KR101093687B1 - ＥＬＦ9 유전자를 이용하여 식물체의 조기 개화와 ｍＲＮＡ안정성에 변화를 유도하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대 유래의 ELF9(EARLY FLOWERING 9) 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 제조하여 식물체의 조기 개화를 유도하거나, 조기 종결 코돈(premature termination codon)을 함유한 mRNA 안정성을 조절하는 방법, 애기장대 유래의 ELF9(EARLY FLOWERING 9) 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA가 삽입되어 조기 개화 및 조기 종결 코돈을 함유한 다수의 mRNA 안정성에 변화가 유도된 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

ELF9, SOC1, T-DNA, 전사체, 조기 개화, NMD

Description

ＥＬＦ9 유전자를 이용하여 식물체의 조기 개화와 ｍＲＮＡ 안정성에 변화를 유도하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 식물체{Method for inducing early flowering and changes in mRNA stability of plant using ELF9 gene and plant produced by the same}

본 발명은 ELF9 유전자를 이용하여 식물체의 조기 개화와 mRNA 안정성에 변화를 유도하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ELF9 유전자를 이용하여 SOC1 전사체의 발현을 조절함으로써 식물체의 조기 개화를 유도하는 방법, 조기 종결 코돈을 함유한 다수의 mRNA 안정성에 변화를 유도하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 식물체에 관한 것이다.

개화는 영양생장에서 생식생장으로의 발달적 변화이다. 이 전환의 시점이 다음 세대의 성공에 결정적이기 때문에 개개 식물종은 내부 발달 신호뿐 아니라 환경적 신호에 적절히 반응하는 기작을 세밀히 조율하는 기작을 발달시켜 왔다. 모델 식물인 애기장대의 분자유전적 연구로 개화시기의 조절에 관여되는 몇 주요 경로들이 밝혀져 왔다. 이들 경로 중 광주기 경로는 주요 환경적 신호인 일장의 길이를 감지하여 개화를 조절한다. 광주기는 파이토크롬 비 (Phytochrome B, PHYB) 및 크 립토크롬 2 (Cryptochrome 2, CRY2) 같은 광수용인자에 의해 잎에서 주로 인식된다. 그러면 그라프트 전달 신호 (graft-transmissible signal)가 잎에서 어린 줄기 정단부로 이동하여, 여기서 개화로의 전환을 자극한다 (Kobayashi and Weigel, (2007) Genes Dev 21:2371-2384). CONSTANS (CO)는 광주기 경로에서 주요 역할을 한다 (Putterill et al., (1995) Cell 80:847-857). 애기장대에서 CO의 전사활성은 GIGANTEA (GI) 및 CYCLING DOF FACTOR1 (CDF1)를 통해 생체시계에 의해 조절된다 (Imaizumi et al., (2005) Science 309:293-297). CO 활성은 CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1, Jang et al., (2008) Plant Cell 20:292-306) 및 SUPPRESSOR OF PHYA-105 (SPA; Laubinger et al., (2006) Development 133:3213-3222)의 기능을 포함하는 유비퀴틴 (UBQ)-의존성 단백질분해 경로에 의해서 단백질 수준에서도 조절된다. 따라서 저녁에 생체시계에 의해 유도된 높은 수준의 CO의 발현이 장일 조건 하에서 빛에 의해 유도된 CO 단백질의 안정화와 일치할 때만 CO 활성은 개화를 활성화하기에 충분한 수준에 이른다 (Baurle and Dean, (2006) Cell 125:655-664). 이런 발견은 광주기성에 대한 Bunning (1936, Ber Deut Bot Ges 54:590-607)의 외부부합 모델 (external coincidence model)과 일치한다.

온대 기후지역의 식물에 대한 또 다른 주요 환경적 신호는 겨울 저온에의 노출이다. 이런 노출에 의한 개화의 촉진을 춘화처리라 한다 (Sung and Amasino, (2005) Annu Rev Plant Biol 56:491-508). 애기장대에 있어 이런 개화촉진은 개화 억제자 FLC의 epigenetic silencing에 기인한다 (Sheldon et al., (1999) Plant Cell 11:445-458). 이같은 춘화처리 매개된 개화촉진효과는 2년생 또는 겨울종 1년 생 식물들에서 더 명확하다. 애기장대에 있어 겨울 1년생 습성은 FRIGIDA (FRI) 및 FLC의 우성 기능성 대립인자에 의한 것이다 (Lee et al., (1994) Plant J. 6:903-909). FRI는 FLC의 전사활성제이므로, 춘화처리는 FLC 전사에 미치는 FRI 활성에 반하는 작용을 한다. 인위적으로 유도된 개화지연 돌연변이체들의 일부는 FRI-함유 겨울 1년생 개화기 습성과 유사한 개화시기 특성을 보인다 (Koornneef et al., (1991) Mol Gen Genet 229:57-66). 이 돌연변이체들 관련 유전자들을 집합적으로 자발적 경로 유전자 (autonomous-pathway genes)라 한다 (Koornneef et al. (1991) Mol Gen Genet 229:57-66). 보통 FLC 억제제로 작용하는 자발적 경로 유전자는 보통 두 집단으로 구성되며, 첫째는 추정적인 RNA 결합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 반면, 둘째는 염색질 조절인자 (chromatin modifier)를 암호화하는 유전자를 포함한다 (Noh and Noh, (2006) Physiol Plant 126:484-493). FCA (Macknight et al., (1997) Cell 89:737-745), FPA (Schomburg et al., (2001) Plant Cell 13:1427-1436), FY (Simpson et al., (2003) Cell 113:777-787), 및 FLOWERING LOCUS K (FLK; Lim et al., (2004) Plant Cell 16:731-740)는 RNA-결합 또는 RNA-가공 단백질을 암호화하는 자발적 경로의 구성원들이다. FLOWERING LOCUS D (FLD; He et al., (2003) Science 302:1751-1754), FVE (Ausin et al., (2004) Nat Genet 36:162-166), RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6 (REF6; Noh et al., (2004) Plant Cell 16:2601-2613), 및 HISTONE ACETYLTRANSFERASEs OF THE CBP FAMILY (HACs; Han et al., (2007) Plant J 49:103-114)는 자발적 경로에 작용하는 염색질 조절인자를 암호화하는 유전자이다. 요약하면 애기장대에서 주요 개화억제 제인 FLC는 FRI, 춘화처리, 자발적 경로를 포함하는 다수의 개화조절 입력자들의 수렴자로서 작용한다.

애기장대 게놈에서 FLC는 MADS box 단백질을 암호화하는 5개의 다른 유전자와 함께 작은 유전자 패밀리 (MADS AFFECTING FLOWERING (MAF) 1~5; Parenicova et al., (2003) Plant Cell 15:1538-1551)를 이룬다. 이전 연구에서는 이들 MAF 유전자의 일부가 FLC와 함께 조절되는 것으로 보였다 (Han et al., (2007) Plant J 49:103-114). 이들 중 하나인 MAF1 (FLOWERING LOCUS M, FLM이라고도 불림)은 일차적으로 비유도성 광주기 하에서 개화를 억제하는 것으로 알려졌다 (Scortecci et al., (2001) Plant J 26:229-236). MAF2는 짧은 저온처리에 반응하여 이른 춘화처리 (premature vernalization)를 막는다 (Ratcliffe et al., (2003) Plant Cell 15:1159-1169).

CO에 의해 중재되는 광주기성 개화촉진 활성은 FLC의 개화억제 활성에 의해 중화되며 이들 서로 반대로 작용하는 신호들은 개화 통합체 (floral integrators)라는 몇 유전자로 수렴한다. FLOWERING LOCUS T (FT), SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1 (SOC1), 및 LEAFY (LFY)가 개화 통합체로 작용하는 것으로 알려진 세 유전자들이다 (Simpson and Dean, (2002) Science 296:285-289). FT와 SOC1는 CO와 FLC의 효과를 통합할 수 있다. SOC1은 지베렐린 (GA)-의존성 개화촉진신호 통합에 관여한다 (Moon et al., (2003) Plant J 35:613-623). LFY는 프로모터에 있는 불연속적 시스 인자 (cis elements)를 통하여 광주기와 지베렐린 신호를 통합한다 (Blazquez and Weigel, (2000) Nature 404:889-892). 이들 개화 통합체 중에서 FT은 자엽과 잎의 사부조직에서 발현되고 (Takada and Goto, (2003) Plant Cell 15:2856-2865), FT 단백질은 어린 줄기 정단부로 이동하여 (Corbesier et al., (2007) Science 316:1030-1033), 여기서 APETALA 1을 발현시키기 위해 FD와 상호작용한다 (AP1; Abe et al., (2005) Science 309:1052-1056).

MADS-box 단백질을 암호화하는 유전자 SOC1의 전사조절에 관한 많은 연구가 있었다. SOC1는 별개의 프로모터 인자에 의하여 CO 및 FLC에 의해 각각 양 또는 음으로 조절된다 (Hepworth et al., (2002) EMBO J 21:4327-4337). 비록 CO가 미지의 DNA 결합 단백질을 통하여 SOC1을 조절하지만 SOC1에 미치는 FLC의 효과는 직접적이다 (Searle et al., (2006) Gene Dev 20:898-912). SOC1 전사에 미치는 지베렐린의 양성 효과에 관한 분자적 기작은 아직 파악되지 않았다. 최근 또 다른 MADS-box 단백질인 AGAMOUS-LIKE 24 (AGL24) 그리고 SOC1가 개화전이 중 두 유전자의 전사를 증대시키는 양의 피드백 고리를 형성함이 밝혀졌다. 어린 줄기 정단부에서는 FT-FD 복합체가 아마도 간접적인 기작을 통하여 개화 전이 중 SOC1 전사에 양성 효과를 미치는 것으로 보인다. 영양조직에서 FLC와 상호작용할 수 있는 MADS-box 단백질인 SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)는 어린 줄기 정단부에서 SOC1 전사를 직접적으로 억제하는 것으로 보고되었다 (Li et al., (2008) Development 135:1481-1491).

따라서 SOC1은 다수의 개화조절 입력체를 통합하는 복합 전사조절망 하에 있다. 그러나 SOC1의 전사후 조절은 아직 보고된 바 없다.

개화시기 조절과 관련된 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 인위적으로 조절하고자 하는 기술들로는, 대한민국특허 제319395호에는 애기장대의 생체시계 및 개화시기 조절 유전자 자이겐티아(GIGANTEA)가 개시되어 있고, 대한민국특허 제0519049호에는 bCIP1 단백질과 이를 암호화하는 DNA를 이용하여 식물체의 개화시기를 조절하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국특허 제0510959호에는 식물의 개화시기 조절 유전자인 COG를 이용한 식물의 조기 개화를 유도하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국특허 제0648146호에는 AGL28 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 촉진하는 방법이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 EARLY FLOWERING 9 (ELF9)이 애기장대의 RNA 결합단백질로서 SOC1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1) 전사체를 직접적인 표적으로 하여, 넌센스-매개된 mRNA 분해 (NMD) 기작을 통해서 그 발현을 조절함으로써, 식물체의 개화 시기를 조절한다는 것을 밝히고, 조기 종결 코돈을 함유한 다수의 애기장대 mRNA의 안정성에 변화를 유발한다는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래의 ELF9(EARLY FLOWERING 9) 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 제조하여 식물체의 조기 개화를 유도하거나, 조기 종결 코돈을 함유한 mRNA 안정성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래의 ELF9(EARLY FLOWERING 9) 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA가 삽입되어 조기 개화 및 조기 종결 코돈을 함유한 다수의 mRNA 안정성에 변화가 유도된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명에 따르면, 애기장대 유래의 ELF9(EARLY FLOWERING 9) 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 제조하여 식물체의 조기 개화를 유도하여 꽃과 종자의 생산 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, ELF9 유전자를 이용하여 식물의 개화시기 조절 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다. 나아가 조기 종결 코돈을 함유한 다수의 mRNA 안정성에 변화를 유발하여 식물의 발달과 반응성을 조절하는 효과가 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래의 ELF9(EARLY FLOWERING 9) 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 제조하여 식물체의 조기 개화를 유도하거나, 조기 종결 코돈을 함유한 mRNA 안정성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 애기장대 유래의 ELF9 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 ELF9 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 T-DNA 삽입 위치는 ELF9 유전자 의 RNA 인지 모티프 (RNA-Recognition Motif; RRM) 내일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 RRM2 내일 수 있다 (도 1의 C 참고). ELF9 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조기 개화 유도 방법에서, 상기 돌연변이체는 SOC1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1) 전사체 수준을 증가시킴으로써 조기 개화를 유도할 수 있으며, 상기 SOC1 전사체 수준은 넌센스 매개 mRNA 분해를 통해 조절될 수 있다. 또한, 상기 돌연변이체는 단일 조건에서 조기 개화를 유도할 수 있다. SOC1 전사체는 ELF9 단백질의 직접적인 타겟이 되며, ELF9 단백질은 넌센스 매개 mRNA 분해를 통해 SOC1 전사체 수준을 감소시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조기 종결 코돈을 함유한 mRNA 안정성을 조절하는 방법에서, 상기 mRNA 안정성은 넌센스 매개 mRNA 분해를 통해 조절될 수 있다.

본 발명은 또한, 애기장대 유래의 ELF9(EARLY FLOWERING 9) 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA가 삽입되어 조기 개화 및 조기 종결 코돈을 함유한 다수의 mRNA 안정성에 변화가 유도된 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 애기장대 유래의 ELF9 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 ELF9 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물체에서, 상기 T-DNA는 ELF9 유전자의 RNA 인지 모티프 (RNA-Recognition Motif; RRM) 내에 삽입될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 RRM2 내에 삽입될 수 있다 (도 1의 C 참고).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 식물체와 생장조건

elf9 돌연변이체는 Ws 백그라운드로 만들어진 활성화-태깅 T-DNA 삽입 집단에서 분리하였다. 두 돌연변이체, Col 백그라운드의 soc1-2 (Moon et al., (2003) Plant J 35:613-623) 및 soc1-101D FRI (Lee et al., (2000) Gene Dev 14:2366-2376)에 관해서는 예전에 기술하였다. RT-PCR을 위해서는, 표면 멸균한 종자를 1% 수크로스 함유하는 MS 배지 (Murashige and Skoog, (1962) Physiol Plant 15:473-477)에 파종하여, 2 일간 4℃에서 암소에 둔 후, 22℃에 옮겼다. 모든 식물체는 22℃, ~100 μEm^-2s^-1 시원한 백색 형광 빛 하에서 재배하였다.

2. T-DNA 주변 염기서열 분석

elf9 의 T-DNA 주변 염기서열은 Schomburg 등 (2003, Plant Cell 15:151-163)에 기술된 바에 따라 thermal asymmetric interlaced PCR (Liu et al., (1995) Plant J 8:457-463)을 이용하여 얻었다. elf9의 T-DNA 경계부는 T-DNA 경계 프라이머 (JL270: 5'-TTTCTCCATATTGACCATCATACTCATTG-3'; 서열번호 3) 및 유전자-특이 프라이머를 사용하여 얻은 PCR 산물을 염기서열분석하여 정했다.

3. ChIP 분석

ChIP은 14 내지 16일된 실생(seedling)을 사용하여 Han 등 (2007, Plant J 49:103-114) 에 기술된 바에 따라 수행했다. 간략하게, 실생은 가교(cross-linking)를 위하여 1% 포름알데히드로 진공 침윤하여, 가교 과정 중단 후 액체질소에서 갈았다. 염색질은 분리하여 0.5 내지 1 kb 단편으로 초음파 절단하였다. RNA PolII-특이 항체 (Covance, Emeryville, CA, USA)는 연어 정자 DNA/Protein A 아가로스 비드 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)로 precleared한 염색질액에 첨가하였다. 연어 정자 DNA/Protein A 아가로스 비드에 연이은 배양 후, 면역복합체를 침전시킨 후 비드로부터 분리하였다. 가교를 역전시키고, 면역복합체내의 잔존 단백질은 proteinase K와 배양하여 제거하고 페놀/클로로포름으로 추출하였다. DNA는 에탄올 침전으로 회수하였다. 면역침전된 SOC1 염색질의 양은 SOC1 프로모터의 4가지 상이한 영역을 평가하는 PCR로 측정하였다. 각 PCR 반응에 사용된 프라이머 염기서열은 다음과 같다: SPR1, PF1 (5'-GGGTACTTAATCTTTCGTTGAC-3'; 서열번호 4) 및 PR1 (5'-CTTGTCTGCTTGTTGCATTCTC-3'; 서열번호 5); SPR2, SOC1Fa (5'- CAAACCCTTTTAGCCAATCG-3'; 서열번호 6) 및 PR2 (5'-GTTTGGGTGGGAGAAGACTGATG-3'; 서열번호 7); SPR3, PF3 (5'-GCTCCTCCCTCTTTCTTTCTC-3'; 서열번호 8) 및 PR3 (5'-CTCTGCGAAAGGAAGAACC-3'; 서열번호 9); SPR4, PF4 (5'-TACAAGTGGGGGCATATAGG-3'; 서열번호 10) 및 PR4 (5'-GTCGCAAATATGATGGACGC-3'; 서열번호 11); Actin, JP1595 (5'-CGTTTCGCTTTCCTTAGTGTTAGCT-3'; 서열번호 12) 및 JP1596 (5'-AGCGAACGGATCTAGAGACTCACCTTG-3'; 서열번호 13).

4. IP-RT-PCR

IP-RT-PCR에서는 (Wang et al., (2008) Nature 454:126-130)을 참고하였으며, 초음파처리 단계를 삭제한 것을 제외하면 ChIP과 같은 방식으로 하였다. 간략히 하면, 14 내지 16일 된 실생을 가교를 위해 1% 포름알데히드와 진공 침윤하여, 가교 중단 후 액체질소에서 갈았다. Myc-특이 항체 (Upstate Biotechnology)를 연어 정자 DNA/Protein A 아가로스 비드 (Upstate Biotechnology)로 preclear한 용액에 첨가하였다. 연이어 연어 정자 DNA/Protein A 아가로스 비드와 배양 후 면역복합체를 침전시켜 비드로부터 분리하였다. 가교를 역전시키고, 면역복합체 내의 잔존 단백질은 proteinase K와 배양하여 제거하고 페놀/클로로포름 (phenol/chloroform)으로 추출하였다. 회수된 RNA는 SOC1 7 번째 엑손 특이 프라이머, SOC1EX7R (5'-CTGCAGCTAGAGCTTTCTC-3'; 서열번호 14, 도 8) 또는 oligo-dT 프라이머 (도 9)를 사용하여 RT-PCR에 대해 기술된 바와 같이 역전사 시켰다. SOC1에 대해서는 면역침전된 RNA로부터 역전사된 cDNA의 양은 SOC1 pre-mRNA의 다섯 영역 의 PCR 증폭에 의하여 측정하였다. 각 PCR 반응에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: SIT1, SOC1Fa (5'-CAAACCCTTTTAGCCAATCG-3'; 서열번호 15) 및 SOC1EX5R (5'-GCTCCTCGATTGAGCATGTTCC-3'; 서열번호 16); SIT2, SOC1Fa 및 SOC1EX3R (5'-GCTGACTCGATCCTTAGTATGCC-3'; 서열번호 17); SIT3, SOC1F (5'-TGAGGCATACTAAGGATCGAGTCAG-3'; 서열번호 18) 및 SOC1EX5R; SIT4, SOC1F 및 SOC6INT (5'-GCAAGCACAAGAGGCTTAC-3'; 서열번호 19); SIT5, SOC1F 및 SOC1R (5'-GCGTCTCTACT TCAGAACTTGGGC-3'; 서열번호 20). 도 9C에 있는 전사체에 대하여서는 RT-PCR 분석에 사용한 프라이머를 IP-RT 후 생성된 cDNAs 양 측정에도 사용하였다.

5. GUS 및 GFP 분석

ELF9pro:ELF9:GUS 해독 융합 구축물을 제작하기 위해, 0.6-kb 5' 업스트림 영역과 전 코딩 영역을 포함하는 ELF9의 4.7-kb 게놈 단편을 프라이머 ELF9GUS-Pst (5'-aaactgcagACTCTTCTACTGGTGATGAAGAAG-3'; 서열번호 21) 및 ELF9GUS-Sma (5'-acccgggCTCAGCAGCTTCCAGTTC-3'; 서열번호 22)를 사용하여 PCR 증폭으로 얻었다. 생성된 PCR 산물은 PstI 및 SmaI으로 절단하여 동일한 제한 효소로 절단한 pPZP211-GUS (Noh and Amasino, (2003) Plant Cell 15:1671-1682)와 붙였다. CaMV35Spro:ELF9:GFP 융합 구축물은 프라이머 ELF9GFP-Sal (5'-gtcgacATGTCAGACTCTGATAATC-3'; 서열번호 23) 및 ELF9GFP-Sma (5'-acccgggaaCTCAGCAGCTTCCAGTTC-3'; 서열번호 24)로 1.6-kb ELF9 cDNA 단편의 PCR 증폭으로 만들었다. SalI-SmaI으로 절단 후 PCR 산물을 JJ461 (Han et al., (2007) Plant J 49:103-114)에 붙였다. 클로닝 위한 제한효소 절단부위는 프라이머 염기서열에 밑줄을 그어 표시하였고, cDNA의 ELF9 게놈에 해당되는 염기서열은 대문자로 표시하였다. 야생형 Ws 식물체는 ELF9pro:ELF9:GUS 또는 CaMV35Spro:ELF9:GFP 구축물을 지니는 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 ABI를 사용하여 침윤 (Clough and Bent, (1998) Plant J 16:735-743)에 의하여 형질전환하였다. 조직화학적 GUS 염색은 하기에 기술된 바와 같이 선발된 형질전환 식물체로 Schomburg 등 (2001, Plant Cell 13:1427-1436)에 따라 수행하였다. ELF9pro:ELF9:GUS 또는 CaMV35Spro:ELF9:GFP 구축물을 지니는 형질전환 식물체는 각각 50 ㎍/ml의 카나마이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 또는 50 ㎍/ml의 하이그로마이신 (Sigma-Aldrich)이 든 MS 배지에서 선발하였다. GFP 융합 단백질은 488nm에서 여기되었으며, 신호는 Confocal Laser Scanning Microscope (MRC-1024, Bio-Rad, UK)를 사용하여 HQ515/30 여기 필터로 여과하였다.

6. RT-PCR 분석

역전사는 상기에 기술한 바와 같이 2.5 ㎍의 총 RNA를 사용하여 Superscript II (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 및 oligo-dT 프라이머로 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 반정량적 PCR은 제1가닥 DNA를 사용하여 i-Taq DNA 중합효소 (iNtRON Biotechnology Inc., 서울, 한국) 및 각 유전자에 대하여 하기의 프라이머 쌍으로 수행되었다: CRY2 (5'-GACAATCCCG CGTTACAAGGCG-3'; 서열번호 25와 5'-CGTTGTAACGAACAGCCGAAGG-3'; 서열번호 26), FT (5'- GCTACAACTGGAACAACCTTTGGCAAT-3'; 서열번호 27과 5'-TATAGGCATCATCACCGTTCGTTACTC-3'; 서열번호 28), GI (5'-GTTGTCCTTCAGGCTGAAAG-3'; 서열번호 29와 5'-TGTGGAGAGCAAGCTGTGAG-3'; 서열번호 30), CO (5'-AAACTCTTTCAGCTCCATGACCACTACT-3'; 서열번호 31과 5'-CCATGGATGAAATGTATGCGTTATGGTTA-3'; 서열번호 32), FLC (5'-TTCTCCAAACGTCGCAACGGTCTC-3'; 서열번호 33과 5'-GATTTGTCCAGCAGGTGACATCTC-3'; 서열번호 34), FLM (5'-GGCATAACCCTTATCGGAGATTTGAAGC-3'; 서열번호 35와 5'-ACACAAACTCTGATCTTGTCTCCGAAGG-3'; 서열번호 36), MAF2 (5'-GGGTCTCCGGTGATTAGG-3'; 서열번호 37과 5'-CTTGAGCAGCGGAAGAGT CTCCC-3'; 서열번호 38), MAF3 (5'-CATTTTGGGTCCCCGGTGG-3'; 서열번호 39와 5'-GCGAAAGAGTCTCCGGTAC-3'; 서열번호 40), MAF4 (5'-CGTTCAGTGTCTCCGGCGAG-3'; 서열번호 41과 5'-CGTAGCAGGGGGAAGAAGAGG-3'; 서열번호 42), MAF5 (5'-TTCAGGATCTCCGACCAG-3'; 서열번호 43과 5'-CAGCCGTTGATGATTGGTGG-3'; 서열번호 44), SVP (5'-CGCTCTCATCATCTTCTCTTCCAC-3'; 서열번호 45와 5'-GCTCGTTCTCTTCCGTTAGTTGC-3'; 서열번호 46), UBQ (5'-GATCTTTGCCGGAAAACAATTGGAGGATGGT-3'; 서열번호 47과 5'-CGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAACAGG-3'; 서열번호 48). SOC1 RT-PCR에 사용된 프라이머는 상기 IT-RT-PCR 부분에서 기술하였다. 내재적 ELF9 발현 연구를 위하여, ELF9F (5'-AATACCTGCAACGGTTGTTCTGCGCTACAT-3'; 서열번호 49)와 ELF9UTR (5'-ACTAGATAAAACCGGTCCTCTGGGTTTGCG-3'; 서열번호 50)이 사용되었다. 도 7B에 있는 총 ELF9 발현을 측정하기 위하여, ELF9F와 ELF9OER (5'-ACCCGGGCTCAGCAGCTTCCAG TTC-3'; 서열번호 51)이 사용되었다. FCA, FY, FVE, 및 FLD에 사용된 RT-PCR 프라이머 는 사전에 기술되었으며 (Han et al., (2007) Plant J 49:103-114), elf9에서 NMD를 평가하기 위해 사용된 프라이머는 사전에 기술되었다 (Arciga-Reyes et al., (2006) Plant J 47:480-489). PCR 산물의 양은 Metamorph™ 소프트웨어 (Universal Imaging Corp. UK)를 사용하여 이미지에 근거하여 정량화되었다.

7. ELF9 의 과발현

ELF9를 과발현시키기 위하여 ELF9의 전 코딩 영역을 지니는 4.1-kb의 게놈 DNA를 프라이머 ELF9OEF (5'-ggatccCCATGTCAGACTCTGATAATC-3'; 서열번호 52)와 ELF9OER (5'-acccgggCTCAGCAGCTTCCAGTTC-3'; 서열번호 53)를 사용하여 PCR 증폭으로 만들었다. 클로닝에 사용된 제한효소 절단 부위에는 밑줄을 그어 표시하였으며 ELF9 게놈 DNA에 해당되는 염기서열은 대문자로 표시하였다. 생성된 PCR 산물은 BamHI-SmaI으로 절단하여 BamHI-SnaBI으로 절단한 myc-pBA (Zhou et al., (2005) Plant J 43:356-370)에 붙였다. 상기 구축물을 지니는 아그로박테리움 투머파시엔스 균주 GV3101로 야생형 Ws의 형질전환 및 형질전환체의 선발은 50 ㎍/ml의 BASTA (glufosinate ammonium; Aventis, 한국) 함유한 MS 배지에서 수행하였다. 강력한 ELF9 mRNA 발현을 보이는 두 대표 라인을 elf9 돌연변이체와 교배하였다. T3 세대에서 동형접합 라인을 선발하여, 개화시기의 변화에 대하여 평가하였다.

8. elf9 의 보상실험

elf9 돌연변이체의 보상실험을 위하여, ELF9의 0.6-kb 5' 업스트림 영역, 전 코딩 영역 및 3'-비해독영역을 지니는 6.1-kb의 ELF9 게놈 단편을 프라이머 ELF9GUS-Pst (5'-aaactgcagACTCTTCTACTGGTGATGAAGAAG-3'; 서열번호 54)와 ELF9-Kpn (5'-cggggtaccTGCGAATAA AACATTCCTCGT-3'; 서열번호 55)를 사용하여 PCR 증폭하여 만들었다. 클로닝에 사용된 제한효소 절단 부위에는 밑줄을 그어 표시하였으며 ELF9 게놈 DNA에 해당되는 염기서열은 대문자로 표시하였다. 생성된 PCR 산물은 Pst1과 KpnI으로 절단하여 pPZP211-G (Noh et al., (2001) Plant Cell 13:2441-2454 )내 Pst1 및 KpnI 절단 부위 사이에 넣었다. elf9 돌연변이체는 상기 구축물을 지니는 아그로박테리움 투머파시엔스 균주 GV3101로 형질전환되었으며, 형질전환된 식물체를 선발하여 개화시기의 변화에 대하여 평가하였다.

실시예 1. ELF9 의 돌연변이가 단일 조건에서 조기 개화를 야기한다

elf9 돌연변이체는 비개화유도성 단일 (SD; 8 시간의 낮과 16 시간의 밤)에서의 조기 개화 표현형에 근거하여 바실레브스키야 (Wassilewskija, Ws) accession 유래의 애기장대 T-DNA 삽입 돌연변이체 집단으로부터 분리하였다. 단일 조건에서 elf9 돌연변이체는 근생엽이 11~12 장일 때, 한편 야생 Ws 식물체는 근생엽이 32~33 장일 때 개화하였다 (도 1A과 1B). 유도성 장일 조건에서는 (LD; 16 시간의 낮과 8 시간의 밤) 돌연변이체와 야생형 모두에서 근생엽이 6~7 장일 때 개화함으로써 조기 개화 표현형은 뚜렷하지 않았다 (도 1B). elf9 돌연변이체는 단일조건에서 야생형에 비하여 잎이 작았다 (도 1A). 개화시기의 차이가 나지 않는 장일 조건에서 돌연변이체와 야생형 간에 크기의 차이가 없는 것으로 보아 이는 단일에서 돌 연변이체가 일찍 개화하기 때문일 것이다. 개화시기에 근거한 분리비를 보면 elf9 돌연변이가 열성이다 (자료 미제시).

elf9은 T-DNA 삽입 집단에서 분리되었으므로, T-DNA 삽입부 주변 염기서열을 알기 위하여 thermal asymmetrical interlaced 중합효소연쇄반응 (TAIL-PCR; 실험방법 참조)으로 At5g16260의 14 번째 엑손에서 T-DNA를 찾았다 (도 1C). 이 T-DNA는 큰 분리집단에서 조기 개화 표현형과 함께 분리 (co-segregation) 되었다 (자료 미제시). elf9의 조기 개화가 At5g16260에서 T-DNA의 삽입에 의한 것인지 검정하기 위해, 693 bp 업스트림 영역, 전체 코딩 영역, 1.3 kb의 3' 비해독 영역 (UTR)을 포함하는 At5g16260의 5.5 kb의 게놈 DNA로 elf9 돌연변이체를 형질전환하였다. elf9의 조기 개화 표현형이 이 게놈 단편을 지니는 3개의 형질전환체에서 완전히 복구되었음 (도 1D와 1E)은 At5g16260가 ELF9이라는 증거이다.

ELF9는 두 RNA 인지 모티프를 지니는 단백질을 암호화한다 (RRMs; 도 1C). 애기장대 게놈은 196 RRM-함유 단백질을 암호화하는 유전자를 지닌다 (Lorkovic and Barta, (2002) Nucleic Acids Res 30:623-635). ELF9의 두 RRMs은 임의의 다른 애기장대 RRMs에 상동성이 거의 없다. 오히려, 이들 모티프들은 효모 CUS2와 사람 Tat-SF1의 RRMs에 상동성을 보인다 (도 1F). CUS2는 splicing-competent U2 snRNP의 어셈블리 (assembly)를 도우는 스플라이싱 인자인 것으로 보고되었다 (Yan et al., (1998) Mol Cell Biol 18:5000-5009). Tat-SF1는 HIV 복제에 필수적인데, 이는 HIV 프로모터에 대한 Tat-SF1의 recruitment가 Tat-enhanced HIV-1 전사에 중요한 신장 인자(elongation factor)를 제공하기 때문이다 (Zhou and Sharp, (1996) Science 274:605-610).

실시예 2. ELF9의 공간적 발현 양상과 핵내 위치

ELF9의 공간적 발현양상을 연구하기 위하여 ELF9의 전체 코딩 영역과 함께 0.6 kb의 프로모터를 지니는 게놈 DNA를 β-glucuronidase (GUS) 리포터 유전자와 인프레임으로 클로닝하였다. GUS 발현양상은 적어도 12 개의 형질전환체에서 조직화학적 GUS 염색으로 조사하였다. 비록 발현수준은 약간씩 달랐지만 형질전환체들 간에 공통적인 공간적 발현양상이 보였다. GUS 발현은 10일된 실생 (seedling)의 근단뿐 아니라 자엽의 유관속 조직과 어린 줄기 정단부에서 가장 현저하게 나타났다 (도 2A 및 2B). GUS 발현은 꽃의 주두, 약, 화사에서도 분명하게 관찰되었다 (도 2C).

ELF9에 두 RRMs의 존재는 ELF9이 핵 또는 세포질 단백질임을 나타낸다. 따라서, ELF9의 세포 내 위치 파악을 위하여, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S (CaMV35) 프로모터와 ELF9 전 코딩 영역, 이어 인프레임 녹색 형광단백질 (GFP)을 포함하는 ELF9:GFP 융합구조물을 야생 Ws 식물체에 도입하였다. 도 2D-2K에서 보이는 것처럼, GFP 형광은 두 형질전환 식물체의 실생 하배축 세포의 핵에서 분명히 감지되었다. 그러나, GFP 형광은 조사한 세포의 어느 것에서도 세포질에서는 좀처럼 감지되지 않았다. 따라서, ELF9:GFP 융합 단백질은 애기장대에 있어 특이하게 또는 우선적으로 핵에 국한되어 있다.

실시예 3. 완전하게 그리고 불완전하게 스플라이싱된 형태의 SOC1 전사체의 수준은 elf9 에서 증가한다

elf9의 조기 개화를 유도하는 분자적 기작을 이해하기 위하여, 야생 Ws 에 있어 다양한 개화관련 유전자의 발현수준을 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)으로 elf9 돌연변이체의 것과 비교하였다. 상기 분석에서 CRY2, GI, CO, 및 FT 같은 광주기 경로에 작용하는 유전자의 발현수준은 단일 조건에서 두 다른 ZT (zeitgever: 빛을 비춘 후의 시간) 시점에서 elf9 돌연변이에 의해 변화되지 않았고 (도 3A), FLC, 몇 FLC-family MADS 유전자 (FLM, MAF2~MAF5, SVP), 몇 FLC 억제제 (FCA, FY, FVE, FLD)의 발현은 영향받지 않았다 (도 3A). 그러나, SOC1F와 SOC1R 프라이머를 사용한 RT-PCR (도 5A)에서의 SOC1 전사체의 수준은 ZT4와 ZT16 양 시점에서 elf9 돌연변이체에서 분명히 증가하였다 (도 3A).

SOC1 전사체의 수준은 ZT2~3에서 정점에 달하며 낮 동안에 일주 리듬을 보이는 것으로 보고되었다 (El-Din et al., (2003) Plant Physiol 133:1504-1516). 따라서, SOC1 전사체 수준의 증가가 elf9 돌연변이에 의하여 야기된 상변화 (phase shift)에 기인한 것인지를 평가하기 위하여 야생형 Ws와 elf9 돌연변이체에서 SOC1 전사체의 일주 발현양상을 조사하였다. SOC1 전사체는 야생형과 elf9 돌연변이체 모두에서 ZT4에서 최고치였으며 변동 (oscillation)을 보였고, 한편 ELF9 전사체는 단일 조건에서 구성적으로 발현되었다 (도 3B). 조사했던 매 시점마다 야생형 식물체보다 elf9의 SOC1 전사체의 수준이 높았던 것은 SOC1 전사체 양의 변화가 SOC1 일주 발현양상에 있어서의 상변화에 기인한 것이 아님을 나타낸다. 오히려, 이들 자료는 ELF9이 SOC1 발현의 억제에 관여됨을 보여준다.

일주 주기 중에 elf9 돌연변이체에 있어 SOC1 전사체의 수준 증가에다가 분석한 모든 SOC1 RT-PCR 시료에서 elf9 돌연변이체에서 보다 고분자량의 DNA 밴드를 발견하였다 (도 3A 및 3B). 상기 밴드는 약 520 bp 크기였다 (자료 미제시). 상기 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머 (SOC1F 및 SOC1R, 도 5A 및 실험방법 참조)는 완전히 스플라이싱된 SOC1 mRNA의 경우 401 bp 밴드, 게놈 SOC1을 증폭하는 PCR 산물의 경우 약 1.1 kb 밴드를 증폭시켜야 한다. 따라서, 상기 얻어진 밴드는 게놈 SOC1는 아니고, SOC1 전사체의 산물로 여겨진다. SOC1 전사체의 산물로 추정되는 보다 고분자량의 약 520 bp 밴드는 완전히 스플라이싱된 SOC1 mRNA와 동일한 일주 발현양상을 보였으며, 그 발현수준은 조사한 모든 ZT 시점에서 야생식물체에 비하여 elf9 돌연변이체에서 높았다. 고분자량 밴드의 보다 상세한 확인을 위하여, SOC1 cDNA 전체를 증폭하는 프라이머를 사용하여 SOC1 cDNA를 증폭시켰다 (SOC1Fa 및 SOC1R; 도 5A). 한 PCR 반응에 두 다른 산물의 동시적인 정량화는 현실적이지 않으므로 상기 과정을 위하여 실시간 RT-PCR 대신에 다양한 PCR 증폭 사이클 (28X, 32X, 및 36X; 도 3C)을 사용하였다. 완전히 스플라이싱된 652 bp의 SOC1 mRNA (SOC1T)와 770 bp 이상의 보다 고분자량 전사체 (SOC1 변이체; SOC1V) 모두는 28 회 PCR 사이클에서 야생형에 비하여 elf9 에서 증가하였다(도 3C 내지 3E). SOC1T의 수준은 28회와 32회 PCR 사이클 모두에서 야생형에 비하여 elf9에서 높았다. 그러나 36회 PCR 사이클에서는 반응이 거의 포화상태였으므로 그 차이가 분명하지 않았다 (도 3C 및 3D). 야생형과 elf9에서 SOC1V와 SOC1T간의 상대량을 비교하였다. 조사한 모든 증폭 사이클에서 SOC1V의 상대적인 양은 야생식물체에서 보다 돌연변이체에서 분명히 높았다 (도 3F). 요약하면, 완전히 스플라이싱된 SOC1 mRNA (SOC1T)와 보다 고분자량의 변이체 SOC1 전사체 (SOC1V)은 elf9 돌연변이의 결과 증가하였으며, SOC1V가 SOC1T에 비하여 훨씬 더 증가하였다.

elf9에서 SOC1T와 SOC1V 양자가 동시에 증가하므로, 야생형에 비하여 elf9 에서 SOC1 전사 활성이 증가하는지 조사하게 되었다. 이를 평가하기 위하여 RNA PolII-항체로 염색질 면역침전법 (ChIP 분석)을 사용하여 SOC1 프로모터와 RNA 중합효소II (PolII)의 상관 (association) 수준을 측정하였다. SOC1 프로모터의 여러 다른 영역들에 해당되는 프라이머를 ChIP 분석에 사용하였다 (도 4A). FRI-함유 콜롬비아 (Col FRI; Lee at al., (2000) Gene Dev 14:2366-2376) 보다 훨씬 높은 SOC1 전사활성을 지니는 것으로 알려진 soc1-101D FRI에서 RNA PolII의 상관을 먼저 측정하였다. Col FRI 에 비하여 soc1-101D FRI에서 SOC1 프로모터 영역 SPR1과 SPR2에 대한 RNA PolII 결합이 상승됨이 관찰되었다 (도 4B). SPR3 영역은 활성화-태깅 T-DNA의 삽입으로 인하여 ChIP 분석에서 soc1-101D FRI로부터 증폭되지 않았다 (자료 미제시). soc1-101D FRI에 있어 SOC1 개시코돈에서 수 kb 업스트림에 위치한 SPR4 영역에서는 Col FRI 와 soc1-101D FRI 간에 RNA PolII 결합에 있어서의 차이는 없었다 (도 4B). elf9에서는 야생식물체에 비하여 SOC1 프로모터 영역과 RNA PolII 상관에 있어 큰 차이는 없었다 (도 4C). 따라서, ELF9는 전사 외의 기작을 통하여 SOC1 발현을 억제하는 것이다.

실시예 4. SOC1V는 6 번째 인트론이 스플라이싱 안된 SOC1 스플라이싱 변이체이다

SOC1V의 분자적 특징을 알기 위하여 SOC1V를 젤에서 분리 정제하여 (도 3C) 전 영역에 대하여 염기서열 결정을 하였다. SOC1V는 774 bp이며, 스플라이싱 안된 6 번째 인트론이 포함된 부분적으로 스플라이싱된 SOC1 전사체였다 (도 5A). 기대했던 바 대로 SOC1T는 완전히 스플라이싱된 SOC1 mRNA이었다 (자료 미제시). SOC1V 에는 6 번째 인트론 내에 인프레임 해독 종결코돈 (TGA)이 있어 SOC1V는 불완전한 SOC1 단백질을 암호화하게 된다. 야생형과 elf9에 있어 SOC1V 양을 측정하기 위해 SOC1의 6 번째 인트론을 인지하는 프라이머 (SOC6INT; 도 5A)로 RT-PCR을 수행하였다. SOC1V의 수준은 야생형에서 보다 elf9에서 분명히 높았고 (도 5B), SOC1V의 발현수준은 야생형에 비하여 elf9에서 약 세 배 높았다 (도 5C).

도 1에서 보이는 것처럼, elf9의 조기 개화는 게놈 At5g16260 구축물에 의하여 완전히 극복될 수 있다. elf9 돌연변이는 두 SOC1 전사체 (SOC1T 및 SOC1V; 도 3)의 수준을 높이므로, 상기 증가가 같은 게놈 구축물로 회복될 수 있을 것으로 여겨졌다. 이를 증명하기 위하여 두 SOC1 전사체의 발현수준을 두 독립적인 보상 라인 (complementation lines)으로 점검하였다. elf9에 있어 SOC1T와 SOC1V 양자의 발현수준 증가가 보상 라인에 있어 야생형에서 감지된 수준까지 회복된 것으로 보아 (도 5D), elf9 돌연변이가 실제로 SOC1T와 SOC1V 양자의 증가된 발현의 원인이라는 증거이다.

SOC1의 6 번째 인트론의 donor site에서의 돌연변이가 최근에 보고되었다 (Lee et al., (2008) Plant J 55:832-843). SOC1의 6 번째 인트론의 첫 번째 뉴클레오티드 위치에 구아니 대신 아데닌이 있는 soc1-101D 14 (sso14) 돌연변이체의 FRI-함유 suppressor는 끝이 잘린 SOC1 단백질을 발현하여 soc1-101D FRI의 극단적인 조기 개화와 SOC1 FRI의 극단적인 개화지연 간의 중간적인 개화 표현형을 보였다 (Lee et al., (2008) Plant J 55:832-843). SOC1 활성화-tagged soc1-101D FRI에서 높은 수준의 SOC1T와 적절한 수준의 SOC1V가 RT-PCR에 의하여 탐지되었다. sso14에서는 네 가지 다른 형의 SOC1 전사체가 도 3C에서 사용된 프라이머에 의하여 증폭되었다. 그러나, sso14에 있는 네 스플라이싱 변이체 각각은 이론적으로 SOC1 단백질이 절단된 정도가 다르므로 어느 스플라이싱 변이체가 sso14에 있어 부분적인 SOC1 활성에 기여하는지 명확하지 않다. SOC1V로 암호화된 부분 절단된 SOC1 단백질이 sso14 분석으로 보아 부분적인 활성을 지니는지는 결론지을 수 없었다.

실시예 5. elf9 의 조기 개화는 SOC1 의 발현증가 때문일 것이다

다양한 개화유전자를 사용한 본 연구에서, 야생형에 비하여 elf9 돌연변이체에 있어 일정한 수준의 증가된 전사체가 유지되는 것은 SOC1이 유일하였다 (도 3A). 이는 SOC1의 발현증가가 elf9의 조기 개화의 원인이라는 가능성을 증가시킨다. 상기 가능성을 검정하기 위하여 각각 Ws와 Col accessions인 elf9와 soc1-2 (Moon et al., (2003) Plant J 35:613-623)를 교배하였다 . 이 두 accessions은 개화시기가 다르므로 교배로 F2 집단을 만들어 분리되는 각 유전형에 대하여 개화기 를 직접 측정하였다 (도 6). 야생형 Col과 Ws 식물체는 근생엽이 각각 12~13 장 및 7~8 장 되었을 때 개화하였고 soc1-2는 근생엽이 22~23 장일 때, elf9은 근생엽이 약 6 장일 때 개화하였다. F2 집단에서 elf9 단일 동형접합 돌연변이체 및 soc1-2 단일 동형접합 돌연변이체는 근생엽이 각각 7~8 장 및 약 17 장일 때 개화하였다. 그러나, soc1-2 elf9 이중 동형접합 돌연변이체는 soc1-2 단일 돌연변이체와 거의 같은 시기인 근생엽이 17~18 장일 때 개화하였다. 따라서, soc1-2가 elf9에 대하여 완전히 우위성(epistatic)이며, 이는 elf9에서 관찰된 조기 개화가 돌연변이체에서 SOC1의 발현증가 때문임을 나타낸다.

실시예 6. ELF9 의 구성적 과발현이 elf9 돌연변이 표현형을 극복하나, 부가적인 효과를 야기하지는 않는다.

ELF9 활성의 소실은 SOC1T 및 SOC1V의 발현을 증가시켜, 조기 개화로 이끈다 (도 3, 5, 및 6). 따라서, 개화시기와 SOC1 발현 양자에 미치는 ELF9 과발현 (OE)의 효과도 평가하였다. CaMV35S 프로모터, MYC tag, 전 게놈 ELF9를 사용하여 ELF9OE 구축물을 만들어 이를 야생형 Ws에 도입하였다. 강력한 ELF9 mRNA 발현을 보이는 두 대표적 형질전환체 (Ws의 MycELF9OE1 및 Ws의 MycELF9OE2)를 선발하여 elf9 돌연변이체와 교배하였다.

Ws 또는 elf9 돌연변이체 배경의 MycELF9OE1 및 MycELF9OE2 표현형은 야생형 Ws 식물체와 동일하였다 (도 7A). 이들 모든 형질전환 식물체는 야생형 Ws에 비하여 비록 SOC1T 및 SOC1V의 발현수준은 대략 동일하였지만, ELF9 mRNA의 발현이 상 승되었음을 보였다 (도 7B). 특히 elf9에 있어 SOC1T 및 SOC1VI의 증가된 발현은 elf9 돌연변이체 백그라운드에서 ELF9의 과발현에 의하여 완전히 극복되었다.

SOC1T 및 SOC1V 발현의 극복과 일치하여 Ws와 elf9에 있어 MycELF9OEs의 개화시기는 장일 (도 7C) 및 단일 (도 7D)조건에서 야생형 Ws에 있어서와 크게 다르지 않았다. 따라서 ELF9의 과발현은 차별적 SOC1 발현에 의한 elf9의 조기 개화를 극복하였으나 개화를 지연시키거나 부가적인 형태적 표현형을 유도하지는 않았다.

실시예 7. SOC1 전사체에 ELF9의 직접적인 결합

상기에 제시된 모든 분자적 및 유전적 자료는 ELF9이 SOC1 pre-mRNA의 가공(processing)에 관여함을 제안한다. ELF9은 RRM-함유 단백질이므로, SOC1 pre-mRNA 가공에 직접적인 역할을 할 수 있다. 이 가설을 검정하기 위하여 elf9 식물체에서 MycELF9OE1~2를 사용하여 면역침강 후 RT-PCR (IP-RT-PCR; Wang et al., (2008) Nature 454:126-130)을 수행하였다. Myc-특이 항체로 면역침강 후, SOC1의 7 번째 엑손 (SOC1EX7R; 도 8A)에 특이적인 역방향 프라이머로 역전사효소가 있을 때 ((+) RT) 또는 없을 때 ((-) RT) 역전사를 수행하였다. SOC1 pre-mRNA를 따라 여러 위치를 인지하게 고안된 프라이머로 PCR 하였다 (도 8A 및 8B).

첫째, MycELF9OE1~2 식물체의 SIT3 영역에서 역전사효소가 있을 때 밴드가 나타났다 (도 8B). 게놈 DNA (도 8B의 'Input') 또는 완전히 스플라이싱 안된 SOC1 pre-mRNA로부터 500 bp 이상의 단편이 증폭될 것으로 기대되었기 때문에, IP-RT-PCR 후 MycELF9OE1~2 식물체에서 특이적으로 풍부한 162 bp 밴드는 3, 4 번째 인트 론이 없는 스플라이싱된 SOC1 전사체의 산물이다. 둘째, 결합 신호 증폭은 MycELF9OE1~2 식물체의 SIT4 영역에 대해서도 얻어졌다 (도 8B). 정방향 및 역방향 프라이머 모두가 엑손 영역에서 고안된 SIT3와 달리, SIT4의 역방향 프라이머는 SOC1V의 6 번째 인트론의 염기서열을 인지하게 디자인되었다. 따라서, 277 bp의 SIT4 밴드는 3, 4, 5 번째 인트론은 제거되었으나 6 번째 인트론을 지니는 부분적으로 스플라이싱된 SOC1 전사체가 증폭된 것이다. 연장된 RT-PCR 증폭 후에도 SOC1V가 유일한 스플라이싱 변이체인 것으로 보아 (도 3C), IP-RT-PCR 후 MycELF9OE1~2 식물체에 있어 277 bp의 SIT4 밴드는 SOC1V이 ELF9의 결합 표적임을 나타낸다. 따라서, 이들 IP-RT-PCR 분석에서 MycELF9OE1~2 식물체의 SIT3 및 SIT4 영역에서의 결합 증폭은 완전히 스플라이싱 안된 SOC1 pre-mRNA가 아닌 SOC1V가 ELF9의 우선적 결합 표적임을 제시한다.

SIT1 및 SIT2 영역에서 증폭이 없는 것은 역전사 중에 보다 짧은 SOC1 cDNAs에 비하여 SOC1 cDNA 전체 영역의 생성효율이 보다 낮기 때문일 것이다. 다른 한편으로 IP-RT-PCR에 사용된 연장된 면역침강 기간 중에 SOC1 전사체의 전 영역이 보다 짧은 전사체에 비해 잔여 핵산분해효소의 공격에 대해 보다 취약하기 때문일 수도 있다. 역전사 반응 중 oligo-d(T) 프라이머 대신 SOC1EX7R 사용 시 SIT5에 대해 역방향 프라이머에 의해 인지되는 8번째 엑손은 cDNA로 역전사 되지 않았다. 따라서, 역전사 효소가 없을 때 ((-) RT) 외에도, SIT5가 부가적인 대조구로서 작용함은 SIT3 및 SIT4에서의 밴드가 SOC1 전사체로부터 유래한 것이라는 증거이다.

실시예 8. ELF9는 애기장대에서 넌센스 매개된 mRNA 분해 (NMD)에 필요하다

elf9 돌연변이체에서 SOC1T 및 SOC1V의 수준은 SOC1 염색질과 RNA PolII간의 결합 증가 없이 높아졌고 (도 3 및 4), ELF9 단백질이 3~5 번째 인트론은 없으나 6 번째 인트론은 지닌 SOC1V-유사 부분 스플라이싱된 SOC1 전사체에 직접적으로 결합되었다 (도 8). 상기 결과는 ELF9이 전사 후 과정에서 SOC1 발현에 참여한다는 것을 나타내므로 ELF9의 생화학적 역할에 관하여 세 가지 안이 추정되며, 첫째는 SOC1 스플라이싱, 둘째는 SOC1 전사체의 핵에서 세포질로의 수송, 셋째는 NMD이다. 그러나, 첫 두 안은 elf9 돌연변이체에 있어 SOC1T 및 SOC1V의 동시적인 증가와 일치하지 않는다.

셋째 안은 미성숙 해독 종결코돈을 지닌 비정상적인 전사체 (PTC; Isken and Maquat, (2008) Nat Rev Genet. 9:699-712)을 분해하는 시스템인 NMD에 있어 ELF9의 가능한 역할이다. SOC1V는 PTC 지닌 비정상적인 SOC1 전사체 (도 5A)이고, 따라서 NMD에 대한 표적이다. elf9 돌연변이체에 있어 SOC1V의 증가는 이 안과 일치한다. 더욱이, 몇 야생형 mRNAs는 NMD 돌연변이체에서 상향조절됨이 알려졌다. 텔로머라제(telomerase) 인자 혹은 조절자를 암호화하는 효모 mRNAs (Dahlseid, et al., (2003) Eukaryot Cell 2:134-142), CPA1 mRNA (Ruiz-Echevarria and Peltz, (2000) Cell 101:741-751), SPT10 mRNA (Welch and Jacobson, (1999) EMBO J 18:6134-6145)가 그러하다. CPA1 mRNA는 PTC로 이끄는 업스트림 ORF (uORF) 때문에 NMD에 의해 분해된다. 리보좀은 때때로 개시점 AUG 넘어까지 스캔하여 다음 다운스트림 AUG에서 개시하여 ('leaky scanning') 미성숙 해독종결이 되게 하므로 SPT10 mRNA가 NMD 표적이 된다. SOC1 5'-미해독 영역 및 코딩 영역의 염기서열 분석으로 uORF 후보자뿐 아니라 leaky-scanning에 대한 후보가 되는 다수의 개시 코돈이 보였다 (자료 미제시). 따라서 야생형 SOC1 mRNA (SOC1T)뿐 아니라 SOC1V 가 NMD의 통제 하에 있을 가능성이 있고, 이들 전사체의 발현은 NMD 돌연변이체에서 증가된다.

비록 애기장대에서 NMD의 분자적 기작은 알려지지 않았지만 효모 및 동물에서 진화적으로 보존된 NMD의 주요 인자인 up-frameshift (UPF) 1 및 3의 애기장대 상동체의 유전적 기능은 알려졌다 (Arciga-Reyes et al., (2006) Plant J 47:480-489). 본 연구에서는 PTCs 지니는 몇 전사체가 애기장대 upf1 및 upf3 돌연변이체에서 상향조절됨을 보였다. 따라서 애기장대에서 ELF9이 NMD에 관여되는지 알기 위한 첫 단계로서 이들 5 개 PTC-함유 애기장대 전사체의 발현수준을 (도 9A) 야생형과 elf9, 그리고 elf9 보상 라인들 (complementation lines) 중의 하나에서 조사하였다. 조사된 PTC-함유 전사체 중, AGL88, At1g10160, At1g66710의 경우에는 elf9에 있어 분명히 상향 조절되었으며, 증가된 발현은 ELF9 게놈 구축물에 의하여 회복되었다 (도 9B). RT-PCR 분석에서 PTC-함유 At3g63340 전사체는 elf9에서 소폭 증가하였지만, PTC-함유 At5g62760b 전사체는 야생형과 elf9 간에 차이가 보이지 않았다.

다음에는 elf9에 있어 PTC-함유 전사체의 증가가 ELF9 단백질에 의하여 직접적으로 매개되는지 검정하기 위하여 IP-RT-PCR을 수행하였다. 도 9C에서처럼 elf9에서 분명히 증가된 세 가지 모든 전사체는 IP-RT-PCR 후 MycELF9OE1~2 식물체에서 도 밴드로 증폭되었으며, 이것이 역전사 후에만 있다는 것은 ELF9이 이들 유전자의 RNAs에 특이적으로 결합한다는 것이다. 따라서, 애기장대에 있어 ELF9은 SOC1 및 상기 검정된 유전자의 전사체를 포함하여 PTC-함유 전사체에 대하여 NMD에 관여하는 것으로 보인다. 이 과정에서 RRM 단백질 ELF9은 UPF1, UPF3, 및 다른 미지의 인자로 구성된 NMD 장치에 대하여 어느 정도의 표적 특이성을 제공한다.

도 1은 단일 조건에서 elf9 의 조기 개화 및 ELF9 유전자이다. (A)는 장일 조건에서 63 일(d)간 자란 야생형 Ws 및 elf9 돌연변이체이다. (B)는 Ws (흑색 상자) 및 elf9 (회색 상자) 식물체의 개화시기이다. 야생형 Ws 및 elf9 돌연변이체를 장일 및 단일 조건에서 키웠으며, 개화시기는 추대 시 근생엽의 수로 결정하였다. 각 유전형에 대하여 적어도 10 개체를 세었다. 오차 막대는 표준편차를 나타낸다. (C)는 At5g16260의 게놈 구조이다. elf9 돌연변이체에서 T-DNA 삽입 부위를 표시하였다. 회색 상자는 두 RNA 인지 모티프 (RRMs)를 암호화하는 엑손을, 흑색 상자는 나머지 다른 엑손을 나타낸다. 선은 인트론을 나타낸다. RRMs은 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)로 예측하였다. (D)는 elf9의 게놈 보상실험이다. C1은 게놈 At5g16260 단편을 지니는 elf9 보상 라인 중의 하나이다. 식물체는 단일 조건에서 키웠다. (E)는 추대 시 형성된 근생엽의 수로 센, 세 독립적인 elf9 보상 라인 (C1, C2, 및 C3)의 개화시기이다. 식물체는 단일 조건에서 키웠으며, 제시된 자료는 평균+표준편차이다. (F)는 ELF9, 효모 CUS2, 및 사람 Tat-SF1 간에 RRMs의 염기서열 비교이다. 각 RRM은 선으로 표시하였다. 아미노산 서열 정렬은 ClustalW (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680)로 정렬하였다. 동일하고 유사한 아미노산 잔기는 각각 흑색 및 회색 상자로 표시하였다.

도 2는 ELF9의 공간적 발현양상 및 이의 핵 내 위치이다. (A) 내지 (C)는 ELF9pro:ELF9:GUS 해독 융합 구축물을 지니는 형질전환 애기장대의 조직화학적 GUS 염색을 보여준다. 장일 조건에서 자란 10일된 실생의 어린 줄기 정단부 지닌 두 자 엽 (A) 및 1차 근단 (B), 장일 조건에서 자란 25일된 성숙한 식물체의 꽃(C)을 보여준다. (D-K)는 ELF9:GFP의 세포 내 위치를 보여준다. (D-G 및 H-K)는 두 독립적인 형질전환 식물체로부터 얻은 이미지이다. (D) 및 (H)는 배경을 밝게 한 이미지이다. (E) 및 (I)는 녹색 형광을 나타내는 이미지이다. (F) 및 (J)는 핵 염색에 사용된 4',6'-디아미디노-2-페닐인돌 히드로클로라이드 (DAPI)를 나타내는 이미지이다. (G) 및 (K)는 각각 (E)와 (F), 및 (I)와 (J)가 통합된 이미지이다.

도 3은 elf9에 있어 SOC1 mRNA의 상승된 발현 및 스플라이싱 변이체이다. (A)는 elf9에 있어 개화유전자의 발현을 보여준다. Ws 및 elf9 실생을 단일 하에서 15일 키워, ZT4 혹은 ZT16 시점에서 수확하여, RT-PCR 분석에 사용하였다. UBQ는 발현 대조구로 포함시켰다. 두 독립적인 실험에서 동일한 결과를 얻었으며, 그 중 하나만 보여준다. (B)는 elf9에서 SOC1 전사체의 일주 발현을 보여준다. 실생은 (A)에서처럼 키웠으며, RT-PCR 분석을 위하여 네 시간마다 수확하였다. SOC1F 및 SOC1R (도 5A)가 SOC1 발현 연구에 사용되었다. 두 독립적인 실험에서 동일한 결과를 얻었으며, 그 중 하나만 보여준다. (C)는 elf9에서 SOC1의 전 영역 전사체 및 스플라이싱 변이체의 발현을 보여준다. ZT4 시점의 실생으로부터 추출한 RNAs (B)를 프라이머 SOC1Fa 및 SOC1R (도 5A 및 실험방법 참조)를 사용하여, 표시된 PCR 사이클로 RT-PCR 분석에 사용하였다. (D) SOC1T 발현을 정량화한 것을 보여준다. 다른 여러 PCR 사이클을 사용하여 각 유전형으로부터 증폭된 SOC1T (C)를 ZT4 UBQ (B)에 근거하여 정량화하고 표준화하였다. y축은 SOC1T의 상대량을 나타낸다. 네모는 야생형에서, 원은 elf9에서의 SOC1T의 양을 나타낸다. (E) SOC1V의 발현을 정량 화한 것을 보여준다. 정량화와 표준화는 (D)에서처럼 하였다. (F) elf9에서 SOC1T 보다 SOC1V에서 보다 큰 증가가 보였다. (E)에서의 SOC1V의 양을 (D)에서의 SOC1T의 양으로 나누고, 그 값을 y축에 표시하였다. 검은색 막대는 야생형에서 SOC1V/SOC1T 비; 흰색 막대는 elf9에서의 SOC1V/SOC1T 비를 나타낸다.

도 4는 SOC1 전사활성이 elf9 돌연변이에 의하여 변하지 않음을 보여준다. (A)는 ChIP 분석으로 검정된 SOC1 프로모터 영역이다. 큰 흰색 상자는 첫 번째 exonic 5'UTR, 작은 흰색 상자는 두 번째 exonic 5'UTR을 나타낸다. 두 번째 엑손 내의 전사된 영역은 검은색 상자로 표시하였다. 표지된 선은 ChIP 분석 중에 프라이머 (실험방법 참조)로 증폭된 프로모터 영역을 나타낸다. soc1-101D FRI에 삽입된 활성화-태깅 T-DNA의 위치는 첫 번째 exonic 5'UTR 아래에 표시하였다. (B)는 Col FRI 및 soc1-101D FRI 식물체를 사용하여 PolII-특이 항체로 SOC1 염색질의 ChIP 분석이다. 'Input'은 면역침강 전의 염색질을 나타낸다. 'Mock'는 항체가 없는 대조구 시료이다. 액틴 (Actin)이 내부 대조구로 사용되었다. (C) 야생형 Ws 및 elf9 식물체를 사용하여 RNA PolII-특이 항체로 SOC1 염색질의 ChIP 분석이다.

도 5는 SOC1V에는 SOC1의 스플라이싱 안된 6 번째 인트론이 있음을 보여준다. (A)는 SOC1 게놈 영역의 모식도 및 SOC1V에 남아 있는 6 번째 인트론 영역 주변의 SOC1V 및 SOC1T 염기서열의 정열이다. SOC1V 내의 미성숙 인프레임 종결코돈에 밑줄을 그어 표시하였다. 전반부의 회색 상자는 exonic 5'UTRs을, 후반부의 회색 상자는 3'UTR을 나타낸다. RT-PCR 분석에 사용된 프라이머는 도 3과 도 5에 있다. (B)는 RT-PCR로 측정된 elf9에서 SOC1V의 증가를 보여준다. SOC1 및 SOC1Fa의 6 번째 인트론에 특이적인 SOC6INT가 SOC1V의 특이적 검출에 사용되었다. (C)는 (B)에서 보여진 SOC1V를 정량화한 것이다. SOC1V의 발현은 해당 시료에서 UBQ 발현에 근거하여 정량화 및 표준화되었다. (D)는 elf9에 있어 게놈 At5g16260로 SOC1T 및 SOC1V의 증가된 발현의 보상실험이다. C1과 C2는 도 1E에 기술된 두 형질전환체이다. 실생은 도 3A에 기술된 바와 같이 단일 조건에서 키웠으며, RNA 분리 (B 및 D)에 사용하였다. (D)에서, 실생은 ZT4 시점에서 수확되었다.

도 6은 SOC1과 ELF9 간에 유전적 상호작용을 보여준다. soc1-2 elf9 이중 돌연변이체의 개화시기를 측정하고 이를 soc1-2 (Col accession 백그라운드; 흰색 막대) 및 elf9 (Ws accession 백그라운드; 검은색 막대) 단일 돌연변이체의 개화시기와 비교하기 위하여, soc1-2 와 elf9 간의 교배로 만들어진 분리하는 F2 집단의 개체들 (회색 막대)의 유전형을 직접 밝히고 장일 조건 하에서 개화시기의 변화에 대하여 평가하였다. 개화시기는 추대 시 근생엽의 수로 결정하였다. 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.

도 7은 ELF9의 과발현을 보여준다. (A)는 elf9와 Ws에 있어 ELF9 과발현의 표현형 효과를 보여준다. MycELF9OE1와 MycELF9OE는 두 대표적인 CaMV35S-프로모터 유도된 N-말단 Myc-표지된 ELF9 과발현 라인이다. 식물체는 단일 조건에서 65 일간 키웠다. (B)는 ELF9OE 식물체에서 SOC1 전사체의 발현을 보여준다. 실생은 단일 조건에서 15일간 키워 RT-PCR 분석을 위하여 ZT4 시점에서 수확하였다. 내재적 (endo) ELF9 발현 또는 총 ELF9 발현은 각각 ELF9F와 ELF9UTR 또는 ELF9F와 ELF9OER 프라이머쌍을 (실험방법 참조) 사용하여 측정하였다. (C)는 장일 조건에서 ELF9OE 식물체의 개화시기를 보여준다. (D)는 단일 조건에서 ELF9OE 식물체의 개화시기를 보여준다.

도 8은 ELF9 단백질이 SOC1 전사체에 결합함을 보여준다. (A)는 IP-RT-PCR 분석에 사용된 프라이머 (실험방법 참조)로 증폭된 SOC1 pre-mRNA 영역을 보여준다. 전반의 두 흰색 상자는 5' UTR이고, 후반의 흰색 상자는 3' UTR이다. 인트론은 엑손 사이에 가는 선으로 표시하였다. 7 번째 엑손 아래에 표시된 프라이머 SOC1EX7R은 본 실험에서 RT를 위한 oligo-d(T) 프라이머 대신 사용되었다. (B)는 SOC1 전사체에 결합하는 ELF9이다. CaMV35Spro:Myc:ELF9 융합 구축물을 지니는 15일된 형질전환 실생을 수확하여, Myc-특이 항체와 면역침강하였다. 프라이머로 SOC1EX7R을 이용하고 용출물을 이용하여 역전사를 수행하였다. Input: 면역침강 전 염색질. Mock: 항체 없는 대조구 시료. Myc Ab (+) RT: Myc 항체로 면역침강 후 역전사 효소로 역전사된 것. Myc Ab (-) RT: Myc 항체로 면역침강 후 역전사 효소 없이 역전사된 것.

도 9는 elf9에 있어 NMD 표적 전사체의 발현 증가를 보여준다. (A) elf9에서 NMD에 대해 검정된 다섯 개의 PTC-함유 유전자 (Hori and Watanabe, (2005) Plant J 43:530-540로부터 채택)의 모식도이다. ATGs는 해독개시 코돈, TGAs 또는 TAAs는 종결 코돈. 엑손은 상자로, 인트론은 선으로 표시하였다. 각 유전자에 PTC site를 표시하였다. 화살표는 RT-PCR 프라이머의 위치를 나타낸다. (B)는 (A)에 보여준 PTC-함유 유전자의 RT-PCR 분석이다. 도 5D에서 사용된 것과 동일한 RNAs가 평가되었다. C1은 도 1D, 1E, 5D에서 기술된 elf9 보상 라인들 중의 하나이다. 액틴이 발 현 대조구로 사용되었다. (C)는 ELF9이 (B)에 보여준 PTC-함유 전사체에 결합함을 보여준다. 도 8B에서 Myc-특이 항체로 면역침강되어 정제된 RNAs가 oligo-dT 프라이머로 역전사된 것이다. PCR은 (B)에서 사용된 프라이머로 수행되었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Method for inducing early flowering and changes in mRNA stability of plant using ELF9 gene and plant produced by the same <130> PN08234 <160> 55 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1560 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> gene <222> (1)..(1560) <223> ELF9 gene <400> 1 atgtcagact ctgataatct acagcttcca ccatcatcga caggggcaac agttgcagct 60 actgatgttg gttggtacat tcttggtgaa aatcagcaga acctgggccc ttatactttc 120 tctgagctat gtaaccattt caggaatggt tacctactag aaactactct agtctgggct 180 gacggaagaa gcgaatggca gccactttct gccatccccg atttaatgtc aaggatatcc 240 ggagctgaga ttgcctatcc agctgtaggt tcatctgggt tgataaatgg atctaatgct 300 ggaaccaggc aagagaagca agattatact gcctctgcta gtactgagga tgaatttgag 360 aaatggcaga gagagattaa agacgcagaa gcagaggctg aaaggttgaa aaatggttct 420 gtctctggta ctgagcttgt tgaagatgat catgaaaggg catcttcacc acctgagggc 480 gaagatgagt tcacagatga tgatggaaca aaatataaat gggacagagc tcgtagagta 540 tgggttcctc aggacgatcc accactgggt agcgttgacc cgtatggact 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Thr Lys Tyr Lys Trp Asp Arg 165 170 175 Ala Arg Arg Val Trp Val Pro Gln Asp Asp Pro Pro Leu Gly Ser Val 180 185 190 Asp Pro Tyr Gly Leu Glu Glu Met Thr Phe Ala Lys Glu Asp Glu Val 195 200 205 Phe Pro Thr Ile Asn Ile Leu Asp Thr Ser Val Asp Lys Lys Asp Ala 210 215 220 Ser Lys Asp Asp Val Ala Gly Lys Lys Glu Glu Asp Gly Ser Asp Glu 225 230 235 240 Thr Ala Glu Ile Asn Ser Asn Gly Lys Arg Lys Leu Pro Glu Pro Glu 245 250 255 Thr Glu Lys Lys Glu Pro Asn Lys Pro Pro Asp Ser Trp Phe Glu Leu 260 265 270 Lys Val Asn Pro His Ile Tyr Val Asn Gly Leu Pro Asp Asp Val Thr 275 280 285 Ile Glu Glu Val Ala Glu Val Phe Ser Lys Cys Gly Ile Ile Lys Glu 290 295 300 Asp Asp Thr Gly Lys Pro Arg Ile Lys Leu Tyr Ser Asp Lys Ala Thr 305 310 315 320 Gly Lys Leu Lys Gly Asp Ala Leu Ile Ser Tyr Met Lys Glu Pro Ser 325 330 335 Val Asp Leu Ala Ile Lys Ile Leu Asp Gly Ala Pro Leu Arg Pro Ala 340 345 350 Asp Lys Leu Leu Met Ser Val Ser Arg Ala Lys Phe Glu Gln Lys Gly 355 360 365 Glu Arg Phe Ile Thr Lys Gln Thr Asp Asn Lys Lys Lys Lys Lys Leu 370 375 380 Lys Lys Val Glu Gln Lys Leu Leu Gly Trp Gly Gly Thr Asp Asp Ser 385 390 395 400 Lys Val Ser Ile Pro Ala Thr Val Val Leu Arg Tyr Met Phe Ser Pro 405 410 415 Ala Glu Leu Met Ala Asp Glu Asp Leu Val Ala Glu Leu Glu Glu Asp 420 425 430 Val Lys Glu Glu Ser Leu Lys His Gly Pro Phe Asp Ser Val Lys Val 435 440 445 Cys Glu His His Pro Gln Gly Val Val Leu Val Arg Phe Lys Asp Arg 450 455 460 Arg Asp Ala Gln Lys Cys Ile Glu Ala Met Asn Gly Arg Trp Tyr Ala 465 470 475 480 Lys Arg Gln Ile His Ala Ser Leu Asp Asp Gly Ser Val Asn His Ala 485 490 495 Thr Val Arg Asp Phe Asp Leu Glu Ala Glu Arg Leu Asp Gln Phe Ala 500 505 510 Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu 515 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JL270 primer <400> 3 tttctccata ttgaccatca tactcattg 29 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PF1 primer <400> 4 gggtacttaa tctttcgttg ac 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR1 primer <400> 5 cttgtctgct tgttgcattc tc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOC1Fa primer <400> 6 caaacccttt tagccaatcg 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR2 primer <400> 7 gtttgggtgg gagaagactg atg 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PF3 primer <400> 8 gctcctccct ctttctttct c 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR3 primer <400> 9 ctctgcgaaa ggaagaacc 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PF4 primer <400> 10 tacaagtggg ggcatatagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR4 primer <400> 11 gtcgcaaata tgatggacgc 20 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JP1595 primer <400> 12 cgtttcgctt tccttagtgt tagct 25 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JP1596 primer <400> 13 agcgaacgga tctagagact caccttg 27 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOC1EX7R primer <400> 14 ctgcagctag agctttctc 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOC1Fa primer <400> 15 caaacccttt tagccaatcg 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOC1EX5R primer <400> 16 gctcctcgat tgagcatgtt cc 22 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOC1EX3R primer <400> 17 gctgactcga tccttagtat gcc 23 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOC1F primer <400> 18 tgaggcatac taaggatcga gtcag 25 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOC6INT primer <400> 19 gcaagcacaa gaggcttac 19 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOC1R primer <400> 20 gcgtctctac ttcagaactt gggc 24 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9GUS-Pst primer <400> 21 aaactgcaga ctcttctact ggtgatgaag aag 33 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9GUS-Sma primer <400> 22 acccgggctc agcagcttcc agttc 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9GFP-Sal primer <400> 23 gtcgacatgt cagactctga taatc 25 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9GFP-Sma primer <400> 24 acccgggaac tcagcagctt ccagttc 27 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRY2 primer <400> 25 gacaatcccg cgttacaagg cg 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRY2 primer <400> 26 cgttgtaacg aacagccgaa gg 22 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FT primer <400> 27 gctacaactg gaacaacctt tggcaat 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FT primer <400> 28 tataggcatc atcaccgttc gttactc 27 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GI primer <400> 29 gttgtccttc aggctgaaag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GI primer <400> 30 tgtggagagc aagctgtgag 20 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CO primer <400> 31 aaactctttc agctccatga ccactact 28 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CO primer <400> 32 ccatggatga aatgtatgcg ttatggtta 29 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLC primer <400> 33 ttctccaaac gtcgcaacgg tctc 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLC primer <400> 34 gatttgtcca gcaggtgaca tctc 24 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLM primer <400> 35 ggcataaccc ttatcggaga tttgaagc 28 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLM primer <400> 36 acacaaactc tgatcttgtc tccgaagg 28 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAF2 primer <400> 37 gggtctccgg tgattagg 18 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAF2 primer <400> 38 cttgagcagc ggaagagtct ccc 23 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAF3 primer <400> 39 cattttgggt ccccggtgg 19 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAF3 primer <400> 40 gcgaaagagt ctccggtac 19 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAF4 primer <400> 41 cgttcagtgt ctccggcgag 20 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAF4 primer <400> 42 cgtagcaggg ggaagaagag g 21 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAF5 primer <400> 43 ttcaggatct ccgaccag 18 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAF5 primer <400> 44 cagccgttga tgattggtgg 20 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP primer <400> 45 cgctctcatc atcttctctt ccac 24 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVP primer <400> 46 gctcgttctc ttccgttagt tgc 23 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBQ primer <400> 47 gatctttgcc ggaaaacaat tggaggatgg t 31 <210> 48 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBQ primer <400> 48 cgacttgtca ttagaaagaa agagataaca gg 32 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9F primer <400> 49 aatacctgca acggttgttc tgcgctacat 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9UTR primer <400> 50 actagataaa accggtcctc tgggtttgcg 30 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9OER primer <400> 51 acccgggctc agcagcttcc agttc 25 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9OEF primer <400> 52 ggatccccat gtcagactct gataatc 27 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9OER primer <400> 53 acccgggctc agcagcttcc agttc 25 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9GUS-Pst primer <400> 54 aaactgcaga ctcttctact ggtgatgaag aag 33 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF9-Kpn primer <400> 55 cggggtacct gcgaataaaa cattcctcgt 30

Claims (11)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 ELF9(EARLY FLOWERING 9) 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 제조하는 단계를 포함하는 식물체의 조기 개화를 유도하는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 T-DNA 삽입 위치는 ELF9 유전자의 RNA 인지 모티프(RNA-Recognition Motif; RRM) 내인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이체는 SOC1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1) 전사체 수준을 증가시킴으로써 조기 개화를 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 SOC1 전사체 수준은 넌센스 매개 mRNA 분해를 통해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 삭제
8. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 ELF9(EARLY FLOWERING 9) 단백질을 코딩하는 유전자에 T-DNA가 삽입되어 조기 개화가 유도된 식물체.
9. 삭제
10. 제8항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체.
11. 제8항에 있어서, 상기 T-DNA는 ELF9 유전자의 RNA 인지 모티프(RNA-Recognition Motif; RRM) 내에 삽입된 것을 특징으로 하는 식물체.

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