특성조사가 가능해야 할 필요성이 대두되었다(예를 들어, Calin et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99, 15524-15529 (2002)). 일부 경우에는, 상이한 조직 유형에서, 또는 자극, 예를 들어 화학적 또는 물리적 중재(intervention)와 같은 자극을 적용한 전후에 miRNA의 수준을 비교하는 것이 중요할 수 있다.

관련된 siRNA 및 miRNA가 세포 내에 소량으로 존재할 수 있으므로, 민감하고 특이적인 검출 방법이 바람직하다. 더우기, 어떤 적용에 있어서는, 고효율 스크리 닝에 적합한 방법, 예를 들어 균질 방법(homogeneous method), 다중 복합 방법(multiplexed method), 또는 고도의 병렬 자동 조작(highly parallel automated manipulation) 및 제한된 온도 변화에 적합한 방법을 동정함이 유익할 수 있다.

miRNA가 유전자 발현의 조절에 있어서 중요한 역할을 담당함에도 불구하고, miRNA 발현의 검출 및 정량분석을 위한 효과적인 기술이 없다. miRNA의 정량분석을 위해 사용되어온 방법은 겔 전기영동에 기초한 것이다. miRNA는 노턴 블로팅 또는 방사성 RNase-저항성 이중체(duplex)의 존재에 의해 검출된다. 노턴 블로팅 및 칩 혼성화 방법(chip hybridization method)은 분석 감도가 상대적으로 낮으므로(Krichevsky et al. 2003), 마이크로그람 수준의 RNA 양이 분석에 필요하며; 더욱이 작은 RNA를 필터에 이전하는 과정에서 정량 분석의 재현성 문제가 발생할 수 있으므로, 이는 통상 고효율에 적합하지 않다. 또한, RNase 저항성에 기초한 검출 방법은 고도의 방사성 탐침을 필요로 한다. 추가로, 탐침 혼성화에만 기초한 에세이는, 서열상 밀접하게 관련된 동형(isotype) 간의 충분한 구별을 제공하지 못할 수 있다. 대안적 접근 방법은 miRNA를 클로닝하여 삽입물을 서열분석함을 포함한다. 이 접근 방법은 밀접하게 관련된 miRNA 종 간의 단일-염기 차이를 구별하기에 적합하지만, 시간과 노동력이 많이 소모된다.

miRNA와 마찬가지로, 작은 간섭 RNA(siRNA)는 RNA 간섭(RNAi)이라고 명명된 반응을 통하여 예를 들어 바이러스 RNA에 대항하는 세포 방어에 관련된 작은 RNA 분자이다(Cullen, B.R., Nature Immunology, 3: 597-599 (2002)). 한 분류의 siRNA는, 세포내 이중 가닥 RNA의 존재에 대한 RNAi 반응의 일부로서 다이서 효소 및 RNA-유도성 발현저해 복합체(RISC: RNA-induced silencing complex) 단백질의 작용을 통해 생산된다(Khvorova, A. et al., Cell 115: 209-216 (2003)). 또 다른 분류의 siRNA는 합성물로서, 특징적인 디뉴클레오티드 돌출부(overhang)를 가진, 보통 21-23 nt의 짧은 이중체를 포함하며(Elbashir, S.M. et al., EMBO J. 20: 6877-6888 (2001)), 형질감염에 의해 세포 내로 직접 도입되거나 도입된 벡터로부터 발현된다(Paul, C.P. et al., Nature Biotechnology 20: 505-508 (2002), 미국 특허출원공개 제2003/0148519A1호는 모든 목적으로 그 전체가 본원에 참조로서 도입된다). 일부 경우에, siRNA는 정의된 서열로서 존속하여 기능 및 조성에 있어서 miRNA와 유사한 것으로 나타난다(Elbashir, S.M. et al., supra). miRNA 및 siRNA 수준의 검출 및 특성조사(예를 들어 정량분석)를 위한 효율적이고 정확한 방법이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 핵산 분자(예를 들어 RNA(예를 들어 마이크로 RNA(miRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같이 작은 RNA) 및 기타 짧은 핵산 분자의 검출 및 특성조사를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 RNA 발현의 검출 및 특성조사(예를 들어 정량분석)를 위한 개선된 방법에 관한 것이다.

예를 들어 본 발명은, 적어도 하나의 핵산(예를 들어 간섭 RNA에 상보적이지 않은 서열을 포함하는)을 간섭 RNA 표적에 혼성화시켜 검출 구조를 생성시키고 그 검출 구조를 검출함을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 간섭 RNA 표적은 miRNA이다. 다른 구체예에서, 간섭 RNA 표적은 siRNA이다. 다른 구체예에서, siRNA는 이중 가닥이다.

일부 구체예에서, 검출 구조는 침입성 분해 구조(invasive cleavage structure)를 포함한다. 예를 들어 일부 구체예에서, 핵산은 miRNA와 조합하여 침입성 분해 구조를 형성하도록 구성된 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 miRNA와 조합하여 침입성 분해 구조를 형성하도록 구성된 제1 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 5' 부분 및 3' 부분을 포함하며, 여기에서 3' 부분은 표적 서열에 혼성화되도록 구성되고 5' 부분은 표적 서열에 혼성화되지 않도록 구성된다. 제2 올리고뉴클레오티드를 채택하는 일부 구체예에서는, 제2 올리고뉴클레오티드가 5' 부분 및 3' 부분을 포함하며, 여기에서 5' 부분은 표적 서열에 혼성화되도록 구성되고 3' 부분은 표적 서열에 혼성화되지 않도록 구성된다. 일부 구체예에서, 검출 단계는 인베이더(INVADER) 에세이의 사용을 포함한다.

일부 구체예에서, 검출 구조는 작은 RNA에 혼성화되어 환형(circular) 검출 구조를 생성하는 환형 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 단계는 회전환 복제 에세이(rolling circle replication assay)의 사용을 포함한다.

일부 구체예에서, 검출 구조는 중합효소에 의해 연장되는(예를 들어 주형(template) 의존성 연장) 유리 3'-OH 그룹을 가진 핵산 분자를 포함하며, 연장된 서열이 직접 또는 간접적으로 검출된다.

일부 구체예에서, 검출 단계(들)은 서열분석 에세이, 중합효소 연쇄반응 에세이, 혼성화 에세이, 돌연변이에 대해 상보적인 탐침을 채택하는 혼성화 에세이, 마이크로배열 에세이(microarray assay), 비드 배열 에세이(bead array assay), 프라이머 연장 에세이, 효소 불일치 분해 에세이(enzyme mismatch cleavage assay), 측쇄 혼성화 에세이(branched hybridization assay), NASBA 에세이, 분자 비콘 에세이(molecular beacon assay), 주기순환 탐침 에세이(cycling probe assay), 리가제 연쇄반응 에세이(ligase chain reaction assay), 침입성 분해 구조 에세이, ARMS 에세이 및 샌드위치 혼성화 에세이(sandwich hybridization assay)를 포함하나 이에 한정되지 않는 검출 에세이의 사용을 포함한다. 몇 가지 바람직한 구체예에서, 검출 단계는 세포 용해물 내에서 실행된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 제2 핵산 표적의 검출을 포함한다. 바람직한 일부 구체예에서, 제2 핵산 표적은 RNA이다. 특히 바람직한 몇 가지 구체예에서, 제2 핵산 표적은 U6 RNA 또는 GAPDH mRNA이다.

일부 구체예에서 검출 구조를 형성하기 위해 사용된 핵산은, RNA가 주형에 혼성화되어 연장 반응에서 연장될 수 있도록, 작은 RNA에 충분히 상보적인 하나 이상의 자리를 가진 주형을 포함한다. 일부 구체예에서 연장 반응은, 중합효소 연쇄반응에서 하나 이상의 RNA가 프라이머로 사용되는 중합효소 연쇄반응이다. 이러한 일부 구체예에서는, 단일 유형의 RNA가 주형 상의 2개 위치에 결합하여 중합효소 연쇄반응 프라이머를 제공한다. 다른 구체예에서는 2개 이상의 RNA가 프라이머로 사용된다. 이러한 구체예에서, 증폭 산물의 검출은 시료 내에 2개 이상의 RNA가 존재함을 의미한다(즉 miRNA 다중 복합 에세이). 결찰 올리고뉴클레오티드(들)로서 miRNA를 사용하는 리가제 연쇄반응에서도 유사한 방법이 채택될 수 있다. 일부 구체예에서는, RNA 주형의 적어도 일부에 걸친 프라이머의 연장에 의한 검출 복합체의 개질을 위하여 RNA가 주형으로 사용된다.

일부 구체예에서, 본 방법은 복수의 miRNA 검출을 포함한다. 이러한 일부 구체예에서, 복수의 miRNA는 동일한 miRNA의 다형성(polymorphism)을 포함한다. 다른 구체예에서, 복수의 miRNA는 상이한 miRNA(예를 들어 Let-7, miR-1, miR-1d, miR-135, miR-15, miR-16, miR-124a 또는 miR125b)를 포함한다.

본 발명은 또한 임의의 상기 방법을 실행하기 위한 키트를 제공한다. 예를 들어, 일부 구체예에서 본 발명은, RNA 표적 서열에 혼성화되었을 때 검출 구조를 형성하도록 구성된 핵산을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 키트는 miRNA를 검출하도록 구성된다. 바람직한 일부 구체예에서, 키트는 Let-7, miR-1, miR-135, miR-15, miR-16, miR-1b, miR-124a 또는 miR125b miRNA를 검출하도록 구성된다. 바람직한 일부 구체예에서, 키트는 miRNA 표적을 가진 제2 RNA 표적을 공동-검출하도록 구성된다.

본 발명은 또한, (i) miRNA 표적; (ii) 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드; (iii) 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드; (iv) 역전사 효소; (v) 중합효소; 및 (vi) 탐침 올리고뉴클레오티드를 제공하고; 검출 구조가 형성되는 조건 하에 (i) 내지 (vi)을 배양하며; 검출 구조를 검출하는 것을 포함하는 miRNA 표적을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드는 miRNA 표적에 상보적인 제1 영역 및 miRNA 표적에 상보적이지 않은 제2 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드는 miRNA 표적의 제2 영역에 상보적인 제1 영역 및 miRNA 표적의 제2 영역에 상보적이지 않은 제2 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 검출은 침입성 분해 구조의 형성, 침입성 분해 구조의 분해, 및 침입성 분해 구조의 분해의 검출을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 배양은 검출 구조를 분해할 수 있으나 중합효소 활성이 없는 효소와의 배양을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 효소가 5' 뉴클레아제이나, 일부 구체예에서는 상기 효소가 FEN-1 뉴클레아제를 포함한다. 일부 구체예에서, 침입성 분해 구조의 분해는 45 ℃ 내지 60 ℃의 온도에서 일어난다. 일부 구체예에서, 침입성 분해 구조의 분해는 약 50 ℃의 온도에서 일어난다. 일부 구체예에서는, 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드를 역전사의 프라이머로 사용한다. 일부 구체예에서는 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드를 침입성 분해 반응에서 인베이더 올리고뉴클레오티드로 사용한다. 일부 구체예에서는 (i) 내지 (vi)이 동일한 반응 용기 내에 존재한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 (vii) 제2 탐침 올리고뉴클레오티드의 제공을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서는, 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드 및 역전사 효소가 miRNA 표적을 역전사한다. 일부 구체예에서는, 역전사된 miRNA 표적(즉 miRNA cDNA 표적)이 중합효소 연쇄반응에서 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드 및 DNA 중합효소에 의해 증폭된다. 일부 구체예에서는, 역전사된 miRNA 표적이 증폭되어 탐침 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 검출 구조를 형성한다. 일부 구체예에서, 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 miRNA 표적 사이에 약 6-7 염기쌍의 이중체가 형성되도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 매우 적은 카피 수(copy number)로 존재하는 miRNA를 검출할 수 있다. 예를 들어 일부 구체예에서는, 시료 내 200 카피 미만의 miRNA가 검출된다. 일부 구체예에서는, 시료 내 100 카피 미만의 miRNA가 검출된다. 일부 구체예에서, 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 miRNA 표적 사이에 약 9 염기쌍의 이중체가 형성되도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 탐침 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 miRNA 표적 또는 miRNA 표적의 증폭된 카피 사이에 약 8-10 염기쌍의 이중체가 형성되도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드 탐침의 제2 영역은 제1 부분 및 제2 부분을 포함하며, 여기에서 제1 부분 및 제2 부분은 서로 혼성화될 수 있다. 일부 구체예에서는, 제1 부분 및 제2 부분이 서로 혼성화될 때 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드 탐침 내에 헤어핀 구조가 형성된다. 일부 구체예에서, 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드 탐침의 제2 영역은 제1 부분 및 제2 부분을 포함하며, 여기에서 제1 부분 및 제2 부분은 서로 혼성화될 수 있다. 일부 구체예에서는, 제1 부분 및 제2 부분이 서로 혼성화될 때 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드 탐침 내에 헤어핀 구조가 형성된다. 일부 구체예에서 본 방법은, (vii) 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드 탐침의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 제공을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 (vii) 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드 탐침의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 제공을 추가로 포함한다. 최적의 성과를 위하여 서열, 완충액 구성성분 등에 기초하여 다른 온도를 선택할 수도 있으나, 일부 구체예에서는 침입성 분해 구조를 약 50 ℃의 온도에서 분해함으로써 표적 서열을 고성능으로 구별할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 단일 종의 변이체 miRNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 탐침 올리고뉴클레오티드의 농도를 증가시키면 miRNA 표적의 검출 감도가 증가한다. 일부 구체예에서는 2개 이상의 miRNA가 검출된다. 일부 구체예에서, 검출은 표지된 탐침의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 표지된 탐침은 형광 표지된다. 일부 구체예에서, 표지된 탐침은 FRET 검출을 위해 구성된다. 일부 구체예에서, 표지된 탐침은 이중체로 혼성화되지 않았을 때의 제1 입체 구조 및, 이중체로 혼성화되었을 때의 제2 입체 구조를 가진다. 일부 구체예에서, 표지된 탐침은 이중체로 혼성화되었을 때 증가된 형광을 나타낸다. 본 발명은 검출되는 miRNA에 한정되지 않는다. 실제로, Let-7, miR-1, miR-135, miR-15, miR-16, miR125b, miR-1d 및 miR124a를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 miRNA가 본 발명의 조성물 및 방법을 사용함으로써 검출될 수 있다.

본 발명은 또한, miRNA 표적에 상보적인 제1 영역 및 miRNA 표적에 상보적이지 않은 제2 영역을 포함하는 하나 이상의 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드; miRNA 표적의 제2 영역에 상보적인 제1 영역 및 miRNA 표적의 제2 영역에 상보적이지 않은 제2 영역을 포함하는 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드; 역전사 효소; DNA 중합효소; 탐침 올리고뉴클레오티드; 및 검출 구조를 분해할 수 있는 효소를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 검출 구조는 침입성 분해 구조를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 miRNA 표적 및 적어도 하나의 기타 RNA 표적을 검출하도록 구성된다. 일부 구체예에서, 키트는 세포 용해물에서 miRNA 표적 서열을 검출하도록 구성된다.

정의

본 발명의 원활한 이해를 위하여 하기와 같이 다수의 용어 및 어구를 정의한다:

본 명세서에서 용어 "miRNA"는 마이크로 RNA를 지칭한다. 본 명세서에서 용어 "miRNA 표적 서열"은 검출하고자 하는 miRNA(예를 들어 다른 핵산의 존재 하에)를 지칭한다. 일부 구체예에서, miRNA 표적 서열은 miRNA의 변이체이다.

본 명세서에서 용어 "RNA 검출 구조" 및 "검출 구조"는, RNA 표적, 예를 들어 miRNA 또는 siRNA에 핵산(예를 들어 올리고뉴클레오티드)이 혼성화됨에 의해 형성되는 구조를 지칭한다. 일부 구체예에서, 핵산은 단일 핵산(예를 들어 miRNA에 상동적인 작은 영역(또는 영역들)을 가진 큰 핵산)이다. 다른 구체예에서, 핵산은 2개 핵산(예를 들어 miRNA에 혼성화되어 헤어핀(예를 들어 단일 또는 이중 헤어핀) 구조를 형성하는)을 포함한다. 바람직한 구체예에서 miRNA 검출 구조는, 본 명세서에 개시된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 공지의 핵산 검출 방법을 사용하여 검출할 수 있다.

일부 구체예에서, RNA 검출 구조는 혼성화 단계에 따라 추가로 개질된다. 예를 들어 일부 구체예에서, 검출 구조의 하나 이상의 구성성분은 핵산 중합효소에 의한 연장을 위한 주형을 제공한다. 다른 구체예에서, 검출 구조의 하나 이상의 구성성분은 리가제에 접촉되어 추가의 핵산에 결찰된다.

용어 "siRNA"는 짧은 간섭 RNA를 지칭한다. 일부 구체예에서 siRNA는 이중체 또는 이중-가닥 영역을 포함하며, 여기에서 이중-가닥 영역의 각 가닥은 약 18 내지 25개 뉴클레오티드 길이이고; 이중-가닥 영역은 최소 16개, 최대 29개 염기쌍의 길이일 수 있으며, 그 길이는 안티센스 가닥에 의해 결정된다. siRNA는 종종 약 2개 내지 4개의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드를 각 가닥의 3' 말단에 포함한다. siRNA는 무척추 동물 및 척추 동물에서의 RNA 간섭의 촉발, 및 식물에서의 전사후 유전자 발현저해(posttranscriptional gene silencing) 과정 중의 서열-특이적 RNA 분해의 촉발에 있어서 중심적 중간체로서 작용하는 것으로 보인다. siRNA의 이중체 또는 이중-가닥 영역의 적어도 하나의 가닥은 표적 RNA 분자에 실질적으로 상동적이거나 실질적으로 상보적이다. 표적 RNA 분자에 상보적인 가닥은 "안티센스" 가닥이고; 표적 RNA 분자에 상동적인 가닥은 "센스" 가닥으로서 이는 또한 siRNA 안티센스 가닥에 상보적이다. 이중 가닥 영역의 한쪽 가닥과 반대쪽 가닥의 길이가 정확히 동일할 필요는 없으며, 따라서 한쪽 가닥이 반대쪽 상보적 가닥보다 적어도 1개가 적은 뉴클레오티드를 가짐으로써 반대쪽 가닥에 "버블(bubble)" 또는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않는 염기를 유발할 수 있다. 이중-가닥 영역의 한쪽 가닥은 반대쪽 가닥에 정확하게 상보적일 필요는 없으며; 따라서 그 가닥, 바람직하게는 센스 가닥은 적어도 하나의 불일치 염기쌍을 가질 수 있다.

siRNA는 또한 추가의 서열을 포함할 수 있으며; 이러한 서열의 비-한정적인 예는 이중체 영역의 2개 가닥을 연결하는 연결 서열(linking sequence), 또는 루프(loop)를 포함한다. 이 형태의 siRNA는 "si-유사 RNA", "짧은 헤어핀 siRNA"라고 지칭될 수 있으며, 여기에서 '짧은'은 "헤어핀 siRNA" 또는 siRNA의 이중체 영역에 적용된다. siRNA 내에 존재하는 추가의 서열의 비-한정적인 예는 스템(stem) 및 기타 폴딩(folding)된 구조를 포함한다. 추가의 서열의 기능은 공지일 수도 있고 미지일 수도 있으며; 이러한 기능의 비-한정적인 예는 siRNA 분자의 안정성의 증진, 또는 세포 지정 신호(cellular destination signal)의 제공을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "대상" 및 "환자"는 식물, 미생물 및 동물(예를 들어 개, 고양이, 가축 및 인간을 포함하는 포유류)을 포함하는 임의의 유기체를 지칭한다.

본 명세서에서 용어 "인베이더 에세이 시약 (INVADER assay reagent)" 또는 "침입성 분해 에세이 시약"은 표적 서열을 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 지칭하며, 이 시약은 표적 서열의 존재 하에 침입성 분해 구조를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 침입성 분해 구조의 존재를 검출하는 약제(예를 들어 분해 시약)를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 제1 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 제1 영역에 상보적인 5' 부분을 포함하고, 제2 올리고뉴클레오티드는 3' 부분 및 5' 부분을 포함하며, 5' 부분은 제1 부분에 인접하여 그 다운스트림(downstream)에 있는 표적 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 일부 구체예에서, 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 부분은 표적 핵산에 상보적이지 않은 3' 말단 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 부분은 표적 핵산에 상보적이지 않은 단일 뉴클레오티드로 구성된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드는 서로 공유적으로 결합된다(예를 들어 연결부(linker)를 통해).

일부 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 고체 지지체를 추가로 포함한다. 예를 들어 일부 구체예에서는, 에세이 시약 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 가교화(bridging) 또는 비-가교화(non-bridging)를 불문하고 제1 및/또는 제2 올리고뉴클레오티드)가 고체 지지체에 부착된다. 일부 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 완충 용액을 추가로 포함한다. 바람직한 일부 구체예에서, 완충 용액은 2가 양이온(예를 들어, Mn^{2 +} 및/또는 Mg^{2 +} 이온)의 공급원을 포함한다. 인베이더 에세이 시약을 총체적으로 이루는 개별적인 성분들(예를 들어 올리고뉴클레오티드, 효소, 완충액, 표적 핵산)을 "인베이더 에세이 시약 구성성분" 이라고 명명한다.

일부 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 제1 표적 핵산의 제1 부분의 업스트림(upstream)에 있는 표적 핵산의 제3 부분에 상보적인 제3 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 표적 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 제2 표적 핵산을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 제2 표적 핵산의 제1 영역에 상보적인 5' 부분을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 특이적 구체예에서, 제3 올리고뉴클레오티드의 3' 부분은 제2 표적 핵산에 공유적으로 연결된다. 다른 특이적 구체예에서, 제2 표적 핵산은 5' 부분을 추가로 포함하며, 여기에서 제2 표적 핵산의 5' 부분은 제3 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 어레스터(ARRESTOR) 분자(예를 들어 어레스터 올리고뉴클레오티드)를 추가로 포함한다.

모든 목적에서 그 전체 내용이 본 명세서에 참고로 도입된 문헌(Eis et al., Nature Biotechnology, 19:673-676 (2001))에 기술된 바와 같이, 각 탐침의 표적-특이적 영역에 완전히 염기-대합하고 그의 5'-플랩 영역(5'-flap region)에 부분적으로 염기-대합하는 2' O-메틸화 어레스터 올리고뉴클레오티드를 포함함으로써, 분해되지 않은 탐침을 격리하여 2차 반응에서 X-구조의 형성을 방지한다.

일부 바람직한 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 핵산 분해 산물을 검출하는 시약을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 인베이더 에세이 시약 내의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 표지를 포함한다. 바람직한 일부 구체예에서는, 제1 올리고뉴클레오티드가 표지를 포함한다. 바람직한 다른 구체예에서는, 제3 올리고뉴클레오티드가 표지를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 시약은 형광공명 에너지 전이(FRET: fluorescence resonance energy transfer) 효과를 발생시키는 부위로 표지된 제1 및/또는 제3 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

일부 구체예에서는, 하나 이상의 인베이더 에세이 시약이 미리 분주된 체제(predispensed format)(즉, 재측정 또는 재분주 없이 절차의 단계에서 사용하기 위해 미리 측정된)로 제공될 수 있다. 일부 구체예에서는, 선택된 인베이더 에세이 시약 구성성분들을 혼합하여 함께 미리 분주한다. 바람직한 구체예에서, 미리 분주된 에세이 시약 구성성분들은 반응 용기(반응 시험관 또는 예를 들어 마이크로타이터 플레이터(microtiter plate)의 웰을 포함하나 이에 한정되지 않음) 내에 미리 분주되어 제공된다. 특히 바람직한 구체예에서, 미리 분주된 인베이더 에세이 시약 구성성분은 반응 용기 내에 마른 상태이다(예를 들어 건조되거나 동결건조된).

일부 구체예에서, 인베이더 에세이 시약은 키트로서 제공된다. 본 명세서에서 용어 "키트"는 재료를 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 반응 에세이와 관련하여, 이러한 전달 시스템은 반응 시약(예를 들어 적절한 용기 내의 올리고뉴클레오티드, 효소 등) 및/또는 보조 재료(예를 들어 완충액, 에세이 수행에 필요한 서면 사용 설명서 등)를 한 위치에서 다른 위치로 보관, 수송, 또는 전달할 수 있도록 하는 시스템을 포함한다. 예를 들어 키트는 관련된 반응 시약 및/또는 보조 재료를 담은 하나 이상의 동봉물(예를 들어 상자)을 포함한다. 본 명세서에서 용어 "분할 키트(fragmented kit)"는 전체 키트 구성성분의 하위 부분(subportion)을 각각 포함하는 2개 이상의 독립된 용기를 포함하는 전달 시스템을 지칭한다. 용기들은 의도된 수령인에게 함께 또는 독립적으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 용기는 에세이에 사용할 효소를 포함하고, 제2 용기는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어 "분할 키트"는 연방 식품, 의약품 및 화장품법의 섹션 520(e)에 의해 규제되는 분석물 특이적 시약(ASR: Analyte specific reagent)을 함유하는 키트를 포함하는 의미로 사용되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사실상, 전체 키트 구성성분의 하위 부분을 각각 포함하는 2개 이상의 독립적인 용기를 포함하는 모든 전달 시스템이 용어 "분할 키트"에 포함된다. 반면에, "배합 키트(combined kit)"는 반응 에세이의 모든 구성성분을 단일 용기 내에 포함하는 전달 시스템을 지칭한다(예를 들어 목적하는 각 구성성분을 하나의 상자 내에 담음). 용어 "키트"는 분할 및 배합 키트 양자 모두를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 실시에 필요한 하나 이상의 구성성분을 포함하는 인베이더 에세이 시약 키트를 제공한다. 예를 들어 본 발명은 인베이더 에세이를 실시하기 위해 필요한 효소 및/또는 반응 구성성분의 보관 또는 전달을 위한 키트를 제공한다. 키트는 에세이를 위해 필요하거나 바람직한 임의의 모든 구성성분을 포함할 수 있으며, 여기에는 시약 자체, 완충액, 제어 시약(예를 들어 조직 시료, 양성 및 음성 대조군 표적 올리고뉴클레오티드 등), 고체 지지체, 표지, 서면 및/또는 도면 사용 설명서 및 제품 정보, 저해제, 표지화 및/또는 검출 시약, 포장 환경 제어(예를 들어 얼음, 제습제 등) 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 일부 구체예에서, 키트는 필요한 구성성분의 하위-세트(sub-set)를 제공하며, 여기에서 나머지 구성성분은 사용자가 조달할 것을 전제한다. 일부 구체예에서, 키트는 2개 이상의 독립적인 용기를 포함하며, 여기에서 각 용기는 전달될 구성성분의 하위 세트를 담는다. 예를 들어, 제1 용기(예를 들어 상자)는 효소(예를 들어 적합한 보관 완충액 및 용기 내의 구조 특이적 분해 효소)를 포함할 수 있고, 제2 상자는 올리고뉴클레오티드(예를 들어 인베이더 올리고뉴클레오티드, 탐침 올리고뉴클레오티드, 대조군 표적 올리고뉴클레오티드 등)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "표지"는 검출 가능한(바람직하게는 정량분석이 가능한) 효과를 제공하기 위하여 사용될 수 있고 핵산 또는 단백질에 부착될 수 있는 임의의 원자 또는 분자를 지칭한다. 표지는 염료; ³²P와 같은 방사성 표지; 바이오틴과 같은 결합 부위: 디곡스제닌(digoxgenin)과 같은 부착소(hapten); 발광성(luminogenic), 인광성(phosphorescent) 또는 형광성(fluorogenic) 부위; 질량 태그(mass tags); 및 형광공명 에너지 전이(FRET)에 의해 방출 스펙트럼을 억제 또는 이동시킬 수 있는 부위와 조합하거나 단독으로 사용되는 형광 염료를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 표지는 형광, 방사능, 비색법, 중량측정법, X-선 회절 또는 흡수, 자기학(magnetism), 효소 활성, 질량 특징 또는 질량에 의해 영향을 받는 거동(예를 들어 MALDI 비행시간형 질량 분석기(time-of-flight mass spectrometry); 형광 편광(fluorescence polarization) 등에 의해 검출되는 신호를 제공할 수 있다. 표지는 전하를 띈 부위(양성 또는 음성 전하)이거나, 대안적으로 중성 전하일 수 있다. 표지를 포함하는 서열이 검출 가능한 한, 표지는 핵산 또는 단백질 서열을 포함하거나 이로써 구성될 수 있다.

본 명세서에서 신호와 관련하여 용어 "독특한(distinct)"은, 예를 들어 형광 방출 파장, 색상, 흡광도, 질량, 크기, 형광 편광 특성, 전하, 등과 같은 분광학적 특성, 또는 화학 시약, 효소, 항체 등과 같은 다른 부위와의 상호작용 능력에 의해 다른 것과 구별될 수 있는 신호를 지칭한다.

본 명세서에서 용어 "상보적인" 또는 "상보성"은 염기-대합 규칙에 의해 관련되는 폴리뉴클레오티드(즉, 올리고뉴클레오티드 또는 표적 핵산과 같은 뉴클레오티드 서열)에 관해 사용된다. 예를 들어, 서열 "5'-A-G-T-3'"는 서열 "3'-T-C-A-5'"에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있으며, 이 경우에는 핵산의 염기 중 일부만이 염기 대합 규칙에 따라 일치된다. 또는, 핵산 사이의 "완전" 또는 "전체적" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화 효율 및 강도에 중대한 효과를 가진다. 이는 증폭 반응 및 핵산 간의 결합에 의존하는 검출 방법에 있어서 특히 중요하다. 각각의 용어는 또한, 특히 폴리뉴클레오티드에 있어서 개별적인 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 내의 특정 뉴클레오티드는 다른 핵산 가닥 내의 뉴클레오티드에 대한 그의 상보성의 유무에 관하여, 올리고뉴클레오티드의 나머지 부분과 핵산 가닥 사이의 상보성과 대조 또는 비교하여 언급될 수 있다.

용어 "상동성" 및 "상동적인"은 동일성의 정도를 지칭한다. 부분적 상동성 또는 완전 상동성이 있을 수 있다. 부분적으로 상동적인 서열은 다른 서열과 100% 미만으로 동일한 서열이다.

본 명세서에서 용어 "혼성화"는 상보적인 핵산의 대합과 관련하여 사용된다. 혼성화 및 혼성화 강도(즉 핵산 사이의 연합 강도)는 핵산 사이의 상보성 정도, 관련 조건의 엄격성(stringency), 및 형성된 혼성물(hybrid)의 T_m과 같은 요인들에 의해 영향을 받는다. "혼성화" 방법은 하나의 핵산과 다른 상보적 핵산, 즉 상보적 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산의 어닐링(annealing)을 포함한다. 상보적 서열을 포함하는 두 가지 핵산 중합체가 서로를 인식하고 염기 대합 상호작용을 통해 어닐링하는 능력은 잘 이해되어 있는 현상이다. "혼성화" 과정의 초기 관찰(Marmur and Lane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:453 (1960) 및 Doty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:461 (1960))은 후속의 연구에 의해 진보하여 현대 생물학의 필수 도구가 되었다.

본 명세서에서 핵산 서열의 상보는, 한 서열의 5' 말단이 다른 서열의 3' 말단과 대합하도록 핵산 서열을 배열했을 때 "역평행 연합(antiparallel association)"을 하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 천연 핵산에서 일반적으로 발견되지 않는 염기도 본 발명의 핵산에 포함될 수 있으며, 이는 예를 들어 이노신 및 7-데아자구아닌을 포함한다. 상보성이 완벽할 필요는 없으며; 안정한 이중체가 불일치 염기쌍 또는 쌍을 이루지 않는 염기를 포함할 수 있다. 핵산 기술 분야의 당업자는, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 염기 조성 및 서열, 이온 세기 및 불일치 염기쌍의 발생률과 같은 다수의 변수를 고려하여 실험적으로 이중체의 안정성을 결정할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "T_m"은 "융해 온도"와 관련하여 사용된다. 융해 온도는 이중-가닥 핵산 분자의 집단이 단일 가닥으로 절반 해리되는 온도이다. 핵산의 T_m을 계산하는 몇 개의 수학식이 당업계에 주지되어 있다. 표준적인 참조 문헌에 나타나듯이, T_m 수치의 간단한 산정은 핵산이 1 M NaCl 수용액 중에 있을 때 수학식: T_m = 81.5 + 0.41(% G + C)에 의해 계산된다(예를 들어, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985) 참조). 다른 참조 문헌(예를 들어, Allawi and SantaLucia, Biochemistry 36: 10581-94 (1997))은 T_m 계산에 서열 특징과 더불어 구조 및 환경적 특징까지 고려하는 좀더 복잡한 계산을 포함한다.

용어 "유전자"는, 비-암호화 기능을 가진 RNA(예를 들어 리보솜 RNA 또는 전이 RNA), 폴리펩티드 또는 전구체의 생산을 위해 필요한 제어 및 암호화 서열을 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. RNA 또는 폴리펩티드는 전체 길이 암호화 서열 또는, 목적하는 활성 또는 기능이 보유되어 있는 한, 암호화 서열의 임의의 부분에 의해 암호화될 수 있다.

용어 "야생형(wild-type)"은, 천연적인 공급원으로부터 단리된 유전자 또는 유전자 산물의 특징을 가진 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 야생형 유전자는 개체군 내에서 가장 높은 빈도로 관찰되는 것이므로, 유전자의 "정상' 또는 "야생형" 형태라고 임의로 지명한다. 반면에, 용어 "개질된(modified)", "돌연변이체" 또는 "다형성의"는, 야생형 유전자 또는 유전자 산물에 비교할 때 서열 및/또는 기능적 특성에 있어서의 개질(즉, 변형된 특징)을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 천연적인 돌연변이체가 단리될 수 있으며; 이들은 야생형 유전자 또는 유전자 산물에 비교할 때 변경된 특징을 가진다는 사실에 의해 동정됨을 유의한다.

본 명세서에서 용어 "재조합 DNA 벡터"는 목적하는 이종 기원 서열을 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 비록 이 용어가 발현되는 서열 또는 발현 산물을 암호화하는 서열에 한정되어 사용되지는 않지만, 일부 구체예에서 이종 기원 서열은 암호화 서열 및 숙주 유기체 내에서의 암호화 서열의 복제 또는 특정 숙주 유기체 내에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현을 위해 필요한 적절한 DNA 서열이다. 원핵생물에서 발현에 필요한 DNA 서열은 프로모터(promoter), 임의로 오퍼레이터(operator) 서열, 리보솜 결합 자리 및 가능한 다른 서열을 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서(enhancer)를 사용하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 5개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 10-15개 뉴클레오티드, 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 15 내지 30개 뉴클레오티드를 포함하는 분자로서 정의된다. 정확한 크기는 여러 요인에 의해 결정되며, 이는 다시 올리고뉴클레오티드의 궁극적인 기능 또는 용도에 따라 결정된다. 올리고뉴클레오티드는 임의의 방식, 예를 들어 화학적 합성, DNA 복제, 역전사, PCR, 또는 이들의 조합에 의해 생성될 수 있다.

한 모노뉴클레오티드 오탄당 환의 5' 포스페이트가 한쪽 방향으로 그에 인접하는 것의 3' 산소에 포스포디에스테르 결합에 의해 부착되는 방식으로 모노뉴클레오티드를 반응시켜 올리고뉴클레오티드가 만들어지므로, 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 오탄당의 3' 산소에 연결되어 있지 않은 올리고뉴클레오티드의 말단을 "5' 말단"이라 지칭하고, 3' 산소가 후속의 모노뉴클레오티드 오탄당 환의 5' 포스페이트에 연결되어 있지 않은 올리고뉴클레오티드의 말단을 "3' 말단"이라 지칭한다. 본 명세서에서 핵산 서열은, 더 큰 올리고뉴클레오티드의 내부에 있을 경우에도 5' 및 3' 말단을 가진 것으로 표현할 수 있다. 핵산 가닥을 따라 5'에서 3' 방향으로 움직일 때 제1 영역의 3' 말단이 제2 영역의 5' 말단의 앞에 있을 경우, 핵산 가닥을 따라 제1 영역은 다른 영역의 업스트림에 있다고 한다.

2개의 상이한 비-중첩(non-overlapping) 올리고뉴클레오티드가 동일한 선형 상보적 핵산 서열의 다른 영역에 어닐링되고, 한 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 다른 것의 5' 말단을 향하고 있을 경우, 전자를 "업스트림" 올리고뉴클레오티드라 하고 후자를 "다운스트림" 올리고뉴클레오티드라 할 수 있다. 마찬가지로, 2개의 중첩되는 올리고뉴클레오티드가 동일한 선형 상보적 핵산 서열에 혼성화될 경우, 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 업스트림에 있도록 위치하고, 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 업스트림에 있다면, 제1 올리고뉴클레오티드를 "업스트림" 올리고뉴클레오티드라 칭하고 제2 올리고뉴클레오티드는 "다운스트림" 올리고뉴클레오티드라 칭할 수 있다.

용어 "프라이머"는 프라이머 연장이 개시되는 조건 하에 놓였을 경우 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 "프라이머"는 정제된 제한효소 분해물(restriction digest)에서와 같이 천연적으로 존재할 수 있고 합성에 의해 생산될 수도 있다.

프라이머는 주형의 특이적 서열 가닥에 "실질적으로" 상보적이도록 선택된다. 프라이머 연장이 일어나려면 프라이머가 주형 가닥에 혼성화되기에 충분할 만큼 상보적이어야 한다. 프라이머 서열이 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들어, 비-상보적 뉴클레오티드 단편이 프라이머의 5' 말단에 부착되고 나머지 프라이머 서열은 가닥에 실질적으로 상보적일 수 있다. 프라이머 서열이 혼성화될 주형의 서열에 대해 충분한 상보성을 가짐으로써 프라이머의 연장 산물 합성을 위한 주형 프라이머 복합체를 형성하는 한, 비-상보적 염기 또는 더 긴 서열이 프라이머 내에 산재될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "분해 구조"는, 적어도 하나의 탐침 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산의 상호작용에 의해 형성되고, 이중체를 포함하는 구조를 형성하며, 생성된 구조가 효소를 포함하나 이에 한정되지 않는 분해 수단에 의해 분해될 수 있는 구조를 지칭한다. 분해 구조는 분해 수단에 의한 특이적 분해의 기질이며, 이는 2차 구조에 무관하게 핵산 분자를 분해하는(즉, 이중체 구조의 형성을 필요로 하지 않는) 포스포디에스테라제와 같은 약제에 의한 비-특이적 분해의 기질인 핵산 분자와 대조된다.

본 명세서에서 용어 "분해 수단" 또는 "분해 약제"는, 분해 구조를 분해할 수 있는 임의의 수단을 지칭하며, 이는 효소를 포함하나 이에 한정되지 않는다. "구조-특이적 뉴클레아제" 또는 "구조-특이적 효소"는 핵산 분자의 특이적 2차 구조를 인식하여 이들 구조를 분해하는 효소들이다. 본 발명의 분해 수단은 분해 구조의 형성에 반응하여 핵산 분자를 분해하며; 분해 수단이 분해 구조 내의 어떤 특정 위치에서 분해 구조를 분해할 필요는 없다.

분해 수단은 다양한 공급원으로부터 제공되는 뉴클레아제 활성, 예를 들어 클레아바제(CLEAVASE) 효소(Third Wave Technologies, Madison, WI), FEN-1 엔도뉴클레아제(예를 들어 고세균(archaeabacteria)으로부터 유래하는 FEN-1 엔도뉴클레아제, 및 RAD2 및 XPG 단백질), Taq DNA 중합효소 및 E. coli DNA 중합효소 I을 포함할 수 있다. 분해 수단은 5' 뉴클레아제 활성을 가진 효소(예를 들어, Taq DNA 중합효소(DNAP), E. coli DNA 중합효소 I)를 포함할 수 있다. 분해 수단은 또한, 5' 뉴클레아제 활성을 가지나 합성 활성이 없는 개질된 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법 및 키트에 사용하기에 적합한 분해 수단의 예는 미국 특허 제5,614,402호; 제5,795,763호; 제5,843,669호; PCT 출원 제WO 98/23774호; 제WO 02/070755A2호; 및 제WO0190337A2호에 제공되며, 이들 각각은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

용어 "열안정성"은, 5' 뉴클레아제와 같은 효소와 관련하여 사용될 경우에, 효소가 상승된 온도, 즉 약 55 ℃ 이상에서(예를 들어 60 ℃, 65 ℃, 70 ℃, 75 ℃, 80 ℃, 85 ℃ 또는 90 ℃를 포함하나 이에 한정되지 않음) 기능성 또는 활성임(즉, 촉매작용을 수행할 수 있음)을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "분해 산물"은 분해 수단과 분해 구조의 반응(즉, 분해 수단으로 분해 구조를 처리함)에 의해 생성된 산물을 지칭한다.

용어 "비-표적 분해 산물"은 표적 핵산으로부터 유래하지 않는 분해 반응의 산물을 지칭한다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 일부 방법에서, 분해 구조의 분해는 일반적으로 탐침 올리고뉴클레오티드 내에서 일어난다. 이러한 표적 핵산-의존성 분해에 의해 생성된 탐침 올리고뉴클레오티드의 단편이 "비-표적 분해 산물"이다.

인베이더 에세이 반응과 관련하여 용어 "탐침 올리고뉴클레오티드"는, 인베이더 올리고뉴클레오티드의 존재 또는 부재 하에 표적 핵산과 상호작용하여 분해 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 표적 핵산에 어닐링 처리 되었을 경우, 탐침 올리고뉴클레오티드 및 표적은 분해 구조를 형성하고 탐침 올리고뉴클레오티드 내에서 분해가 일어난다.

용어 "인베이더 올리고뉴클레오티드"는, 탐침 및 표적 핵산 사이의 혼성화 영역 부근의 위치에서 표적 핵산에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 여기에서 인베이더 올리고뉴클레오티드는 탐침 및 표적 사이의 혼성화 영역과 중첩되는 부분(예를 들어 화학적 부위, 또는 뉴클레오티드-표적에 대한 상보성을 불문함)을 포함한다. 일부 구체예에서, 인베이더 올리고뉴클레오티드는 탐침 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는 서열과 실질적으로 동일한 서열을 그의 3' 말단에 포함한다.

용어 "어레스터 분자"는, 하나 이상의 반응 구성성분이 후속의 활동 또는 반응에 참여하지 못하도록 중단시키기 위해 침입성 분해 반응에 첨가되거나 포함되는 약제를 지칭한다. 이는 일부 반응 구성성분을 격리 또는 비활성화함으로써(예를 들어 핵산 구성성분에 결합 또는 염기-대합하거나, 단백질 구성성분에 결합함으로써) 실행될 수 있다. 용어 "어레스터 올리고뉴클레오티드"는, 임의의 반응의 하나 이상의 양상(예를 들어 1차 반응 및/또는 임의의 후속 반응 또는 활동; 어레스터 올리고뉴클레오티드는 임의의 특정 반응 또는 반응 단계에 한정되지 않음)을 중단 또는 정지시키기 위하여 침입성 분해 반응에 포함된 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이는 일부 반응 구성성분을 격리시킴으로써(예를 들어 다른 핵산과의 염기-대합, 또는 단백질 구성성분과의 결합) 실행될 수 있다. 그러나, 이 용어를 반응 구성성분이 격리되는 상황에만 한정하고자 하는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "카세트(cassette)"는, 인베이더 에세이에서 탐침 올리고뉴클레오티드의 분해에 반응하여 검출 가능한 신호를 발생하도록 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 조합을 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 카세트는 탐침 올리고뉴클레오티드의 분해에 의한 비-표적 분해 산물에 혼성화되어 제2 침입성 분해 구조를 형성함으로써, 이후에 카세트가 분해된다.

본 발명의 바람직한 일부 구체예에서, 2차 분해 반응은 FRET 카세트의 사용을 포함한다. 이러한 분자는 제2 표적(2차 반응 표적(Secondary Reaction Target) 또는 SRT) 및 FRET 표지된 분해가능 서열을 모두 제공함으로써, 일련의 침입성 분해 반응의 균질한 검출(즉, 산물 분리 또는 반응 후의 다른 조작이 없는)을 가능하게 한다. 다른 바람직한 구체예에서는, FRET 탐침 및 합성 표적이 별개의 올리고뉴클레오티드로서 제공되는 2차 반응 시스템을 사용한다. 1차 반응으로부터 분해된 5'-플랩은 2차 반응에서 침입성 올리고뉴클레오티드로서 작용하여 적절한 2차-반응 표적(SRT)에 결합한다.

일부 구체예에서, 카세트는 헤어핀 부분(즉, 반응 조건 하에서 카세트 올리고뉴클레오티드의 한 부분이 동일한 올리고뉴클레오티드의 제2 부분에 혼성화되어 이중체를 형성하는 영역)을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 카세트는 반응 조건 하에서 이중체를 형성할 수 있는 상보적 부분을 포함하는 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 카세트는 표지를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 카세트는 형광공명 에너지 전이(FRET) 효과를 발생시키는 표지 부위를 포함한다.

핵산 기질과 관련하여 사용되는 용어 "실질적인 단일-가닥"은, 기질 분자가 주로 단일 가닥의 핵산으로서 존재함을 의미하며, 이는 가닥 사이의 염기 대합 상호작용에 의해 서로 결합되어 있는 2 가닥의 핵산으로서 존재하는 이중-가닥 기질과 대조된다.

본 명세서에서 어구 "비-증폭 올리고뉴클레오티드 검출 에세이"는, 표적 서열의 카피를 만들지 않으면서 증폭(예를 들어 PCR에 의해)되지 않은 특정 표적 서열(예를 들어 miRNA, SNP, 반복 서열 등)의 존재 또는 부재를 검출하도록 구성된 검출 에세이를 지칭한다. "비-증폭 올리고뉴클레오티드 검출 에세이"는, 예를 들어, 표적 서열이 복제되지 않는 한, 표적 서열 내의 특정 표적 서열 또는 다형성의 존재 또는 부재를 나타내기 위해 사용되는 신호를 증폭할 수 있다.

본 명세서에서 어구 "비-증폭 올리고뉴클레오티드 검출 에세이"는, 표적 서열의 카피를 만들지 않으면서 표적 서열(예를 들어 miRNA, SNP, 반복 서열 등)의 존재 또는 부재를 검출하도록 구성된 검출 에세이를 지칭한다. "비-증폭 올리고뉴클레오티드 검출 에세이"는, 예를 들어, 표적 서열이 복제되지 않는 한, 표적 서열 내의 특정 표적 서열 또는 다형성의 존재 또는 부재를 나타내기 위해 사용되는 신호를 증폭할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "서열 변이(sequence variation)"는, 2개 핵산 사이의 핵산 서열의 차이를 지칭한다. 예를 들어, 야생형 구조 유전자 및 이 야생형 구조 유전자의 돌연변이 형태는 단일 염기 치환 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입에 의해 서열상 변이될 수 있다. 이들 2개 형태의 구조 유전자는 서로 서열상 변이되었다고 표현한다. 구조 유전자의 제2 돌연변이 형태가 존재할 수 있다. 이러한 제2 돌연변이 형태는 야생형 유전자 및 유전자의 제1 돌연변이 형태 양자 모두로부터 서열상 변이되었다고 표현한다.

본 명세서에서 용어 "해리(liberating)"는, 올리고뉴클레오티드와 같은 큰 핵산 단편으로부터 예를 들어 5' 뉴클레아제의 작용에 의해 핵산 단편이 유리되어, 유리된 단편이 나머지 올리고뉴클레오티드에 더 이상 공유적으로 부착되어 있지 않음을 지칭한다.

본 명세서에서 용어 "K_m"은 효소의 미카엘리스-멘텐 상수(Michaelis-Menten constant)를 지칭하며, 주어진 효소가 효소 촉매 반응에서 최대 속도의 절반을 나타내는 특이적 기질의 농도로서 정의된다.

본 명세서에서 용어 "뉴클레오티드 유사체"는 개질되거나 비-천연적인 뉴클레오티드를 지칭하며, 적층 상호작용(stacking interaction)이 변경된 유사체, 예를 들어 7-데아자 퓨린(즉, 7-데아자-dATP 및 7-데아자-dGTP); 대안적 수소 결합 구성을 가진 염기 유사체(예를 들어, Iso-C 및 Iso-G 및 원용에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,001,983호(S. Benner)에 기술된 기타 비-표준 염기쌍); 비-수소 결합 유사체(예를 들어, 각각 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌(B.A. Schweitzer and E.T. Kool, J. Org. Chem., 1994, 59, 7238-7242, B.A. Schweitzer and E.T. Kool, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 1863-1872)에 기술된 2,4-디플루오로톨루엔과 같은 비극성, 방향족 뉴클레오시드 유사체); 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤과 같은 "보편적" 염기; 및 보편적 퓨린 및 피리미딘(예를 들어, 각각 "K" 및 "P" 뉴클레오티드; P. Kong, et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 10373-10383, P. Kong et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5149-5152)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 뉴클레오티드 유사체는 디데옥시 뉴클레오티드 및 2'-O-메틸 뉴클레오티드와 같이 당 부위가 개질된 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드 유사체는 리보뉴클레오티드와 더불어 데옥시리보뉴클레오티드의 개질 형태를 포함한다.

용어 "다형성 유전자좌(polymorphic locus)"는, 개체군의 구성원 사이에 변이를 나타내는 개체군에 존재하는 유전자좌이다(예를 들어 가장 공통적인 대립유전자가 0.95 미만의 빈도를 가진다). 반면에, "단형성 유전자좌(monomorphic locus)"는 개체군의 구성원 사이에 변이가 없거나 거의 없는 유전자좌이다(일반적으로 개체군의 유전자 풀(pool)에서 가장 공통적인 대립유전자가 0.95의 빈도를 초과하는 유전자좌에 해당한다).

본 명세서에서 용어 "미생물"은 육안으로 관찰할 수 없을 만큼 작은 유기체를 의미하며, 박테리아, 바이러스, 원생동물, 진균류 및 섬모충을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

용어 "미생물 유전자 서열"은 미생물로부터 유래하는 유전자 서열을 지칭한다.

용어 "박테리아"는 진정세균 및 고세균 종을 포함하는 임의의 박테리아 종을 지칭한다.

용어 "바이러스"는 자율 복제를 할 수 없는(즉, 복제를 위해서는 숙주 세포의 기전을 사용해야 하는) 절대(obligate), 극미소(ultramicroscopic), 세포내 기생균을 지칭한다.

본 명세서 및 청구 범위에서 용어 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다.

생물학적 시료는 인간을 포함하는 동물, 유체, 고체(예를 들어 대변) 또는 조직일 수 있으며, 액체 및 고체 식품 및 사료 제품(feed product) 및 유제품 품목, 야채, 식육 및 식육 부산물과 같은 성분, 및 폐기물일 수도 있다. 생물학적 시료는 야생화(feral) 또는 야생 동물을 비롯하여 다양한 계열의 모든 가축으로부터 수득할 수 있으며, 이들 동물은 유제류, 곰, 물고기, 토끼목의 포유류, 설치류 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

환경적 시료는, 식품 및 유제품 가공 기기, 기구, 장비, 용구, 일회용 및 비-일회용 품목과 함께, 표면 소재(surface matter), 토양, 물 및 산업적 시료와 같은 환경적 재료를 포함한다. 이들 예가 본 발명에 적용할 수 있는 시료 유형을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

용어 "표적 핵산의 공급원"은 핵산(RNA(예를 들어 miRNA) 또는 DNA)을 포함하는 임의의 시료를 지칭한다. 표적 핵산의 특히 바람직한 공급원은, 혈액, 타액, 뇌척수액, 늑막액, 유액, 림프액, 객담 및 정액을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

올리고뉴클레오티드가 다른 올리고뉴클레오티드(또는 표적 핵산 서열)보다 높은 몰 농도로 존재할 경우, 그 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드(또는 표적 핵산 서열)에 비해 "과량"으로 존재한다고 표현한다. 탐침 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드가 상보적인 표적 핵산 서열의 농도에 비해 과량으로 분해 반응 내에 존재할 경우, 그 반응은 존재하는 표적 핵산의 양을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 통상적으로, 과량으로 존재할 경우, 탐침 올리고뉴클레오티드는 적어도 100배 몰 과량으로 존재하며; 표적 핵산 서열이 약 10 fmole 이하로 존재할 경우, 통상 적어도 1 pmole의 각 탐침 올리고뉴클레오티드가 사용된다.

제1 및 제2 표적 핵산을 "함유할 것으로 추정되는" 시료는 표적 핵산 분자 중 하나 또는 양자 모두를 함유하거나 어느 것도 함유하지 않을 수 있다.

본 명세서에서 용어 "반응물"은 가장 광범위한 의미로 사용된다. 반응물은 예를 들어, 효소적 반응물, 화학적 반응물 또는 광선(예를 들어 자외선, 특히 단파장 자외선은 올리고뉴클레오티드 쇄를 파괴하는 것으로 알려져 있음)을 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오티드와 반응하여 올리고뉴클레오티드를 단축(예를 들어 분해)하거나 연장할 수 있는 임의의 약제는 용어 "반응물"에 포함된다.

본 명세서에서 용어 "정제된" 또는 "정제함"은 시료로부터 오염물질을 제거함을 지칭한다. 예를 들어 일부 구체예에서, 재조합 클레아바제 뉴클레아제는 박테리아 숙주 세포에서 발현되고, 숙주 세포 단백질을 제거함으로써 뉴클레아제가 정제되며; 따라서 이들 재조합 뉴클레아제의 백분율은 시료 내에서 증가한다.

본 명세서에서 단백질과 관련하여 용어 "부분"("주어진 단백질의 부분"에서와 같이)은 그 단백질의 단편을 지칭한다. 단편의 크기는 4개 아미노산 잔기 내지 전체 아미노산 서열 빼기 1 아미노산의 범위(예를 들어 4, 5, 6, ..., n-1)일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편 또는 부분을 지칭하며, 단일 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 의미할 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 마찬가지로 본 명세서에서 "아미노산 서열"은 펩티드 또는 단백질 서열을 지칭한다.

본 명세서에서 용어 "정제된" 또는 "실질적으로 정제된"은, 천연 환경으로부터 격리되어 단리 또는 분리되고, 천연적으로 연계된 다른 구성성분이 적어도 60%, 바람직하게는 75%, 가장 바람직하게는 90% 제거된 분자, 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서 "단리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "단리된 올리고뉴클레오티드"는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드이다.

본 명세서에서 용어 "핵산의 연속적인 가닥"은, 닉(nick) 또는 다른 중단이 없이 연속적인 공유결합으로 연결된 골격 구조를 가진 핵산 가닥을 의미한다. 각 뉴클레오티드의 염기 부분의 배열, 염기-대합 여부, 단일-가닥 또는 불일치는 연속적 가닥의 정의 요소가 아니다. 연속적 가닥의 골격은 개질되지 않은 천연적 핵산에서 발견되는 리보오스-포스페이트 또는 데옥시리보오스-포스페이트 조성물에 한정되지 않는다. 본 발명의 핵산은 골격의 구조에 있어서 개질을 포함할 수 있으며, 이는 포스포로티오에이트 잔기, 포스포네이트 잔기, 2' 치환된 리보오스 잔기(예를 들어 2'-O-메틸 리보오스) 및 대안적 당(예를 들어 아라비노오스)을 포함하는 잔기를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "연속적 이중체"은 이중체 내에서 염기쌍의 진행에 있어서 중단이 없는(즉, 연속적 이중체 영역의 범위 내에서 갭(gap), 중배(bulge) 또는 불일치에 순응하기 위해 이중체 상의 염기쌍이 왜곡되지 않는) 이중 가닥 핵산의 영역을 지칭한다. 본 명세서에서 상기 용어는 이중체 내의 염기쌍의 배열만을 지칭하는 것으로서, 핵산 가닥의 골격 부분에서의 연속성을 의미하지는 않는다. 중단되지 않는 염기 대합을 가졌으나 한쪽 또는 양쪽 가닥에 닉이 있는 이중체 핵산은 연속적 이중체의 정의 내에 포함된다.

용어 "이중체"는, 한쪽 가닥 상의 뉴클레오티드 염기 부분이 제2 가닥 상에 배열된 상보적 염기에 수소 결합을 통해 결합된 핵산의 상태를 지칭한다. 이중체 형태를 취하는 조건은 핵산의 염기 상태에 영향을 미친다. 염기 대합에 의해 핵산의 가닥들은 또한 일반적으로 큰 홈(major groove) 및 작은 홈(minor groove)을 가진 이중 나선 3차 구조를 취한다. 나선형 형태를 취하는 것은 이중체가 되는 활성에 내재되어 있다.

용어 "주형"은, 주형-의존성 핵산 중합효소의 활성을 통해 뉴클레오시드 트리포스페이트로부터 상보적 카피가 그 위에 구축되는 핵산의 가닥을 지칭한다. 이중체 내에서 주형 가닥은 관용적으로 "하단(bottom)" 가닥이라고 묘사 및 표현된다. 마찬가지로, 비-주형가닥은 종종 "상단(top)" 가닥이라고 묘사 및 표현된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 핵산 분자(예를 들어 RNA(예를 들어 마이크로 RNA(miRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같이 작은 RNA) 및 기타 짧은 핵산 분자)의 검출 및 특성조사를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 miRNA 발현의 검출, 특성조사 및 정량분석 방법을 제공한다. 일부 구체예에서 본 발명은, 검출을 보조하기 위하여 miRNA에 핵산을 첨가함을 특징으로 하여 miRNA 발현을 검출하는 방법을 제공한다. 생성된 "miRNA 검출 구조"는 본 명세서에 개시된 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 검출된다. 하기의 설명은 miRNA의 검출 및 정량분석에 초점을 두고 있으나, 본 발명은 다른 짧은 핵산 분자(예를 들어, 길이가 50, 40, 30 또는 20 뉴클레오티드 미만인 DNA 및 RNA)에도 유용함이 이해되어야 한다.

miRNA를 예시로 하여 다양한 구체예들이 하기와 같이 설명된다. 그러나, 본 방법은 다른 작은 핵산 분자에도 적용될 수 있음이 이해되어야 한다.

I. miRNA 검출 구조의 형성

일부 구체예에서, 본 발명은 miRNA의 검출을 보조하기 위하여 miRNA 검출 구조를 생성시키는 방법을 제공한다. miRNA는 크기가 작으므로(약 21 뉴클레오티드(예를 들어 18-25 뉴클레오티드 정도)) 표준 혼성화 방법을 사용해서는 검출하기 어렵다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 검출 구조를 생성시키기 위하여 miRNA에 핵산 분자를 첨가함(예를 들어 혼성화, 연장, 또는 결찰에 의해)을 특징으로 한다. 이러한 검출 구조는 임의의 적합한 방법을 사용하여 검출할 수 있다.

한 특정 구체예에서는, miRNA의 검출을 위하여 도 2에 기술된 검출 구조가 생성된다. 이 구체예에서는 2개 올리고뉴클레오티드를 miRNA에 어닐링하여 이중 루프 또는 "아령"형 구조를 형성시킨다. 아령 구조는 miRNA의 말단들을 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 영역으로 연장함으로써 이중-가닥 핵산의 더 큰 영역을 만든다. 일부 구체예에서, miRNA의 각 말단은 2 내지 5개 뉴클레오티드만큼 연장된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 말단은 miRNA에 혼성화되지 않는 추가의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 추가 서열은 침입성 분해 구조(예를 들어 인베이더 에세이 침입성 분해 구조)를 형성한다. 일부 구체예에서, 침입성 분해 구조는 인베이더 에세이에 의해 검출된다(예를 들어, 하기 설명 참조). 예를 들어 일부 구체예에서는, 실시예 18에 기술된 올리고뉴클레오티드(예를 들어 도 31 참조)를 이용하여 암과 연계된 miRNA(예를 들어 인베이더 에세이에 의해 검출될 수 있는 침입성 분해 구조를 형성하는)를 검출한다.

다른 구체예에서는, miRNA의 검출을 위해 도 3에 기술된 검출 구조가 생성된다. 이 구체예에서는 하나의 올리고뉴클레오티드가 miRNA에 어닐링되어 아치형 구조를 생성한다. miRNA는 올리고뉴클레오티드의 말단들을 miRNA가 없는 경우에 비해 더 높은 효율로 한 곳에 맺어준다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 말단들은 miRNA를 넘어서 연장되며 miRNA에 혼성화되지 않는 추가의 서열들을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 추가 서열들은 침입성 분해 구조(예를 들어 인베이더 에세이 침입성 분해 구조)를 형성한다. 일부 구체예에서, 침입성 분해 구조는 INVDAER 에세이(예를 들어 하기 설명 참조)에 의해 검출된다. 다른 구체예에서는, 인베이더 에세이 침입성 분해 구조의 분해 후에, 생성된 말단들이 결찰되어 환형 구조를 형성한다. 다른 구체예에서는, 하나의 올리고뉴클레오티드가 miRNA에 혼성화되어 올리고뉴클레오티드의 말단들이 가깝게 접근한 후에(예를 들어 miRNA의 인접 뉴클레오티드에 혼성화되어) 결찰된다.

또 다른 구체예에서는 도 24 및 도 25에 기술된 검출 구조가 생성된다. 이 구체예에서는 탐침 또는 인베이더 올리고뉴클레오티드가 연장되어 단일 헤어핀 루프 또는 "반 아령" 구조를 만든다. 예를 들어 일부 구체예에서는, 실시예 18에 기술된 올리고뉴클레오티드(예를 들어 도 31 참조)를 이용하여 암과 연계된 miRNA(예를 들어 인베이더 에세이에 의해 검출될 수 있는 침입성 분해 구조를 형성하는)를 검출한다.

일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 말단들은 miRNA에 혼성화되지 않는 추가의 핵산 서열을 포함한다(예를 들어 실시예 19G 및 실시예 19H 참조). 일부 구체예에서는, 이들 추가 서열이 침입성 분해 구조(예를 들어 인베이더 에세이 침입성 분해 구조)를 형성한다. 일부 구체예에서는 인베이더 에세이에 의해 침입성 분해 구조를 검출한다(예를 들어 하기 설명 참조).

다른 구체예에서, 이들 추가 서열들은 분해 구조, 예를 들어 인베이더 에세이 침입성 분해 구조를 안정화시키기 위해 반응 혼합물에 첨가하는 추가의 올리고뉴클레오티드에 상보적이다(도 4).

일부 구체예에서는, 상기와 같이 생성된 환형 구조를 회전환 복제 에세이를 사용하여 검출한다(예를 들어 회전환 복제에 관한 하기 설명 참조).

또 다른 구체예에서는, miRNA에 대해 짧은 상동성 영역(들)을 가진 긴 올리고뉴클레오티드(예를 들어 50, 100, 1000 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 초과하는)로부터 검출 구조가 생성된다. 하나 이상의 miRNA가 올리고뉴클레오티드에 혼성화되어 검출 구조를 생성시킨다. 일부 구체예에서는 miRNA의 연장(예를 들어 RT-PCR과 같은 중합 반응 또는 결찰에 의한)에 의해 이들 검출 구조를 검출한다. 일부 구체예에서, 이들 검출 구조는 미소구체(microsphere)와 같은 고체 지지체, 또는 다른 표면 또는 구조에 접합된 올리고뉴클레오티드에의 혼성화에 의해 추가로 검출된다. 일부 구체예에서는, 비-miRNA 구성성분이 연장되거나 다른 핵산에 결찰되어 직접 또는 간접적으로 검출된다.

일부 구체예에서, 검출 구조를 형성하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 예를 들어 일부 구체예에서는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 이용된다. 본 발명은 특정 기전에 한정되지 않는다. 사실상, 기전의 이해는 본 발명의 실시에 필요하지 않다. 그렇지만 2'-O-메틸 염기의 존재는 혼성화된 검출 구조의 안정성을 증진하고 추가의 검출 방법을 보조하는 것으로 생각된다.

II . 핵산(예를 들어 간섭 RNA )의 검출

일부 구체예에서, 본 발명은 miRNA를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 특정 검출 에세이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 개시된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 일부 바람직한 구체예에서, miRNA 검출 방법은 정량적이다. 본 발명은 특정 기전에 한정되지 않는다. 사실상 기전의 이해는 본 발명의 실시에 필요하지 않다. 그렇지만 체내의 특정 miRNA 수준은 그의 동종(cognate) 유전자로부터의 유전자 발현 수준과 연계되어 있는 것으로 생각된다. 따라서 본 발명은 miRNA를 특정 유전자(예를 들어 질환 상태(예를 들어 암) 또는 대사작용에 관련된 유전자)의 유전자 발현에 관련시키는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구체예에서는, 본 발명의 방법을 이용하여 특정 miRNA의 비정상(예를 들어 높거나 낮은) 수준의 존재(예를 들어 암과 연계된 miRNA 발현(예를 들어, Calin et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99, 15524-15529 (2002) 참조, 예를 들어 실시예 18 및 도 31에 기술된 올리고뉴클레오티드를 사용)를 결정하거나 miRNA에 발현에 대한 중재(예를 들어 약물)의 효과를 결정한다. 다른 구체예에서는 이종 기원 miRNA(예를 들어 발현 벡터, 형질전환 작제물, 형질감염 등으로부터의)를 검출하여 miRNA 발현 시스템의 효율을 특성조사한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 특정 miRNA(예를 들어 mir-1 또는 mir-135와 같은 miRNA)를 검출하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 특정 miRNA의 변이체(예를 들어 다형성 또는 돌연변이) 사이의 구별을 위해 사용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 miRNA의 존재를 시험할 세포의 용해 방법을 제공한다.

A. 인베이더 에세이

일부 구체예에서는 인베이더 에세이를 사용하여 miRNA를 검출한다. 일부 구체예에서 인베이더 에세이는, 표적 핵산의 존재에 의존하는 핵산 분해 구조를 형성하고 핵산 분해 구조를 분해하여 특유의 분해 산물을 유리시킴을 특징으로 한다. 예를 들어 5' 뉴클레아제 활성을 사용하여 표적-의존성 분해 구조를 분해하며, 생성된 분해 산물 또는 분해 구조의 분해는 시료 내에 특이적 표적 핵산 서열이 존재함을 나타낸다. 1개 또는 2개(또는 그 이상)의 핵산 또는 올리고뉴클레오티드 가닥이 표적 핵산 가닥에 혼성화되어 중첩 침입성 분해 구조를 형성할 경우, 하기와 같이 침입성 분해가 일어날 수 있다. 분해 약제(예를 들어 5' 뉴클레아제)와 업스트림 올리고뉴클레오티드의 상호작용을 통해, 특유의 단편을 발생시키는 방식으로 분해 약제가 다운스트림 올리고뉴클레오티드를 내부 자리에서 분해하게 할 수 있다. 이러한 구체예는 인베이더 에세이(Third Wave Technologies)라고 명명되었으며, 원용에 의해 모든 목적에서 본 명세서에 그 전체 내용이 각각 포함된 문헌(미국 특허 제5,846,717호, 제5,985,557호, 제5,994,069호, 제6,001,567호, 제6,090,543호, 제6,348,314호, 및 제6,458,535호, 제WO 97/27214호, 제WO 98/42873호, Lyamichev et al., Nat. Biotech., 17:292 (1999), Hall et al., PNAS, USA, 97:8272 (2000))에 기술되었다.

인베이더 에세이는 구조 특이적 효소에 의해 특이적 구조를 효소적으로 분해함으로써 표적에 대한 탐침의 혼성화를 검출한다(원용에 의해 모든 목적에서 본 명세서에 그 전체 내용이 각각 포함된, 인베이더 assays, Third Wave Technologies; 예를 들어, 미국 특허 제5,846,717호; 제6,090,543호; 제6,001,567호; 제5,985,557호; 제5,994,069호; 제6,090,543호; 미국 특허 출원 제20030186238호(일련 번호 10/084839); 제20030104378A1호(일련 번호 09/864636); Lyamichev et al., Nat. Biotech., 17:292 (1999), Hall et al., PNAS, USA, 97:8272 (2000), 제WO97/27214호 및 제WO98/42873호 참조).

인베이더 에세이는 구조-특이적 효소(예를 들어 FEN 엔도뉴클레아제)를 사용하여 중첩 올리고뉴클레오티드 탐침의 혼성화에 의해 형성된 복합체(예를 들어 도 1 참조)를 분해함으로써 특이적 DNA 및 RNA 서열을 검출한다. 상승된 온도 및 탐침 중 하나를 과량으로 사용함으로써, 존재하는 각 표적 서열에 대한 다중의 탐침을 온도 주기순환(temperature cycling) 없이 분해할 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 분해된 탐침은 이후에 제2 표지 탐침의 분해를 유도한다. 제2 탐침 올리고뉴클레오티드는 내부 염료에 의해 소광되는 플루오레신으로 5'-말단 표지될 수 있다. 분해가 일어나면, 소광되지 않은(de-quenched) 플루오레신 표지 산물을 표준 형광 플레이트 판독기를 사용하여 검출할 수 있다.

인베이더 에세이는 게놈 DNA를 포함하여 증폭되거나 증폭되지 않은(예를 들어 실시예 19, 도 32 참조) RNA 및 DNA에서 특이적 서열, 돌연변이 및 SNP를 검출할 수 있다. 도 1에 도식적으로 나타낸 구체예에서, 인베이더 에세이는 2개의 연속단계(cascading step)(1차 및 2차 반응)를 사용하여 표적-특이적 신호를 발생 및 증폭시킨다. 편의상, 하기 논의의 대립유전자를 야생형(WT) 및 돌연변이체(MT)로 기술하지만, 이 용어가 모든 유전학적 변이체에 적용되는 것은 아니다. 1차 반응에서는(도 1, 패널 A) WT 제1 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산에 직렬로 혼성화되어 중첩 구조를 형성한다. 쌍을 이루지 않는 "플랩"이 WT 제1 탐침의 5' 말단에 포함된다. 구조-특이적 효소(예를 들어 클레아바제 효소, Third Wave Technologies)가 중첩을 인식하여 쌍을 이루지 않는 플랩을 분해해 내고 이를 표적-특이적 산물로서 유리시킨다. 2차 반응에서는, 이러한 분해 산물이 WT 형광공명 에너지 전이(WT-FRET) 탐침 상에 인베이더 올리고뉴클레오티드로서 작용하여, 구조 특이적 효소(패널 A)에 의해 인식되는 구조를 다시 만들어낸다. 단일 FRET 탐침 상의 2개 염료가 분해에 의해 분리되면(도 1에 화살표로 표시), 배경 형광 상에서 검출가능한 형광 신호가 발생한다. 결과적으로, 이러한 2차 구조의 분해는 형광의 증가를 유발하고, 이는 WT 대립유전자(에세이가 돌연변이 대립유전자에 대해 검출가능 신호를 발생하도록 구성된 경우에는 돌연변이 대립유전자)의 존재를 나타낸다. 일부 구체예에서는, 검출하고자 하는 각 대립유전자 또는 유전자좌에 대해 상이한 표지(예를 들어 방출 또는 여기 파장의 차이에 의해 분해 가능(resolvable)하거나, 시간-분해 형광 검출(time-resolved fluorescence detection)에 의해 분해 가능한)를 가진 FRET 탐침이 제공되어, 상이한 대립유전자 또는 유전자좌를 단일 반응 내에서 검출할 수 있다. 이러한 구체예에서는, 제1 탐침 세트 및 상이한 FRET 탐침을 단일 에세이 내에서 조합하여, 동일 시료 내에서 각 대립유전자 또는 유전자좌로부터의 신호를 비교할 수 있다.

제1 탐침 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열이 분해 자리에서 완전히 일치하지 않는다면(예를 들어 MT 제1 탐침 및 WT 표적에서와 같이, 도 1, 패널 B), 중첩 구조가 형성되지 않아 분해가 억제된다. 사용된 구조 특이적 효소(예를 들어 클레아바제 VIII 효소, Third Wave Technologies)는 비-중첩 구조보다 중첩 구조를 더 효율적으로(예를 들어 적어도 340배) 분해함으로써 대립유전자의 우수한 구별을 가능하게 한다.

탐침은 온도 주기순환 없이 교체(turn over)되어 표적 당 다수의 신호를 발생시킨다(즉, 선형 신호 증폭). 마찬가지로 각 표적-특이적 산물은 다수의 FRET 탐침의 분해를 가능하게 한다.

1차 인베이더 에세이 반응은 검출되는 표적 DNA(또는 RNA)에 대한 것이다. 인베이더 및 제1 탐침이 몰 과량으로 공급되므로, 표적 DNA는 1차 침입성 분해에서 한정적 구성성분(limiting component)이다. 2차 침입성 분해에서는 유리된 플랩이 한정적이다. 이들 2개 분해 반응이 순차적으로 수행될 경우, 복합 반응으로부터의 형광 신호는 표적 DNA 양에 비례하여 축적된다.

어떤 구체예에서는, 인베이더 에세이 또는 다른 뉴클레오티드 검출 에세이가 이용가능한 자리-설계(site-designed) 올리고뉴클레오티드 및/또는 가교(bridging) 올리고뉴클레오티드와 함께 수행된다. 이러한 방법, 절차 및 조성물은 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 명시적으로 포함된 미국 특허 제6,194,149호, 제6,358,691호, 제6,355,437호, 미국 특허 출원 일련 번호 제09/882,945호, 및 PCT 출원 제WO9850403호 및 제WO0198537호에 개시되어 있다.

바람직한 일부 구체예에서, 시료(예를 들어 핵산 서열(예를 들어 간섭 RNA(예를 들어 miRNA 또는 siRNA)))를 올리고뉴클레오티드 및 약제에 노출시킴은, 표적 서열이 시료 내에 존재할 경우 표적 서열 및 올리고뉴클레오티드 사이에 침입성 분해 구조가 형성되고, 여기에서 침입성 분해 구조가 분해 약제에 의해 분해되어 분해 산물을 형성하는 조건 하에 시료를 올리고뉴클레오티드 및 약제에 노출시킴을 포함한다.

일부 구체예에서, 표적 서열(예를 들어 miRNA)은 제1 영역 및 제2 영역을 포함하고, 제2 영역은 제1 영역의 연속적인 다운스트림에 있으며, 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 제1 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 표적 서열의 제1 부분에 완전히 상보적이며, 제2 올리고뉴클레오티드는 3' 부분 및 5' 부분을 포함하고, 여기에서 5' 부분은 표적 핵산의 제2 부분에 완전히 상보적이다.

바람직한 일부 구체예에서, 시료를 올리고뉴클레오티드 및 약제에 노출시킴은, 표적 서열이 시료 내에 존재할 경우 표적 서열 및 올리고뉴클레오티드 사이에 침입성 분해 구조가 형성되고, 여기에서 침입성 분해 구조가 분해 약제에 의해 분해되어 분해 산물을 형성하는 조건 하에 시료를 올리고뉴클레오티드 및 약제에 노출시킴을 포함한다.

특히 바람직한 일부 구체예에서, 표적 서열은 제1 영역 및 제2 영역을 포함하고, 제2 영역은 제1 영역의 연속적인 다운스트림에 있으며, 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 제1 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 표적 서열의 제1 부분에 완전히 상보적이며, 제2 올리고뉴클레오티드는 3' 부분 및 5' 부분을 포함하고, 여기에서 5' 부분은 표적 핵산의 제2 부분에 완전히 상보적이다.

어떤 구체예에서, 본 발명은 인베이더 검출 시약(예를 들어 제1 탐침, 인베이더 탐침 및 FRET 카세트)을 사용하여 혼합된(pooled) 시료(예를 들어 혼합된 혈액 시료 또는 혼합된 세포 용해물)를 에세이하는 키트를 제공한다. 바람직한 구체예에서 키트는, 인베이더 에세이의 수행 방법에 관한 사용 설명서를 추가로 포함하고, 일부 구체예에서는 다수의 개체로부터의 혼합된 시료 또는 단일 대상으로부터의 다수의 세포로부터의(예를 들어 생검 시료로부터) "혼합된" 시료에 대한 인베이더 검출 에세이의 적용 방법에 관한 사용 설명서를 추가로 포함한다.

본 발명은 올리고뉴클레오티드 탐침과의 다중 라운드(multiple round) 혼성화 및 탐침의 분해 과정에서 온도 주기순환(즉, 표적 핵산 가닥의 주기적 변성을 위한) 또는 핵산 합성(즉, 중합효소를 기초로 하는 표적 또는 탐침 핵산 가닥의 대체)이 필요 없이 표적 핵산을 재사용 또는 재순환하는 에세이를 추가로 제공한다. 표적 가닥 상에서 탐침이 연속적으로 교체되는 조건(예를 들어, 탐침-탐침 대체 또는 탐침/표적 결합 및 해리 사이의 평형을 통해, 또는 이들 기전을 포함하는 조합에 의해, (Reynaldo et al., J. Mol. Biol. 97: 511-520 (2000))) 하에서 분해 반응이 실행되는 경우, 다중 탐침이 동일 표적에 혼성화될 수 있으므로 다중 분해 및 다중 분해 산물의 생성이 가능하다.

인베이더 에세이 반응:

인베이더 DNA 에세이의 바람직한 구체예에서, 2개 올리고뉴클레오티드(차별적 제1 탐침 및 인베이더 올리고)가 표적 DNA에 직렬로 혼성화되어 중첩 구조를 형성한다. 제1 탐침의 5'-말단은 표적 DNA에 혼성화되지 않는 5'-플랩을 포함한다(도 1). 결합된 인베이더 올리고뉴클레오티드의 3'-뉴클레오티드는 제1 탐침과 중첩되나, 표적 DNA에 혼성화될 필요는 없다(예를 들어 실시예 15 및 실시예 16 참조). 클레아바제 효소는 이러한 중첩 구조를 인식하고 제1 탐침의 쌍을 이루지 않는 5'-플랩을 분해해 내어 이를 표적-특이적 산물로서 유리시킨다. 제1 탐침은 반응 온도에 가까운 용융 온도를 가지도록 설계된다. 따라서, 등온성 에세이 조건하에서, 과량으로 제공되는 제1 탐침은 표적 DNA 상에서 순환된다. 이는 각 표적 DNA에 대한 제1 탐침 분해의 다중 라운드 및 다수의 유리 5'-플랩의 증폭을 가능하게 한다.

2차 반응에서 각각의 유리 5'-플랩은 형광공명 에너지 전이(FRET) 카세트 상에서 인베이더 올리고뉴클레오티드로서 작용하여, 클레아바제 효소에 의해 인식되고 분해되는 또 다른 중첩 구조를 만들 수 있다(도 1). FRET 카세트가 분해되면 형광발색단(F: fluorophore) 및 소광체(Q: quencher)가 분리되어 검출가능한 형광 신호가 발생한다. 초기 반응과 마찬가지로, 유리 5'-플랩 및 FRET 카세트가 순환함으로써 형광 신호를 증푹시킨다. 초기 및 2차 반응은 동일한 웰 내에서 동시에 실행된다.

인베이더 DNA 에세이의 바이플렉스 체제(biplex format)는 2개 DNA 서열을 단일한 웰에서 동시에 검출할 수 있게 한다(예를 들어, 실시예 17 및 실시예 19(L) 참조). 이는 종종 특정 다형성의 2개 변이체의 검출을 포함한다(예를 들어 miRNA에서). 바이플렉스 체제는 각각 고유의 5'-플랩을 가진 2개의 상이한 차별적 제1 탐침, 및 각각 분광적으로 독특한 형광발색단을 가진 2개의 상이한 FRET 카세트를 사용한다. 설계에 따라, 유리된 5'-플랩은 그들 각자의 FRET 카세트에만 결합하여 표적-특이적 신호를 발생시킬 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 실시에 필요한 하나 이상의 구성성분을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어 본 발명은, 본 발명의 효소 및/또는 분해 에세이(예를 들어 인베이더 에세이)를 실시하기 위해 필요한 반응 구성성분을 저장 또는 전달하기 위한 키트를 제공한다. 하기와 같이 본 발명의 실시를 위한 키트의 한 구체예가 기술되지만, 이는 예시를 위한 것으로서 본 발명의 키트를 임의의 특정 구성 또는 구성성분들의 조합에 한정하려는 것은 아니다.

일부 구체예에서, 본 발명의 키트는 하기 시약들을 제공한다:

클레아바제 효소 제1 탐침 올리고

DNA 반응 완충액 1 인베이더 올리고

FRET 카세트 1 (예를 들어 F)

FRET 카세트 2 (예를 들어 R)

돌연변이체 DNA 대조군

야생형 DNA 대조군

"표적이 없는" 공백(blank) 대조군

다른 구체예에서, 본 발명의 키트는 RNA의 직접 검출을 위해 구성된다. 이들 키트는 하기 시약들을 제공할 수 있다:

클레아바제 효소 제1 탐침

올리고뉴클레오티드

DNA 반응 완충액 1 인베이더 올리고

FRET 탐침 1 (예를 들어 F)

FRET 탐침 2 (예를 들어 R)

2차 반응 표적 1

2차 반응 표적 2

어레스터 올리고뉴클레오티드 1

어레스터 올리고뉴클레오티드 2

돌연변이체 DNA 대조군

야생형 DNA 대조군

"표적이 없는" 공백 대조군

단일 반응 내에서 올리고뉴클레오티드의 특정 조합으로부터 유발되는 바람직하지 않은 효과와 관련하여 추가로 고찰한다. 이러한 효과 중의 하나는 배경 신호의 표적-비의존성 발생이다. 어떤 올리고뉴클레오티드는 다른 것과 조합하여, 검출되는 특정 표적이 없는 인베이더 에세이에서 신호를 발생시킬 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드 조합을 상이한 풀(pool)로 분리함으로써 상기 효과를 완화할 수 있다. 마찬가지로 어떤 올리고뉴클레오티드 조합은 목적하는 표적으로부터의 신호 발생을 인위적으로 억제할 수 있다. 역시, 이들 조합을 상이한 풀로 분리하면 상기 효과를 완화할 수 있다.

탐침 세트(예를 들어 올리고뉴클레오티드 및/또는 그의 서열)의 설계는, 본 명세서에 제공된 반응 설계 및 최적화에 관한 지침(예를 들어 실험 단원)을 사용하는 miRNA 검출 에세이에 사용하기 위해 개조될 수 있다. 예를 들어 일부 구체예에서는, 더 작은 혼성화 영역을 감안하여 반응 온도를 낮춘다(예를 들어 50-60 ℃로).

일부 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위하여 사용자에 의해 조달되는 부가적 구성성분(예를 들어 시약, 공급품(supply) 및/또는 장비)의 목록을 제공한다. 예를 들어, 이러한 목록의 한 구체예는 하기와 같은 것들을 포함하나, 이러한 부가적 구성성분 목록을 어떤 특정 구성성분으로 한정하려는 것은 아니다:

■ 투명 CHILLOUT-14 액체 왁스(MJ Research) 또는 RNase가 없는 광학 등급 광유(Sigma, Cat. No. M-5904)

■ 96-웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트(MJ Research, Cat. No. MSP-9601)

■ 멸균 1.5-ml 또는 2.0-ml 미세원심분리관

■ 멸균, DNase/RNase가 없는 1회용 에어로졸 장벽 피펫 팁(disposable aerosol barrier pipet tip)

■ 다중 채널 피펫(0.5-10 ㎕, 2.5-20 ㎕)

■ 열순환기(thermal cycler) 또는 다른 열원(예를 들어 실험실용 오븐 또는 히팅 블록(heating block))

■ 기타 실험실 장비(시험관 꽂이, 마이크로 피페터(micropipetor), 다중 채널 피펫, 미세원심분리기, 보텍스 믹서(vortex mixer))

■ 형광 마이크로플레이트 판독기(하기 특징을 가진 광필터(light filter)가 장착된 탑-리딩(top-reading) 플레이트 판독기가 바람직하다:

여기(파장/대역폭) 방출(파장/대역폭)

485 nm/20 nm 530 nm/25 nm

560 nm/20 nm 620 nm/40 nm

일부 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 용이하게 수행하기 위하여 사용자에 의해 조달되는 임의 구성성분(예를 들어 시약, 공급품 및/또는 장비)의 목록을 제공한다. 예를 들어 이러한 목록의 한 구체예는 하기와 같은 것들을 포함하나, 이러한 임의 구성성분 목록을 어떤 특정 구성성분으로 한정하려는 것은 아니다:

■ 멸균 8-관 스트립(strip) 또는 마이크로플레이트(임의)

■ 1회용 프라스틱 트로프(trough)(임의)

■ 플레이트 밀봉 테이프(optional)

일부 구체예에서 본 발명의 키트는, 본 발명의 방법을 용이하게 수행하기 위하여 사용자에 의해 조달되는 필요 구성성분의 목록을 제공하며, 이는 여러 가지 대체물을 허용한다(예를 들어 시료 준비 키트). 예를 들어 이러한 목록의 한 구체예는 하기와 같은 것들을 포함하나, 이러한 임의 구성성분의 목록을 어떤 특정 구성성분으로 제한하려는 것은 아니다:

● QIAGEN QIAAMP 혈액 키트

● 젠트라 시스템즈(Gentra Systems) PUREGENE 키트

● 젠트라 시스템즈 GENERATION 제품

키트에 관한 일부 구체예에서는 상세한 프로토콜(protocol)이 제공된다. 바람직한 구체예에서는, 인베이더 에세이 반응의 조립을 위한 프로토콜(예를 들어 반응 혼합물을 만들기 위한 바람직한 절차 및 조제)이 제공된다. 특히 바람직한 구체예에서, 반응 혼합물의 조립을 위한 프로토콜은 본 발명의 방법을 수행함에 있어서 오차율을 줄이기 위한 계산적 또는 도식적 보조수단을 포함한다(예를 들어 다중 반응을 위해 필요한 시약의 부피를 용이하게 계산하기 위한 표, 및 다수의 에세이 반응을 포함하는 다중-웰 에세이 플레이트 구성을 돕기 위한 플레이트-배치 지침).

일부 구체예에서는, 부수적 절차, 예를 들어 부가적 시약의 준비, 또는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 시료의 준비에 관한 프로토콜과 같은 보충적 자료가 제공된다. 바람직한 구체예에서, 보충적 자료는 초보자 또는 초심자인 사용자가 본 방법 및 키트를 성공적으로 사용하도록 지원하기 위해 제공되는 주의사항 목록 및 지침을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 보충적 자료는 문제해결 지침, 예를 들어 사용자가 봉착할 수 있는 잠재적 문제를 기술하고 이러한 문제의 해결 또는 예방에 있어서 사용자를 지원하기 위한 해결책 또는 교정을 제안하는 지침을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 시료는 반응 당 10-㎕ 첨가에 상응하는 농도로 희석된다. 100-ng 시료의 농도는 15 ng/㎕가 되어야 한다.

B. 회전환 복제

다른 구체예에서는, 회전환 복제 방법(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 이용하여 miRNA 검출 구조를 검출한다(예를 들어, 원용에 의해 본 명세서에 각각 포함된 미국 특허 제6,344,329호; 제6,143,495호; 제6,316,229호; 제6,210,884호, 제6,183,960호 및 제6,235,502호 참조). 일부 구체예에서는, 회전환 복제를 사용하여 miRNA에 어닐링된 단일 올리고뉴클레오티드의 말단의 어닐링으로부터 생성된 환형 miRNA 검출 구조를 검출한다. 일부 구체예에서는, 올리고뉴클레오티드의 말단이 miRNA에 중첩 없이 혼성화된다. 이 올리고뉴클레오티드는 miRNA의 존재 또는 부재 하에 결찰될 수 있다. 그러나 결찰 반응은 miRNA의 존재 하에 더 효율적이다. 이러한 구체예에서는, 시간에 따라 검출된 환형 분자의 수준을 miRNA가 없는 대조군 반응과 비교한다.

다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 말단은 중첩 말단을 가지고 miRNA에 혼성화되어 침입성 분해 구조를 생성시킨다. 이러한 구조는 결찰 전에 분해되므로, 환형 검출 구조 생성의 특이성을 개선한다.

회전환 증폭(RCA: rolling circle amplification)은 환형 단일-가닥 DNA 분자의 복제를 포함한다. RCA에서는, 회전환 복제 프라이머가 환형 핵산 분자에 혼성화된 후에 가닥-대체(strand displacing) DNA 중합효소를 사용하여 핵산 분자를 회전환 복제한다. 단일 반응 주기에서 회전환 복제 중에 증폭이 일어난다. 회전환 복제는 핵산 서열의 직렬 반복을 포함하는 큰 DNA 분자를 발생시킨다. 이 DNA 분자를 직렬 서열 DNA(TS-DNA: tandem sequence DNA)라고 지칭한다.

일부 구체예에서는, 복제 전에 결찰 작용을 포함하는 결찰-매개성 회전환 증폭(LM-RCA: ligation-mediated rolling circle amplification)을 이용한다. 결찰 작용에서, 동종의 표적 핵산 서열이 있을 경우 탐침이 그에 혼성화된 후에, 혼성화된 탐침의 말단이 결찰되어 공유적으로 폐쇄된 단일-가닥 핵산을 형성한다. 결찰 후에, 회전환 복제 프라이머가 탐침 분자에 혼성화된 다음, 가닥-대체 DNA 중합효소를 사용하여 환형 분자를 회전환 복제한다. 일반적으로 LM-RCA는, 개방환 탐침을 표적 시료와 혼합하여 탐침-표적 시료 혼합물을 만들고, 개방환 탐침 및 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진하는 조건 하에서 탐침-표적 시료 혼합물을 배양하며, 탐침-표적 시료 혼합물에 리가제를 혼합하여 결찰 혼합물을 만들고, 개방환 탐침의 결찰을 촉진하여 증폭 표적환(ATC: amplification target circle)을 형성하는 조건 하에서 결찰 혼합물을 배양하며, 회전환 복제 프라이머(RCRP: rolling circle replication primer)를 결찰 혼합물에 혼합하여 프라이머-ATC 혼합물을 만들고, 증폭 표적환 및 회전환 복제 프라이머 사이의 혼성화를 촉진하는 조건 하에서 프라이머-ATC 혼합물을 배양하며, DNA 중합효소를 프라이머-ATC 혼합물에 혼합하여 중합효소-ATC 혼합물을 만들고, 증폭 표적환의 복제를 촉진하는 조건 하에서 중합효소-ATC 혼합물을 배양하며, 여기에서 증폭 표적환의 복제가 직렬 서열 DNA(TS-DNA)를 형성시키는 단계를 포함한다.

C. 부가적 검출 방법

본 발명은 인베이더 에세이 또는 회전환 에세이 검출에 한정되지 않는다. miRNA 검출 구조를 검출할 수 있는 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 예시적인 비-한정적 검출 에세이는 하기와 같다.

1. 혼성화 에세이

본 발명의 일부 구체예에서는, 혼성화 에세이를 사용하여 검출 구조를 검출한다. 혼성화 에세이에서는, 시료로부터의 DNA가 상보적 DNA 분자(예를 들어 올리고뉴클레오티드 탐침)에 혼성화되는 능력에 기초하여 주어진 핵산 서열의 존재 또는 부재를 결정한다. 혼성화 및 검출을 위한 다양한 기술을 사용하는 다양한 혼성화 에세이가 이용가능하다. 에세이의 선택에 관한 설명이 하기와 같이 제공된다.

a. " DNA 칩" 에세이를 사용하는 혼성화의 검출

본 발명의 일부 구체예에서는 DNA 칩 혼성화 에세이를 사용하여 서열을 검출한다. 이 에세이에서는, 일련의 올리고뉴클레오티드 탐침을 고체 지지체에 고정시킨다. 올리고뉴클레오티드 탐침은 주어진 표적 서열(예를 들어 검출 복합체의 구성성분)에 특이적으로 설계된다. 관심의 대상인 시료를 DNA "칩"에 접촉시켜 혼성화를 검출한다.

일부 구체예에서, DNA 칩 에세이는 GeneChip(Affymetrix, Santa Clara, CA; 예를 들어, 원용에 의해 본 명세서에 각각 포함된 미국 특허 제6,045,996호; 제5,925,525호; 및 제5,858,659호 참조) 에세이이다. GeneChip 기술은 "칩"에 고정된 축소형 고밀도 배열의 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용한다. 탐침 배열은 아피메트릭스(Affymetrix)사의 광-유도성 화학합성공정에 의해 제조되며, 이는 반도체 산업에서 채택되는 사진석판(photolithographic) 제작 기술을 고체상 화학합성에 조합한 것이다. 일련의 사진석판 마스크(mask)를 사용하여 칩 노출 자리를 정의한 후, 특이적 화학합성 단계를 거쳐, 배열 내의 미리 결저왼 위치에 각 탐침을 가진 고밀도 올리고뉴클레오티드 배열을 작제한다. 넓은 유리 기판 위에 다중의 탐침 배열을 동시에 합성한다. 기판을 절단하고, 개별적인 탐침 배열을 주위 환경으로부터 이들을 보호하고 혼성화 챔버(chamber)의 역할을 하는 사출 성형 플라스틱 카트리지에 포장한다.

분석할 핵산을 단리하여 PCR로 증폭하고 형광 리포터 그룹으로 표지한다. 표지된 DNA를 플루이딕스 스테이션(fluidics station)을 사용하여 배열과 함께 배양한다. 배열을 스캐너에 삽입하여 혼성화 패턴을 검출한다. 혼성화 데이터는, 탐침 배열에 결합된 표적에 이미 혼입된 형광 리포터 그룹으로부터 방출되는 광선으로서 수집된다. 일반적으로 표적에 완벽하게 일치하는 탐침은 불일치를 가진 것들보다 강한 신호를 발생시킨다. 배열 상의 각 탐침의 서열 및 위치를 알고 있으므로, 탐침 배열에 적용된 표적 핵산을 상보성에 의해 동정할 수 있다.

다른 구체예에서는, 전자적으로 포획된 탐침을 포함하는 DNA 마이크로칩(Nanogen, San Diego, CA)을 이용한다(예를 들어, 원용에 의해 본 명세서에 각각 포함된 미국 특허 제6,017,696호; 제6,068,818호; 및 제6,051,380호 참조). 마이크로전자공학을 이용함으로써 나노젠(Nanogen)의 기술은, 전하를 띈 분자들이 반도체 마이크로칩 상에서 지정된 시험자리로 또는 그로부터 활동적으로 이동 및 농축됨을 가능하게 한다. 주어진 표적 서열에 특이적인 DNA 포획 탐침은 마이크로칩 상의 특이적 자리에 전자적으로 배치 또는 "주소지정(address)"된다. DNA는 강한 음전하를 가지므로 양전하 지역을 향해 전자적으로 이동할 수 있다.

먼저 마이크로칩 상의 시험 자리 또는 시험 자리의 행을 양전하로 전자적 활성화시킨다. 그 다음에 DNA 탐침을 함유하는 용액을 마이크로칩 상에 도입한다. 음전하를 띈 탐침은 양전하를 띈 자리로 신속하게 이동하여, 그 자리에 농축되고 마이크로칩 상의 자리에 화학적으로 결합한다. 이어서 마이크로칩을 세척하고, 특이적으로 결합된 DNA 탐침의 배열이 완성될 때까지 별개의 DNA 탐침의 다른 용액을 추가한다.

어느 DNA 포획 탐침이 표적 서열과 혼성화되는지를 결정함으로써, 표적 서열의 존재에 대해 시험 시료를 분석한다. 전자적 전하는 또한, 표적 분자를 마이크로칩 상의 하나 이상의 시험 자리로 이동 및 농축시키기 위해서도 사용된다. 각 시험 자리에 시료 DNA를 전자적으로 농축함으로써 시료 DNA와 상보적 포획 탐침의 신속한 혼성화가 촉진된다(혼성화는 수 분 내에 일어날 수 있음). 결합되지 않거나 비특이적으로 결합된 DNA를 각각의 자리로부터 제거하기 위하여, 자리의 극성 또는 전하를 음성으로 역전시킴으로써, 결합되지 않거나 비특이적으로 결합된 DNA를 포획 탐침으로부터 용액으로 돌려보낸다. 레이저-기초의 형광 스캐너를 사용하여 결합을 검출한다.

또 다른 구체예에서는, 편평한 표면(chip) 상에서 표면 장력의 차이에 의한 유체의 격리에 기초한 배열 기술(ProtoGene, Palo Alto, CA)이 이용된다(예를 들어, 원용에 의해 본 명세서에 각각 포함된 미국 특허 제6,001,311호; 제5,985,551호; 및 제5,474,796호 참조). 프로토젠(Protogene)의 기술은 편평한 표면 상에서 화학적 코팅에 의해 부여된 표면 장력의 차이에 의해 유체가 격리될 수 있다는 사실에 기초한다. 일단 격리되면, 칩 상에서 시약의 잉크-제트 프린팅(ink-jet printing)에 의해 올리고뉴클레오티드 탐침이 직접 합성된다. 표면 장력에 의해 정의된 반응 자리를 가진 배열을 4개 표준 DNA 염기 각각에 대해 1개씩 4개의 압전 노즐(piezoelectric nozzle) 세트 하에 X/Y 이동 스테이지(X/Y translation stage) 상에 장착한다. 이동 스테이지는 배열의 각 행을 따라 움직이면서 각각의 반응 자리에 적절한 시약을 전달한다. 예를 들어, A 아미다이트는 그 합성 단계 중에 아미다이트 A가 연결될 자리에만 전달된다. 공통적인 시약 및 세척액은 전체 표면를 충만시킴으로써 전달된 후 회전에 의해 제거된다.

관심의 대상인 표적 서열에 특이적인 DNA 탐침(예를 들어 검출 복합체의 구성성분)을 프로토젠의 기술을 사용하여 칩에 고정시킨다. 그 다음에 칩을 관심의 대상인 PCR-증폭된 유전자에 접촉시킨다. 혼성화 후에, 결합하지 않은 DNA를 제거하고 임의의 적합한 방법(예를 들어 혼입된 형광성 그룹의 형광 비-소광에 의한)을 사용하여 혼성화를 검출한다.

또 다른 구체예에서는, "비드 배열(bead array)"을 사용하여 다형성을 검출한다(Illumina, San Diego, CA; 예를 들어 원용에 의해 본 명세서에 각각 포함된 PCT 공개 제WO 99/67641호 및 제WO 00/39587호 참조). 일루미나(Illumina)는 배열로 자가-조립되는 비드와 광섬유 다발을 결합하는 비드 배열 기술을 사용한다. 각각의 광섬유 다발은 다발의 직경에 따라 천개 내지 백만개의 개별적인 섬유를 포함한다. 비드는 주어진 SNP 또는 돌연변이의 검출에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드로 코팅된다. 비드의 배치(batch)들을 합하여 배열에 특이적인 풀을 형성한다. 에세이를 수행하기 위하여 비드 배열을 준비된 대상 시료(예를 들어 핵산 시료)에 접촉시킨다. 임의의 적합한 방법을 사용하여 혼성화를 검출한다.

b. 혼성화의 효소적 검출

본 발명의 일부 구체예에서는 특이적 구조의 효소적 분해에 의해 혼성화를 검출한다.

일부 구체예예에서, 결합된 탐침의 혼성화는 TaqMan 에세이(PE Biosystems, Foster City, CA; 예를 들어 원용에 의해 본 명세서에 각각 포함된 미국 특허 제5,962,233호 및 제5,538,848호 참조)를 사용하여 검출한다. 에세이는 PCR 반응 중에 수행된다. TaqMan 에세이는 AMPLITAQ GOLD DNA 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클라제 활성을 이용한다. 주어진 대립유전자 또는 돌연변이에 특이적인 탐침이 PCR 반응에 포함된다. 탐침은 5'-리포터 염료(예를 들어 형광 염료) 및 3'-소광체 염료를 가진 올리고뉴클레오티드로 구성된다. PCR 과정에서 탐침이 그의 표적에 결합하는 경우, AMPLITAQ GOLD 중합효소의 5'-3' 핵산분해 활성이 리포터와 소광체 염료 사이에서 탐침을 분해한다. 리포터 염료가 소광체 염료로부터 분리됨으로써 형광의 증가를 유발한다. PCR의 각 주기를 따라 신호가 축적되어 형광계에 의해 검출될 수 있다.

또 다른 구체예에서는, SNP-IT 프라이머 연장 에세이(Orchid Biosciences, Princeton, NJ; 예를 들어 원용에 의해 본 명세서에 각각 포함된 미국 특허 제5,952,174호 및 제5,919,626호 참조)를 사용하여 다형성을 검출한다. 이 에세이에서는, 특수하게 합성된 DNA 프라이머 및 DNA 중합효소를 사용하여 추정상의 SNP 위치에서 DNA 쇄를 1개 염기만큼 선택적으로 연장함으로써 SNP를 동정한다. 관심의 대상인 영역 내의 DNA가 증폭 및 변성된다. 그 다음에 마이크로플루이딕스(microfluidics)라고 지칭되는 축소형 시스템을 사용하여 중합효소 반응을 수행한다. 표적 서열 위치에 있을 것으로 추정되는 뉴클레오티드에 표지를 부가함으로써 검출을 완수한다. DNA에 표지가 혼입됨은 임의의 적합한 방법에 의해 검출할 수 있다(예를 들어 뉴클레오티드가 바이오틴 표지를 포함하는 경우, 바이오틴에 특이적인 형광 표지 항체에 의해 검출).

2. 기타 검출 에세이

miRNA 검출 구조의 검출에 유용한 추가의 검출 에세이는 효소 불일치 분해 방법(예를 들어 Variagenics, 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,110,684호, 제5,958,692호, 제5,851,770호); 중합효소 연쇄반응(예를 들어 실시예 19 및 도 32 참조); 측쇄 혼성화 방법(예를 들어 Chiron, 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제5,849,481호, 제5,710,264호, 제5,124,246호 및 제5,624,802호); NASBA(예를 들어, 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제5,409,818호); 분자 비콘 기술(예를 들어 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,150,097호); E-센서 기술(Motorola, 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,248,229호, 제6,221,583호, 제6,013,170호 및 제6,063,573호); 주기 탐침 기술(예를 들어, 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제5,403,711호, 제5,011,769호 및 제5,660,988호); 데이드 베링 신호 증폭 방법(Dade Behring signal amplification method)(예를 들어, 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,121,001호, 제6,110,677호, 제5,914,230호, 제5,882,867호 및 제5,792,614호); 리가제 연쇄반응(Barnay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 189-93 (1991)); 및 샌드위치 혼성화 방법(예를 들어, 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제5,288,609호)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

도 1은, 단일 반응에서 2개의 상이한 대립유전자(예를 들어 단일 뉴클레오티드가 상이한)를 검출하기 위한 인베이더 올리고뉴클레오티드, 탐침 올리고뉴클레오티드 및 FRET 카세트의 개요도이다.

도 2는 본 발명의 일부 구체예에서 이용되는 예시적인 검출 구조를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 일부 구체예에서 이용되는 제2의 예시적인 검출 구조를 나타낸다.

도 4는 본 발명의 일부 구체예에서 이용되는 제3의 예시적인 검출 구조를 나타낸다.

도 5는 본 발명과 함께 사용하기 위한 예시적 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 표적 miRNA의 염기는 밑줄 친 소문자로 표시한다. 탐침 또는 인베이더 올리고뉴클레오티드의 DNA 잔기는 표준체로 표시한다. 소문자체는 2'-O-메틸 잔기를 나타낸다.

도 6은 let-7에 대한 온도 최적화 실험의 결과를 나타낸다.

도 7은 let-7에 대한 온도 최적화 실험의 결과를 나타낸다.

도 8은 let-7에 대한 검출 한계(LOD: limit of detection) 실험의 결과를 나타낸다.

도 9는 let-7 miRNA를 사용하는 교차 반응성 실험의 결과를 나타낸다.

도 10은 miR-1에 대한 LOD 실험의 결과를 나타낸다.

도 11은 let-7 miRNA를 사용하여 클레아바제 효소 IX 및 XII를 비교한 결과를 나타낸다.

도 12는 다양한 유기체로부터로부터의 U6 RNA 서열의 부분적 서열 정렬을 나타낸다.

도 13은 mir-135에 대한 온도 최적화 실험의 결과를 나타낸다.

도 14는 mir-135에 대한 LOD 실험의 결과를 나타낸다.

도 15는 세포 용해물 내에서의 let-7의 검출에서 얻어진 평균 계수를 도식적으로 나타낸다.

도 16은 RNAse A로 처리하거나 처리하지 않은 세포 용해물 내에서 miRNA 및 mRNA의 결과를 나타낸다.

도 17은 전체-길이 또는 단축된 어레스터 올리고뉴클레오티드를 포함하는 경우의 효과를 비교하는 침입성 분해 에세이의 결과를 나타낸다.

도 18은 도 16에 기술된 에세이 설계를 사용하는 온도 최적화 실험의 결과를 나타낸다.

도 19는 10량체 및 12량체 인베이더 올리고뉴클레오티드 설계를 사용하는 온도 최적화 실험의 결과를 나타낸다.

도 20은 2개의 대안적 올리고뉴클레오티드 설계의 LOD를 비교하는 실험의 결과를 나타낸다.

도 21은 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 잔기의 일부 또는 전부를 2'-데옥시 잔기로 치환한 효과를 비교한 결과를 나타낸다.

도 22는 miR-124a를 검출하는 침입성 분해 에세이의 결과를 나타낸다.

도 23은 20개의 상이한 조직 유형으로부터 단리된 총 RNA에서 5개의 상이한 miRNA를 검출하는 실험의 결과를 나타낸다.

도 24는 탐침 및 올리고뉴클레오티드 길이의 변경이 miRNA 검출에 미치는 효과를 시험하는 실험의 결과를 나타낸다.

도 25는 siRNA의 검출을 위한 예시적인 침입성 분해 올리고뉴클레오티드 설계를 나타낸다. 소문자로 표시한 잔기들은 2'-O-메틸을 나타낸다.

도 26은 동일한 let-7a 혼성화-영역을 가졌으나 5'-플랩 "팔(arm)" 서열이 상이한 2개 탐침을 나타낸다.

도 27은, 탐침 1544-82-01 및 2343-25-01이 각각 1 μM 및 10 nM로 혼합된 경우(혼합 vii), 및 1 μM 및 4 nM로 혼합된 경우(혼합 ix)의 순 신호(net signal)를 카피 수에 대해 도시한 도표를 보여준다.

도 28은 동일한 U6 RNA 혼성화-영역을 가졌으나 5'-플랩 "팔" 서열이 상이한 2개 올리고뉴클레오티드 탐침을 나타낸다.

도 29는, 탐침 1796-53-01 및 2343-30-01이 각각 1 μM 및 4 nM로 혼합된 경우의 순 신호를 카피 수에 대해 도시한 도표를 보여준다.

도 30은, 바이플렉스 U6 및 Let-7a 검출에 있어서, 순 신호를 카피 수에 대해 도시한 도표를 보여준다.

도 31은, 본 발명의 개발 과정에서 생성된, 암과 연계된 miRNA의 검출 및 특성조사를 위한 다양한 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.

도 32는, 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응 및 침입성 분해 에세이 반응을 포함하는 에세이를 사용하여 miRNA를 검출하기 위한 일반 설계를 나타낸다.

도 33은, Let-7a의 반응당 카피 수에 대한 순 신호를 나타낸다.

도 34는 온도의 함수로서의 순 신호를 나타낸다.

도 35는 let-7a 카피 수의 함수로서 도시된 let-7a 반응의 원 신호(raw signal)를 나타낸다.

도 36은 let-7a RNA 카피 수의 함수로서 도시된 let-7a 적층체(stacker) 및 헤어핀 에세이의 원 신호를 나타낸다.

도 37은 1-단계 및 2-단계 let-7a 에세이에 의해 발생한 순 신호를 let-7a 카피 수의 함수로서 나타낸다.

도 38은 탐침 1716-94-1, 1717-94-10 또는 1716-94-11을 사용하는 let-7a 에세이에 의해 발생한 순 신호를 let-7a 카피 수의 함수로서 나타낸다.

도 39는 탐침 1716-94-1 및 1717-94-11을 상이한 비율로 사용하는 let-7a 에세이에 의해 발생한 순 신호를 let-7a 카피 수의 함수로서 나타낸다.

도 40은 let-7a 에세이에 의해 발생한 순 신호를 let-7a, let-7c, let-7e 또는 let-7f 카피 수의 함수로서 나타낸다.

도 41은, 실시예 19(M)에 열거된 지침에 따라 설계된 암 연계 miRNA의 검출을 위해 생성된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.

도 42는 다양한 길이의 제1 탐침 및 PCR 프라이머 혼성화 영역을 가진 let-7a 및 miR-16에 대한 추가 설계를 나타낸다.

도 43은 실시예 19에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 144-285를 열거하는 표를 제공한다.

하기 실시예는 본 발명의 임의의 바람직한 실시예 및 태양을 입증하고 추가로 예시하기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1

재료 및 방법

실시예 1-18의 모든 반응에서 하기 최종 농도를 사용하였다(본 명세서에서 별도로 표시하지 않는 경우):

탐침 = 1 μM

인베이더 = 1 μM

어레스터 = 2.67 μM

클레아바제 XII 효소 = 30 ng

모든 합성 miRNA 올리고뉴클레오티드는 다마콘(Dharmacon)으로부터 구입하여 20% 변성 아크릴아미드 겔 상에서 정제하였다. 합성 miRNA를 사용하여 최적 온도 (하기 참조) 및 LOD를 결정하였다.

● 인베이더, 탐침 및 어레스터 올리고뉴클레오티드는, 별도의 표시가 없는 한, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(IDT: Integrated DNA Technologies) 또는 써드 웨이브 테크놀로지스(Third Wave Technologies)에 의해 합성되어 20% 변성 아크릴아미드 상에서 정제하였다.

● 모든 반응에 하기의 2.5 X 1차 반응 완충액을 사용하였다(별도의 표시가 없는 한):

25 mM MOPS pH 7.5

62.5 mM KCl

0.125% Tween 20

0.125% Nonidet NP40

62.5 mM MgSO₄

5% PEG

● 별도의 표시가 없는 한, 모든 반응에는 1차 열 배양(thermal incubation) 전에 10 ㎕ 광유를 도포하였다.

● 별도의 표시가 없는 한, 합성 miRNA는 5'OH를 포함하였다. 5' 인산화된 합성 miRNA 표적과 인산화되지 않은 합성 miRNA 표적의 검출을 비교하는 실험에서, 이들 2가지 상이한 유형의 합성 분자를 검출하는 인베이더 에세이의 기능에는 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다.

실시예 2

let -7 및 mir -1에 대한 온도 최적화 실험

let-7에 대한 올리고뉴클레오티드 설계는 도 5에 나타낸다. mir-1에 대한 올리고뉴클레오티드 설계는 도 5에 나타낸다. 하기와 같은 1차 혼합을 실시하여 96 웰 플레이트에서 30 분 동안 50 ℃ ± 10 ℃에서 배양하였다. 추가로, 표적이 없는 마스터(master) 혼합을 준비하였다(RNA 대신에 H₂O 첨가). 증발을 방지하기 위하여 모든 반응에는 광유를 도포하였다.

1차 반응 구성성분	스톡(stock) 농도	첨가량
1차 반응 완충액	2.5 X	4 ㎕
탐침 올리고뉴클레오티드(let 7에 대해 서열 번호 2, 6 또는 9; miR-1에 대해 서열 번호 12, 16 또는 19)	10 μM	1 ㎕
인베이더 올리고뉴클레오티드(let 7에 대해 서열 번호 1, 5 또는 8; miR-1에 대해 서열 번호 11, 15 또는 18)	10 μM	1 ㎕
클레아바제 IX 또는 XII 효소	40 ng/㎕ 클레아바제 IX 효소 또는 60 ng/㎕ 클레아바제 XII 효소	0.5 ㎕
tRNA	20 ng/㎕	1.5 ㎕
합성 miRNA (let-7a에 대해 서열 번호 4; miR-1에 대해 서열 번호 14)	100 pM	2 ㎕
합계		10 ㎕

1차 반응의 종료 후에 5 ㎕의 하기 2차 반응 혼합을 첨가한 다음 반응을 60 ℃에서 10-15 분 동안 배양하였다.

2차 반응 구성성분	스톡 농도	첨가량
H2O(또는 클레아바제 IX 효소 에세이를 위한 완충액)		2 ㎕
FAM FRET 탐침(서열 번호 21)	10 μM	1 ㎕
2차 반응 표적 (let-7에 대해 서열 번호 22; miR-1에 대해 서열 번호 40)	1.5 μM	1 ㎕
어레스터 올리고뉴클레오티드(let-7에 대해 서열 번호 3, 7 또는 10; miR-1에 대해 서열 번호 13, 17 또는 20)	40 μM	1 ㎕
합계		5 ㎕

반응의 종료 후에, 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 530 nm를 사용하여 CYTOFLUOR 4000 형광 마이크로플레이트 판독기에서 플레이트를 판독하였다. 결과는 도 6 및 도 7에 나타낸다. 인베이더 올리고뉴클레오티드의 3'-말단이 2'-O-메틸화된 경우, miRNA 3'-말단에 대한 인베이더 올리고뉴클레오티드 5'-말단의 적층이 증진되었다. 또한, 인베이더 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 2'-O-메틸화되면 반응 온도가 증가하였다. 인베이더 올리고뉴클레오티드의 2'-O-메틸화 염기를 연장하여 miRNA의 최초 2개 염기와 염기 대합하도록 하면(let-7a의 서열 번호 9(1496-96-01R) 설계에서 서열 번호 8(1496-96-02) 대 서열 번호 23(1496-96-03)), 기술된 반응의 최적 온도가 증가하지만 검출이 증진되지는 않는다.

실시예 3

let -7 및 miR -1에 대한 LOD 실험

각 세트의 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드에 대한 최적 반응 온도의 결정 및 최적 작동 설계의 결정(온도 최적화 순 신호로부터) 후에, 하기 실험을 구성함으로써 합성 RNA를 사용하는 설계의 LOD를 결정하였다. 하기 반응 혼합을 96- 웰 플레이트에 분주하여(하기 플레이트 구성 참조) 각 웰이 하기와 같은 것을 포함하게 하였다:

구성성분	스톡 농도	첨가량
1차 반응 완충액	2.5 X	4 ㎕
탐침 let 7에 대해 서열 번호 6 miR-1에 대해 서열 번호 16 또는 19	10 μM	1 ㎕
인베이더 올리고 let 7에 대해 서열 번호 5 miR-1에 대해 서열 번호 15 또는 18	10 μM	1 ㎕
클레아바제 XII 효소	60 ng/㎕	0.5 ㎕
TRNA	20 ng/㎕	1 ㎕
합계		7.5 ㎕

하기 구성을 이용하여 2.5 ㎕의 하기 miRNA 농도를 삼중실험 또는 사중실험으로 첨가하였다:

<-------(miRNA)---->

	1nM	100pM	10pM	1pM	100fM	10fM	H2O
A
B
C
D

플레이트에 광유(10 ㎕)를 도포하고 50 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 1차 반응의 종료 후에, 5 ㎕의 하기 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 60 ℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 상기와 같은 설정값을 사용하여 플레이트를 판독하였다(실시예 2 참조).

2차 반응 구성성분	스톡 농도	첨가량
H2O (또는 클레아바제 IX 효소 에세이를 위한 완충액)		2 ㎕
FAM FRET 탐침 (서열 번호 21)	10 μM	1 ㎕
제2 표적 (let-7에 대해 서열 번호 22; miR-1에 대해 서열 번호 40)	1.5 μM	1 ㎕
어레스터 올리고뉴클레오티드(let 7에 대해 서열 번호 7; miR-1에 대해 서열 번호17 또는 20)	40 μM	1 ㎕
합계		5 ㎕

그 다음에 let-7 및 mir-1에 대한 LOD를 인간 RNA 시료로 시험하였다. 상기와 같은 프로토콜을 이용하였다. 50-100 ng의 조직 특이적 총 인간 RNA 시료(Clonetech, Palo Alto, CA)를 사용하였다. 결과는 도 8 및 도 10에 나타낸다. 총 RNA를 사용하는 let-7a 인베이더 에세이는, 조직 공급원에 따른 let-7a 발현 수준에 대해 앞서 관찰된 바와 동일한 조직 발현 프로파일을 검출한다(Pasquinelli et al., 408:86 (2000)).

실시예 4

let -7 a,c,e, 및 f에 대한 교차 반응성 실험

본 실시예는 let-7의 한 아형에 대하여 다른 아형을 위해 유도된 탐침 및/또는 인베이더 올리고뉴클레오티드의 교차 반응성의 분석에 관하여 기술한다. 실시예 3에 기술된 합성 let-7a miRNA 구성을 위한 프로토콜을 이용하였다. 도 5는 올리고뉴클레오티드 설계를 나타낸다. 하기 플레이트 구성을 사용하였다:

		10 nM	1 nM	100 pM	10 pM	1 pM	100 fM	10 fM	H2O
		1	2	3	4	5	6	7	8
Let 7 A	A
Let 7 A	B
Let 7 C	C
Let 7 C	D
Let 7 E	E
Let 7 E	F
Let 7 F	G
Let 7 F	H

결과는 도 9에 나타낸다. let-7a 설계에 있어서, 분해 자리로부터 떨어진 곳에 있는 1개 염기 변화와 miRNA가 동일한 길이인 경우에 교차 반응성은 최대이다. 다시 말해서, 불일치가 분해 자리로부터 가장 먼 곳에 있을 경우에(let-7c) 인베이더 올리고뉴클레오티드/miRNA 혼성화 영역의 불일치는 높은 교차 반응성을 유발한다. 염기 변화가 분해 자리를 마주보고 있는 경우(또는 가까운 경우)에 교차 반응성은 최소가 된다. let-7a에 있어서 최악의 교차 반응성은 let-7c로서 신호의 25%가 얻어진다. 이 실시예는 인베이더 에세이에서 매우 유사한 miRNA 사이의 구별이 가능함을 입증한다.

실시예 5

클레아바제 IX 효소 대 클레아바제 XII 효소

본 실시예는 miRNA 에세이에 사용하기 위한 클레아바제 효소의 최적화를 기술한다. 온도 최적화에 대한 상기 프로토콜을 이용하였다. 20 ng의 클레아바제 IX 효소(Third Wave Technologies, Madison, WI) 또는 30 ng의 클레아바제 XII 효소(Third Wave Technologies, Madison, WI)를 사용하였다. 클레아바제 IX 효소에는 하기 완충액을 사용하였다:

2.5 X 1차 반응 완충액: 25 mM MOPS pH 7.5, 250 mM KCl, 0.125% Tween 20, 0.125% Nonidet NP40, 31.25 mM MgSO₄, 10% PEG.

7.5 X 2차 반응 완충액: 87.5 mM MgSO₄

클레아바제 XII 효소에는 하기 완충액을 사용하였다:

2.5 X 1차 반응 완충액: 25 mM MOPS pH 7.5, 62.5 mM KCl, 0.125% Tween 20, 0.125% Nonidet NP40, 62.5 mM MgSO₄, 5% PEG.

7.5 X 2차 반응 완충액: H₂O

클레아바제 IX 또는 XII 효소로 LOD 실험 프로토콜을 사용하였다. 두가지 효소에 대해 LOD를 결정하였다. 결과는 도 11에 나타낸다.

클레아바제 IX 효소 또는 클레아바제 XII 효소로 에세이하였을 경우, let-7 miRNA 양의 증가에 비례하여 신호가 증가하였다. 그러나 R² 수치는 클레아바제 XII 효소에서 더 컸으며, 이는 더 높은 선형성(linearity)을 나타낸다. 또한, 클레아바제 XII 효소에서 LOD가 더 낮았다. 2.5 amole의 검출에 대한 순 신호는 클레아바제 IX 효소에서 20 계수였고 클레아바제 XII 효소에서 66.75였다.

실시예 6

miR -135, GAPDH 및 U6 RNA

A. miR135 를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드의 설계

본 실시예는 miRNA miR135에 대한 에세이 설계 및 LOD 결정을 기술한다. miR-1에 대한 실시예 2 및 실시예 3에 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 설계는 도 5에 기술된다. 각각의 설계(A-D)는 mir-135 miRNA의 검출을 위하여 상이한 인베이더 및 탐침 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 모든 설계의 성과를 비교하는 온도 최적화 실험의 결과는 도 13에 나타낸다. 설계 D에서 가장 높은 신호가 얻어졌다. 에세이 설계 D를 사용하는 LOD 실험 결과는 도 14에 나타낸다.

도 14A는 각각의 표시된 표적 농도에서 4개 복제 에세이로부터 발생한 원 계수(raw count)를 나타낸다. 각각의 표적 농도에서 얻어진 평균 계수를 순 신호 및 영점상 배수(FOZ: fold-over-zero)로 표시한다. 이 실험에서 miR-135 표적의 검출 한계는 164 zmole로서, 98,743 분자와 균등하였다. 도 14B는 각 농도에서 얻어진 평균 계수를 도식적으로 나타내며, 시험 농도 범위의 많은 부분에 걸쳐 인베이더 에세이가 선형임을 의미한다.

B. GAPDH 및 U6 RNA 를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드의 설계

어떤 경우에는, 예를 들어 바이플렉스 에세이에서, 조직-특이적 방식으로 발현될 수 있는 하나 이상의 miRNA 종과 함께 일정한 수준으로 모든 세포에 일반적으로 존재하는 RNA를 공동-검출하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서 모든 세포 유형에서 일반적으로 발견되는 별개의 2가지 RNA에 대해 인베이더 에세이를 설계하였다: 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(hGAPDH: human glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase) 및 U6 RNA.

hGAPDH의 경우에는 하기 올리고뉴클레오티드를 바이플렉스 miRNA 검출 에세이에 사용하였다: 인베이더 올리고뉴클레오티드(서열 번호 41); 탐침(서열 번호 42); 어레스터 올리고뉴클레오티드(서열 번호 43); SRT 올리고뉴클레오티드(서열 번호 49), FRET 올리고뉴클레오티드(적색 염료)(서열 번호 48).

U6의 경우에는, "보편적" 인베이더 에세이의 설계에 적합한 영역을 동정하기 위하여 C. 엘레강스로부터 마우스, 아라비돕시스 및 인간에 이르기까지 다양한 8개 종의 U6 RNA를 서열 정렬하였다. 도 12는 정렬을 나타내며, 이러한 서열을 검출하기 위해 만들어진 올리고뉴클레오티드 서열은 서열 번호 93-95이다.

서열 번호 45-47을 사용하여 세포 용해물에서 이들 올리고뉴클레오티드로 실행한 초기 실험은, U6 반응으로부터의 신호가 miRNA 신호에 충분히 앞서 포화에 도달함을 입증하였으며, 이는 세포 내에 U6 RNA가 많은 양으로 존재하기 때문인 것으 로 보인다. 따라서 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드 농도의 희석에 의해 이 탐침 세트가 1 μM 내지 12.5 nM 범위의 최종 농도로 INVDAER 및 탐침을 사용하는 바이플렉스 miRNA 검출 에세이에 사용하기에 적합하게 될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 적정(titration) 반응을 실행하였다. miR-1d 및 let-7a에 대한 바이플렉스 miRNA 검출에 적합한 인베이더 및 탐침 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 12.5-50 nM이었다. 어레스터, SRT 및 FRET 탐침 농도는 전기 실시예에 기술된 바와 같다. "보편적" U6 RNA 올리고뉴클레오티드(서열 번호 93-95)에 의한 U6 RNA의 검출이 서열 번호 45-47에 의한 검출에 필적함이 추가 실험에 의해 입증되었다.

실시예 7

세포 용해물에서 let -7, GAPDH , 및 U6 RNA 의 검출

A. 세포 용해물에서 let 7a의 검출

본 실시예는 인간 골육종 세포주 MG63(Third Wave Technologies, Madison, WI; catalog number CRL-1427)의 유도되지 않은 섬유아세포 및 세포 총 RNA 내에서 let-7 miRNA의 직접적 검출을 기술한다. 기존에 기술된 바와 같이(Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162: 156-156 (1987)) TRIZOL(Gibco-BRL)을 사용하여 세포 총 RNA를 추출하고 문헌(Eis et al., Nature Biotechnology, 19: 673-6 (2001))에 기술된 바와 같이 세포 용해물을 준비하였으며, 이들 2개 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

반응은 하기와 같이 구성되었다. 5 ㎕ 분획의 세포 용해물, 용해 완충액 내 의 표시된 농도의 합성 miRNA 표적(Eis et al., Nature Biotechnology, 19: 673-6 (2001)), 또는 5 ㎕의 20 ng/㎕ tRNA(표적이 없는 대조군의 경우)를 마이크로타이터 플레이트의 적절한 웰에 분주하였다. 하기 시약을 포함하는 96개 반응에 대해 1차 반응 마스터 혼합을 실시하였다.

시약	스톡 농도	반응 당 양(㎕)	마스터 혼합에 첨가한 총량(㎕)
탐침 올리고뉴클레오티드 1496-78-01 R(서열 번호6) 및 인베이더 올리고뉴클레오티드 1496-78-02 (서열 번호 5)의 혼합물	Probe 20 μM/ 인베이더 올리고뉴클레오티드 200 μM	0.5	45
클레아바제 XII 효소	60 ng/㎕	0.5	45
제1 완충액	2.5 X	4	360
합계		5	450

적절한 표적 또는 대조군을 포함하는 웰에 5 ㎕ 분획의 1차 반응 마스터 혼합을 첨가하였다. 플레이트에 광유(10 ㎕)를 도포하고 53 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 1차 반응의 종료 후에 하기 용액 5 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 60 ℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 상기 설정값(실시예 2 참조)을 사용하여 플레이트를 판독하였다.

2차 반응 구성성분	스톡 농도	첨가량
H2O (또는 클레아바제 IX 효소 에세이를 위한 완충액)		2 ㎕
FAM FRET 탐침 (서열 번호 21)	10 μM	1 ㎕
제2 반응 표적(SRT) 서열 번호 22	1.5 μM	1 ㎕
어레스터 올리고뉴클레오티드 서열 번호 7	40 μM	1 ㎕
합계		5 ㎕

모든 표적은 사중실험으로 에세이하였다. 총 RNA 및 세포 용해물에 대해 에세이한 상이한 수의 세포에서 얻어진 평균 계수를 도 15에 도시하였다. 알고 있는 양의 합성 let-7a miRNA에 대한 인베이더 에세이로부터 얻어진 표준곡선을 사용하여 세포당 let-7a 카피 수를 외삽하였다. 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌(Eis et al., Nature Biotechnology, 19: 673-6 (2001))에 기술된 바와 같이, 세포 용해에 앞서 접종 절차 중에, 세포 용해물을 발생시킬 세포의 수를 결정하였다. 이 실험에서는, 156개 세포로부터 얻어진 총 RNA 추출물에서 세포 용해물 내의 검출 한계에 도달하였다.

B. Mg ⁺⁺ 부재하의 용해

하기와 같이 대안적인 용해 절차를 개발하였다. 상기 용해 절차를 사용하는 경우에는 긴 mRNA, 즉 GAPDH로부터의 mRNA가 예상되는 양으로 검출되지 않는다는 점에 주목하였다. 용해물 내의 RNA 추출에 대한 Mg⁺⁺의 효과를 조사하기 위하여 실험을 실행하였다. MgCl₂의 존재 또는 부재하에 용해된 추출물을 본 실시예에서 상기한 바와 같이 TRIZOL을 사용하여 준비한 세포 총 RNA 추출물에 비교하였다.

Hela 세포(7.5 X 10⁶ 세포)를 10 mM MOPS 완충액, pH 7.5, 및 100 mM KCl의 용액 100 ㎕에 현탁하였다. 10 ㎕의 분획을 개별적인 시험관에 첨가하고, 하기와 같이 제조된 2가지 상이한 용해 완충액 100 ㎕로 용해시켰다:

Mg++ 존재하의 MOPS 용해	Mg++ 부재하의 MOPS 용해
180 ㎕ 11 ㎍/ml tRNA	180 ㎕ 11 ㎍/ml tRNA
0.5 ml NP40	0.5 ml NP40
4 ml 0.5 M MOPS	4 ml 0.5 M MOPS
0.5 ml 1 M MgCl2	N/A
4.82 ml H2O	5.32 ml H2O
10 ml	10 ml

모든 시험관을 80 ℃에서 15 분 동안 배양하여 세포를 용해시킨 후, 원심분리하여 잔해를 침강시켰다. 5 ㎕ 분획의 다양한 용해물을 하기와 같이 인베이더 반응에 첨가하였다.

1차 인베이더 반응은 let-7a에 대해 상기한 바와 같고; GAPDH(서열 번호 41-43) 및 U6(50 nM 최종 농도의 서열 번호 45-47)에 대해서도 PI 올리고뉴클레오티드 혼합을 실시하였다.

구성성분	반응당 첨가량	최종 농도
PI 올리고뉴클레오티드 혼합*	0.25 ㎕	각각 1 μM*
H2O	0.25 ㎕	0.25 ㎕
클레아바제 XII 효소 60 ng/㎕	0.5 ㎕	0.5 ㎕
	4 ㎕	4 ㎕
합계	5 ㎕	5 ㎕

* 1차 인베이더 반응은 let-7a에 대해 상기한 바와 같고; GAPDH(서열 번호 41-43) 및 U6(50 nM 최종 농도의 서열 번호 45-47)에 대해서도 PI 올리고뉴클레오티드 혼합을 실시하였다.

1차 반응 혼합물을 49 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 후에 하기 2차 반응 혼합물의 분획을 첨가하였다:

구성성분	반응당 첨가량
2차 반응 혼합물*	1.5 ㎕
H2O	3.5 ㎕
합계	5 ㎕

2차 반응 혼합물은 SRT(let-7에 대해 서열 번호 22; GAPDH 및 U6에 대해 서열 번호 49 표적, FRET 올리고뉴클레오티드(let-7에 대해 서열 번호 21; GAPDH 및 U6에 대해 서열 번호 48), 어레스터(let-7에 대해 서열 번호 7, GAPDH에 대해 서열 번호 43, 및 U6에 대해 서열 번호 47)를 실시예 7A에 표시된 농도로 포함하였다.

2차 반응을 60 ℃에서 1 시간 동안 실행하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 CYTOFLUOR 마이크로플레이트 판독기에서 반응을 판독하였다. 결과는 도 16에 나타내었으며, 이는 GAPDH 신호의 존재가 용해 완충액의 Mg++의 부재에 의존하는 반면에 U6 RNA 신호는 Mg++의 존재에 상관없이 비교적 일정하게 유지됨을 의미한다. Mg++ 부재하의 용해로부터 얻어지는 것에 필적하는 수준으로 모든 RNA가 세포 총 RNA에서 검출될 수 있음을, 추가 실험에서 확인하였다.

실시예 8

다양한 miRNA 의 검출을 위한 대안적 인베이더 에세이 설계

A. let -7A의 검출을 위한 대안적 설계

본 실시예는 let-7a miRNA의 검출을 위한 대안적 올리고뉴클레오티드 설계의 제조 및 시험을 기술한다. 한 일련 실험에서, 인베이더 올리고뉴클레오티드 및 탐침 올리고뉴클레오티드의 표적 특이적 영역이 11 뉴클레오티드 길이인 대안적 설계 세트를 제조하였다. 두 번째 세트의 설계는 탐침 올리고뉴클레오티드의 표적 특이 적 영역이 10개 뉴클레오티드 길이이고 인베이더 올리고뉴클레오티드의 표적 특이적 영역이 12개 뉴클레오티드 길이가 되도록 제조되었다.

1. 올리고뉴클레오티드 설계

a. 11량체 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드 설계

도 5는, 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드의 표적 특이적 영역이 모두 11개 뉴클레오티드 길이인, let-7a miRNA 검출을 위한 대안적 올리고뉴클레오티드 설계 세트를 나타낸다. 서열 번호 50-51은 인베이더 및 탐침 올리고뉴클레오티드가 모두 선형인 설계를 제공한다. 서열 번호 6은 스템-루프 구조를 형성하는 탐침 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 서열 번호 5는 스템-루프 구조를 형성하는 인베이더 올리고뉴클레오티드를 포함하며; 서열 번호 5-6은 스템-루프를 가진 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드를 모두 포함한다.

b. 10량체 탐침 및 12량체 인베이더 올리고뉴클레오티드 설계

도 5는, 탐침의 표적 특이적 영역이 10개 뉴클레오티드를 포함하고 인베이더 올리고뉴클레오티드의 표적 특이적 영역이 12개 뉴클레오티드를 포함하는, let-7a miRNA 검출을 위한 대안적 올리고뉴클레오티드 설계 세트를 나타낸다. 서열 번호 52-53은 인베이더 및 탐침 올리고뉴클레오티드가 모두 선형인 설계를 제공한다. 서열 번호 2는 스템-루프 구조를 형성하는 탐침 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 서열 번호 1은 스템-루프 구조를 형성하는 인베이더 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

2. let -7a miRNA 의 검출을 위한 대안적 올리고뉴클레오티드 설계의 온도 최적화 프로파일

하기와 같이 온도 최적화 실험을 실행하였다. 24개 반응에 대하여 마스터 혼합을 실시하였다. 각 반응은 하기 용액을 포함한다:

스톡 농도	반응당 부피	최종 농도
클레아바제 XII 효소를 위한 2.5 X 1차 반응 완충액(실시예 5에 기술된 바와 같음)	4 ㎕	1 X
10 μM 탐침*	1 ㎕	1 μM
100 μM 인베이더 올리고뉴클레오티드*	1 ㎕	10 μM
60 ng/㎕ 클레아바제 12	0.5 ㎕	30 ng
H2O	2.5 ㎕	N/A
30 pM miRNA (11량체 온도 최적화의 경우) 또는 10 nM miRNA (10량체 탐침/12량체 인베이더 올리고뉴클레오티드 온도 최적화의 경우)	1 ㎕	3 pM 또는 1 nM
20 ng/㎕ tRNA (표적이 없는 대조군의 경우에만)	1 ㎕	2 ng
합계	10 ㎕

* 도 16 - 도 17에 표시된 바와 같이 본 실험에는 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드의 다양한 조합이 사용되었다.

2차 반응 혼합은 let-7에 대해 실시예 3에 기술된 바와 같다. 적절한 경우에, 어레스터 서열을 전체 루프 및 탐침의 5' 말단 쪽으로 연장된 6개 염기 및 탐침의 표적 특이적 영역에 상보적이도록 만들었다.

11량체 온도 최적화 실험의 경우, 1차 반응을 50 ± 9 ℃에서 1 시간 동안 실행한 후에 실시예 2에 기술된 바와 같이 2차 반응을 60 ℃에서 15 분 동안 실행하였다. 10량체 탐침 및 12량체 인베이더 올리고의 경우에는, 1차 반응을 50 ± 9 ℃에서 15 분 동안 실행한 후에 2차 반응을 60 ℃에서 15 분 동안 실행하였다.

인베이더 및 탐침 올리고뉴클레오티드의 표적 특이적 부분이 11개 뉴클레오티드 길이인 설계에 대한 결과는 도 18에 나타낸다. 도 18A는 각 설계의 온도 최적화 프로파일을 보여준다. 도 18B는 각 설계에 대한 최적 온도를 포함하여 각 설계의 표준화된 최대 성과를 보여준다. 탐침 올리고뉴클레오티드의 표적 특이적 부분이 10개 염기이고 인베이더 올리고뉴클레오티드의 표적 특이적 부분이 12개 염기인 설계에 대한 결과는 도 19에 나타낸다. 도 19A는 온도 최적화 프로파일을 나타내고, 도 19B는 각 설계의 표준화된 최대 성과를 보여준다.

이러한 결과를 고찰함으로써, 어느 설계가 최대 성과를 유발하는지는 반응 조건 및 형성된 miRNA-올리고뉴클레오티드 혼성물의 상대적 안정성에 따라 달라진다는 것이 제안되었다. 예를 들어 두 가지 올리고뉴클레오티드의 표적 특이적 영역이 모두 11개 염기 길이일 때, 탐침 표적 특이적 영역의 예상 Tm은 49 ℃이고 인베이더의 경우는 37 ℃이다. 이러한 경우, 인베이더 올리고뉴클레오티드-miRNA 상호작용의 안정화는 이 설계에 개선된 에세이 성과를 부여한다. 그러나 탐침이 10량체이고 인베이더 올리고뉴클레오티드가 12량체인 let-7a 설계에서는, 2개 올리고뉴클레오티드의 표적 특이적 영역이 대략적으로 균등한 Tm을 가진다. 이러한 경우, 두 가지 올리고뉴클레오티드가 모두 루프인 설계가 가장 우수하다.

3. 2가지 대안적 설계를 사용하는 let -7a의 LOD

실시예 3에 기술된 실험을 구성하여, 인베이더 올리고뉴클레오티드가 스템-루프 구조를 형성하는 이중 루프 설계 및 단일 루프 설계의 LOD를 비교하였다.

LOD를 결정하는 반응은 사중실험으로 실행하였다. 반응 혼합물은 하기 시약들을 함유하였다(최종 농도):

스톡 농도	반응당 부피	최종 농도
클레아바제 XII 효소를 위한 2.5 X 1차 반응 완충액	4 ㎕	1 X
10 μM 탐침/200 μM 인베이더 올리고뉴클레오티드 혼합 (도 20에 표시된 서열)	0.5 ㎕	1 μM 탐침/20 μM 인베이더 올리고뉴클레오티드
60 ng/㎕ 클레아바제 XII 효소	0.5 ㎕	30 ng
합계	5 ㎕

도 20에 나타낸 최종 농도로 반응 혼합물을 포함하는 웰에 50 ㎕ 분획의 miRNA를 첨가하였다. 실시예 8B에서 결정된 각 설계에 대한 최적 온도에서(루프 인베이더 올리고뉴클레오티드 설계는 50 ℃이고 이중 루프 설계는 53 ℃) 1차 반응을 1.5 시간 동안 실행하였다. 실시예 2 및 실시예 3에 기술된 바와 같이 2차 반응을 구성하여 60 ℃에서 1 시간 동안 실행하였다.

도 20의 결과는 발생한 순 신호를 miRNA 몰의 함수로서 나타낸다. 플롯의 선형 범위는 이중 루프 설계에서보다 인베이더 루프 설계를 사용하는 경우에 주어진 양의 miRNA로부터 발생하는 신호가 더 크다는 것을 나타낸다. 마찬가지로, 도 20의 표를 고찰하면 각 miRNA 수준에서의 영점상 배수 수치가 단일 루프 설계에서 더 크다는 것을 알 수 있다. 두 가지 설계는 가장 낮은 시험 농도, 약 16,000 분자와 균등한 2.68 X 10^-20 몰, 또는 26.8 젭토몰(zeptomole)에서 충분한 FOZ를 산출하였다.

4. 전체 길이 대 단축 어레스터 올리고뉴클레오티드

탐침의 miRNA-특이적 영역 및 5' 플랩의 부분에만 상보적이고 루프 영역 내로 또는 그 너머로 연장되지는 않은 단축 어레스터 분자에 대하여, 어레스터 분자가 그의 5' 말단에서 루프 주위로, 탐침의 miRNA-특이적 영역의 길이에 걸쳐, 5' 플랩 영역 내로 연장된, 예를 들어 도 4 및 도 12에 나타낸 전체-길이 어레스터 분자의 상대적 성과를 평가하기 위하여 실험을 수행하였다. 하기와 같이 반응을 구성하여 합성 let-7a miRNA를 검출하였다:

구성성분	스톡 농도	반응당 첨가량
PI 혼합 (탐침 서열 번호 6; 인베이더 올리고뉴클레오티드 서열 번호 5)	10 μM 탐침 50 μM 인베이더 올리고	1 ㎕
클레아바제 XII 효소	(60ng/㎕)	0.5 ㎕
H2O		0.5 ㎕
1차 반응 완충액	2.5 X	4 ㎕
합계		6 ㎕

1차 반응 혼합의 6 ㎕ 분획을 마이크로타이터 플레이트의 적절한 웰에 첨가한 후, 합성 let-7a miRNA의 4 ㎕ 분획 또는 dH₂O 내의 10 ng/㎕ tRNA 4 ㎕를 하기 표에 표시된 최종 농도로 가하였다. 1차 인베이더 반응은 53 ℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다.

2차 반응 혼합물의 분획은 하기와 같이 첨가되었다:

전체-길이 어레스터
구성성분	스톡 농도	첨가량
어레스터 전체 길이 어레스터에 대해 서열 번호 7, 단축 어레스터에 대해 서열 번호 54	40 μM	1 ㎕
MO5 SRT (서열 번호 22)	1.5 μM	1 ㎕
FRET FAM (서열 번호21)	10 μM	1 ㎕
H2O		2 ㎕

2차 반응은 60 ℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 마이크로타이터 플레이트를 판독하였다. 결과는 도 17에 나타내었다.

이러한 결과는, 탐침의 miRNA-특이적 부분에 상보적인 전체-길이 또는 단축 어레스터 올리고뉴클레오티드를 2차 인베이더 반응에 사용할 경우에 신호 발생 또는 검출 한계에 있어서 유의적인 차이가 없다는 것을 나타낸다.

B. 선형 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드를 사용하는 대안적 설계

탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드가 양자 모두 보편적 서열을 포함하고 둘 중 어느 올리고뉴클레오티드도 헤어핀을 형성하지 않는 대안적 설계를 시험하였다. 설계의 개요도는 도 4에 나타낸다. 보편적 서열은 인베이더 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및 탐침 올리고의 3' 말단 상에 존재한다. 짧은, 상보적 "포획" 올리고뉴클레오티드가 첨가되고 이는 2'-O-메틸 잔기들을 포함함으로써, miRNA(예를 들어 서열 번호 60)의 존재 하에 동축 적층(co-axial stacking)을 촉진할 수 있게 한다. miR-15(서열 번호 58-59 및 61) 및 mir-135 (서열 번호 63-65)에 대해서도 설계를 제작하였다. 초기 설계는, miRNA 표적의 부재 하에 높은 비-특이적 배경 신호 를 유발함에도 불구하고, 상기 보편적 포획 올리고뉴클레오티드로 miRNA를 검출할 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 9

루프 내의 뉴클레오티드 잔기의 2'-O-메틸화에 의한 효과

본 실시예는, miRNA 검출을 위해 사용된 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드에 혼입된 2'-O-메틸 잔기의 일부 또는 전부를 2'-데옥시 잔기로 치환함에 따른 효과를 평가하기 위한 실험을 기술한다. 전기 실시예에 제공된 모든 설계들은 실시예 2에 기술된 바와 같이 루프 영역 내에 2'-O-메틸 잔기들을 포함한다. let-7a miRNA를 검출하기 위해 설계된 탐침 올리고뉴클레오티드 및 인베이더 내의 2'-O-메틸 잔기의 일부 또는 전부를 2' 데옥시 잔기로 치환함에 따른 효과를 시험하기 위하여 실험을 수행하였다.

도 5는 개질된 let-7a 설계를 나타낸다. 서열 번호 5-6은 실시예 2에 기술된 바와 같이 2'-O-메틸 잔기를 포함한다. 서열 번호 73-74의 설계는 모든 위치에 2' 데옥시 잔기를 포함하고; 서열 번호 75-76의 설계는 표적에 인접한 스템 부분 내에 2'-O-메틸 잔기를 포함한다.

3개 상이한 설계의 신호 발생 및 최적 온도를 비교하기 위하여 인베이더 반응을 구성하였다. 반응은 실시예 8의 LOD 실험에 기술된 바와 같았으며 100 pM 합성 miRNA, 1 μM 탐침, 및 10 μM 인베이더 올리고뉴클레오티드를 포함하였다. 1차 반응은 표시된 온도에서 15 분 동안 실행하였고; 2차 반응은 60 ℃에서 5 분 동 안 실행하였다.

인베이더 에세이의 결과는 도 21에 나타내며, 최대의 신호를 발생시키는 설계는 스템 루프 구조가 2'-O-메틸 잔기를 포함하는 설계이고, 그 다음으로는 표적에 인접한 염기가 2'-O-메틸 잔기를 포함하는 설계임을 보여준다. 전체적으로 2'-데옥시 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 최소 수준의 신호를 발생시켰다.

하기와 같은 부가적 설계 변형을 시험하기 위하여 추가 세트의 실험을 기획하였다: 짧은 헤어핀을 가진 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드, 더 안정한 루프 또는 대안적으로 더 짧은 루프를 가진 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드, 3개의 2'-O-메틸 잔기만을 가진 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드. 하기와 같이 miR-15의 검출을 시험하기 위해 1차 반응을 구성하였다.

하기의 탐침/인베이더 올리고뉴클레오티드 조합을 시험하였다.

탐침		인베이더 올리고
1544-71-01	서열 번호 55	1544-71-02	서열 번호 56
1544-71-01	서열 번호 55	1796-43-02	서열 번호 68
1544-71-01	서열 번호 55	1796-43-04	서열 번호 70
1544-71-01	서열 번호 55	1796-43-06	서열 번호 72
1796-43-01	서열 번호 67	1544-71-02	서열 번호 56
1796-43-03	서열 번호 69	1544-71-02	서열 번호 56
1796-43-05	서열 번호 71	1544-71-02	서열 번호 56
1796-43-03	서열 번호 69	1796-43-04	서열 번호 70

하기와 같이 1차 반응 혼합을 실시하였다.

1차 반응 구성성분	스톡 농도	첨가량
탐침 올리고뉴클레오티드(상기 표에 표시된 바와 같음)	40 μM	0.25 ㎕
인베이더 올리고	40 μM	0.25 ㎕
클레아바제 XII 효소	60 ng/㎕	0.5 ㎕
1차 반응 완충액	2.5 X	4 ㎕
합계		5 ㎕

1차 반응 혼합의 5 ㎕ 분획을 5 ㎕의 합성 miR-15 RNA에 하기의 최종량으로 첨가하였다: 0, 0.1 amole, 0.33 amole, 1.09 amole. 1차 반응은 52.5 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다.

하기와 같이 2차 반응 혼합을 실시하였다.

2차 반응 구성성분	농도	첨가량
FAM FRET 올리고뉴클레오티드(서열 번호 21) 및 2차 반응 표적(SRT)(서열 번호 40)	13.4 ㎕ FAM FRET 2 μM SRT	0.75 ㎕
어레스터 올리고뉴클레오티드(서열 번호 66)	54 μM	0.75 ㎕
H2O		3.5 ㎕
합계		5 ㎕

5 ㎕의 분획을 첨가하고 반응을 60 ℃에서 45 분 동안 배양하였다. 결과는 상대 형광 단위(RFU: relative fluorescent unit)로 하기에 제공된다.

이러한 결과는, 탐침 올리고뉴클레오티드가 2'-O-메틸 잔기를 포함하는 고도로 안정한 사중-루프 및 단축 헤어핀을 기원 인베이더 올리고뉴클레오티드 설계(2'-O-메틸 잔기, TTTT 루프, 긴 헤어핀)와 조합하여 포함하는 설계가 다소 높은 FOZ 수치를 발생시킬 수 있음을 제시한다. 다른 점에서는, 대안적 설계 올리고뉴클레오티드 세트 중 아무것도 기원 설계를 능가하는 어떤 개선점을 제공하지 않았다. 전체-DNA 인베이더 올리고뉴클레오티드와 기원 키메릭(chimeric) 탐침 올리고뉴클레오티드의 조합이, 키메릭 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드 양자 모두에 의해 얻어지는 것과 대략적으로 균등한 FOZ 수치를 제공한다는 사실이 특기할만하다. 일부 응용에서는, 전체 DNA 인베이더 올리고뉴클레오티드의 치환이 올리고뉴클레오티드 합성 비용의 절감을 위하여 바람직하며, 검출 한계를 희생하지 않으면서도 이를 실행할 수 있다.

추가의 실험에서는, 더 많은 RNA(예를 들어 용해물, 정제된 총 RNA, 합성 miRNA)를 반응에 첨가함으로써, 특정 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하는 차선의(sub-optimal) 신호 발생을 보상할 수 있음을 입증하였다. 마찬가지로, 다양한 올리고뉴클레오티드(즉, 탐침, 인베이더, 어레스터 또는 그의 다양한 조합)를 실시예 1에 기술된 바와 같이 겔 정제하는 부가적 실험에서, 3개 유형 모두의 올리고뉴클레오티드의 표준 겔 정제는 최대 신호를 제공하는 것으로 나타났다. 다른 올리고뉴클레오티드, 즉 인베이더 및 어레스터 올리고뉴클레오티드를 합성 후에 탈염하면, 겔 정제 탐침에 의한 최대 수준과 대략적으로 동등한 신호 수준을 달성할 수 있다.

실시예 10

다중의 조직 유형으로부터의 총 RNA 에서 miRNA 발현의 검출

본 실시예는 다양한 조직 유형으로부터 추출된 총 RNA 내의 상이한 miRNA 종을 검출하기 위한 인베이더 에세이의 적합성을 시험하기 위해 실행된 실험을 기술한다. 조직 특이적 유전자 발현을 평가하기 위하여, 각 설계에 대한 최적 온도 및 LOD를 먼저 결정하였다.

1. 인베이더 및 탐침 올리고뉴클레오티드 설계

miR-15, miR-16 및 miR-125b miRNA 종을 검출하기 위하여 인베이더 에세이 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 이들 에세이의 설계는 도 5에 나타낸다. let-7a 및 miR-135에 대한 설계는 실시예 2 및 실시예 6에 각각 기술된다.

2. 최적 온도 및 LOD 의 결정

이들 올리고뉴클레오티드 세트 각각에 대하여 실시예 8에 기술된 바와 같이 온도 최적화 실험을 수행하였다. 각각의 1차 반응은 1 nM의 표적화된 miRNA를 포함하였으며, 50 ± 9 ℃ 범위의 온도에서 15 분 동안 실행되었다. 2차 반응은 실시예 2에 기술된 바와 같았으며 60 ℃에서 1 내지 1.5 시간 동안 실행하였다. 최적 온도는 하기와 같다:

let-7a	53 ℃
miR-15	53 ℃
miR-16	56 ℃
MiR-125b	52 ℃
MiR-135	45 ℃

일단 최적 온도가 얻어지면, 각각의 miRNA 종에 대하여 실시예 8에 기술된 바와 같이 LOD를 결정하였다. 모든 LOD는 30 젭토몰 이하였다.

3. 유전자 발현 프로파일 작성

20개의 상이한 조직 유형으로부터 추출된 총 RNA에 대하여 유전자 발현 프로파일을 작성하였다. 총 RNA는 클론텍(Clontech)(Palo Alto, CA, catalog number K4008-1, Human Total RNA Master Panel II)으로부터 구입하였다. let-7a에 대해서는 각 반응에서 50 ng의 총 RNA를 시험하였고; 다른 miRNA 종에 대해서는 100 ng의 총 RNA를 시험하였다. 모든 반응은 실시예 8에 기술된 바와 같이 구성되었고; 1차 반응은 최적 온도에서 1.5 시간 동안 실행하였으며; 2차 반응은 상기와 같이 실행 하였다. 각각의 miRNA 종에 대한 유전자 발현 프로파일은 도 23에 나타낸다. 이들 결과는, 인베이더 에세이가 상이한 조직 유형에서 miRNA 발현을 고찰하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 이들 데이터는 let-7a 및 miR-125b가 광범위한 조직에서 발현되고; 다른 miRNA 종들은 한정된 수의 조직 유형에 좀더 특이적인 것으로 나타남을 추가로 제시한다.

실시예 11

miRNA 의 인베이더 에세이 검출에 대한 다양한 올리고뉴클레오티드 길이의 효과

본 실시예는, 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드의 길이 변경이 let-7a 22-nt miRNA의 검출에 미치는 영향을 기술한다. 특히, 이들 실험은 탐침의 말단들 및 인베이더 올리고뉴클레오티드 사이에 완전한 적층 상호작용을 형성하는 miRNA의 검출을, 5' 및 3' 중첩을 모두 형성하는 miRNA의 검출, 및 5' 및 3' 말단에서 단일 뉴클레오티드 갭을 형성하는 miRNA의 검출에 비교한다.

도 24는 상이한 3개 유형의 설계를 분석한 결과를 보여준다. 서열 번호 5-6은 22-nt 표적과 루프 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드의 양쪽 말단 사이에 완전한 적층을 나타낸다. 서열 번호 83-84에서는, 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드가 모두 1개 염기씩 연장되어 5' 및 3' 중첩을 유발한다. 서열 번호 85-86에서는, 탐침 및 인베이더 올리고뉴클레오티드가 모두 서열 번호 5-6의 설계에 비해 1개 염기씩 단축되어 양쪽 말단에 단일 뉴클레오티드 갭을 유발한다.

합성 let-7a miRNA의 검출에 있어서 이들 올리고뉴클레오티드 세트의 성과를 시험하기 위하여 인베이더 에세이를 구성하였다. 반응은 실시예 8에 기술된 바와 같이 실행되었으며, 100 pM 합성 let-7a miRNA, 1 μM 탐침 및 10 μM 인베이더 올리고뉴클레오티드를 포함하였다. 1차 반응은 53 ℃에서 15 분 동안 실행하였고; 2차 반응은 실시예 2에 기술된 바와 같이 60 ℃에서 5 분 동안 실행하였다. 결과는 도 24에 나타낸다.

이러한 데이터는, 본 실험에서 miRNA 표적의 양쪽 말단에서의 단일 뉴클레오티드 중첩이 신호 발생을 약 30% 감소시키고 최적 온도를 2 ℃ 낮춘다는 것을 보여준다. 그러나 표적의 양쪽 말단에서의 단일 뉴클레오티드 갭은, 최적 반응 온도를 5 ℃ 낮추었지만 신호 발생을 감소시키지는 않았다.

실시예 12

전구체 RNA 및 암호화 DNA 로부터 miRNA 의 구별

인베이더 miRNA 에세이가 miRNA 표적 자체를 그의 전구체 RNA로부터, 및 miRNA를 암호화하는 DNA로부터 구별할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 실험을 실행하였다.

A. 전구체 교차-반응성 시험

전구체 let-7 RNA(서열 번호 87)를 시험관내에서 전사하고 모세관 전기영동으로 분석하여, let-7a miRNA를 모방할 수 있는 임의의 단편이 포함되어 있는지 여부를 결정하였다. 가장 짧은 오염 단편은 약 45 nt로 산정되었다. 하기 표에 표시 된 전구체 또는 합성 5' P let-7a mi-RNA 농도에서 본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 LOD 반응을 실행하였다. PI 혼합은 10 μM 탐침 서열 번호 6 및 100 μM 인베이더 올리고뉴클레오티드 서열 번호 5를 포함하였다. 1차 반응은 53 ℃에서 1 시간동안 실행하였고; 2차 반응은 본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같은 2차 반응 혼합으로(FRET 탐침 서열 번호 21, SRT 서열 번호 22, 및 어레스터 서열 번호 7) 58 ℃에서 1 시간 동안 실행하였다. 본 실험의 결과는, 이 miRNA 에세이가 전구체 RNA에 대하여 약 4% 교차 반응성임을 보여준다.

B. RNA 대 DNA 신호의 구별

실시예 7에 기술된 바와 같이 세포 용해물 내에서 let-7a miRNA를 검출하기 위해 반응을 실행하였다. 인베이더 에세이로 검출하기 전에, 8 ㎍/㎕ RNAse A(Qiagen, Inc.)의 1 ㎕ 분획을 80 ㎕의 세포 용해물에 첨가하고 37 ℃에서 2.25 시간 동안 배양하였다. RNAse A로 처리한 시료는 배경 위로 어떤 신호도 발생시키지 못함으로써, RNAse A가 없는 에세이에서 발생하는 신호는 암호화 DNA가 아닌 miRNA 표적의 검출로부터 일어나는 것임을 보여주었다(도 16). RNAse A를 1차 반응 전에 또는 2차 반응 전에 첨가하는 추가의 실험을 실행하였다. RNAse A를 1차 반응 전에 첨가한 경우에는 신호가 발생하지 않았으며, 이는 전기의 결과와 일치한다. RNAse A를 1차 반응 후에 첨가한 경우에는 신호의 손실이 관찰되지 않았으며, 이는 검출되는 신호가 RNA에 기인하는 것이고 다른 반응 구성성분, 예를 들어 클레아바제 효소에는 RNAse가 악영향을 주지 않음을 추가로 보여준다.

실시예 13

이중 형태 miRNA 의 검출

miR-124a에 대한 올리고뉴클레오티드 설계를 제작하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 2가지 천연적 miRNA(하나는 21 nt 길이이고 다른 하나는 22 nt 길이임)의 검출에 사용할 수 있다.

본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이, 1 nM의 합성 miRNA 표적, 25 1차 반응 및 15 분 2차 반응을 사용하여 온도 최적화 반응을 구성하였다. 이들 반응에 사용된 올리고뉴클레오티드는 도 5에 열거한다(서열 번호 90-92). 상이한 2가지 길이 miRNA 표적에 대한 온도 프로파일은 도 22에 나타내며, 이는 두가지 표적 모두의 검출에 동일한 올리고뉴클레오티드 설계를 사용할 수 있음을 보여준다.

실시예 14

siRNA 의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 설계

전기 실시예에 기술된 것과 유사한 접근 방법을 사용하여 siRNA를 검출할 수 있다. 도 25는 β-액틴 siRNA의 검출을 위한 2가지 대안적 인베이더 에세이 설계를 설명한다. 이러한 siRNA는 문헌(Harborth, J. et al., Journal of Cell Science, 114: 4557-4565 (2001))에 기술되어 있다. 센스 및 안티센스 가닥 각각에 대해 하나의 설계가 제공되며; 이러한 siRNA를 검출하기 위한 예시적 올리고뉴클레오티드는 도 26, 서열 번호 101-106에 열거한다.

실시예 15

let -7a miRNA 검출의 동적 범위를 확장하기 위한 최적화

let-7a miRNA 인베이더 에세이 검출의 동적 범위를 확장하기 위한 시도로서, let-7a 혼성화-영역은 동일하고 5'-플랩 "팔" 서열은 상이한 2개 올리고뉴클레오티드 탐침을 설계하였다. 상이한 5'-플랩 또는 팔은, 분해되었을 때 FAM 신호를 발생시키도록 설계된 FRET 카세트에 보고(report)한다. 올리고뉴클레오티드 서열은 하기와 같으며("Z28"은 ECLIPSE 소광체를 지칭함, Nanogen, Inc., San Diego, CA), 도 26에 나타낸다:

서열 번호	설명	서열 5'-3'	비고
1544-82-01 (서열 번호 124)	탐침 MO5 팔	CCGTCGCTGCGTCTACTACCTCA-NH2
2343-25-01 (서열 번호 125)	탐침 MO4 팔	CCGTCACGCCTCCTACTACCTCA-NH2
1496-78-02 (서열 번호 126)	인베이더 올리고	mGmGmCmAmCmUmUmUmUmGmUmGmCmCAACTATACAACT	m = 2'-O-메틸
1581-63-01 (서열 번호 127)	MO5-팔 탐침에 대한 어레스터	mUmGmAmGmGmUmAmGmUmAmGmAmCmGmCmAmG	m = 2'-O-메틸
2343-25-02 (서열 번호 128)	MO4-팔 탐침에 대한 어레스터	mUmGmAmGmGmUmAmGmUmAmGmGmAmGmGmCmG	m = 2'-O-메틸
23-182 (서열 번호 129)	MO5 SRT에 대한 FAM FRET 탐침	YCACXTGCTTCGTGG	Y = 6FAM, X= Z28 소광체
2343-23-01 (서열 번호 130)	MO4 SRT에 대한 FAM FRET 탐침	YCACXTCGAACGTCG	Y = 6FAM, X= Z28 소광체
2343-23-02 (서열 번호 131)	MO4 SRT	CGAGGTTCGAAGTGGAGGCGTGACmGmGmU
1107-10-02 (서열 번호 132)	MO5 SRT	CCAGGAAGCAAGTGACGCAGCGACmGmGmU
Let-7a (서열 번호 133)	Let-7a 합성 RNA	UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU

하기와 같은 반응 조건을 시험하였다:

2.5 X 반응 완충액	25 mM MOPS pH 7.5, 62.5 mM KCl, 0.125% Tween 20, 0.125% Nonidet P40, 62.5mM MgSO4, 5% PEG.
tRNA 담체	RNase가 없는 물 내의 20 ng/㎕ tRNA 효모
클레아바제 XII 효소	20 mM Tris pH 8.0, 50 mM KCl, 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P40, 50% glycerol, 0.1 mg/ml BSA에 희석한 60 ng/㎕ 클레아바제 XII 효소.

총 9가지 탐침 농도 조건에 대하여 1차 Let-7a 인베이더 반응을 10 ㎕ 반응으로 구성하였다. 시험한 9개 탐침 농도 조건은 하기와 같다: (i) 1 μM의 탐침 1544-82-01, (ii) 1 μM의 탐침 2343-25-01, (iii) 1 μM의 탐침 1544-82-01 및 2343-25-01, (iv) 100 nM의 탐침 2343-25-01, (v) 1 μM의 탐침 1544-82-01 및 100 nM의 2343-25-01, (vi) 10 nM의 탐침 2343-25-01, (vii) 1 μM의 1544-82-01 및 10 nM의 2343-25-01, (viii) 4 nM의 2343-25-01, 및 (ix) 1 μM의 1544-82-01 및 4 nM의 2343-25-01. 이들 탐침 올리고 농도에 부가하여, 반응은 1 μM의 인베이더 올리고 1496-78-02, 30 ng의 클레아바제 XII 효소, 및 10 mM MOPS pH 7.5, 25 mM KCl, 0.05% Tween 20, 0.05% Noidet P40, 25 mM MgSO₄, 및 2% PEG를 포함하였다.

각각의 탐침 농도 조건에 있어서, 반응당 6 x 10⁹, 6 x 10⁸, 6 x 10⁷, 6 x 10⁶, 6 x 10⁵, 6 x 10⁴, 6 x 10³, 및 0 카피의 최종 농도로 Let-7a 합성 RNA를 반응 혼합에 첨가하였다. Rnase가 없는 물에 희석한 20 ng/㎕의 tRNA 용액 내에 Let-7a RNA를 희석하였다. 반응을 96-웰 플레이트 내에 조립하고, 증발을 방지하기 위하여 10 ㎕의 투명한 광유를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 열-블록에 이전하여 49 ℃에서 90 분 동안 배양하였다.

배양이 종료된 후에, 0.3 μM의 2차 반응 주형 1107-10-02 및 2343-23-01, 8 μM의 어레스터 올리고뉴클레오티드 1581-63-01 및 2343-25-02, 및 2 μM의 FRET 탐침 23-182 및 2343-23-01을 함유하는 5 ㎕의 2차 반응 혼합을 첨가하고, 반응 플레이트를 60 ℃에서 90 분 동안 배양하였다. 반응의 종료 후에, 플레이트를 형광 플레이트 판독기(Cytofluor)에 이전하고, 각각 485 nm 및 535 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 43의 이득(gain) 설정으로 형광을 판독함으로써 데이터를 수집하였다.

원 데이터 및 가공 데이터는 하기와 같으며, 도 27에 나타낸다:

1- 원 데이터

Let -7a 카피	탐침 농도 혼합 #	i	ii	iii	iv	v	vi	vii	viii	ix
6 X 10 9		21731	16970	35383	18062	36419	19680	33594	19297	28291
6 X 10 8		20369	14201	29797	16429	35792	18103	28532	18419	25425
6 X 10 7		19752	3772	7247	15969	32775	15128	22546	10576	21604
6 X 10 6		11535	997	1452	4548	13603	3419	11830	1998	10654
6 X 10 5		3500	726	787	1254	2941	1084	2759	923	2540
6 X 10 4		1415	638	675	751	1053	750	972	726	1050
6 X 10 3		840	652	665	666	841	671	770	690	756
6 X 10 9		638	635	637	661	800	658	731	694	698

2- 가공 데이터

Let -7a 카피	탐침 농도 혼합 #	i	ii	iii	iv	v	vi	vii	viii	ix
6 X 10 9		21093	16335	34746	17401	35619	19022	32863	18603	27593
6 X 10 8		19731	13566	29160	15768	34992	17445	27801	17725	24727
6 X 10 7		19114	3137	6610	15308	31975	14470	21815	9882	20906
6 X 10 6		10897	362	815	3887	12803	2761	11099	1304	9956
6 X 10 5		2862	91	150	593	2141	426	2028	229	1842
6 X 10 4		777	3	38	90	253	92	241	32	352
6 X 10 3		202	17	28	10	41	13	39	-4	58

결과는, 탐침 1544-82-01 및 2343-25-01을 각각 1 mM 및 10 nM(혼합 vii), 및 1 mM 및 4 nM 혼합(ix)로 혼합한 경우에 >6 log의 동적 범위가 달성되었음을 입증한다.

실시예 16

U6 RNA 검출의 동적 범위를 확장하기 위한 최적화

인베이더 에세이를 이용한 U6 RNA 검출의 동적 범위를 확장하기 위한 시도로서, U6 RNA 혼성화-영역은 동일하고 5'-플랩 "팔" 서열은 상이한 2개 올리고뉴클레오티드 탐침을 설계하였다. 상이한 5'-플랩 또는 팔은, 분해되었을 때 RED 신호를 발생시키도록 설계된 FRET 카세트에 보고한다. 올리고뉴클레오티드 서열은 하기와 같으며(RED 염료는 REDMOND RED를 지칭함, Nanogen, Inc., San Diego, CA), 도 28에 나타낸다:

서열 번호	설명	서열 5'-3'	비고
1796-53-01 (서열 번호 134)	탐침 562-86B 팔	ccgccgagatcacCTAATCTTCTCTGTAT-NH2
2343-30-01 (서열 번호 135)	탐침 ER4 팔	AAGCACGCAGCACCTAATCTTCTCTGTAT-NH2
1796-59-01 (서열 번호 136)	U6 합성 표적	rUrUrUrArUrArCrArGrArGrArArGrArUrUrArGrCrArUrGrGrCrCrCrCrUrGrCrGrCrArArGrGrArUrGrUrUrU
1796-53-02 (서열 번호 137)	인베이더 올리고	CATCCTTGCGCAGGGGCCATGA
1796-53-03 (서열 번호 138)	탐침 1796-53-01에 대한 어레스터	mAmUmAmCmAmGmAmGmAmAmGmAmUmUmAmGmGmUmGmAmUmC	m = 2'-O-메틸
2343-30-04 (서열 번호 139)	탐침 2343-30-01에 대한 어레스터	mAmUmAmCmAmGmAmGmAmAmGmAmUmUmAmGmGmUmGmCmUmG	m = 2'-O-메틸
23-181 (서열 번호 140)	562-86B 팔에 대한 RED FRET 탐침	YCTCXTTCTCAGTGCG	y = Red 염료 및 x = Z28
2343-30-02 (서열 번호 141)	ER4 팔에 대한 RED FRET 탐침	YCTCXTGCATAGTCCG	y = Red 염료 및 x = Z28
23-183 (서열 번호 142)	562-86B SRT	CGCAGTGAGAATGAGGTGATCTCGGCmGmGmU
2343-30-03 (서열 번호 143)	ER4 SRT	CGGAGTATGCATGAGGTGCTGCGTGCmUmUmU

반응 조건은 하기와 같았다:

시약:

반응 완충액	25 mM MOPS pH 7.5, 62.5 mM KCl, 0.125% Tween 20, 0.125% Nonidet P40, 62.5mM MgSO4, 5% PEG.
tRNA 담체	RNase가 없는 물 내의 20 ng/㎕ tRNA 효모
클레아바제 XII 효소	20 mM Tris pH 8.0, 50 mM KCl, 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P40, 50% glycerol, 0.1 mg/ml BSA에 희석한 60 ng/㎕ 클레아바제 XII 효소.

1 μM의 1796-53-01, 4 nM의 탐침 2343-30-01, 또는 각각 1 μM 및 4 nM의 1796-53-01 및 2343-30-01의 농도로 탐침을 함유하는 1차 인베이더 반응을 10 ㎕ 부피로 구성하였다. 추가로, 이들 반응은 1 μM의 인베이더 올리고 1796-53-02, 30 ng의 클레아바제 XII 효소, 및 10 mM MOPS pH 7.5, 25 mM KCl, 0.05% Tween 20, 0.05% Noidet P40, 25 mM MgSO₄, 및 2% PEG를 포함하였다.

각각의 탐침 농도 조건에 있어서, 반응당 102 x 10⁹, 102 x 10⁸, 102 x 10⁷, 102 x 10⁶, 102 x 10⁵, 102 x 10⁴, 102 x 10³, 10,200, 5,100, 2,550, 및 0 카피의 최종 농도로 U6 합성 RNA를 반응 혼합에 첨가하였다. Rnase가 없는 물에 희석한 20 ng/㎕의 tRNA 용액 내에 U6 합성 RNA를 희석하였다. 반응을 96-웰 플레이트 내에 조립하고, 증발을 방지하기 위하여 10 ㎕의 투명한 광유를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 열-블록에 이전하여 50 ℃에서 90 분 동안 배양하였다.

배양이 종료된 후에, 0.3 μM의 2차 반응 주형 23-183 및 2343-30-02, 7.5 μM의 어레스터 올리고뉴클레오티드 1796-53-03 및 2343-30-04, 및 1.5 μM의 FRET 탐침 23-181 및 2343-30-02를 함유하는 5 ㎕의 2차 반응 혼합을 첨가하고, 반응 플레이트를 60 ℃에서 90 분 동안 배양하였다. 반응의 종료 후에, 플레이트를 형광 플레이트 판독기(Cytofluor)에 이전하고, 각각 560 nm 및 620 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 45의 이득 설정으로 형광을 판독함으로써 데이터를 수집하였다.

얻어진 데이터는 하기와 같으며, 카피 수 대 순 신호의 플롯으로 도 29에 나타낸다:

		U6 카피 / rxn	102x 10 9	102 x 10 8	102 x 10 7	102 x 10 6	102 x 10 5	102 x 10 4	102 x 10 3	10,200	5,100	2,550	0	0
탐침	농도
1796-53-01	1 μM		1174	1343	1282	1205	958	235	77	51	45	40	31	31
			1347	1359	1286	1219	1094	280	95	50	47	42	36	33
		평균	1260.5	1351	1284	1212	1026	257.5	86	50.5	46	41	33.5	32
		순	1227.75	1318.25	1251.25	1179.25	993.25	224.75	53.25	17.75	13.25	8.25
2343-30-01	4 nM		838	865	762	348	101	48	43	40	38	36	32	29
			819	924	794	204	110	55	49	41	42	36	35	28
		평균	828.5	894.5	778	276	105.5	51.5	46	40.5	40	36	33.5	28.5
		순	797.5	863.5	747	245	74.5	20.5	15	9.5	9	5
1796-53-01	1 μM
및			1934	2142	2033	1608	1523	404	115	68	57	47	32	30
2343-30-01	4 nM		1685	2113	1947	1483	1174	304	110	66	48	41	34	29
		평균	1809.5	2127.5	1990	1545.5	1174	354	112.5	67	52.5	44	33	29.5
		순	1778.25	2096.25	1958.75	1514.25	1142.75	322.75	81.25	35.75	21.25	12.75

결과는, 탐침 1796-53-01 및 2343-30-01을 각각 1 μM 및 4 nM 혼합으로 혼합한 경우에 >6 log의 동적 범위가 달성되었음을 입증한다.

실시예 17

단일 반응 용기 내에서 Let -7a 및 U6 검출의 동적 범위를 확장하기 위한 최적화

바이플렉스 인베이더 에세이에서 let-7a miRNA 및 U6 RNA 검출의 동적 범위를 확장하기 위한 시도로서, 몇 개의 변수를 시험 및 평가하였다.

1 μM의 1796-53-01, 1 μM의 1544-82-01, 4 nM의 2343-30-01, 4 nM의 2343- 25-01, 1 μM의 인베이더 올리고 1796-53-02 및 1496-78-02, 30 ng의 클레아바제 XII 효소, 및 10 mM MOPS pH 7.5, 25 mM KCl, 0.05% Tween 20, 0.05% Nonidet P40, 25 mM MgSO₄, 및 2% PEG를 함유하는 1차 인베이더 반응을 10 ㎕ 부피로 구성하였다.

반응당 6 x 10⁹, 1.2 x 10⁹, 2.4 x 10⁸, 4.8 x 10⁷, 9.6 x 10⁶, 1.92 x 10⁶, 384,000, 76,800, 15,360, 3,072, 및 0 카피의 U6 RNA 및 Let-7a miRNA 농도에서 이중실험 반응을 구성하였다. 반응을 96-웰 플레이트 내에 조립하고, 증발을 방지하기 위하여 10 ㎕의 투명한 광유를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 열-블록에 이전하여 49 ℃에서 90 분 동안 배양하였다.

배양이 종료된 후에, 0.3 μM의 2차 반응 주형 1107-10-02, 2343-30-02, 23-183 및 2343-30-03, 7.5 μM의 어레스터 1796-53-03 및 1581-63-01, 및 30 nM의 어레스터 2343-30-04 및 2343-25-02, 1.5 μM의 FRET 탐침 23-181, 2343-30-02, 23-182, 및 2343-23-01을 함유하는 5 ㎕의 2차 반응 혼합을 첨가하였다. 반응 플레이트를 60 ℃에서 90 분 동안 배양하였다. 반응의 종료 후에, 플레이트를 형광 플레이트 판독기(Cytofluor)에 이전하고, Red 염료에 대해서는 각각 560 nm 및 620 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 45의 이득 설정으로, FAM 염료에 대해서는 각각 485 nm 및 530 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 43의 이득 설정으로, 형광을 판독함으로써 데이터를 수집하였다.

얻어진 데이터는 하기와 같으며, 카피 수 대 순 신호의 플롯으로 도 30에 나타낸다:

	Let-7a/ U6 카피/rxn	6.00E*09	1.20E*09	2.40E*08	4.80E807	9.60e*06	1.92e*06	3.84e*05	7.68e*04	1.54e*04	3.07e*03	0
염료 채널
FAM		14133	13249	9947	9102	4204	1177	701	466	427	397	389
		13569	12336	9942	7759	3159	1020	577	447	422	397	364
	평균	13851	12793	9945	8431	3682	1099	639	457	425	397	377
	순	13474	12416	9568	8054	3305	722	262	80	48	20
Red		17353	15351	10722	4140	1219	429	322	257	237	235	237
		16785	14299	10317	3780	936	378	285	245	217	234	226
	평균	17069	14825	10520	3960	1078	404	304	251	227	235	232
	순	16837	14593	10288	3728	846	172	72	19	-5	3

결과는, 바이플렉스 U6 및 Let-7a 검출에 있어서 >6 log의 동적 범위가 달성되었음을 입증한다.

실시예 18

암과 연계되고 그의 징후가 되는 miRNA 의 검출을 위한 조성물

miRNA 유전자의 결실 및 하향 조절은 암(예를 들어 B-세포 만성 림프구성 백혈병(CLL))과 연계되어왔다(예를 들어, Calin et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99, 15524-15529 (2002) 참조). 따라서 본 명세서에서는 암과 연계된 miRNA의 검출 및 특성조사를 위하여 다양한 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 도 31에 도시한다(여기에서 m = 2'-O-메틸; r = 리보오스(DNA 대신 RNA를 표시하기 위해)).

실시예 19

역전사 반응, 중합효소 연쇄반응 및 침입성 분해 에세이 반응을 포함하는 에세이를 이용한 miRNA 검출

역전사(RT), 중합효소 연쇄반응(PCR) 및 침입성 분해 반응 에세이(예를 들어 2-단계 또는 단일-단계 반응(예를 들어 단일 시험관 내에서))를 이용하여 miRNA를 검출 및 특성조사하기 위하여 실험을 수행하였다. 이들 에세이(예를 들어 단일-단계 RT, PCR 및 침입성 분해 반응)에 이용된 화학은, 예를 들어 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 각각 포함된 미국 특허 제6,913,881호; 제6,875,572호, 제6,872,816호 및 제7,011,944호, 및 2005년 11월 3일자 출원된 미국 특허 출원 제11/266,723호에 기술되어 있다. 이러한 방법을 이용하여 miRNA를 검출하기 위한 일반적 설계는 도 32에 나타낸다. 약술하면, 역전사(RT) 프라이머 올리고뉴클레오티드(바람직한 구체예에서 침입성 분해 반응 에세이의 인베이더 올리고뉴클레오티드로서도 작용함) 및 역전사 효소를 사용하여 표적 RNA(예를 들어 miRNA)를 역전사하고(cDNA로), 이어서(예를 들어 2-단계 에세이에서) 또는 동시에(예를 들어 단일-단계 에세이에서(예를 들어 단일 시험관 내에서)) 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 DNA 중합효소를 사용하여 제1 탐침의 존재하에 cDNA 산물을 증폭함으로써 검출 구조(예를 들어 침입성 분해 반응 에세이에 의해 검출 가능한)가 형성되도록 한다.

역전사 반응, 중합효소 연쇄반응 및 침입성 분해 에세이 반응을 포함하는 에세이를 사용하는 miRNA 검출 성능 및 감도를 최적화하기 위하여, 본 발명의 개발 과정에서 다중의 요인을 시험 및 특성조사하였다. 이들은 형성된 RT 프라이머 / miRNA 이중체(예를 들어 4 내지 10개(예를 들어 6 내지 7개) 염기쌍)의 길이(예를 들어 올리고뉴클레오티드 설계를 통해); 검출을 위해 시료 내에서 이용가능한 miRNA의 카피 수; 형성된 PCR 순방향(forward) 프라이머 / miRNA 이중체(예를 들어 4 내지 10개(예를 들어 7 내지 9개) 염기쌍)의 길이(예를 들어 올리고뉴클레오티드 설계를 통한); 사용된 올리고뉴클레오티드의 농도; 에세이를 수행할 수 있는 반응 온도; 적층체 올리고뉴클레오티드(예를 들어 RT 프라이머 / 인베이더 올리고 또는 PCR 프라이머에 결합하는 올리고뉴클레오티드)의 영향; 헤어핀 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드의 사용; 단일-단계 또는 2-단계 에세이 구성의 사용; 인베이더 제1 탐침 길이(예를 들어 8 내지 10개 염기쌍)의 효과; 단일 miRNA 종의 변이체(예를 들어 돌연변이체)를 구별하는 에세이의 기능; 및 단일 반응(예를 들어 바이플렉스 에세이)에서 하나 이상의 miRNA를 검출하는 에세이의 기능을 포함한다.

A) RT - 프라이머 / miRNA 이중체의 길이

다양한 길이의 RT-프라이머 / miRNA 이중체를 시험 및 특성조사하였다. RT 프라이머-miRNA 이중체 길이의 영향을 miRNA 검출 기능과 함께 시험하기 위하여, RT 프라이머 및 miRNA 사이에 6 내지 7개 염기쌍의 이중체가 형성되도록 RT 프라이머로 사용할 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 반응당 let-7a miRNA 분자의 수준을 변화시키면서(예를 들어, 300,000, 50,000, 8,333, 1,389, 231, 39 및 0) 이들 프라이머에 의한 성과를 삼중실험으로 시험하였다. 10 mM MOPS, pH 7.5, 7.5 mM MgCl₂, 및 25 μM dNTP를 함유하는 완충액 내에 0.5 μM의 순방향 PCR 프라이머 2343-16-01, 0.034 unit/㎕ 천연 Taq 중합효소, 2 unit/ml의 MMLV 역전사 효소, 및 6.67 ng/㎕의 클레아바제 VIII 효소를 함유하는 25 ㎕의 부피 내에서 반응을 수행하였다. 6개 염기쌍 길이의 이중체의 경우에는 0.5 μM의 RT 프라이머 2343-14-01, 0.5 μM 탐침 2343-14-05, 0.25 μM FRET 탐침 23-211을 반응 혼합에 첨가하였다. 7개 염기쌍 길이의 이중체의 경우에는 0.5 μM의 RT 프라이머 2343-03-01, 0.5 μM 탐침 2343-14-08, 0.25 μM FRET 탐침 23-755를 반응 혼합에 첨가하였다. 반응을 96-웰 스커티드(skirted) 플레이트 내에서 조립하고 10 ㎕의 광유로 도포하였다. 플레이트에 30 분 동안 42 ℃의 단일 단계 후에 2 분 동안 95 ℃, 및 30회의 95 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 15 초, 72 ℃에서 45 초의 주기를 적용하였다. 주기의 종료 후에, 반응 플레이트를 99 ℃로 10 분 동안 가열한 후 50 ℃로 15 분 동안 냉각시키고, 각각 560 nm 및 620 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 45의 이득 설정으로, 사이토플루오르(Cytofluor) 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

miRNA 표적과의 7개 염기쌍 이중체를 제공하도록 구성된 RT 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 얻은 데이터는 하기와 같다:

7량체 RT 프라이머 Let-7a 이중체
	카피/ rxn					평균	순 계수
	300,000		1307	1257	1191	1252	1147
	50,000		549	520	538	536	431
	8,333		178	178	174	177	72
	1,389		121	118	114	118	13
	231		108	110	110	109	4
	39		105	106	107	106	1
	-		102	108	109	105
	-		104	102	105

miRNA 표적과의 6개 염기쌍 이중체를 제공하도록 구성된 RT 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 얻은 데이터는 하기와 같다:

6량체 RT 프라이머 Let-7a 이중체
	카피/ rxn					평균	순 계수
	300,000		1006	958	757	907	813
	50,000		436	413	358	402	308
	8,333		143	151	139	144	50
	1,389		103	101	102	102	8
	231		100	94	95	96	2
	39		95	91	92	93	-2
	-		97	93	92	94
	-		99	92	92

따라서 본 발명은, 반응당 let-7a의 동일한 카피 수를 비교할 경우에, 6개 염기쌍 RT 프라이머-miRNA 이중체보다 7개 염기쌍 RT 프라이머-miRNA 이중체에서 순 신호가 더 높으나, 짧은 이중체도 검출하기에 충분한 수준의 신호를 발생시킨다 는 사실을 제공한다. 따라서 일부 구체예에서, 본 발명의 에세이(예를 들어 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응, 및 침입성 분해 에세이 반응 및 검출 구조를 포함하는)는, RT 프라이머 / 인베이더 올리고뉴클레오티드 및 miRNA 표적 사이의 짧은 상동성 영역(예를 들어 10개 뉴클레오티드 미만; 8개 뉴클레오티드 미만; 또는 7개 뉴클레오티드 미만)을 가진 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에도 miRNA 표적을 검출할 수 있다. 일부 구체예에서, RT 프라이머 / 인베이더 올리고뉴클레오티드는 표적 miRNA와 이중체를 형성하지 않는(예를 들어 상보적이지 않은) 기타 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중체를 형성하지 않는 기타 서열은 헤어핀 구조를 형성한다(예를 들어 표적 RNA와 이중체를 형성하지 않는 서열 내의 서열이 폴드백(fold back)되어 그 자신과 결합할 수 있다).

따라서 일부 구체예에서는, 올리고뉴클레오티드와 miRNA 표적 사이에 6개 염기쌍 이중체가 형성되도록 RT 프라이머 / 인베이더 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 일부 구체예에서는, 올리고뉴클레오티드와 miRNA 표적 사이에 7개 염기쌍 이중체가 형성되도록 RT 프라이머 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 본 발명의 실시는 기전의 이해를 필요로 하지 않고, 본 발명은 임의의 특정 작용 기전에 한정되지 않지만, RT 프라이머와 miRNA 표적 사이의 이중체 형성 길이가 증가하면 검출 구조가 더욱 용이하게 형성될 수 있으며(예를 들어 도 32에 기술된 바와 같이 RT 프라이머 올리고뉴클레오티드가 제1 인베이더 올리고뉴클레오티드로서도 사용되는 경우), 이는 짧은 이중체에 비하여 더 높은 순 신호를 제공한다.

B) 낮은 수준의 miRNA 의 검출

검출 수준의 범위를 결정하는 실험에서는 반응당 3 x 10⁶ 내지 2 카피 범위의 다양한 수준의 miR-16 miRNA를 이용하여 25 ㎕ 반응 부피로 시험하였다. 10 mM MOPS, pH 7.5, 7.5 mM MgCl₂, 및 25 μM dNTP를 함유하는 완충액 내에서 0.5 μM의 프라이머 2343-03-05 및 2343-03-06, 0.67 μM의 탐침 2343-03-07, 0.25 μM의 FRET 탐침 23-210, 0.034 unit/㎕ 천연 Taq 중합효소, 2 unit/㎕의 MMLV 역전사 효소, 및 6.67 ng/㎕의 클레아바제 VIII 효소로 반응을 구성하였다. 반응을 96-웰 스커티드 플레이트 내에서 조립하고 10 ㎕의 광유로 도포하였다. 플레이트에 45 분 동안 42 ℃의 단일 단계 후에 2 분 동안 95 ℃, 및 30회의 95 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 60 초의 주기를 적용하였다. 주기의 종료 후에, 반응 플레이트를 99 ℃로 10 분 동안 가열한 후 50 ℃로 30 분 동안 냉각시키고, 각각 485 nm 및 535 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 43의 이득 설정으로, 사이토플루오르 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

얻어진 데이터는 하기와 같다:

miR -16 카피/ rxn	3,000,000	600,000	120,000	24,000	4,800	960	192	38	8	2	tRNA
	2039	2040	2128	2134	2319	2359	2014	1073	1040	918	275
	2087	2161	2254	2236	2391	2327	2203	1185	309	297	301
	2070	2099	2212	2260	2364	2315	2311	310	983	294	292
	1953	2140	2240	2257	2311	2236	2121	1496	295	309	295
순 계수	1746	1819	1918	1931	2055	2018	1871	725	366	164

따라서 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여(예를 들어 역전사 반응, 중합 효소 연쇄반응, 및 침입성 분해 에세이 반응 및 검출 구조를 포함하는 에세이(예를 들어 단일-단계 또는 2-단계 에세이)를 사용하여), 카피 수가 약 38-192 카피에 불과한 miRNA 종을 측정할 수 있다. 따라서 일부 구체예에서, 본 발명은 낮은 카피 수(예를 들어 500 카피 미만; 400 카피 미만; 300 카피 미만; 200 카피 미만; 100 카피 미만; 50 카피 미만)로 존재하는 miRNA를 검출 및 특성조사하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 실시는 기전의 이해를 필요로 하지 않으며, 본 발명은 임의의 특정 작용 기전에 한정되지 않지만, 일부 구체예에서, 인베이더 올리고뉴클레오티드로서도 사용되는 RT 프라이머 올리고뉴클레오티드의 사용은(예를 들어 역전사 반응, 중합효소 연쇄 반응 및 침입성 분해 에세이를 포함하는 에세이에서) 연장(예를 들어 miRNA 주형으로부터)을 위한 적당량의 연합(association)을 제공함과 더불어 매우 낮은 카피 수(예를 들어 100 미만(예를 들어 50 미만))의 표적 miRNA를 검출할 수 있는 검출 구조의 생성 및 검출에 관련된 침입성 분해 효소(예를 들어 클레아바제 효소)에 의한 인식을 위한 적당량의 연합을 제공한다.

C) PCR 순방향 프라이머 / miRNA 이중체(7, 8 및 9 염기쌍)의 길이의 최적화

반응당 3,000 내지 47 분자의 범위에서 다양한 수준의 miR-16 miRNA를 사용하여 miRNA 및 PCR 순방향 프라이머 혼성화의 최적 길이를 시험하였다. 0.5 μM의 하기 프라이머 각각을 사용하여 7, 8 및 9 염기쌍(b.p.)의 혼성화 영역 길이를 시험하였다: 0.034 unit/㎕ 천연 Taq 중합효소, 2 unit/㎕의 MMLV 역전사 효소, 및 6.67 ng/㎕의 클레아바제 VIII 효소, 및 10 mM MOPS 완충액, pH 7.5, 7.5 mM MgCl₂, 및 25 μM dNTP를 함유하는 25 ㎕의 반응에서, 0.5 μM의 RT 프라이머 2343-03-05, 0.67 μM의 탐침 2343-03-07, 0.25 μM의 FRET 탐침 23-210과 혼합된, 2343-03-06(9 b.p.), 2343-10-05(8 b.p.), 2343-10-06(7 b.p.). 반응을 96-웰 스커티드 플레이트 내에서 조립하고 10 ㎕의 광유로 도포하였다. 플레이트에 45 분 동안 42 ℃의 단일 단계 후에 2 분 동안 95 ℃, 및 30회의 95 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 15 초, 72 ℃에서 60 초의 주기를 적용하였다. 주기의 종료 후에, 반응 플레이트를 99 ℃로 10 분 동안 가열한 후 50 ℃로 15 분 동안 냉각시키고, 각각 485 nm 및 535 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 43의 이득 설정으로, 사이토플루오르 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

결과는 하기와 같다:

원 데이터:

프라이머 - miRNA 길이 (b.p.)	9	9	9	8	8	8	7	7	7
miR -16 (분자/ rxn )
3,000	1608	1662	1634	560	1206	843	230	225	219
1,500	1453	1490	1578	735	221	231	240	231	222
750	948	1277	1035	490	259	365	236	230	231
375	970	959	1374	347	224	226	238	238	232
188	669	859	612	218	233	383	214	240	222
94	594	728	894	338	227	233	238	242	230
47	511	561	437	225	230	247	241	241	240
0	686	189	519	223	227	221	228	228	227

가공 데이터:

프라이머 - miRNA 길이 (b.p.)	9		8		7
miR -16 (분자/ rxn )	평균	순 계수 (RFU)	평균	순 계수 (RFU)	평균	순 계수 (RFU)
3,000	1635	1170	870	646	225	-3
1,500	1507	1042	396	172	231	3
750	1087	622	371	147	232	4
375	1101	636	266	42	236	8
188	713	248	278	54	225	-3
94	739	274	266	42	237	9
47	503	38	234	10	241	13
0	465		224		228

따라서 본 발명은, PCR 프라이머-miRNA 이중체의 길이가 9개에서 7개 염기쌍으로 감소함에 따라, miRNA의 검출 에세이(예를 들어 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응, 및 침입성 분해 에세이 반응 및 분해 구조를 포함하는)의 성과가 감소한다는 것을 입증한다. 따라서 일부 구체예에서는, 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA 사이에 약 9개 염기쌍의 이중체가 형성되도록 PCR 프라이머 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 일부 구체예에서, 프라이머 올리고뉴클레오티드는 표적 miRNA 또는 그로부터 생성된 cDNA와 이중체를 형성하지 않는(예를 들어 상보적이지 않은) 기타 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중체를 형성하지 않는 기타 서열은 헤어핀 구조를 형성한다(예를 들어 표적 서열 또는 그로부터 생성된 cDNA와 이중체를 형성하지 않는 서열 내의 서열이 폴드백되어 그 자신과 결합할 수 있다).

D) 단일 또는 다중 탐침을 이용하는 Let -7a miRNA 의 검출

2가지 탐침, 0.5 μM의 2343-14-02 및 40 nM의 2343-14-03을 채택하여, 이들 탐침 중 하나 또는 양자 모두가 존재하는 반응 내에서, 반응당 3 x 10⁸ 내지 3 분자 범위의 Let-7a miRNA 수준을 시험하였다. 모든 반응에 있어서, 0.034 unit/㎕ 천연 Taq 중합효소, 2 unit/㎕의 MMLV 역전사 효소, 및 6.67 ng/㎕의 클레아바제 VIII 효소, 10 mM MOPS, pH 7.5, 7.5 mM MgCl₂, 및 25 μM dNTP를 포함하는 완충액 내에 적절한 수준의 Let-7a, 0.5 μM의 프라이머 2343-14-01 및 2343-16-01, 및 0.25 μM의 FRET 탐침 23-210 및 23-204를 포함하는 25 ㎕의 부피에 상기 농도의 개별적 또는 조합된 탐침을 혼합하였다. 반응을 96-웰 스커티드 플레이트 내에서 조립하고 10 ㎕의 광유로 도포하였다. 플레이트에 45 분 동안 42 ℃의 단일 단계 후에 2 분 동안 95 ℃, 및 29회의 95 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 15 초, 72 ℃에서 45 초의 주기를 적용하였다. 주기의 종료 후에, 반응 플레이트를 99 ℃로 10 분 동안 가열한 후 50 ℃로 30 분 동안 냉각시키고, 각각 485 nm 및 535 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 43의 이득 설정으로, 사이토플루오르 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

얻어진 형광 데이터는 하기와 같으며 도 32에 나타낸다:

탐침	Let -7a (분자/ rxn )	3.E+08	3.E+07	3.E+06	3.E+05	3.E+04	3.E+03	3.E+02	3.E+01	3	0
2343-14-02 0.5 μM		2056	2129	2035	1643	599	315	266	281	255	262
		2071	2144	2061	1681	548	323	233	250	295	252
	평균	2064	2137	2048	1662	574	319	250	266	275	257
	순 계수	1807	1880	1791	1405	317	62	-8	9	18
2343-14-03 40 nM
		1425	1357	822	289	205	190	191	190	188	188
		1448	1393	858	303	205	198	199	196	192	188
	평균	1437	1375	840	296	205	194	195	193	190	188
	순 계수	1249	1187	652	108	17	6	7	5	2
2343-14-02 (0.5 μM) & 2343-14-03 (40 nM )
		3203	3022	2563	1931	851	604	442	343	415	400
		2973	2889	2450	1872	848	540	489	472	437	417
	평균	3088	2956	2507	1902	850	572	466	408	426	409
	순 계수	2679	2547	2098	1493	441	163	57	-2	17

따라서 본 발명은, 탐침 2343-14-02(0.5 μM) 및 2343-14-03(40 nM)의 조합이 miRNA 검출에 있어서 > 6 차수로 확장된 동적 범위를 유발한다는 사실을 제공한다. 따라서 일부 구체예에서, 본 발명의 miRNA 검출 에세이(예를 들어 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응 및 침입성 분해 에세이 반응을 포함하는)는 검출 감도(예를 들어 낮은 카피 수의 miRNA의)를 증가시키기 위하여 하나 이상의(예를 들어 2개, 3개 또는 그 이상) 탐침 올리고뉴클레오티드를 이용한다.

E) 표적 혼성화 영역이 짧은 제1 탐침을 사용하는 반응 온도의 효과

표적 혼성화 영역이 짧은 제1 탐침을 사용하는 에세이의 온도 감도(또는 그의 결여)를 결정하기 위하여 실험을 수행하였다. 45 ℃ 내지 60 ℃의 배양 온도 범위에 걸쳐, 10개 및 11개의 표적 혼성화 염기를 가진 2가지 제1 탐침을 시험하였다.

1. 인베이더 에세이를 위한 올리고뉴클레오티드:

1716-94-1	제1 탐침	5'-GACGCGGAGTACAACCTAC-HEX
1716-94-2	제1 탐침	5'-GACGCGGAGATACAACCTAC-HEX
1716-94-3	RT/프라이머/인베이더	5'-CACGGTCCAGCGAACTAT
1716-94-5	RT/프라이머/인베이더	5'-CACGGTCCAGCGAACTA
1716-94-6	PCR 프라이머	5'-CCAGTGCCGATGAGGTAGTA
1716-94-8	적층체	5'-CGCTGGACCGTG-HEX-3'
Let-7a RNA	표적	5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU

2. Let-7a 앰플리콘(amplicon) 생성: 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-6, 0.4 μM 1716-94-8, 0.5 fM let-7a RNA, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol을 포함하는 RT-PCR 반응에서 let-7a 앰플리콘이 생성되었다. PCR 주기순환(cycling) 프로파일: 37 ℃에서 30 min 후에 28 주기의 95 ℃ 30 초 및 60 ℃ 1 분.

3. Let-7a 앰플리콘 RT-PCR의 개요도

4. 인베이더 에세이: 0.67 μM 1716-94-1, 0.4 μM 1716-94-3, 표적으로 사용된 let-7a 앰플리콘의 10배 희석액 1 ㎕, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소를 포함하는 18 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서, 99 ℃로 10 분 후에 45-60 ℃ 온도 구배로 1 시간 동안, 1716-94-1 탐침으로 인베이더 반응을 수행하였다. 그 다음에, 2 ㎕ 23-210 팔 3-FAM FRET 카세트를 시험관에 첨가하고, 95 ℃에서 1 분 및 54 ℃에 서 10 분 동안 반응을 계속하였다.

5. 1716-94-1 탐침을 사용하는 인베이더 에세이의 개요도

6. 0.67 μM 1716-94-2, 0.4 μM 1716-94-5, 표적으로 사용된 let-7a 앰플리콘의 10배 희석액 1 ㎕, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소를 포함하는 18 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서, 99 ℃로 10 분 후에 45-60 ℃ 온도 구배로 1 시간 동안, 1716-94-2 탐침으로 인베이더 반응을 수행하였다. 그 다음에, 2 ㎕ 23-210 팔 3-FAM FRET 카세트를 시험관에 첨가하고, 95 ℃에서 1 분 및 54 ℃에서 10 분 동안 반응을 계속하였다. '표적이 없는 대조군'에는 앰플리콘 대신에 2 ㎕ H₂O를 사용하였다.

7. 1716-94-2 탐침을 사용하는 인베이더 에세이의 개요도

탐침 1716-94-1 및 1716-94-2를 사용하는 인베이더 반응의 순 신호를 온도의 함수로서 도시하여 도 34에 나타낸다.

따라서 본 발명은, 10개 또는 11개 염기의 표적 혼성화 영역을 가진 제1 탐 침의 사용이 광범위한 온도에 걸쳐 우수하게 기능한다는 사실을 제공한다. 따라서 일부 구체예에서 본 발명은, miRNA 검출을 위한 에세이가(예를 들어, 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응, 및 침입성 분해 에세이 반응 및 검출 구조를 포함하는), 침입성 분해 효소(예를 들어 클레아바제 효소)와 함께 45 내지 60 ℃ 사이의 온도(예를 들어, 일부 바람직한 구체예에서는 50 ℃, 다른 바람직한 구체예에서는 49 ℃, 또 다른 바람직한 구체예에서는 48 ℃, 및 추가의 바람직한 구체예에서는 47 ℃)에서 배양함을 포함한다는 사실을 제공한다.

F) RT - 프라이머 및 PCR 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드에 대한 적층체 올리고뉴클레오티드의 효과

RT 프라이머/인베이더 올리고뉴클레오티드 및 PCR 순방향 올리고뉴클레오티드 프라이머 올리고뉴클레오티드에 대한 적층체 올리고뉴클레오티드의 효과를 시험하기 위하여 실험을 설계 및 수행하였다.

let-7a 에세이를 위한 올리고뉴클레오티드:

1716-94-9

적층체

5'-TCGGCACTGG-HEX

1. let-7a 에세이의 개요도

2. 0.67 μM 1716-94-1, 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-6, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소; 0.25 μM 23-210 팔 3-FAM FRET 카세트; 1716-94-8 및 1716-94-9 적층체(8+9), 1716-94-8 적층체(8), 1716-94-9 적층체(9)의 존재 하에, 또는 적층체의 부재 하에(0) 60,000, 6,000, 600 또는 0 카피의 let-7a RNA를 포함하는 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서 Let-7a 에세이를 실행하였다. 온도 프로파일은 37 ℃에서 30 분; 95 ℃에서 1 분; 28 주기의 95 ℃에서 30 초 및 60 ℃에서 1 분; 99 ℃에서 10 분; 49 ℃에서 30 분이었다.

let-7a 반응의 원 신호를 let-7a RNA 카피 수의 함수로서 도시하여 도 35에 나타낸다.

따라서 본 발명은 일부 구체예에서, 임의의 적층체를 사용하는 것이 적층체가 없는 경우에 비해 바람직하다는 사실을 제공한다(예를 들어 표적 miRNA의 낮은 수준(예를 들어 카피 수)에서). 일부 구체예에서는 표적 핵산(예를 들어 miRNA)의 높은 수준(예를 들어 카피수)에서 적층체의 사용이 더 높은 신호를 유발한다. PCR 순방향 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대한 적층체 올리고뉴클레오티드의 사용은 반응에 어떤 긍정적 유익을 부여하지는 않는 것으로 나타났으며, 일부 경우에는 신호를 사실상 감소시킬 수도 있다. 반면에, RT 프라이머/인베이더 올리고뉴클레오티드의 적층체 사용은 에세이의 감도 증진을 제공하였다.

G) 적층체 올리고뉴클레오티드 대 헤어핀-형성 RT - 프라이머 사용의 비교

RT/프라이머/인베이더 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 헤어핀-형성 영역의 사용을 동일한 영역에서의 적층체 올리고뉴클레오티드의 사용에 대해 비교하기 위하여 실험을 설계 및 수행하였다.

1. 인베이더 에세이를 위한 올리고뉴클레오티드:

2343-03-1

RT/프라이머/인베이더

5'-GCTACCAAGACACGTAGCCAACTAT

2. let-7a 에세이를 위한 적층체 설계의 개요도:

3. let-7a 에세이를 위한 헤어핀 설계의 개요도:

4. 0.67 μM 1716-94-1, 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-6, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소; 0.25 μM 23-210 팔 3-FAM FRET 카세트; 1716-94-8의 존재 하에 60,000, 6,000, 600 또는 0 카피의 let-7a RNA를 포함하는 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서 Let-7a 적층체 에세이를 실행하였다. 온도 프로파일은 37 ℃에서 30 분; 95 ℃에서 1 분; 28 주기의 95 ℃에서 30 초 및 60 ℃에서 1 분; 99 ℃에서 10 분; 49 ℃에서 30 분이었다.

Let-7a 헤어핀 에세이는 적층체 에세이에 관해 기술된 바와 같이 실행되었으나, 다만 1716-94-3 및 1716-94-8 대신에 0.4 μM 2343-03-1을 사용하였다.

let-7a 적층체 및 헤어핀 에세이의 원 신호는 let-7a RNA 카피 수의 함수로서 도시하여 도 36에 나타낸다.

따라서 본 발명은, 적층체의 사용 및 헤어핀-형성 올리고뉴클레오티드의 사용 사이에는 검출 성능(예를 들어 감도)에 있어서 유의적 차이가 관찰되지 않는다는 사실을 제공한다.

H) 단일-단계 대 2-단계 반응 구성의 비교

단일-단계 대 2-단계 반응 구성을 비교하기 위하여 실험을 설계 및 수행하였다. 1-단계 구성에서는, 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응 및 침입성 분해 에세이 반응이 각각 순서적으로 수행되며, 반응 용기에 시약을 첨가하지 않는다. 반면에 2-단계 구성에서는, 역전사 반응 단계 후에 중합효소 연쇄반응 및 침입성 분해 에세이 반응을 위한 시약을 포함하는 반응 용기에 역전사 반응 부피의 1/10을 첨가한 다.

1. 1-단계 let-7a 에세이. 0.67 μM 1716-94-1, 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-6, 0.4 μM 1716-94-8, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소; 0.25 μM 23-210 팔 3-FAM FRET 카세트 및 60,000, 6,000, 600 또는 0 카피의 let-7a RNA를 포함하는 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서 Let-7a 1-단계 에세이를 실행하였다. 온도 프로파일은 37 ℃에서 30 분; 95 ℃에서 1 분; 27 주기의 95 ℃에서 30 초 및 60 ℃에서 1 분; 99 ℃에서 10 분; 49 ℃에서 30 분이었다.

2-단계 let-7a 에세이. 0.25 mM의 각 dNTP, 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-8, 5 unit/㎕ MMLV 및 60,000, 6,000, 600 또는 0 카피의 let-7a RNA를 포함하는 20 ㎕의 MMLV 반응 완충액(Promega) 내에서 37 ℃에서 30 분 동안 제1 단계를 수행하였다. 95 ℃에서 1 분 동안 MMLV를 비활성화시켰다. 0.67 μM 1716-94-1, 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-6, 0.4 μM 1716-94-8, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소; 0.25 μM 23-210 팔 3-FAM FRET 카세트 및 2 ㎕의 제1 단계 반응 시료를 포함하는 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서 제2 단계를 실행하였다. 온도 프로파일은 95 ℃에서 1 분; 27 주기의 95 ℃에서 30 초 및 60 ℃에서 1 분; 99 ℃에서 10 분; 49 ℃에서 30 분이었다.

1-단계 및 2-단계 let-7a 에세이에 의해 발생한 순 신호를 let-7a 카피 수의 함수로서 도 37에 나타낸다.

따라서 본 발명은, 2-단계 구성에서 주형의 1/10 희석을 보정하면, 1-단계 또는 2-단계 에세이 구성을 사용하는 경우에 신호 강도, 검출 한계 또는 동적 범위에 있어서 유의적 차이가 없다는 사실을 제공한다. 따라서 일부 구체예에서, 본 발명은 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응 및 침입성 분해 에세이 반응을 단일 단계에(예를 들어 단일 시험관 내에) 모두 포함하는 에세이를 사용하는 표적 핵산(예를 들어 RNA(예를 들어 miRNA))의 검출을 제공함으로써 시간 및 비용을 절약하고 시료 오염 및/또는 처리오류의 가능성을 감소시킨다. 일부 구체예에서 본 발명은, 2 단계 반응에서 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응 및 침입성 분해 에세이 반응을 포함하고, 여기에서 역전사 반응 단계로부터 얻어진 핵산(예를 들어 cDNA)의 일부를 중합효소 연쇄반응 및 침입성 분해 반응 에세이를 포함하는 후속 단계에 사용하는 에세이를 사용하여 표적 핵산(예를 들어 RNA(예를 들어 miRNA))의 검출을 제공한다.

I) 저온 침입성 분해 에세이 반응에서의 제1 탐침

저온 반응에서 상이한 제1 탐침 길이의 효과를 시험하기 위하여 실험을 설계 및 수행하였다. 8, 9 및 10 염기쌍 길이의 표적 혼성화 영역을 가진 제1 탐침을 50 ℃ 인베이더 반응에서 시험하였다.

1. 인베이더 에세이를 위한 올리고뉴클레오티드:

1716-94-10	제1 탐침	5'-CCACGGACGTACAACCTA-NH2
1716-94-11	제1 탐침	5'- CCACGGACGTACAACCT-NH2

2. 상이한 길이의 탐침을 사용하는 let-7a 에세이의 개요도

3. 0.67 μM 1716-94-1, 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-4, 0.4 μM 1716-94-8, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소; 0.25 μM 23-210 팔 3-FAM FRET 카세트 및 6 10⁶, 6 10⁵, 6 10⁴, 6,000, 600, 60 또는 0 카피의 let-7a RNA를 포함하는 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서 1716-94-1 탐침으로 Let-7a 에세이를 실행하였다. 온도 프로파일은 42 ℃에서 30 분; 95 ℃에서 1 분; 25 주기의 95 ℃에서 20 초 및 60 ℃에서 1 분; 99 ℃에서 6 분; 50 ℃에서 30 분이었다.

4. 0.67 μM 1716-94-10 또는 1716-94-11, 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-4, 0.4 μM 1716-94-8, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소; 0.25 μM 23-204 팔 4-FAM FRET 카세트 및 6 10⁶, 6 10⁵, 6 10⁴, 6,000, 600, 60 또는 0 카피의 let-7a RNA를 포함하는 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서 1716-94-10 또는 1716-94-11 탐침으로 Let-7a 에세이를 실행하였다. 온도 프로파일은 42 ℃에서 30 분; 95 ℃에서 1 분; 25 주기의 95 ℃에서 20 초 및 60 ℃에서 1 분; 99 ℃에서 6 분; 50 ℃에서 30 분이었다.

1716-94-1, 1716-94-10 또는 1716-94-11 탐침을 사용하는 let-7a 에세이에 의해 발생한 순 신호를 let-7a 카피 수의 함수로서 도 38에 나타낸다.

따라서 본 발명은, 8-10개 염기쌍 길이의 표적 혼성화 영역(예를 들어 표적 핵산(예를 들어 miRNA)와 연합하는)을 가진 제1 탐침은 에세이에서 상이한 수준으로 기능한다는 사실을 제공한다. 특히, 제1 탐침의 길이가 증가하면 신호 강도 또한 증가하고(예를 들어, 도 38, 탐침 1716-94-1 참조), 제1 탐침의 길이가 감소하면 신호 강도 또한 감소한다(예를 들어, 도 38, 탐침 1716-94-11 참조).

J) 탐침 길이 및 농도

표적 혼성화 영역의 길이가 상이한 제1 탐침의 사용을 통해 에세이의 동적 범위를 확장할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 실험을 수행하였다. 이 경우에는 8 bp 대 10 bp를 시험하였다. 또한, 10 bp를 포함하는 제1 탐침의 농도를 변화시켰다.

1. 0.67 μM 1716-94-1; 0.067, 0.167 또는 0.33 μM 1716-94-11; 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-4, 0.4 μM 1716-94-8, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소; 0.25 μM 23-204 팔 3-FAM 및 0.25 μM 23-204 팔 4-FAM FRET 카세트 및 6 10⁶, 6 10⁵, 6 10⁴, 6,000, 600, 60 또는 0 카피의 let-7a RNA를 포함하는 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서 동적 범위가 확장된 Let-7a 에세이를 실행하였다. 온도 프로파일은 42 ℃에서 30 분; 95 ℃에서 1 분; 25 주기의 95 ℃에서 20 초 및 60 ℃에서 1 분; 99 ℃에서 6 분; 50 ℃에서 30 분이었다.

1716-94-1 및 1716-94-11 탐침을 상이한 비율로 사용하는 let-7a 에세이에 의해 발생한 순 신호를 let-7a 카피 수의 함수로서 도 39에 나타낸다.

따라서 본 발명은, 0.067 μM - 0.33 μM의 제1 탐침 농도가 본 발명의 에세이에서 기능하며, 일부 구체예에서는 더 높은 농도의 탐침(예를 들어 0.33 μM)을 사용함으로써 낮은 농도(예를 들어 0.067 μM)의 경우에 비해 에세이의 감도가 증가한다는 사실을 제공한다. 따라서 일부 구체예에서는 본 발명의 검출 에세이(예를 들어 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응, 및 침입성 분해 에세이 반응 및 검출 구조를 포함하는)에서 제1 탐침의 농도를 변경(예를 들어, 증가)하면 반응의 감도가 변경(예를 들어, 증가)된다.

K) Let -7 동종체(isoform)의 구별

밀접하게 관련된 Let-7의 동종체(예를 들어, Let-7 변이체)를 구별하는 Let- 7a 에세이의 기능을 시험하기 위하여 실험을 설계 및 수행하였다.

사용된 let-7 변이체는 하기와 같다:

0.67 μM 1716-94-1, 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-4, 0.4 μM 1716-94-8, 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소; 0.25 μM 23-210 팔 3-FAM FRET 카세트 및 6 10⁵, 6 10⁴, 6,000, 600, 60 또는 0 카피의 let-7a RNA를 포함하는 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서 Let-7a 에세이를 실행하였다. 온도 프로파일은 42 ℃에서 30 분; 95 ℃에서 1 분; 25 주기의 95 ℃에서 20 초 및 60 ℃에서 1 분; 99 ℃에서 6 분; 49 ℃에서 30 분이었다.

let-7a 에세이에 의해 발생한 순 신호를 let-7a, let-7c, let-7e 또는 let-7f 카피 수의 함수로서 도 40에 나타낸다.

따라서 본 발명은, 본 명세서에 기술된 핵산(예를 들어, RNA(예를 들어, miRNA)) 검출 에세이(예를 들어, 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응, 및 침입성 분해 에세이 반응 및 검출 구조를 포함하는)의 표적 핵산(예를 들어 Let-7a)에 대한 특 이성이 그의 변이체 서열(예를 들어 Let-7c)에 대비하여 100배임을 제공한다..

L) 내부 표준으로서 let -7a miRNA 및 U6 RNA 에 대한 바이플렉스 에세이.

동일한 반응 용기 내에서 각각 별개의 miRNA에 상응하는 2가지 형광 신호의 검출을 시험하기 위하여 실험을 설계 및 수행하였다.

1. FAM 염료에 보고하는 확장된 범위의 let-7a 에세이 및 RED 염료에 보고하는 U6 RNA 에세이의 개요도.

Let-7a 에세이

U6 에세이

2. 0.67 μM 1716-94-1; 0.33 μM 1716-94-11; 0.4 μM 1716-94-3, 0.4 μM 1716-94-4, 0.4 μM 1716-94-8, 0.4 μM 1716-96-5; 0.04 μM 1716-96-4; 0.04 μM 1716-96-8; 2 unit/㎕ MMLV, 0.033 unit/㎕ TaqPol, 6.7 ng/㎕ 클레아바제 VIII 효소; 0.25 μM 23-210 팔 3-FAM, 0.25 μM 23-204 팔 4-FAM FRET 및 0.25 μM 팔 7- RED 카세트를 포함하는 20 ㎕의 10 mM MOPS pH7.5, 7.5 mM MgCl₂, 0.25 mM의 각 dNTP 내에서 U6로 바이플렉스된 Let-7a 에세이를 실행하였다. 알고 있는 양의 let-7a 및 U6 RNA 또는 상이한 조직으로부터의 총 RNA(Clontech)를 함유하는 분획을 시료로서 사용하였다. 온도 프로파일은 42 ℃에서 30 분; 95 ℃에서 1 분; 20 주기의 95 ℃에서 20 초 및 60 ℃에서 1 분; 99 ℃에서 6 분; 50 ℃에서 10 분이었다.

3. let-7a/U6 바이플렉스 에세이에 의해 발생한 Let-7a 및 U6 특이적 신호는 하기와 같다:

let -7a 표준	순 let -7a 신호	U6 표준	순 U6 신호
6.0E+06	1101	6.0E+08	952
1.2E+06	432	1.2E+08	942
2.4E+05	93	2.4E+07	878
4.8E+04	24	4.8E+06	600
9.6E+03	1	9.6E+05	210
1.9E+03	1	1.9E+05	71
3.8E+02	-2	3.8E+04	12
Clontech 시료		Clontech 시료
심장	1064	심장	840
신장	1212	신장	842
간	467	간	597
폐	1150	폐	774
기관	73	기관	158
골수	9	골수	48
흉선	17	흉선	514
전립선	168	전립선	95
골격근	4	골격근	52
고환	45	고환	324
자궁	33	자궁	288
태아간	41	태아간	265
부신	19	부신	266
침샘	27	침샘	257
갑상선	30	갑상선	273

상기 데이터에 나타낸 바와 같이 본 발명은, 단일-단계 반응에서(예를 들어 단일 반응 용기 내에서) 별개의 2개 miRNA가 동시에 증폭 및 검출될 수 있음을 제공한다.

M) 암과 연계된 miRNA 의 검출을 위한 설계

본 발명의 개발 과정에서, 암과 연계된 다양한 miRNA를 검출할 수 있는 몇 개의 올리고뉴클레오티드가 생성되었다. 올리고뉴클레오티드는 하기 지침에 따라 설계되었다:

1) 6개 염기쌍의 RT 프라이머-miRNA 혼성화 영역.

2)　RT 프라이머는 표적화된 miRNA에 혼성화되었을 때 하기의 3가지 방법으로 동축 적층을 형성한다:

a.　RT 프라이머의 5'-말단이 자기 자신에 폴드백되어 miRNA의 3'-말단에 적층되는 헤어핀을 형성한다.

b. 일단 miRNA에 혼성화되면 miRNA와 동축 적층을 형성하는 RT 프라이머에 혼성화시키기 위해 DNA 올리고뉴클레오티드를 첨가한다.

c. 일단 miRNA에 혼성화되면 miRNA와 동축 적층을 형성하는 RT 프라이머에 혼성화시키기 위해 2'-O-메틸화된 올리고뉴클레오티드를 첨가한다.

3)　9개 염기쌍의 PCR 프라이머 cDNA 혼성화 영역.

각각 팔 3 및 팔 4를 이용하는, miRNA에 상보적인 10개 및 8개 염기쌍의 인베이더 탐침.

이들 지침에 따라 설계된 올리고뉴클레오티드는 도 41에 도시한다.

다양한 길이의 제1 탐침 및 PCR 프라이머 혼성화 영역을 가진 Let-7a 및 miR-16에 대한 추가 설계는 도 42에 나타낸다.

본 실시예에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드의 목록은 도 43에 나타낸다.

상기 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명에 기술된 방법 및 시스템의 다양한 개질 및 변형은, 본 발명의 범위 및 기술 사상을 이탈하지 않으면서 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명을 바람직한 특이적 구체예와 관련하여 기술하였으나, 이러한 특이적 구체예에 본 발명의 청구 범위가 부당하게 한정되어서는 안 된다. 사실상, 본 발명의 실행을 위해 기술된 양식의 다양한 개질로서 분자생물학, 유전학, 또는 관련분야의 당업자에게 명백한 것들은 하기 청구 범위의 범위 내에 포함된다.

<110> THIRD WAVE TECHNOLOGIES. INC. <120> Detection of Nucleic Acids <130> IPA080612 <150> US 60/810,078 <151> 2006-06-01 <160> 285 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(14) <223> 2'-O-methyl <400> 1 ggcacuuuug ugccaactat acaaccg 27 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (23)..(36) <223> 2'-O-methyl <400> 2 ccgtcgctgc gttactacct cacgacguuu ucgucg 36 <210> 3 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(30) <223> 2'-O-methyl <400> 3 cgacgaaaac gucgugaggu aguaacgcag 30 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <400> 4 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(14) <223> 2'-O-methyl <400> 5 ggcacuuuug ugccaactat acaact 26 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (24)..(37) <223> 2'-O-methyl <400> 6 ccgtcgctgc gtctactacc tcacgacguu uucgucg 37 <210> 7 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(31) <223> 2'-O-methyl <400> 7 cgacgaaaac gucgugaggu aguagacgca g 31 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(14) <223> 2'-O-methyl <400> 8 ggcacuuuug ugccaactat acaat 25 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (25)..(38) <223> 2'-O-methyl <400> 9 aacgaggcgc accctactac ctcacgacgu uuucgucg 38 <210> 10 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(32) <223> 2'-O-methyl <400> 10 cgacgaaaac gucgugaggu aguagggugc gc 32 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(16) <223> 2'-O-methyl <400> 11 ggcagcuuuu gcugccctcc atacttctc 29 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (23)..(38) <223> 2'-O-methyl <400> 12 aacgaggcgc acttacattc cacgagccuu uuggcucg 38 <210> 13 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(32) <223> 2'-O-methyl <400> 13 cgagccaaaa ggcucgugga auguaagugc gc 32 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> 2'-O-methyl <400> 14 uggaauguaa agaaguaugg ag 22 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(16) <223> 2'-O-methyl <400> 15 ggcagcuuuu gcugccctcc atacttcc 28 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (24)..(39) <223> 2'-O-methyl <400> 16 aacgaggcgc actttacatt ccacgagccu uuuggcucg 39 <210> 17 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(33) <223> 2'-O-methyl <400> 17 cgagccaaaa ggcucgugga auguaaagug cgc 33 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(16) <223> 2'-O-methyl <400> 18 ggcagcuuuu gcugccctcc atacttt 27 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (25)..(40) <223> 2'-O-methyl <400> 19 aacgaggcgc acctttacat tccacgagcc uuuuggcucg 40 <210> 20 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <400> 20 cgagccaaaa ggcucgugga auguaaaggu gcgc 34 <210> 21 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(13) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> The residue at this position is linked to a quencher. <400> 21 cactgcttcg tgg 13 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (25)..(27) <223> 2'-O-methyl <400> 22 ccaggaagca agtgacgcag cgacggu 27 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(16) <223> 2'-O-methyl <400> 23 ggcacuuuug ugccaactat acaat 25 <210> 24 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> 2'-O-methyl <400> 24 uugguauguu ggaugaugga gu 22 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 25 ugguacguug gaugauggag u 21 <210> 26 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> 2'-O-methyl <400> 26 uugauauguu agaugaugga gu 22 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(16) <223> 2'-O-methyl <400> 27 ccgagcgaaa gcucggttca cataggaatc 30 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (24)..(39) <223> 2'-O-methyl <400> 28 aacgaggcgc acaaaaagcc atacgagccg aaaggcucg 39 <210> 29 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(33) <223> 2'-O-methyl <400> 29 cgagccuuuc ggcucguaug gcuuuuugug cgc 33 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(16) <223> 2'-O-methyl <400> 30 ccgagcgaaa gcucggttca cataggaac 29 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (25)..(40) <223> 2'-O-methyl <400> 31 aacgaggcgc actaaaaagc catacgagcc gaaaggcucg 40 <210> 32 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> 2'-O-methyl <400> 32 cgagccuuuc ggcucguaug gcuuuuuagu gcgc 34 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(16) <223> 2'-O-methyl <400> 33 ccgagcgaaa gcucggttca cataggac 28 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (26)..(41) <223> 2'-O-methyl <400> 34 aacgaggcgc acataaaaag ccatacgagc cgaaaggcuc g 41 <210> 35 <211> 35 <212> RNA <213> 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21 <210> 103 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(17) <223> 2'-O-methyl <400> 103 gcaaugaucu ugugcgc 17 <210> 104 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (24)..(33) <223> 2'-O-methyl <400> 104 aacgaggcgc accttgatct tcaggcuucg gcc 33 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> 2'-O-methyl <400> 105 ggcuucggcc aagcaatgat a 21 <210> 106 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> modified_base <222> (1)..(17) <223> 2'-O-methyl <400> 106 ugaagaucaa ggugcgc 17 <210> 107 <211> 102 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 107 gttcttccga gaacatatac taaaattgga acaatacaga gaagattagc atggcccctg 60 cgcaaggatg acacgcaaat tcgtgaagcg ttccaaattt tt 102 <210> 108 <211> 102 <212> DNA <213> Caenorhabditis briggsae <400> 108 gttcttccga gaacatatac taaaattgga acaatacaga gaagattagc atggcccctg 60 cgcaaggatg acacgcaaat tcgtgaagcg ttccaaattt tt 102 <210> 109 <211> 107 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60 ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tattttt 107 <210> 110 <211> 106 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 110 gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60 ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tatttt 106 <210> 111 <211> 107 <212> DNA <213> Xenopus sp. <400> 111 gtgcttgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60 ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tattttt 107 <210> 112 <211> 107 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is a, c, g, or t <400> 112 ngtgcctgct tcggcagcac atatactaaa attggaacga tacagagaag attagcatgg 60 cccctgcgca aggatgacac gcaaattcgt gaagcgttcc atatttt 107 <210> 113 <211> 108 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is a, c, g, or t <400> 113 ngttcttgct tcggcagaac atatactaaa attggaacga tacagagaag attagcatgg 60 ccccagcgca aggatgacac gcaaaatcgt gaagcgttcc acattttt 108 <210> 114 <211> 102 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 114 gtcccttcgg ggacatccga taaaattgga acgatacaga gaagattagc atggcccctg 60 cgcaaggatg acacgcataa atcgagaaat ggtccaaatt tt 102 <210> 115 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <400> 115 ccgtcgctgc gtctactacc tcacgacgtt ttcgtcguga gguaguaggu uguauaguug 60 gcacttttgt gccaactata caact 85 <210> 116 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <400> 116 ccgtcgctgc gtctactacc tcacgacgtt ttcgtcgtug agguaguagg uuguauaguu 60 tggcactttt gtgccaacta tacaact 87 <210> 117 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <400> 117 ccgtcgctgc gtctactacc tcacgacgtt ttcgtcugag guaguagguu guauaguugc 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17 <210> 124 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is a, c, g, or t <400> 124 ccgtcgctgc gtctactacc tcanh 25 <210> 125 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is a, c, g, or t <400> 125 ccgtcacgcc tcctactacc tcanh 25 <210> 126 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <400> 126 mgmgmcmamc mumumumumg mumgmcmcaa ctatacaact 40 <210> 127 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 127 mumgmamgmg mumamgmuma mgmamcmgmc mamg 34 <210> 128 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 128 mumgmamgmg mumamgmuma mgmgmamgmg mcmg 34 <210> 129 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 129 ycactgcttc gtgg 14 <210> 130 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 130 ycactcgaac gtcg 14 <210> 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 137 catccttgcg caggggccat ga 22 <210> 138 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 138 mamumamcma mgmamgmama mgmamumuma mgmgmumgma mumc 44 <210> 139 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 139 mamumamcma mgmamgmama mgmamumuma mgmgmumgmc mumg 44 <210> 140 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 140 yctcttctca gtgcg 15 <210> 141 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 141 yctctgcata gtccg 15 <210> 142 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <400> 142 cgcagtgaga atgaggtgat ctcggcmgmg mu 32 <210> 143 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence <400> 143 cggagtatgc atgaggtgct gcgtgcmumu mu 32 <210> 144 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> DNA/RNA sequence 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275 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 275 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 276 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 276 hsrurgrarg rgrurargru rargrgruru rgrurarurg rgruru 46 <210> 277 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 277 hsrurgrarg rgrurargrg rargrgruru rgrurarura rgru 44 <210> 278 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 278 hsrurgrarg rgrurargru rargraruru rgrurarura rgruru 46 <210> 279 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 279 hsrurcrcrc rurgrargra rcrcrcrura rarcrururg rurgra 46 <210> 280 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 280 hsrururara rurgrcrura rarurcrgru rgrarurarg rgrgrg 46 <210> 281 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 281 hsrurargrc rargrcrarc rarurararu rgrgrururu rgrurg 46 <210> 282 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial 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Claims (20)

1. a) ⅰ) 내지 ⅳ)를 제공하는 단계:

   i) miRNA 표적;

   ii) 상기 miRNA 표적에 상보적인 제1 영역 및 상기 miRNA 표적에 상보적이지 않은 제2 영역을 포함하는, 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드;

   iii) 상기 miRNA 표적의 제2 영역에 상동적인 제1 영역 및 상기 miRNA 표적의 제2 영역에 상동적이지 않은 제2 영역을 포함하는, 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드;

   iv) 역전사 효소;

   v) DNA 중합효소;

   vi) 탐침 올리고뉴클레오티드, 여기에서 상기 탐침 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 상기 miRNA의 적어도 일부와 상보적임; 및

   vii) 5' 말단 부분을 포함하는 적층체(stacker) 올리고뉴클레오티드, 여기에서 상기 적층체 올리고뉴클레오티드의 적어도 5' 말단 부분은 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 상기 제1 영역에 인접한 제1 올리고뉴클레오티드의 상기 제2 영역에 상보적임;

   b) 검출 구조가 형성되는 조건 하에서 구성성분 (i) 내지 (vii)를 함께 배양하는 단계; 및

   c) 상기 검출 구조를 검출하는 단계

   를 포함하는 miRNA 표적을 검출하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 검출이 상기 탐침 올리고뉴클레오티드를 포함하는 침입성 분해 구조(invasive cleavage structure)의 형성, 상기 침입성 분해 구조의 분해, 및 상기 침입성 분해 구조의 분해의 검출을 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드가 역전사의 프라이머(primer)로서 사용되는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드가 침입성 분해 반응에서 인베이더 올리고뉴클레오티드로서 사용되는 방법.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, (viii) 검출 구조를 분해할 수 있는 효소를 제공하는 것을 추가로 포함하며, 상기 효소가 중합효소 활성이 없는 방법.
7. 제6항에 있어서, 검출 구조를 분해할 수 있는 상기 효소가 FEN-1 뉴클레아제인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 탐침 올리고뉴클레오티드가 표지되지 않는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 역전 사 효소가 miRNA 표적을 역전사하여 miRNA cDNA 표적을 생산하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 miRNA cDNA 표적이 중합효소 연쇄반응에서 상기 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드 및 DNA 중합효소에 의해 증폭되는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 증폭된 miRNA cDNA 표적이 상기 탐침 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 검출 구조를 형성하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드가, 상기 올리고뉴클레오티드 및 miRNA 표적 사이에 6-10개 염기쌍의 이중체(duplex)가 형성되도록 하는 핵산 서열을 포함하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 표지되지 않은 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 탐침 중 하나 또는 양자 모두의 제2 영역이 제1 부분 및 제2 부분을 포함하며, 여기에서 제2 영역 내의 제1 부분 및 제2 부분은 서로 혼성화되어 헤어핀(hairpin) 구조를 형성할 수 있는 방법.
14. 제1항에 있어서, (ix) 상기 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드 탐침의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
15. 제1항에 있어서, (ix) 상기 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드 탐침의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 검출이 표지된 탐침의 사용을 포함하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 표지된 탐침이 FRET 검출을 위해 구성되는 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 miRNA가 Let-7, miR-1, miR-135, miR-15, miR-16, miR125b, miR-1d 및 miR124a로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
19. i) miRNA 표적에 상보적인 제1 영역 및 상기 miRNA 표적에 상보적이지 않은 제2 영역을 포함하는, 표지되지 않은 제1 올리고뉴클레오티드;

    ii) 상기 miRNA 표적의 제2 영역에 상동적인 제1 영역 및 상기 miRNA 표적의 제2 영역에 상동적이지 않은 제2 영역을 포함하는, 표지되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드;

    iii) 역전사 효소;

    iv) DNA 중합효소;

    v) 탐침 올리고뉴클레오티드;

    vi) 5' 말단 부분을 포함하는 적층체(stacker) 올리고뉴클레오티드, 여기에서 상기 적층체 올리고뉴클레오티드의 적어도 5' 말단 부분은 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 상기 제1 영역에 인접한 제1 올리고뉴클레오티드의 상기 제2 영역에 상보적임; 및

    vii) 검출 구조를 분해할 수 있는 효소

    를 포함하는 키트.
20. 제19항에 있어서, 상기 검출 구조가 침입성 분해 구조를 포함하는 키트.

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