JP2002532069A

JP2002532069A - 開花の制御

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Publication number: JP2002532069A
Application number: JP2000585411A
Authority: JP
Inventors: ジョアン・エリザベス・バーン; ウィリアム・ジェイムズ・ピーコック; エリザベス・ソールズベリ・デニス; キャンディス・クレア・シェルドン; パスカル・ペレ; クリストファー・アンドリュー・ヘリウェル; ディーン・トーマス・ラウズ
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-12-02
Publication date: 2002-10-02
Also published as: EP1135500A4; CA2353080A1; WO2000032780A1; EP1135500A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物の開花および生殖の制御、並びに特に開花を誘導または抑制する物質および方法に関する。本発明は、開花の誘導特に早期開花のイニシエーションに、開花の遅延もしくは抑制に、または開花期の操作に有用な単離された核酸分子を提供する。最初の態様において、本発明はＭＡＤＳボックスを含む単離された核酸分子を提供し、それは植物の開花期を変化させることができる。好ましくは、本発明の核酸分子は、ＦＬＯＷＥＲＩＮＧＬＯＣＵＳＦ（ＦＬＦ）遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む。該核酸分子はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡであってよい。本発明は、鑑賞用花、野菜、果実、穀物、グラス、樹木、および他の顕花植物種を含むがこれらに限定されない任意の双子葉植物または単子葉植物種に応用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、植物の開花および生殖の制御、特に開花を誘導または抑制するため
の物質および方法に関する。本発明は、開花を誘導、特に早期開花をイニシエー
トするために、開花を遅延もしくは抑制するために、または開花期を操作するた
めに有用な単離された核酸分子を提供する。

【０００２】（発明の詳細な開示）植物における開花のイニシエーションは、生理的な齢または植物成長調節物質
のレベルのような内的シグナルに応答して起こり、日長または低温のような環境
条件の変化に起因し得る。様々な植物種において重要な要因は、光周期としても
知られる日長であることは周知である。広く使用されるモデル植物種Arabidopsi
s thalianaのいくつかのエコタイプを含む多くの植物種において、開花は長日光
周期によって、または低温の期間(バーナリゼーション)によって促進される (Na
pp-Zinn,1985)。

【０００３】園芸および圃場作物植物の両方における開花の制御は、農業産業における主要
な問題であり、林業においても問題である。植物の不斉一な開花が起こると、植
物の収量の重大な喪失という結果となり得る；これは圃場育成および温室育成植
物の両方に当てはまる。該問題は、圃場育成植物にとって特に深刻である。圃場
育成植物は頻繁に異常または不時条件にさらされ、不適当な時期の開花の誘導と
いう結果となり得る。効率的な植物生産は、花粉ドナーおよび花粉レセプター植
物の間の開花期の同時性を要する。そして特に温室育成植物にとって、市場機会
を最大化するために特に重要である。

【０００４】植物の開花を調節するための現行の利用可能な方法は、高価、労働力過大であ
り、植物成長調節物質の使用、並びに/または制御された栽培型および制御され
た環境成長条件を要する。結果として、当技術分野では、開花期を制御するため
のより有効な、費用対効果のよい方法が必要である。これらの方法は、園芸植物
、特に切花産業において使用される園芸植物、並びに野菜、穀物および他の作物
の両方を含む様々な商業的に重要な植物種について利用可能である。

【０００５】ＭＡＤＳボックス遺伝子として知られる遺伝子のクラスは、ＭＡＤＳボックス
として知られる、特徴的な保存ＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質をコードし
ている。それは、ある場合、ＣＣ（Ａ／Ｔ）_６ＧＧのＤＮＡモチーフに結合する
ことが示されている。該ＭＡＤＳボックス遺伝子は、酵母および哺乳動物で最初
に同定された転写因子のクラスをコードしている。続いて、類似の転写因子が、Arabidopsis thaliana、Antirrhinum majus、ト
マト、タバコ、ペチュニア、トウモロコシ、Pinus種およびEucalyptus種を含む
広範囲の植物において同定された。植物において、該ＭＡＤＳボックス遺伝子は
「Ｋドメイン」を有する。Ｋドメインは、ケラチンタンパク質のコイルドコイル
メインに似て、タンパク質/タンパク質相互作用に関係し、(Ｉ)ドメインおよび
カルボキシル末端(Ｃ)ドメインの間に挟まっている。植物において、ＭＡＤＳボ
ックス遺伝子の主要な役割は、花序分裂組織同一性、並びに花器同一性および発
達を指定することである。あるＭＡＤボックス遺伝子が、根および栄養発達にお
いて役割を有すると考えられている。

【０００６】われわれは、モデル植物Arabidopsis thalianaにおける開花期の制御の役割を
果たすＭＡＤＳボックスを含む核酸配列を同定した。開花に及ぼす影響は、該核
酸配列の発現の程度に依存する。

【０００７】 (発明の要約) 最初の態様において、本発明は、ＭＡＤＳボックスを含む単離された核酸分子
を提供する。それは、植物の開花期を変化させることができる。１つの好ましい実施態様において、本発明は、植物の開花を遅延させることの
可能な単離された核酸分子を提供する。好ましくは、植物における該核酸分子の
発現は、プロモーター配列の制御の下でのセンス配向において、該植物の開花を
遅延させることが可能である。

【０００８】第２の好ましい実施態様において、本発明の単離された核酸は、植物の開花を
早めることができる。好ましくは植物において、プロモーター配列の制御の下で
のアンチセンス配向における該核酸分子の発現は、該植物の開花を早めることが
できる。好ましくは、本発明の核酸分子は、FLOWERING LOCUS F (FLF)遺伝子に対応す
る核酸配列を含む。該核酸分子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはメッセンジ
ャーＲＮＡであってよい。

【０００９】より好ましくは、該核酸分子は、配列番号１、２、４、および６ないし１５の
いずれかに表されるヌクレオチド配列、もしくは少なくとも低ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下でそれらとハイブリダイズすることのできる核
酸分子、または少なくとも配列番号１、２、４および６ないし１５のいずれかと
少なくと７０％の配列同一性を有する核酸分子を含む。ハイブリダイズする能力
および％配列同一性を評価する方法は、当技術分野では周知である。さらにより
好ましくは、該核酸分子は、高ストリンジェントな条件下でそれらとハイブリダ
イズすることのでき、または少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０
％配列同一性を有する。これらの配列の１またはそれ以上と少なくとも７０％、
好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性を有
する核酸も、本発明の範囲に入る。

【００１０】第２の態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する
。該ベクターは、ウイルス、バクテリオファージ、プラスミド、またはバクテリ
アであってよい。特に好ましい実施態様において、該ベクターは、アグロバクテ
リウム属のバクテリア、特にAgrobacterium tumefaciensにおいて存在するＴ−
ＤＮＡベクターである。第３の態様において、本発明は、本発明の核酸で形質転換された植物細胞を提
供する。第４の態様において、本発明は、本発明の核酸分子で形質転換された植物を提
供する。

【００１１】第５の態様において、本発明は、標的植物の開花期を変化させることのできる
核酸分子を単離する方法を提供し、本発明の核酸分子またはその機能部分をハイ
ブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)プライマーと
して使用し、さらに要すればハイブリダイゼーションを検出する段階を含む。適
当な方法は当技術分野で周知である。例えば、われわれは、本明細書に記載した
アラビドプシスＦＬＦ配列が、Brassica napusから相同配列を単離するために使
用可能であることを示した。

【００１２】第６の態様において、本発明はＦＬＦポリペプチドを提供する。好ましくは、
該ポリペプチドは、本発明の核酸分子によってコードされているポリペプチドで
ある。より好ましくは該ポリペプチドは、配列番号３、５、および１６ないし３
０のいずれかに示したアミノ酸配列を有するか、またはそれらと少なくとも７０
％同一の配列を有する。

【００１３】該ポリペプチドは、簡便な宿主、例えば、Escherichia coli.等のバクテリア
宿主におけるＦＬＦ核酸分子の発現によって生産され得る。ポリペプチドに対す
るモノクローナル抗体を含む抗体は、日常的な方法を使用して産生され得る。Ｆ
ＬＦポリペプチドに対する抗体が本発明の範囲に入ることは明白に理解される。
そのような抗体は、高または低レベルのＦＬＦポリペプチドの発現について植物
をスクリーニングするために有用である。適当なスクリーニング方法は、ウェス
タンブロッティングまたは様々な形のイムノアッセイ、例えばラジオイムノアッ
セイ、ＥＬＩＳＡ、および化学発光または蛍光検出イムノアッセイを含む。

【００１４】本発明の核酸に関連する遺伝子のような植物の発達段階を制御する遺伝子は、
進化の間高度に保存されている。結果的に、本発明の核酸分子および方法は、種
が単子葉植物または双子葉植物であろうと、すべての植物種に利用可能である。
故に、本発明は、鑑賞植物、園芸植物、農作物および樹木種を含むがこれらに限
定されない顕花植物に一般的に応用可能である。外生ＤＮＡをこれらのすべての
型の植物に導入し、植物組織をインビトロで培養し、植物細胞または組織を全植
物体(whole plant)に再生する方法は、当技術分野で既知である。商業的に有用
な品種のさらなる作出および選抜の方法も、周知である。植物のタイプによって
、開花を早め、すなわち早期開花を誘導し、開花を同時にし、開花を遅延させま
たは開花を抑制することは、望ましい場合がある。

【００１５】例えば、多くの野菜植物において、ライグラス等の牧草において、またはサト
ウキビにおいて開花を抑制または遅延させることは望ましい。早期開花の誘導に
よって開花を早めることは、多くの作物種、ワタ等、および園芸的な種において
望ましい。われわれは、驚くべきことに、本発明の核酸分子の発現の程度に比例して開花
が遅延され、早期開花がこの核酸分子の発現を減少させることによって誘導され
ることを見出した。

【００１６】第６の態様において、本発明は、植物の開花を遅延させる方法を提供し、該方
法は、本発明の核酸分子を植物の細胞に導入し(要すれば該核酸分子の発現は誘
導可能なプロモーターの制御の下にある)、さらに該核酸分子を過剰発現させる
段階を含む。好ましくは該プロモーターは、組織特異的プロモーターである。

【００１７】好ましくは開花は、通常の開花期より少なくとも５日、好ましくは少なくとも
２０日、より好ましくは少なくとも３０日遅延される。最も好ましくは、開花は
、少なくとも４０ないし５０日遅延される。少なくともいくつかの種において、
開花の完全な抑制を達成することが可能であってよい。このことはさらに植物の
不稔性を誘導する方法を提供する。

【００１８】第７の態様によれば、本発明は植物における早期開花を誘導する方法を提供し
、該方法は、本発明の核酸分子の植物における発現の程度を減少させる段階を含
む。該減少は、標的植物をアンチセンス核酸配列、転写後の遺伝子サイレンシン
グ、リボザイム切断、転位性因子(transposable element)もしくはトランスポゾ
ンを使用する該核酸配列の崩壊によって形質転換することを含むがこれらに限定
されない、任意の簡便な手段によって、またはバーナリゼーションのような手法
によって達成され得る。当業者は、所望の特定の植物種について最も適当な手法
を容易に選択することができる。要すれば、本発明の方法は他の処理、外生ジベ
レリン等によって補足され得る。

【００１９】好ましくは、開花は、通常の開花期より少なくとも５日早く、より好ましくは
少なくとも１０日、最も好ましくは通常の開花期より少なくとも１５日早い。われわれは、ＦＬＦの発現の程度、およびその後の開花期を、開花期に影響す
ることが知られている遺伝子（ＦＣＡ、ＦＶＥ、ＦＰＡ、ＬＤ、ＦＬＤ、および
ＶＲＮ２を含むがこれらに限定されない)の活性を変更することによって変化さ
せることができることを見出した。さらに、本発明の第６および第７の態様の両
方において、開花期に影響する１またはそれ以上の付加的な遺伝子の活性の変更
、またはバーナリゼーションによって、ＦＬＦの発現の程度を変更するさらなる
方法が提供される。

【００２０】第８の態様によれば本発明は、植物の栄養的なおよび／または花の表現型を変
更する方法を提供し、それは、ＦＬＦ遺伝子の発現のレベル増大させ、それによ
って植物におけるジベレリンの生産または活性のレベルを変更する段階を含む。

【００２１】好ましくは、栄養的または花の表現型的な特徴は、ジベレリン酸生産または活
性によって調節される。より好ましくは、該特徴は、植物の構造(architecture)
または稔性に関連する。例えば、本発明のこの態様の方法を使用するジベレリン
酸生産および／または活性の変更は、矮性または不稔性植物を生産するために使
用され得る。１つの特定の好ましい実施態様において、本発明は不稔性植物を提
供する。第２の好ましい実施態様において、本発明は矮性植物を提供し；より好
ましくは該植物はコムギ植物である。

【００２２】本発明のいくつかの実施態様において、本発明の核酸分子は、該核酸分子の発
現を調節することのできるプロモーター配列に操作可能なように連結されており
；より好ましくは該プロモーター配列は、真核細胞、最も好ましくは植物細胞に
おける発現を調節するように適応されている。本発明の核酸分子は、転写終結配
列にも操作可能なように連結され得る。

【００２３】適当なプロモーター配列は、当技術分野において周知であり、ＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーター、ＮＯＳプロモーター、オクトピンシンターゼ(ＯＣＳ)プロモータ
ー、サブクローバ萎縮ウイルスプロモーターおよびAlabidopsis thalianaユビキ
チン遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない。当業者は、所望の目的
に最も適当なプロモーターを容易に選択することができる。特に、ある目的のた
めに、誘導可能なプロモーターが望ましくあり得、これらは当技術分野で周知で
ある。植物細胞において活性のある適当な転写終結配列も、周知であり、バクテ
リア、真菌、ウイルス、動物または植物起源であってよい。

【００２４】本発明における使用にとって特に適当な適当な転写ターミネーターは、Agroba
cterium tumefaciensのノパリンシンターゼ(ＮＯＳ)遺伝子転写ターミネーター
、カリフラワーモザイクウィルス(ＣａＭＶ)３５Ｓ遺伝子の転写ターミネーター
配列、トウモロコシからのzein遺伝子転写ターミネーター配列、およびRubisco
小サブユニット(ＳＳＵ)遺伝子転写ターミネーター配列またはサブクローバー萎
縮ウィルス(ＳＣＳＶ)遺伝子配列転写ターミネーターを含む。

【００２５】本発明の核酸分子は、植物細胞または組織に任意の適当な方法によって導入さ
れ得る。外生ＤＮＡを植物組織に導入する(形質転換)様々な方法が既知である。
これらは、プロトプラストへの直接的なＤＮＡの取り込み(Krens et al, 1982;
Paszkowski et al, 1984)、プロトプラストへのポリエチレングリコール仲介取
り込み(Armstrong et al, 1990)、電気穿孔法(Fromm et al, 1985)、ＤＮＡのマ
イクロインジェクション(Crossway et al, 1986)、組織外植体または細胞のマイ
クロプロジェクタイルボンバードメント(Christou et al,1988; Sanford, 1993)
、またはアグロバクテリウムからの植物組織へのＴ−ＤＮＡ仲介送達を含むがこ
れらに限定されない。代表的なＴ−ＤＮＡベクター系は、後記の引用文献に記載されている：An et
al(1985); Herrera-Estrella et al(1983a,b); Herrera-Estrella et al(1985)
。これらの形質転換方法は、植物組織培養に応用可能であり、または全植物体に
使用され得る(インプランタ形質転換)。さらに当業者は、与えられた如何なる植
物に対しても最も適当な方法を選択することができる。

【００２６】器官形成であれ胚形成であれ、その後のクローン増殖の可能な任意な植物組織
が、本発明のベクターによって形質転換され得る。形質転換される種に最も適当
なクローン増殖系によって、選択される特定の組織は様々である。適当な組織標
的は、全植物体、リーフディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大胚軸体、カルス組
織、存在する分裂組織(例えば、頂端分裂組織、えき芽、および根分裂組織)、な
らびに誘導された分裂組織(例えば、子葉分裂および下胚軸分裂組織)を含む。

【００２７】本発明のベクターは、優性の選択マーカーをさらに含み、細胞選抜および植物
育種を容易にする。様々な適当なマーカーが当技術分野で既知であり、ＮＰＴＩ
Ｉ遺伝子、抗生物質(ハイグロマイシンまたはアンシピリン等)または除草剤(ホ
スヒノスリシンまたはグリホサート等)に対する抵抗性をコードしている遺伝子
；ストレス耐性を付与するポリペプチド(スーパーオキシドジムスターゼ等)をコ
ードしている遺伝子；または視覚的に検出可能なマーカー(緑色蛍光タンパク質
またはβグルクロニダーゼ等)を含むがこれらに限定されない。当業者は、特定
の場合における使用のために最も適当なマーカーを容易に選択することができる
。

【００２８】本発明は、装飾用花、野菜、果実、穀物、草(grass)、樹木および他の顕花植
物種を含むがこれらに限定されない任意の双子葉殖物または単子葉植物に対して
応用可能である。好ましくは該植物は、キク、バラ、ガーベラ、カーネーション
、チューリップ、マメ科植物(ダイズ等)、シュガービート、レタス、ワタ、ナタ
ネ、コリアンダー、Lolium、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、イネ、牧草、Ph
alaris、Canola、および他のBrassica種、Linola種、サトウキビ、Eucalyptus種
、マツおよびポプラを含む群から選択される。森林植物も本発明の範囲に含まれ
る。

【００２９】本明細書において、「含む(comprising)」の語は「含むがこれらに限定されな
い(including but not limited to)」および「含む(comprises)」の語は同じ意味
であることが明確に理解される。本明細書で使用される「開花期」の語は、植物において花器の分裂組織が、例え
ば、光学顕微鏡によってまたは裸眼によって、最初に視覚的に検出される時期を
意味する。測定される開花期は、花器分裂組織の分化およびその後の視覚的手段
の使用を可能とする細胞分裂における細胞プロセスが起こるのに要する時間を含
む。「開花期」の語は、特定の化学的、物理的または環境の刺激(植物成長調節物
質、光周期または温度型等、植物のバーナリゼーションを含む)の適用による植
物における開花の誘導の後、視覚的に測定されるように栄養的分裂組織から花器
分裂組織へ移行が起こる時期をも含む。または、開花は、植物における内的発達
シグナルに応答して誘導され得る。当業者は、そのような化学的、物理的または
環境の刺激または内的発達シグナルの特定の性質を知っている。

【００３０】「開花期を変化させる」は、花の分裂組織が最初に視覚的に植物において検出さ
れる時期が、増加、減少、または変更もしくは調節されることを意味する。さら
に開花は遅延され、早められ、阻害され、抑制され、または同時化され得る。「分裂組織」の語は、細胞が急速な有糸分裂、続いて葉、根、茎、花芽または他
の植物器官などの器官に発達する原基を形成することのできる細胞型への分化を
経験し、または経験することのできる植物組織を意味する。

【００３１】「栄養的分裂組織」の語は、分化プロセスが、葉、葉柄、包葉、茎もしくは根等
の栄養器官、または非生殖器官に発達する細胞型を生産する分裂組織を意味する
。「花の分裂組織」は、分化プロセスが、花序分裂組織、二次的花序分裂組織、花
器、または有性生殖器官[該分裂組織もしくは器官は、発達したとき、生殖およ
び非生殖組織の両方(葯、雄蘂、柱頭、卵、心皮、花弁およびがく片を含むがこ
れらに限定されない)を含み得る]に発達する細胞型を生産する分裂組織を意味す
る。

【００３２】「由来する」の語は、特定の完全なものまたは完全なものの群が、本明細書で
特定される特定の生物または種から起源することを意味するが、そのもとから必
ずしも直接的に得られるわけではない。本明細書で言及するハイブリダイゼーションの代表的な低または高ストリンジ
ェントな条件とは、後記の通りである：高ストリンジェント：５０％ホルムアミド中の４２℃でのハイブリダイゼーショ
ン、３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２０×Dehardt's、５０μｇ／ｍｌサケ精子
ＤＮＡ終夜、そして最後に４２℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ洗浄。低ストリンジェント：５０％ホルムアミド中の２８℃でのハイブリダイゼーショ
ン、３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２０×Dehardt's、５０μｇ／ｍｌサケ精子
ＤＮＡ終夜、そして最後に室温で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ洗浄。

【００３３】ヌクレオチド配列の「相同物」は、配列内の１またはそれ以上のヌクレオチドの
置換、挿入、欠失、または再配列の存在にかかわらず、本発明の核酸分子と実質
的に同じである単離された核酸分子またはその相補的ヌクレオチド配列を意味す
る。

【００３４】ヌクレオチド配列の「類似物」は、通常は単離された核酸分子に存在しない任意
の非ヌクレオチド構成要素、例えば、炭水化物、放射性ヌクレオチドを含む放射
性化学物質、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ、もしくはホースラディ
ッシュペルオキシダーゼを含むがこれに限定されないレポーター分子の存在にか
かわらず、本発明の核酸分子と実質的に同じである単離された核酸分子またはそ
の相補的核酸を意味する。

【００３５】核酸配列の「誘導体」は、該分子またはその一部に対して有意な配列類似性を含
む任意の単離された核酸分子を意味する。当業者は、本発明のヌクレオチド配列
が突然変異誘発に服し、１またはそれ以上の単一または複数ヌクレオチド置換、
欠失および／または挿入を生産し得ることを理解する。本発明のヌクレオチド配
列のヌクレオチド挿入誘導体は、５’および３’末端融合体並びに単一または複
数ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物の配列間挿入を含む。挿入ヌクレオチ
ド配列変異体は、１またはそれ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物が
、該配列のヌクレオチド配列の予め決定された位置(しかしランダム挿入もあり
得る)に導入されているものである；得られた産物の適当なスクリーニングが実
施される。欠失変異体は、ヌクレオチド配列からの１またはそれ以上のヌクレオ
チドの除去を特徴とする。置換ヌクレオチド変異体は、配列中の少なくとも１つ
のヌクレオチドが除去され、異なるヌクレオチド類似物がその場所に挿入された
ものである。

【００３６】本明細書における「遺伝子」の記載は、最も広い意味として理解されるべきであ
り： (i)転写および／または翻訳調節配列および／またはコード領域および／または
非翻訳配列(すなわち、イントロンおよび５’および３’非翻訳配列)を含む、古
典的なゲノム配列； (ii) 要すれば付加的に該遺伝子の５’または３’非翻訳配列を含む、コード領
域(すなわちエキソン)に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ；または (iii)インビトロで生産され、コード領域および／または該遺伝子の５’または
３’非翻訳配列のすべてまたは一部を含む、増幅されたＤＮＡ断片または他の組
換え核酸分子を含む。

【００３７】「遺伝子」の語は、機能産物のすべてまたは一部をコードしている合成または融
合分子を記載するためにも使用される。機能産物は、ヌクレオチドの配列を含み
、または、機能ポリペプチド、特に本発明のＦＬＦポリペプチドまたはその相同
物、類似物もしくは誘導体をコードしているヌクレオチドの配列に相補的なもの
である。本明細書の実施例のある場合、ＦＬＦ遺伝子は遺伝子Ｂを意味する。これらの
２つの用語は同意語である

【００３８】 (図面の簡単な説明) 図１は、野生型Ｃ２４(左)、発芽後７０日における晩生開花Ｔ−ＤＮＡ標識さ
れたｆｌｆ変異体(中)、および栄養抽だい(vegetative bolts)によってドーム状
の形状を示す、１５０日におけるｆｌｆ変異体(右)。バーは５cmである。

【００３９】図２は、晩生開花表現型を有する２つのＴ−ＤＮＡ挿入の分離を示す。Ａ．ＥｃｏＲＩで消化しＮＰＴＩＩ遺伝子で探索した、早生(Ｅ)、晩生(Ｌ)およ
び極晩生（ＶＬ）に分離するＴ_２集団から単離されたゲノムＤＮＡ。Ｂ．ＦＬＦ遺伝子座に連鎖した２つのＴ−ＤＮＡ挿入の物理的マップ。それらの
配向を示す。ＥｃｏＲＩ部位はＲＩ標識されている；ＬＢおよびＲＢは、それぞ
れＴ−ＤＮＡのレフトおよびライトボーダーを表す。三角印はＴ−ＤＮＡのライ
トの３０ｂｐの欠失の位置を表す。矢印は該遺伝子の転写の向きを表す。

【００４０】Ｃ．遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂ遺伝子座を含むアラビドプシス変異体ＤＮＡの２７
ｋｂの領域の表示。Ｔ−ＤＮＡ挿入の位置を示す。フランキング植物ＤＮＡから
のＤＮＡ断片（プローブ２および３）を、ｃＤＮＡクローンを単離するためにプ
ローブとして使用した。ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、ＢａｍＨＩ（Ｂ）およびＥｃｏ
ＲＩ（ＲＩ）制限酵素部位を示す。遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂの位置が示され、そ
れらの転写方向を、矢印で示す。

【００４１】Ｄ．Ｔ−ＤＮＡ挿入の位置にわたる、図２Ｃのプローブ１および２によって野生
型Ｃ２４のゲノムライブラリーから単離された、６．５ｋｂおよび６．８ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片。制限部位は図２Ｃの通りである。図３は、３０日齢の野生型Ｃ２４植物（レーン１）、ヘミ接合体（レーン２）
およびホモ接合体（レーン３）ｆｌｆ変異体植物における遺伝子Ａおよび遺伝子
Ｂの発現レベルを示す。

【００４２】図４は、Ｃ２４における３５Ｓ：：ＦＬＦのＴ１トランスジェニック植物（左
）およびLandsberg erecta(右)エコタイプを示す写真である。Ｃ２４トランスジ
ェニックは、早生開花（後）または晩生開花（前）のいずれかであった。Landsb
erg erectaトランスジェニックは、晩生開花(左)または通常開花(右)のいずれか
であった。

【００４３】図５は、ＦＬＦ遺伝子構造およびＦＬＦ転写物の発現パターンを示す。Ａ．イントロンの位置および大きさ、並びにＭＡＤＳボックス、介在するドメイ
ン(Ｉ)、Ｋドメイン(Ｋ)およびカルボキシル末端ドメイン(Ｃ)の位置を示す、Ｆ
ＬＦ遺伝子のゲノム構造。ラインの下の数は、各エキソンにおける塩基対の数を
表す。Ｂ．Ｃ２４植物におけるＦＬＦのｍＲＮＡの発現のパターン：インビトロ育成栄
養植物からの根(Ｒ)およびロゼット葉(ＲＬ)、1および5ｃｍの間の抽だい茎(bol
t stem)を有する土壌育成植物からの芝生状の葉(cauline leaves)(ＣＬ)、抽だ
い茎 (ＢＳ)、花茎茎頂(floral apex)およびつぼみ(Ｂ)。成熟花(Ｆ)および長角
果(Ｓ)を他の植物から採集した。植物を、16時間の光周期条件で育成した。Ｂ−
ＦについてのＲＮＡゲルブロットを、線形化し、ＭＡＤＳボックス領域を除去し
たＦＬＦ(遺伝子Ｂ)ｃＤＮＡクローンから転写されたリボプローブによって探索
した。Ｂ−Ｆにおいて臭化エチジウム染色リボゾームバンドをローディングコン
トロールとして示す。

【００４４】Ｃ．Ｃ２４植物の大多数が抽だいしたとき(これらの成長条件下で50日)までの、
10日ごとに収穫した(数で表す)、Ｃ２４植物またはｆｌｆ変異体全植物体におけ
るＦＬＦのｍＲＮＡの発現レベル。Ｄ．21日間8時間蛍光灯光周期で育成し、その後、第21の光周期の終了時、同じ
条件(ＳＤ;レーン１、２、７、８)に保つか、または継続暗黒(ＣＤ;レーン３、
４、９、１０）にもしくは継続光(ＣＬ;レーン５、６、１１、１２)に移動した
、Ｃ２４(レーン１−６)およびｆｌｆ(レーン７−１２)植物のＦＬＦのｍＲＮＡ
の発現。植物を次の光周期が開始するであろう直前(明け方;レーン１、３、５、７、９
、１１)、または光周期の終わりの直前(日暮れ；レーン２、４、６、８、１０、
１２)に収穫した。転写レベルは、光周期の開始時にやや高かったが、このパタ
ーンは変異体においては変わらなかった。

【００４５】Ｅ．ジベレリン酸(ＧＡ_３)処理およびバーナリゼーションが、Ｃ２４(レーン１
−３)およびｆｌｆ変異体(レーン４−６)実生におけるＦＬＦ転写へ及ぼす影響
。ＲＮＡを、無処理(Ｃ;レーン１および４)、１０^−５ＭのＧＡ_３を含む培地で
育成または４℃３週間の前処理をした（Ｖ；レーン３および６)１２日齢の実生
から単離した。Ｆ．抽だい後すぐ収穫した、Ｃ２４および早生開花アンチセンスメチルトランス
フェラーゼ系統１０．５（Ｔ３世代)のロゼット葉におけるＦＬＦ発現。

【００４６】図６について：Ａ．ＥｃｏＲＩで消化し、Ａｃの３’領域についてのプローブによって探索した
、ＥｃｏＲＩで消化したそれぞれｆｌｆ、ｅｆＳＬ３(Ｍ２)、ｅｆＳＬ４(Ｍ２)
およびＣ２４植物から単離したゲノムＤＮＡ。ｆｌｆ試料についてのＤＮＡを、
第３のＴ−ＤＮＡバンド、すなわち約８ｋｂの該バンドを含む植物から抽出した
。この第３のバンドの存在は開花期に影響がなかったので、無関係である。Ｂ．プローブがプローブ４である他は、Ａと同様である(図２Ｃ参照)。ｅｆＳＬ
３(Ｍ２)およびｅｆＳＬ４(Ｍ２)試料についてのＤＮＡを、ネオ晩生および早生
開花変異体を含む大量のＭ２植物から抽出した。いくつかの２．７ｋｂバンドが
、これらのＤＮＡ抽出物中に存在する。それぞれの早生開花植物から単離された
他のＤＮＡは、２．７ｋｂのバンドを含まない。Ｃ．イントロンＩにおけるＡｃ挿入の位置。該ヌクレオチドの位置を、後記でＡ
ＴＧのＡをヌクレオチド１として、後記に記載する。Ｄ．Ｃ２４(レーン１)、ｆｌｆ(レーン２)、ｅｆＳＬ３(レーン３)、ｅｆＳＬ４
(レーン４)の１５日齢のロゼット葉におけるＦＬＦ遺伝子の発現レベル。Ｍ２早
生開花変異体はまさに抽だいを始めようとしており、一方、他の植物は栄養成長
のままであった。臭化エチジウム染色リボゾームバンドはローディングコントロ
ールとして示す。

【００４７】図７は、ネオ晩生植物からのゲルブロットを示す。Ａ．ゲノムＤＮＡを６つのネオ晩生変異体植物からおよびｅｆＳＬ３(Ｍ２)、ｅ
ｆＳＬ４(Ｍ２)、ｆｌｆおよびＣ２４植物から単離し、ＥｃｏＲＩで消化した。
ＤＮＡゲルブロットをＡｃの３’領域によって探索した。Ｂ．全ＲＮＡを、６つのネオ晩生植物、ｆｌｆおよびＣ２４からのロゼットおよ
び芝生状の葉(cauline leaves)の混合物から単離した。ＲＮＡゲルブロットを図
５のように探索した。臭化エチジウム染色リボゾームバンドをローディングコン
トロールとして示す。

【００４８】図８は、エコタイプおよび晩生開花変異体におけるＦＬＦ遺伝子の発現を示す
。全ＲＮＡを１２日齢実生から単離し、ＲＮＡゲルブロットを図５におけるよう
に探索する。臭化エチジウムリボゾームバンドをＡ−Ｃにおいてローディングコ
ントロールとして示す。Ａ．いくつかの様々なアラビドプシスエコタイプにおける発現。Ｂ．Landsberg erecta(L.er)およびＥＲＩ(L.er.-FRI^Sf2)またはＦＬＣ(L.er.-F
LC^Sf2,L.er.-FLC^Col)遺伝子座のいずれかにおいて晩生対立遺伝子を含むLandsbe
rg erecta系統における発現。Ｃ．L.er.エコタイプ(ｆｃａ、ｆｖｅ、ｆｐａ、ｇｉ、ｃｏ、ｆｈａ、ｆｗａ、
ｆｄ、ｆｅ、ｆｔ)またはＷｓ(Ｉｄ)のいずれかにおける晩生開花変異体におけ
る発現。変異体ｖｒｎ１およびｖｒｎ２は、ｆｃａバックグラウンドにおいて単
離され、ｖｒｎ１のみが、ｆｃａ変異体遺伝子座から分離された。

【００４９】図９は、Brassica napusからのＦＬＦ様配列のゲノム配列の一部を示す。エキ
ソンおよび翻訳産物の推測される配列を示している。図１０は、Brassica napusのＦＬＦ様配列の推測された翻訳産物(トップライ
ン)、およびArabidopsis thalianaからの推測されたＦＬＦ翻訳産物の比較を示
す。同一なアミノ酸(|)、高度に保存されたアミノ酸(:)および保存されたアミノ
酸(.)を示している。

【００５０】 (発明の詳細な開示) 本発明を後記の非限定的な実施例および図面を記載することによって詳細に記
載する。全般的な方法植物材料および成長条件アラビドプシスを５０％の砂および５０％の壌土の混合物を含むポット、また
は無菌的に修正Murashige and Skoog(ＭＳ)培地(Langridge, 1957)を含む試験チ
ューブもしくはペトリ皿において成長させた。他に言及しない場合、すべての植
物を２１℃または２３℃、長日条件(１６時間明期、８時間暗期)下の人工的に照
明したキャビネットにおいて、２００μＭｍ^−２ｓ^−１の強さのクールホワイト
蛍光灯を使用して成長させた。３、４または８週間４℃の暗黒下で種子を発芽させることによって、植物をバ
ーナリゼーションした。この低温処理の後、実生を２３℃の長日光周期条件に移
動し、茎の伸長(抽だい)が観察されるまでの時間として測定される開花するため
の時間を測定し、それは高温における最初の日から開始する。

【００５１】アラビドプシス形質転換アラビドプシスを、ｆｌｆ変異体および遺伝子Ａトランスジェニック植物を作
出するために、根形質転換(Valvelkens et al., 1988)によって、または遺伝子
Ｂトランスジェニック植物のためにインプランタ形質転換(Bechtold et al, 199
3)によって形質転換させた。晩生開花変異体(ｆｌｆ)は、早生開花エコタイプＣ
２４の修飾バイナリーベクターｐＢｉｎΔＡｃ(Finnegan et al,1993)による形
質転換中に生じた。このベクターは、転写方向と逆配向に、βグルクロニダーゼ
遺伝子の非翻訳リーダー内に挿入された欠失したトウモロコシＡｃ転位性因子(t
ransposable element)と一緒に、ノパリンシンターゼ(ＮＯＳ)プロモーターの制
御の下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ(ＮＰＴＩＩ)遺伝子を含む
。

【００５２】実施例１晩生開花表現型に関連する変異体遺伝子座の同定Ａｃ転位性因子(transposable element)を含むＴ−ＤＮＡ構築物によるArabid
opsis thalianaエコタイプＣ２４の形質転換の後、カナマイシン抵抗性のＴ_０植
物をそれぞれ自家授粉させ、Ｔ_１後代を親のＣ２４植物より有意に遅く開花する
ファミリーにスクリーニングした。ファミリー１４−５８の植物のいくつかは、Ｃ２４コントロール植物の３０日
に対して７０日後に開花した。ファミリー１４−５８からの自殖晩生開花Ｔ_１植
物の後代の分離分析は、１５の「早生」開花植物(開花期３０日)と比較して、５３
の「晩生」(開花期＞７０日)を示した。この結果は、３：１分離割合(χ^２＝０．
３１３Ｐ＞０．５)と適合し、単一突然変異の結果である晩生開花表現型と矛
盾しない。われわれは、この変異体遺伝子座をFLOWERIG LOCUS F(ＦＬＦ)と命名
した。

【００５３】分離後代内で晩生開花植物はさらに２つのクラスに分類し得る；「晩生」、７０
ないし９０日の間の開花、および「極晩生」、１５０日より遅く開花。「極晩生」植
物のあるものは、1年間の成長の後も開花しなかった。図１に示される「極晩生」
ｆｌｆ変異体は、非形質転換Ｃ２４と類似する速度で葉を生じ、開花時にＣ２４
よりも、より多くの葉を有していた。数ヶ月の成長の後、ロゼット葉の間の節間
から抽だいが起こった。これらの抽だいは、およそ２ないし３ｃｍ伸長し、空間
的なロゼット構造を形成し、ドーム様外観の変異体植物を生じ、これはｆｌｄ変
異体について記載されたものと類似していた(Chu and Yang, 1998)。観察された晩生開花表現型は、以前報告された晩生開花変異体およびエコタイ
プ(Koornneef et al, 1991)のいずれよりもより極端であった。後代検定は、自
殖「極晩生」は、「極晩生」後代のみを生じ、一方、自殖「晩生」は、極晩生、晩生お
よび早生開花植物について1:2:1に分離した。この分離パターンは、遺伝子産物
のレベルに比例して開花が遅れる半優性突然変異と矛盾しない。

【００５４】実施例２ゲノムライブラリーの構築およびスクリーニングｆｌｆ変異体のゲノムライブラリーを、全植物体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉで部分的に消化し、ファージベクターλＥＭＢＬ４にライゲートすることによ
って構築した。得られたライブラリーを、ＮＰＴＩＩ遺伝子(Feinberg and Voge
lstein, 1983)の^３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブを使用してスクリーニングした
。４つの正のファージクローンを精製し制限マッピングした。これらのＴ−ＤＮ
Ａの挿入部位の側方の植物ＤＮＡは全部で２７ｋｂにわたっていた。続いてこれ
らのフランキング植物ＤＮＡから単離された２．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ
Ｉおよび２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片(それぞれプローブ１および２、図２Ｃ）
を、野生型アラビドプシスＣ２４のゲノムライブラリー（ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ
から作成されλＥＭＢＬ４にクローン化された)を探索するために使用した。プ
ローブ１は、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位にわたる６．５ｋｂの植物ＤＮＡを含むゲノム
クローンにハイブリダイズし、プローブ２は、６．８ｋｂの隣接配列を含むゲノ
ムクローンにハイブリダイズした。

【００５５】実施例３ＦＬＦ遺伝子の単離２つのＴ−ＤＮＡは極晩生開花表現型を分離する。極晩生開花表現型は、サザン分析によって同定可能な２つのＴ−ＤＮＡバンド
を分離する。これらを、バンド１および５と命名する。サザンブロッティングは
、バンド１および５が、逆向きで、隣接していることを示す：ＲＢ←ＬＢＬＢ→ＲＢ１５ (ＬＢ、レフトボーダー；ＲＢ、ライトボーダー) 配列分析と合わせて、バンドのサイズは、小さい方のバンド(バンド５)を、Ｆ
ＬＦ遺伝子に最も接近させている。組換え近交系を使用して、ＦＬＦ領域は、ＲＦＬＰマーカー４４７から４ｃＭの
染色体5のトップにマッピングされた。これにより、ＦＬＦ遺伝子は、アラビド
プシスのエコタイプにおいて開花期を制御することが知られている遺伝子である
ＦＬＣの近傍にあることがわかった。

【００５６】Ｔ−ＤＮＡ挿入の位置の周辺の変異体からのゲノムＤＮＡの２７ｋｂのセグメ
ントをマッピングした。該変異体におけるＴ−ＤＮＡ挿入の周辺の１３ｋｂに渡
るＣ２４ゲノムクローンを、配列決定した。Ｔ−ＤＮＡ挿入のいずれかの側の２
つのプローブを、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した。
Ｃ２４ゲノムクローンからの４．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片（Ｔ−Ｄ
ＮＡ挿入部位の「上流」の４．４ｋｂの配列、およびＴ−ＤＮＡ挿入部位の「下流」
の０．２ｋｂを含む)を、ｃＤＮＡクローンを単離するために使用し、転写領域
として「遺伝子Ａ」を同定した。Ｔ−ＤＮＡ挿入の０．４ｋｂ「下流」ないし３．
１ｋｂ「下流」の領域に渡る、２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｃＤＮＡクローン
を単利するために使用し、転写領域として「遺伝子Ｂ」を同定した。

【００５７】エコタイプＣ２４およびＷｓの間の遺伝子間領域配列の部分の比較によって、
およそ２００ｂｐの配列、遺伝子Ａの終止コドンの「ライト」まで４２０ｂｐおよ
びＴ−ＤＮＡ挿入の「レフト」まで１２０ｂｐの、Ｃ２４のＤＮＡへの挿入が明ら
かになった。該配列は、Ｃ２４野生型およびｆｌｆ変異体の両方に存在する。該
２００ｂｐの挿入は、アラビドプシスミトコンドリアゲノムのＯＲＦ１６７と１
００％の相同性を示す。ＰＣＲ分析によって、われわれは、この配列はLandsber
g erectaおよびColumbiaエコタイプに不存在であることを示した。この挿入され
たＤＮＡセグメントの意味は知られていない。すべての領域のマップを図２Ｂに
示す。

【００５８】実施例４ｃＤＮＡライブラリーＴ−ＤＮＡに近接して連鎖している発現された遺伝子を同定するために、Ｔ−
ＤＮＡ挿入部位の周辺の植物ＤＮＡに対するプローブ(プローブ２および３、図
２Ｃ)を使用して、３つのアラビドプシスｃＤＮＡライブラリー(Elledge et al,
1991; Weigel et al, 1992; Newman et al, 1994)をスクリーニングした。２つ
のクラスのｃＤＮＡクローンが単離された。これらをそれぞれ遺伝子Ａおよび遺
伝子Ｂと命名する。遺伝子Ｂは、後にＦＬＦと再命名された。２つの遺伝子Ａの
ｃＤＮＡを４．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片(プローブ３、図２Ｃ)によ
って２０００００λ是クローンのスクリーンから単離した；しかし、２．７ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片(プローブ３、図２Ｃ)によってはクローンは単離されなかった
。遺伝子ＡのｃＤＮＡを、ファージから部位特異的組換えによってＣＲＥタンパ
ク質(E.coli系統BNN132によって提供された)およびベクター内のlox部位(Elledg
e et al, 1991)を使用してサブクローン化する。より大きい、ほとんど全長の遺
伝子ＡのｃＤＮＡをpBluescript SK(-)(Stratagene)にさらにサブクローン化す
る。次に、全長の遺伝子ＡのｃＤＮＡをLandsberg erectaの花のｃＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングによって単離する(Weigel et al, 1992)。

【００５９】単離されたｃＤＮＡに対応する変異体および野生型ゲノムクローンをも、pBlu
escript SK(-)に、より小さい断片としてサブクローン化する。いずれのｃＤＮ
Ａライブラリーからも、プローブ２(図２Ｃ)によってｃＤＮＡクローンが単離さ
れなかったので、第３のライブラリーをスクリーニングした。４つの全長の遺伝
子ＢのｃＤＮＡクローンを、様々な組織および発達段階からのλＰＰＬ２のｃＤ
ＮＡライブラリーから単離した(Newman et al, 1994)。すべてのｃＤＮＡ並びに
変異体および野生型のゲノムクローンを両鎖において、蛍光プライマー(Brumbau
gh et al, 1988)を使用してジデオキシ鎖ターミネーション法(Sanger et al, 19
77)によって配列決定した。University of Wisconsin ＧＣＧソフトウェアーパ
ッケージを配列分析のために使用した(Devereux et al, 1984)。ヌクレオチドお
よび予測されたタンパク質配列を使用して、すべての相同配列についてGenBank
データベースを探索し；発見されなかった。

【００６０】実施例５３５Ｓ：：遺伝子Ａプラスミドの構築最初に単離された遺伝子ＡのｃＤＮＡクローンの大部分は、開始コドンのＡＴ
ＧのＡＴを欠いていたので、オリゴヌクレオチドを用いた変異導入を実施し、不
存在ヌクレオチドを含むｃＤＮＡの５’末端から、２００ｂｐの断片を作成した
。２つのオリゴヌクレオチドをApplied Biosystems DNA Synthesizerにおいて合
成しそれは：

【化１】であった。

【００６１】太字で示したヌクレオチドは、プライマー内のＳａｃＩＩおよびＨｐａＩ制限
部位の位置を示す。増幅反応を、２μＭの各オリゴヌクレオチドプライマー、鋳
型としての２００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ切断ｃＤＮＡ、０．２単位のＴａｑポリ
メラーゼおよび１２５μＭの各４のデオキシヌクレオチドを含む１０μｌ最終容
量の中で実施した。この増幅のための条件は次の通りである：９５℃２分、１５
秒の変性９５℃からなる５サイクル、３０秒の４０℃におけるアニーリング、１
分間の７２℃における重合、続いてアニーリング温度を５０℃１５秒に上げ最終
的に３０℃１分の２５サイクル。得られた２００ｂｐのＰＣＲ断片を、もとのｃ
ＤＮＡプラスミドにおいてＳａｃＩＩおよびＨａｐＩ部位にクローン化し、増幅
過程中に突然変異が導入されなかったことを確認するために配列決定した。

【００６２】センスバイナリー構築物を全長ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩＩによっ
て消化することによって作成し、末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を
使用して陥凹末端を平滑末端化し、放出された１．４ｋｂ断片を発現ベクターｐ
ＤＨ５１(Pietrzak et al, 1986)のＳｍａＩ部位にライゲートした。これによっ
て、Ｃａ３５Ｓプロモーターの制御の下でのＦＬＦのｃＤＮＡの発現が可能とな
る。所望の配向のｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを、ＥｃｏＲＩで切断し、バ
イナリーベクターｐＢｉｎ１９(Becvan, 1984)のライトおよびレフトボーダー配
列の間にクローン化する。該バイナリー構築物を、pRK2013をヘルパープラスミ
ドとして使用し、三親交配(triparental mating)によって、Agrobacterium tume
faciens系統ＡＧＬ１(Lazo et al, 1991)に送達した。野生型Ｃ２４植物の根を
、ＮＰＴＩＩ遺伝子をトランスジェニック植物を同定するための選択マーカーと
して使用して、形質転換した。

【００６３】実施例６３５：：遺伝子Ｂプラスミドの構築ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターの制御の下での遺伝子Ｂを含むバイナリー構築
物を、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化ＰＣＲ産物[遺伝子ＢのｃＤＮＡクローンを鋳型
として使用し、下記：

【化２】のプライマー(ここで制限部位を太字で示し、遺伝子ＢのｃＤＮＡにハイブリダ
イズする配列にアンダーラインを付する)と共に、実施例５に記載の方法と類似
の方法を使用して増幅した]をＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含むＸｈｏＩ／Ｓ
ｐｅＩ消化ｐＡＲＴ７(Gleaves, 1992)にクローニングすることによって作成し
た。そして、３５Ｓ：：遺伝子ＢカセットをＮｏｔＩを使用してｐＡＲＴ２７(G
leaves, 1992)にサブクローン化し、A. tumefaciens系統ＧＶ３１０１(Koncz an
d Schell, 1986)に前記のように導入した。トランスジェニック植物をインプラ
ンタ形質転換(Bechthold et al, 1993)によって作出した。

【００６４】実施例７ＤＮＡゲルブロット分析全ゲノムＤＮＡを、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(ＣＴＡＢ)法(Dea
n et al, 1992)に従って、またはMcNellis et al. (1998)によって記載のように
単離した。２−３μｇのＤＮＡを適当な制限酵素によって消化し、０．８％アガ
ロースゲル上で電気泳動し、Hybond N+膜(Southern,1975)にブロッティングした
。プローブを、ランダムプライマー法(Feinberg and Vogelstein, 1983)を使用
して^３２Ｐ−ｄＣＴＰによって標識した。ＮＰＴＩＩプローブを、前記のように作成した。３’ＡｃプローブはＳｐｈＩ
断片(Lawrence et al, 1993)であり、プローブ４を：

【化３】のプライマーと共に野生型ゲノムクローンを増幅することによって作成した。これは、ＭＡＤＳボックスを欠いた、プローブ２配列の５７０ｂｐのサブセッ
トをもたらし、クロスハイブリダイゼーションを除いた。

【００６５】実施例８ＲＮＡ抽出およびＲＮＡゲルブロッティング分析全ＲＮＡをおよそ１ｇの植物組織から、Longemann et al.(1987)の方法にした
がって抽出した。１０−２０μｇの全ＲＮＡを２．２Ｍホルムアルデヒド／アガ
ロースゲル上で電気泳動し、Hybond N ナイロンフィルターにブロッティングし
た。線形化された遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂプラスミド鋳型(遺伝子Ａの完全なｃ
ＤＮＡを含み、線形にされた遺伝子ＢのＭＡＤＳボックスを除去した)のＴ７ま
たはＳＰ６ポリメラーゼ転写を使用して、アンチセンス^３２Ｐ−ｄＵＴＰ標識リ
ボプローブを作成した。フィルターは、Dolferus et al(1994)によって記載のよ
うにハイブリダイズさせ、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの最終溶液によっ
て６５℃で洗浄した。遺伝子Ａノーザンブロッティングのために、前記で記載の
ように(Dolferus et al, 1994)、ＲＮアーゼＡによってフィルターを処理し、リ
ボゾームの捕捉を避けることが必要であった。該フィルターを、phosphorimager
(Molecular Dynamics, USA)を使用してシグナル強度を定量するために、りん光
フィルター(phosphor filter)にさらした。ＲＮＡサイズマーカーを、遺伝子Ａ
および遺伝子Ｂ転写物のサイズを決定するために使用した。

【００６６】実施例９ＲＦＬＰマッピング６４の組換え近交系からのＤＮＡ(Lister and Dean, 1993)を、ＢａｍＨＩに
よって消化し、遺伝子Ａをプローブとしてサザンブロッティングを実施した。配
列決定プログラムを６８のマッピングされたマーカーについてのＲＦＬＰデータ
を有するデーターと比較するために使用した。遺伝子Ａの精密なマッピングを、
Landsberg erectaおよび該ｆｌｆ変異体の交雑から得られたＦ２植物からのＤＮ
Ａを使用して実施した。６２のＦ_２ＤＮＡのＨｐａＩ消化物を、染色体５のＲＦ
ＬＰマーカー４４７(Chang et al., 1988)によって探索した。制限断片長多型(
ＲＦＬＰ)が、ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩによる消化および遺伝子ＡのｃＤＮＡ
による探索によって、親系統、Landsberg erectaおよびColumbiaの間に見出され
た。

【００６７】実施例１０２つの逆向きの隣接したＴ−ＤＮＡの挿入が、半優性晩生開花変異
体を生じる晩生開花Ｔ_１親のＤＮＡゲルブロッティング分析は、５つのＴ−ＤＮＡの挿入
を示した。図２Ａは、このＴ_１親に由来する自殖の、ヘミ接合体変異体植物の１
６の分離する後代植物のＤＮＡゲルブロットを示す。全７０の後代の中で、２つ
の挿入だけが、晩生開花表現型(バンド１および５）の分離を示した；「晩生」植
物はこれらの２つのＴ−ＤＮＡについてヘミ接合であり、「極晩生」植物は同じ2
つの挿入についてホモ接合であった。２つの連鎖したＴ−ＤＮＡは、非形質転換
Ｃ２４への戻し交雑によって他のＴ−ＤＮＡ挿入から分離された。２つのＴ−Ｄ
ＮＡ挿入のみを含む植物(図２Ａ、バンド１および５)を、ＤＮＡゲルブロッティ
ング分析によって同定し、さらなる分析は、２つの挿入は隣接しており、逆の配
向であることを示した(図２Ｂ)。Ｔ−ＤＮＡ構築物のセグメントおよびＡｃに由
来するプローブを使用するＤＮＡゲルブロッティング分析は、Ａｃ転位性因子(t
ransposable element)の移動は起こらなかったを示した。

【００６８】２つの連鎖したＴ−ＤＮＡ挿入のみを含む晩生開花植物からのゲノムＤＮＡラ
イブラリーを、ＮＰＴＩＩプローブによってスクリーニングし、Ｔ−ＤＮＡ挿入
の部位に渡るＤＮＡセグメントを単離した。３つのオーバーラップするクローン
をＴ−ＤＮＡのレフト側から単離した。ライト側から単離された１つのクローン
と一緒に、これらの最も長いものを、図２Ｃに記載する。これらのクローンは、
Ｔ−ＤＮＡ挿入の部位に渡る２７ｋｂの植物ＤＮＡの全部を示した。Ｃ２４ゲノ
ムクローンを、ゲノムＤＮＡライブラリー(全アラビドプシスＤＮＡを制限酵素
ＢａｍＨＩで消化し、消化物をファージベクターλＥＭＢＬ４にライゲートする
ことによって調製した)から、プローブ１および２を使用して単離した(図２Ｃ)
。挿入部位に渡る６．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片および挿入部位の下流の６．８ｋ
ｂのＢａｍＨＩ断片を含むクローンの特性をあらわす(図２Ｄ)。ゲノムＤＮＡ配
列、ｃＤＮＡ配列および予測されたタンパク質配列を、配列番号１、配列番号２
および配列番号３にそれぞれ示す。ゲノムＤＮＡ配列は約２ｋｂのプロモーター
配列および６つのイントロンを含む。

【００６９】ＦＬＦ領域の染色体での位置を、６４のＦ９組換え近交系およびいくつかの既
知のマーカーについてのデーターを使用して決定した(Lister and Dean, 1993)
。Mapmakerプログラムは、ＦＬＦ領域を染色体５のトップ、ＲＦＬＰマーカー４
４７から４ｃＭに位置付け、それは、花のイニシエーションの調節に関連する(S
hannon and Meeks-Wagner, 1991; Lee et al, 1994b; Koornneef et al, 1994;
Sung et al, 1992)３つの他の遺伝子、ＴＦＬ、ＦＬＣおよびＥＭＦ１の付近に
位置している。

【００７０】実施例１１Ｔ−ＤＮＡ挿入体の両端に隣接する２個の遺伝子はｆｌｆ突然変異体において
高い発現性を有するＴ−ＤＮＡ挿入部位全体にわたる植物ＤＮＡにおける転写活性領域は、Ｔ−Ｄ
ＮＡのいずれかの側から誘導されたプローブ（プローブ２および３、図２Ｃ）で
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより同定された。２つのオー
バーラップ部分長ｃＤＮＡクローンをプローブ３により単離した。約１.５kbの
挿入体を含む完全長ｃＤＮＡクローンを、第２ｃＤＮＡライブラリーのスクリー
ニングにより単離した。１.０kbの挿入体を含む４つの同一完全長ｃＤＮＡクロ
ーンをプローブ２により単離した。ｃＤＮＡおよびゲノム配列を比較することに
より、Ｔ−ＤＮＡが２つの転写領域、すなわち遺伝子Ａのポリアデニル化部位の
５９１bp下流および遺伝子Ｂの開始コドンの２.３kb上流間に挿入されたことが
示された。突然変異体およびＣ２４ゲノム配列を比較すると、挿入部位のすぐ下
流に３０bp欠失が示されたが、それ以上差異は同定され得なかった。

【００７１】いずれの遺伝子もＴ−ＤＮＡの挿入による破壊を被らなかったため、われわれ
は、遺伝子の発現が突然変異体において変化されるか否かを調査した。図３Ａは
、エコタイプＣ２４、および同一条件下で成長させたヘミおよびホモ接合ｆｌｆ
突然変異植物の３０日齢葉組織から単離されたＲＮＡを用いて遂行されたＲＮＡ
ゲルブロットを示す。図３に示されている通り、遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂのいず
れかに特異的なアンチセンスリボプローブは、両遺伝子ともエコタイプＣ２４に
おける場合よりもｆｌｆホモ接合葉組織の方でより高度に発現され、１.５kb遺
伝子Ａ転写物は突然変異体において約１０倍高く発現され、１.０kb遺伝子Ｂ転
写物はホモ接合突然変異体において約２倍過剰発現されることを示した。ヘミ接
合突然変異体は、両遺伝子の中間的な発現レベルを有する。提案された機構によ
り制限されることを全く望まないわれわれは、Ａｃエレメントを完備するＴ−Ｄ
ＮＡの挿入によりこの過剰発現が誘発されたものと考える。

【００７２】実施例１２遺伝子Ｂを過剰発現するトランスジェニック植物は開花期が変化させられてい
るどの遺伝子が晩生開花表現型に関与しているかを測定するために、われわれは
、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下いずれかの遺伝子を含む構築物により
Ｃ２４を形質転換した。遺伝子Ａ構築物をもつ４９のトランスジェニック系が生
成され、開花期をＴ２生成で評価した。トランスジェニック系の大多数は、野生
型開花期からの変異を全く示さなかった。しかしながら、数種の系ではやや開花
期が遅れた。表１に示されている通り、トランスジェニック系のうちの４つがＣ
２４野生型より顕著に開花が遅れた。しかしながら、開花までの時間および遺伝
子Ａ発現レベル間に相関関係は無かった。遺伝子Ｂ構築物をもつ２３のトランス
ジェニック系が生成され、Ｃ２４と比べた開花期の差異はＴ１生成、すなわち１
次形質転換体において明らかであった。１７のＴ１植物は非形質転換Ｃ２４（３
０日）よりも早くに（１５−２５日の範囲）開花した。これらのうち８つは完全
または部分的不稔性を示した。４つはＣ２４とほぼ同時に開花し、２つは９０日
後にも開花していなかった。２つの早生開花Ｔ１植物のカナマイシン耐性後代、
および２つの晩生開花Ｔ１植物からのロゼット葉における遺伝子ＢｍＲＮＡ転写
物のレベルを調べると、全トランスジェニック植物における高レベルの遺伝子Ｂ
発現が示された。

【００７３】

【表１】

【００７４】トランスジェニックおよびｆｌｆ突然変異体種子をＭＳプレート＋５０μg／m
lカナマイシンにおいて発芽させ、Ｃ２４種子をＭＳプレートにおいて発芽させ
た。少なくとも２０の１２日実生を個々の植木鉢に移植し、蛍光灯下２３℃で成
長させた（１６時間明所、８時間暗所で）。開花期を茎伸長までの日数として記
録した。全ＲＮＡを１４日インビトロ成長実生から抽出し、ＦＬＦ発現レベルの
定量に使用した。

【００７５】

【表２】

【００７６】植物内形質転換植物から採取された形質転換体種子を、５０μg／mlカナマイ
シン含有ＭＳプレートにおいて選別した。カナマイシン耐性Ｔ１実生を２０日目
に土壌に移した。遺伝子Ｂ転写物のレベルを、Ｂ２およびＢ５に関するカナマイ
シン耐性Ｔ２植物において、およびＴ１晩生開花植物（Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ３６
、Ｂ４５）の若葉から測定した。n.d.：検出不可能。

【００７７】遺伝子Ｂの過剰発現により２種の全く反対の表現型が得られたことは驚くべき
ことである。これを明らかにするために、われわれは、エコタイプ Landsberg e
rectaにおける３５Ｓプロモーターの制御下遺伝子Ｂを含むトランスジェニック
植物を作出した。作出された２４のＴ１系のうち、野生型Landsberg erectaより
早く開花したものは無かった。Landsberg erectaの場合の２５日と比べて、１２
は７０日後にも抽だいしておらず、３つは約４０日後に抽だいした。４０日後に
抽だいした３種の系のうち２種は、開花異常および部分的不稔性を呈した。全Ｒ
ＮＡを２種の非開花Ｔ１植物（Ｂ３６、Ｂ４５、表１）のロゼット葉から単離し
たところ、両方とも高い導入遺伝子発現レベルを呈した。

【００７８】従って、Landsberg erectaでは、遺伝子Ｂの過剰発現により開花期の遅延が誘
発され、Ｃ２４では開花期の遅延が誘発されるか、または植物の顕著に早い開花
を誘発する。これは、支配的な負の効果または転写後遺伝子サイレンシングの一
形態により伝達され得る。この点を明確にするためにタンパク質発現レベルの分
析が遂行されている。恐らく、２エコタイプの遺伝的バックグラウンドにおける
差異がエコタイプ間で観察される差異に関与していると思われる。

【００７９】これらの結果は、遺伝子Ｂの過剰発現により晩生開花が誘発され、遺伝子Ａは
開花期にほとんど影響を及ぼさないことを示しており、遺伝子Ｂの過剰発現が晩
生開花ｆｌｆ表現型の最も可能性の高い誘因であること、およびこの遺伝子が開
花の用量依存的リプレッサーをコードすることが示されている。以後、遺伝子Ｂ
をＦＬＦと称す。

【００８０】実施例１３アンチセンス構築物アンチセンス植物構築物は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下アンチセン
スＦＬＦ遺伝子構築物を用いて生成された。３５Ｓ：：ＦＬＦアンチセンスバイ
ナリー構築物は、３５Ｓ：：ＦＬＦ構築物に関して記載されたプライマー

【化４】により増幅されたＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ消化ＰＣＲ産物のクローニングにより生
成された。これによりＭＡＤＳボックスの下流領域が増幅されたため、アンチセ
ンス構築物はＭＡＤＳボックス領域を欠いている。ＰＣＲ産物をｐＡＲＴ７およ
びｐＢＡＲＴ２７（ｐＡＲＴ２７の誘導体である）にクローン化し、トランスジ
ェニック植物を上記要領で生成させたが、ただしＢａｒ遺伝子を選択マーカーと
して使用した。

【００８１】２５のＴ１Ｃ２４トランスジェニック植物は、アンチセンス配向でＦＬＦ遺
伝子の３’末端が３５Ｓプロモーターの制御下にある構築物（３５Ｓ：：ＦＬＦ
ＡＳ）により生成された。Ｔ１植物のほぼ半分は、非形質転換株の場合の３０日
と比べて、２０日間の成長前に開花していた。

【００８２】トランスジェニック植物をＣ２４およびColumbiaエコタイプにおいて作成した
。Columbiaエコタイプで作成された６つのＴ１植物のうち、３つが野生型Columb
iaより早期に抽だいした。野生型Ｃ２４植物は約３０日目に抽だいし、野生型Co
lumbia植物は約２０日目に抽だいする。

【００８３】これらの結果は、アンチセンス構築物が、恐らくはＦＬＦ転写物レベルを低減
化することにより開花期間を減少させるべく作用することを示している。

【００８４】３つのＴ２Ｃ２４アンチセンス系からの早生開花植物のＲＮＡゲルブロット
分析は、ＦＬＦ転写物レベルが非形質転換Ｃ２４における場合よりもかなり低い
ことを示しており、アンチセンス構築物がＦＬＦ転写物レベルを減少させること
により開花期間を短くすべく作用していることが確認された。

【００８５】実施例１４ＦＬＦ遺伝子は新規ＭＡＤＳボックス遺伝子であるＦＬＦｃＤＮＡ配列は、ＭＡＤＳボックス遺伝子として知られている転写因子
のクラスと強い相同性を有する。ＦＬＦ配列は、Ｍ−Ｉ−ＫドメインにおけるＭ
ＡＤＳ遺伝子ＡＧＬ１４との非常に高い類似性を示すが、全ｃＤＮＡ配列にわた
ってＣＡＬ（ＣＡＵＬＩＦＬＯＷＥＲ）およびＡＰ１（ＡＰＥＴＡＬＡ１）とさ
らに大きな類似性を示す。ＭＡＤＳボックス、Ｉドメイン、ＫドメインおよびＣ
末端ドメインの位置は、図５Ａに示されている。Ｋドメインは、他の植物ＭＡＤ
Ｓ遺伝子を有するものの典型である。ＦＬＦ遺伝子のゲノム配列（配列番号１）
およびｃＤＮＡ配列（配列番号２）を比較すると、６イントロンの存在が示され
、イントロンＩは３.５kbであった。推測されたタンパク質（配列番号３）は１
９６アミノ酸長であり、ほとんどのＭＡＤＳボックス遺伝子によりコードされる
タンパク質より短い。

【００８６】現在までに報告されている植物発生におけるＭＡＤＳボックス遺伝子の主たる
役割の１つは、花器官同一性を指定することである。ＭＡＤＳボックス遺伝子に
関する他の役割には、根の構造および植物の成長を指定することが含まれる。Ｆ
ＬＦが開花時間の制御におけるその役割に加えて他の役割をも有するか否かを調
べるため、われわれは一組織範囲におけるその発現を調べた。図５Ｂは、栄養成
長ロゼット葉におけるＦＬＦ遺伝子の高い発現性を確認しており、根における強
い発現性および花組織におけるさらに低い発現性を示していることから、ＦＬＦ
遺伝子に関するさらに別の役割があり得ることが示唆されている。根の表現型は
トランスジェニック系では全く観察されていない。しかしながら、若干の系は稔
性が低減化していたことから、Ｃ２４系における花粉の欠如またはLandsberg er
ecta系における異常心皮により誘発されると思われる。しかしながら、早生Ａｃ
植物（後記参照）はこれらの表現型を示さなかったので、これがＦＬＦ遺伝子の
発現における変化により誘発されるか否かは不明である。

【００８７】ＦＬＦ遺伝子の発現は、栄養成長ロゼット葉における場合よりも栄養成長後組
織における場合の方が低い。われわれは、ＦＬＦ遺伝子の発現レベルの低減化が
開花への推移を随伴する可能性を調べた。Ｃ２４植物の大多数が抽だいしてしま
う段階（５０日）まで、播種後１０日毎にＣ２４およびｆｌｆ全植物体からＲＮ
Ａを単離した。ＦＬＦ遺伝子の発現がこれらの植物において不変のままであった
ことから（図５Ｃ）、ＦＬＦ遺伝子の発現レベルの低下が実際に開花への推移を
伴う場合、それはごく僅かの細胞でのみ起こるに違いないと思われる。

【００８８】ｆｌｆ突然変異体は、Schafferら（１９８８）により報告された１ｈｙ突然変
異体との若干の類似性を示す。それらは両方とも遺伝子に隣接した外来ＤＮＡの
挿入により誘発された（半）優性晩生開花突然変異体である。野生型植物の場合
ＬＨＹ遺伝子は明け方前後の僅か数時間のみ発現され、１ｈｙ突然変異体の場合
ＬＨＹ遺伝子は２４時間を通して発現される。ｆｌｆおよび１ｈｙ間に類似性が
あるため、われわれは、８時間光周期の明け方および日暮れ時に採取されたＣ２
４およびｆｌｆ組織におけるＦＬＦ遺伝子の発現を調べた。２時点間における遺
伝子発現にある程度の差異はあったが、突然変異体においてこのパターンの変化
は無かった。

【００８９】実施例１５ｆｌｆ突然変異体の晩生開花表現型はバーナリゼーションまたはジベレリン酸
処理により抑制される若干の晩生開花突然変異体およびエコタイプでは、発芽中の種子の低温処理（
バーナリゼーション）により早生開花が誘導され（Napp‐Zinn、１９８５）、２
１日間４℃処理は、開花までの時間を最短にするためのバーナリゼーション必要
条件を満たしている（Bagnall、１９９２）。ヘミ接合およびホモ接合ｆｌｆ突
然変異体の開花までの時間に対するバーナリゼーションの作用は表２に示されて
いる。

【００９０】

【表３】

【００９１】ｆｌｆ突然変異体および野生型Ｃ２４の種子２０個を、試験管中ＭＳ培地で防
腐処置をして成長させ、４℃で４または８週間露出させた。非バーナリゼーショ
ン化植物を土壌で成長させた（２０cm鉢につき２０植物）。次いで、植物を全て
蛍光灯下（１６時間照明、８時間暗所）２３℃で成長させた。データは、バーナ
リゼーション期間を除外し、茎伸長までの平均日数（±標準誤差）として示され
ている。

【００９２】４℃で２８日間処理の結果、開花時間はかなり減少した。しかしながら、ヘミ
接合体およびホモ接合体の両方におけるバーナリゼーション応答を満たしてＣ２
４対照の場合と類似した開花期をもたらすのに、４℃で８週間を必要とした。こ
れは、ＦＬＦ遺伝子発現およびバーナリゼーション誘導経路の一成分間に相互作
用があることを示している。

【００９３】バーナリゼーションされたかまたは未処理対照である１２日齢Ｃ２４実生から
ＲＮＡを抽出し、ＦＬＦ遺伝子特異プローブによりプローブした。図５Ｅは、非
バーナリゼーション化実生と比較したバーナリゼーション化実生におけるＦＬＦ
発現の劇的な減少を示しており、バーナリゼーションシグナル伝達経路の一成分
がＦＬＦ遺伝子発現を制御することを示唆している。第１日は種子を栽培室へ移
した日である。ｆｌｆ突然変異植物において、転写物のレベルは３週間バーナリ
ゼーションされた実生では低下したが、Ｃ２４で観察された低レベルには至らず
、その一部のみの早生開花特性と一致していた。

【００９４】８週間バーナリゼーションされたＦＬＦ突然変異植物では、ＦＬＦ転写が大き
く低下しており、開花期の多大な減少と一致していた。

【００９５】 Arabidopsisの他の晩生開花バーナリゼーション応答性突然変異体およびエコ
タイプの場合と同様、ｆｌｆ突然変異植物は、早生開花によりジベレリン酸（Ｇ
Ａ_３）適用に応答した。全部で２週間の間２日毎に１μgのＧＡ_３で処理された
４週齢ｆｌｆホモ接合体は、未処理植物の場合２０週間よりも遅れるのと比べて
、最終ＧＡ_３適用の２週間後には開花した。しかしながら、１μgのＧＡ_３で４
週齢植物を１回処理してもｆｌｆの開花誘導に十分ではなかったが、このＧＡ_３量は晩生開花ｆｃａ突然変異体（Bagnall、１９９２）の早生開花を誘導したこ
とから、ｆｌｆは開花誘導にさらに多量のＧＡ_３を必要とすることが示唆された
。ＦＬＦ遺伝子の発現に対するバーナリゼーションの劇的効果とは対照的に、Ｃ
２４またはｆｌｆ実生を１０^−５モルＧＡ_３に暴露してもＦＬＦ遺伝子発現には
全く影響を及ぼさなかった。

【００９６】実施例１６Ｔ−ＤＮＡ内に存在するＡｃエレメントの動きは開花期の変化を誘発する２種の早生開花植物（ｅｆＳＬ３およびｅｆＳＬ４と称されるＭ１植物）が、
ｆｌｆ突然変異植物からの膨れた種子を含む一種子ロットから同定された。両植
物とも、３０日後に開花したＣ２４より早く、１８日後には開花した。Ｔ−ＤＮ
Ａ配列およびフランキングゲノム配列内からのプライマーを用いたＰＣＲ分析に
より、これらの早生開花植物はｆｌｆ突然変異体から誘導されたもので、混入物
質ではないことが確認された。

【００９７】ｆｌｆ突然変異体に存在する縦列Ｔ−ＤＮＡは各々Ａｃエレメントを含んでお
り、われわれは、Ａｃの動きが早生開花表現型の誘因である可能性を考慮した。
ｅｆＳＬ３およびｅｆＳＬ４の個々の早生開花Ｍ２後代からＤＮＡを単離し、Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、Ａｃの３’領域によりプローブした。図６Ａは、Ａｃの動き
を示す、早生開花植物における新規２.１kbバンドの出現を示している。Ｔ−Ｄ
ＮＡ内に存在する２つのもとのＡｃバンドが維持されていることは、Ａｃエレメ
ントがなおそれらのもとの位置に残存していることを示す。

【００９８】Ａｃの新たな位置を測定するために、われわれがプローブ４による類似ＤＮＡ
ゲルブロットをプローブしたところ（図２Ｃ）、ＦＬＦ遺伝子のプロモーター、
ＭＡＤＳドメインおよびイントロンＩの一部を含む２.７kb ＥｃｏＲＩ断片のサ
イズの変化が示された（図６Ｂ）。３’Ａｃ断片のサイズ（２.１kb）は、Ａｃ
エレメントがＥｃｏＲＩ部位付近に挿入され、Ａｃの３’末端がＥｃｏＲＩ部位
に最も近いことを示していた。Ａｃの３’末端におけるプライマーおよび２.７k
b ＥｃｏＲＩ断片のいずれかの端にあるＥｃｏＲＩ部位付近のプライマーを用い
たＰＣＲにより、ＡｃがｅｆＳＬ３のＦＬＦ遺伝子のイントロンＩ内に挿入され
たことが示された。ＰＣＲ産物の配列決定により、Ａｃエレメントの正確な挿入
点が測定された（図６Ｃ）。早生開花Ｍ２植物のロゼット葉およびＣ２４および
ｆｌｆ植物の同等サイズのロゼット葉からＲＮＡを単離し、ＦＬＦ遺伝子特異的
リボプローブによりプローブした。図５ｄに示されている通り、ＦＬＦ遺伝子発
現はＣ２４発現レベルの約５％に低減化された。Ａｃの存在により転写物の転写
効率、ＲＮＡ安定性またはスプライシング効率が低減化されるため、正常にスプ
ライシングされたｍＲＮＡの量が減少する結果、早生開花が誘導されると思われ
る。

【００９９】実施例１７イントロンＩからＡｃを削除することにより、開花は遅延され、ＦＬＦ転写物
レベルは高められるＭ１ｅｆＳＬ３植物の２０の後代を成長させ、それらの開花期を記録した。
１５のＭ２植物は１８日目に開花し、それらのＭ１親植物と同じであった。しか
しながら、５植物はそれらの親植物より開花は遅れた。これらの晩生開花植物を
「ネオ晩生開花植物（neo-lates）」と名付けることにより、それらをもとの晩
生開花ｆｌｆ突然変異植物と区別した。それらの抽だいまでのおおよその日数は
、５０日（３.２）、５０日（３.４）、６０日（３.５）、８５日（３.５）、１
００日（３.１）であった。ｅｆＳＬ４のＭ２後代では、３６の植物がそれらの
Ｍ１親植物と同時に開花したが、一ネオ晩生開花植物、４.６は３８日目に開花
した。個々の植物からＤＮＡを単離し、３’Ａｃによりプローブした（図７Ａ）
。ネオ晩生開花植物は全て２.１kbバンドの存在についてヘミ接合性であると思
われることから、イントロンＩにおけるＡｃの存在についてヘミ接合性であるこ
とがわかった。場合によって（３.１、３.２、３.３）、図７Ａにおける新たな
バンドの出現が示すところでは、Ａｃエレメントは新しい部位に再配置されてい
た。

【０１００】各ネオ晩生開花植物でイントロンＩにおける１コピーのＡｃが削除されたこと
を立証するため、Ａｃ挿入部位の両端に隣接する、イントロンＩ配列から誘導さ
れたプライマーを用いてＰＣＲが遂行された。どの場合も、ＰＣＲ産物が生成さ
れたことから、少なくとも１コピーのＡｃが削除されたことがわかる。図７Ａに
おける２.１kbバンドの存在は、Ａｃの少なくとも一コピーがイントロンＩに残
存していることを示すため、各植物はイントロンＩにおけるＡｃの存在について
ヘミ接合性であることがわかる。

【０１０１】ネオ晩生開花植物４.６は、ＦＬＦ（遺伝子Ｂ）に最も近いＴ−ＤＮＡ内にお
けるＡｃエレメントの喪失についてホモ接合性である。われわれは、４.６種子
が由来するＭ１早生開花親植物のセクターがこのＡｃエレメントについてヘミ接
合性であったはずであると考えており、植物４.６はこのＡｃエレメントの喪失
に関するホモ接合性分離体である。Ｍ１植物ｅｆＳＬ３のＭ２後代がこの位置に
おけるＡｃの存在に関してホモ接合性であるため、恐らくこのＡｃエレメントの
喪失は、イントロン１におけるＡｃの挿入をもたらす事象とは関係の無い事象で
あったと考えられる。

【０１０２】ネオ晩生開花植物の約８０日齢ロゼット葉から全ＲＮＡを抽出し、遺伝子Ｂ発
現レベルを、ｆｌｆの８０日ロゼットおよび茎生葉およびＣ２４の２５日ロゼッ
ト葉の場合と比較した。全ネオ晩生開花植物において、転写物レベルは早生開花
親植物の場合よりも高かったが、ｆｌｆ突然変異体の場合よりは低く、晩生対立
遺伝子についてヘミ接合性であるそれらと一致している。

【０１０３】すなわち、ＦＬＦ（遺伝子Ｂ）のイントロンＩへＡｃエレメントを挿入すると
、ＦＬＦ（遺伝子Ｂ）転写物レベルは大きく低減化され、早生開花が誘発され、
そしてイントロンＩからＡｃを削除することにより、ＦＬＦ（遺伝子Ｂ）転写物
の発現が回復する結果、開花は遅延される。これにより、晩生開花ｆｌｆ突然変
異体におけるＦＬＦ（遺伝子Ｂ）の過剰発現が晩生開花表現型の誘因である抗い
難い証拠が提供される。

【０１０４】実施例１８ＦＬＦ遺伝子の発現は既知開花期遺伝子により制御される開花制御におけるＦＬＦ遺伝子の役割をさらに理解するため、われわれは一連
のArabidopsisエコタイプおよび晩生開花突然変異体におけるその発現を調べた
。図８Ａは、様々なエコタイプにおけるＦＬＦ遺伝子の発現を示す。興味深いこ
とに、ＦＬＦ遺伝子は、ＦＲＩ座（PitztalおよびＣ２４）に晩生対立遺伝子を
有するエコタイプでのみ高度に発現され、ＦＲＩ座（Columbia、Ws、Landsberg
erecta）に早生対立遺伝子を伴うエコタイプではなく、Ｃ２４で特に高度に発現
される。

【０１０５】この実験で使用されるPitztal種子供給源が晩生開花Pitztal品種ではなかった
ことに注目すべきである。晩生開花Pitztal品種におけるＦＬＦ発現の後続分析
は、非常に高い発現レベル、すなわちＣ２４の場合の約３倍を示した。これは、
Pitztalが開花までにＣ２４の３倍長くかかる（約３０日と比べて約９０日）と
いう観察結果とまさしく相関関係を示している。

【０１０６】これをさらに調べるため、われわれは、ＦＲＩまたはＦＬＣの晩生対立遺伝子
を伴うLandsberg erectaエコタイプにおけるＦＬＦ遺伝子の発現を調べた（図８
Ｂ）。またＦＬＦは、晩生ＦＲＩ^ｓｆ２対立遺伝子を伴うLandsberg erectaの系
で発現される。しかしながら、それはまた晩生ＦＬＣ^ｓｆ２およびＦＬＣ^Ｃｏｌ対立遺伝子を含む系でも発現される。Landsberg erecta−ＦＬＣ^Ｃｏｌはエコタ
イプColumbiaと同じＦＲＩおよびＦＬＣ遺伝子型（ＦＲＩ^early、ＦＬＣ^late）
を有するが、ColumbiaではなくLandsberg erecta−ＦＬＣ^Ｃｏｌで依然として発
現が行なわれるため、この植物におけるＦＬＦ遺伝子の発現は興味深い。このこ
とは、Landsberg erectaおよびColumbiaでは第３の未知の遺伝子座が異なること
、およびこの座はＦＬＣ座の晩生対立遺伝子と連係して、ＦＲＩの晩生対立遺伝
子の非存在下においてＦＬＦ遺伝子の発現を誘導し得ることを示唆している。

【０１０７】晩生開花突然変異体の多くは Landsberg erectaエコタイプにあり、われわれ
は注意してＦＬＦ遺伝子がこれらの突然変異体においてアップレギュレーション
されているか否かを調べた。図８Ｃは、ＦＬＦ遺伝子が、Landsberg erectaエコ
タイプおよび Wsエコタイプのｌｄにおいてｆｃａおよびｆｖｅ突然変異体では
アップレギュレーションされており、ｆｐａおよびｆｄ突然変異体では僅かにア
ップレギュレーションされているが、試験された他の晩生開花突然変異体では全
くアップレギュレーションされていないことを示している。ＦＬＦはまた、Colu
mbiaエコタイプにおけるｆｌｄ突然変異体でアップレギュレーションされている
。これらのデータは、ＦＣＡ、ＦＶＥ、ＦＰＡ、ＬＤ、ＦＤおよびＦＬＤ遺伝子
の野生型対立遺伝子の機能がＦＬＦ遺伝子をダウンレギュレーションすることを
立証している。

【０１０８】われわれは、これらの突然変異体の少なくとも１種、ｆｃａにおけるＦＬＦ転
写物レベルが高い場合、実施例１３からのＦＬＦアンチセンス構築物を用いてｆ
ｃａ突然変異体におけるＦＬＦ転写物レベルおよび突然変異体の開花期間の両方
を減少させることにより、晩生開花表現型の誘因となることを示した。われわれ
はまた、２８日バーナリゼーション期間が６突然変異体全部においてＦＬＦ転写
物を減らし、開花期間を減らすのに十分であることを示した。すなわち、低温処
理は、これらの座の突然変異により誘発されるＦＬＣ遺伝子のアップレギュレー
ションの克服、および開花の遅延の克服を可能にする。

【０１０９】われわれはまた、バーナリゼーションに対する応答が低下した、突然変異体ｖ
ｒｎ１およびｖｒｎ２におけるＦＬＦ遺伝子の発現に注目した。両突然変異体と
もｆｃａ突然変異体バックグラウンドで単離されたが、ｆｃａおよびｖｒｎ２が
密接に結合しているためｆｃａｖｒｎ２二重突然変異体のみが現在利用可能であ
る。ｖｒｎ１におけるＦＬＦ遺伝子発現の増加は全く検出され得なかったが、ｖ
ｒｎ２ｆｃａ二重突然変異体ではｆｃａ突然変異体レベルを凌ぐレベルでＦＬＦ
遺伝子発現が増加していたことから、バーナリゼーション応答での何らかの役割
とは関係無く、野生型ＶＲＮ２遺伝子は、ＦＬＣ発現を抑制することにより開花
を促進すべく作用すると考えられる。ｆｃａｖｒｎ１は、ｆｃａと類似した開
花期間および類似したＦＬＣ転写物レベルを有する。ｆｃａｖｒｎ１およびｆ
ｃａｖｒｎ２は両方とも、ｆｃａの場合よりもバーナリゼーションに応じた開
花期間の減少が少なく、この点はＦＬＣ転写物レベルにおける減少が少ないこと
と適合する。これは、野生型ＶＲＮ１およびＶＲＮ２遺伝子が、ＦＬＣ遺伝子の
バーナリゼーション誘導ダウンレギュレーションの伝達に関与していることを示
す。われわれの成長条件では、ｆｃａ突然変異体から分離されたｖｒｎ１は晩生
開花であり、開花期間またはＦＬＣ転写物レベルに対する変化に関して、バーナ
リゼーション応答をほとんど示さない。これは、ＶＲＮ１遺伝子がＦＬＣ独立経
路およびＦＬＣ依存的バーナリゼーション経路において活性であり得ることを示
す。

【０１１０】メチル化レベルが低減化された（Finneganら、１９９６）早生開花植物ではＦ
ＬＦ遺伝子の発現が低減化されることから（図５Ｆ）、メチル化がＦＬＦ遺伝子
またはＦＬＦの調節因子である遺伝子の発現制御においてある一定の役割を演じ
得ることが示唆される。

【０１１１】バーナリゼーションまたはバーナリゼーションシグナル伝達経路におけるある
成分は、ＦＬＦ転写を抑制するかまたはＦＬＦｍＲＮＡ分解を増加させるべく
作用する。Ｃ２４は強いバーナリゼーション応答を有し、３週間バーナリゼーシ
ョンされた植物は非バーナリゼーション植物の約半分の時間で開花する。４週間
のバーナリゼーション期間により、ｆｌｆ開花期は幾分減少するが、開花をＣ２
４期間に戻すのには８週間を要する。ｆｌｆ突然変異体の開花期に対する短いバ
ーナリゼーション期間のこの不完全な効果は、ｆｌｆにおける転写物レベルの不
完全な減少と相関関係を示す。これは、高いレベルのＦＬＦ転写物および恐らく
はＦＬＦタンパク質により、バーナリゼーションに応じて生成された開花プロモ
ーターがタイトレーション（滴定）されることを示唆する。バーナリゼーション
期間が長いとき、プロモーターがさらに多く生産され得、高いＦＬＦ転写物レベ
ルが克服され得る。

【０１１２】他のエコタイプ、例えばＷｓ、Landsberg erectaおよびColumbiaは、バーナリ
ゼーションに対してほとんど応答を示さない。Ｃ２４との良好な応答を与える条
件と類似した条件下では、他のエコタイプは僅か１または２日早く開花する。わ
れわれは、これらのエコタイプが非常に低いＦＬＦ転写物レベルを有し、バーナ
リゼーションによってもあまりそれ以上は減少され得ないことに注目している。

【０１１３】 Pitztalは、強いバーナリゼーション応答を有し、高いＦＬＦ転写物レベルを
有する晩生開花エコタイプである。バーナリゼーションは、これらの植物におけ
るＦＬＦ転写物レベルを減少させると予測される。バーナリゼーションはこのエ
コタイプにおけるＦＬＦ転写物レベルを減少させ、バーナリゼーション期間がさ
らに長い場合ＦＬＦ転写物が比例的に大きく減少することになり、開花期の減少
と相関関係を示す。

【０１１４】ｆｌｆ突然変異体は、開花を早めるのに長いＧＡ処理を必要とする。これは、
高レベルのＦＬＦ転写物（および恐らくはＦＬＦタンパク質）がＧＡを除去する
かまたはＧＡ作用を低下させるべく作用し得ることを示している。ＦＬＦはＭＡ
ＤＳボックス転写因子であるため、それは、直接的または間接的にＧＡの異化作
用に関与する遺伝子を活性化するか、またはＧＡシグナル伝達に関与する遺伝子
の発現を変化することによりそれを行い得る。

【０１１５】ＦＬＦ転写物レベルに対するＧＡ処理の効果が欠如するということは、ＧＡが
ＥＬＦの下流または別の経路により作用することを示している。すなわち、バーナリゼーション→→ＦＬＦ転写物の減少→→ＧＡ→→開花またはバーナリゼーション→→ＦＬＦ転写物の減少→→開花？→→ＧＡ→→開花ただしＦＬＦは通常ＶＥＲＮおよびＧＡ間の経路を遮断すべく作用する。

【０１１６】組織特異的発現Ｃ２４エコタイプの異なる組織におけるＦＬＦの発現レベルを調べた。栄養成
長葉、根、花芽および成熟花において高度発現が観察された。茎生葉および薹茎
では低レベルの発現であり、緑色長角果では非常に低い発現レベルであった。Ｃ
２４ロゼット葉および「頂端」、すなわち可能な限り多くの葉および根が除去さ
れた後に残存する組織からＲＮＡを単離した。この組織は非常に小さい葉および
頂端分裂組織を含む。これら２つの組織型間に発現レベルの差異は無かった。

【０１１７】ｆｌｆ突然変異体においてＦＬＦの発現は栄養成長組織におけるＣ２４の場合
の２倍であり、花組織における発現は比較的大きかった（Ｃ２４レベルの約３倍
）。

【０１１８】 Columbiaエコタイプでは、栄養成長組織の発現レベルはＣ２４と比べて非常に
低く、花組織ではＣ２４とほぼ同レベルの発現であった。

【０１１９】これは、ＦＬＦ遺伝子の栄養成長および花転写の単独制御であり得ることを示
している。

【０１２０】発生的発現ＦＬＦは開花のリプレッサーであると思われるため、その発現パターンに関す
る一予測は、開花への移行前または移行に伴ってそれが減少し得るというもので
ある。ＭＳ培地で成長させ、１０日毎に採取した全植物体からＲＮＡを抽出した
。これらの条件下ではＣ２４植物の５０％が５０日後に抽だいしていた。Ｃ２４
またはｆｌｆ突然変異体におけるＦＬＦ転写物レベルに変化は全く無かった。こ
れは、開花への移行に伴ってＦＬＦ転写物レベルに減少がある場合、それは非常
に僅かの細胞で起こるはずであることを示している。またこの結果は、成長の進
んだ葉では転写レベルに全く減少は無い、すなわち葉が成長するのに応じて転写
物が希釈されるわけではないことを示唆している。

【０１２１】概日応答Ｃ２４およびｆｌｆ植物を、２１日間８時間の蛍光光周期で成長させ、この状
態で維持するかまたは連続明所または連続暗所に移した。８時間光周期となった
はずの過程の開始または最終時に採取した植物からＲＮＡを抽出した。どの場合
も、早い時点では発現性が僅かに高くなったことから、微妙な概日応答が示唆さ
れる。突然変異体およびＣ２４間に発現パターンの差異は全く無かった。

【０１２２】実施例１９ Brassica napus ＦＬＦ相同体の単離ＭＡＤＳボックス領域を欠くＦＬＦプローブによるBrassica napusゲノムライ
ブラリーの低ストリンジェントなスクリーニングの結果、スクリーニングされた
合計７２０００から１８の強度ハイブリダイズ性プラークが単離された。低スト
リンジェント条件は、５０％ホルムアミド、３×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、２０
×Denhardt's、５０μg／mlサケ精液ＤＮＡ中一夜２８℃でハイブリダイゼーシ
ョンであり、室温で０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳの最終洗浄液により洗浄した
。これらのプラークを精製し、選抜したものを上記実施例４と同様配列決定した
。

【０１２３】 Brassica napusＦＬＦ様遺伝子の部分的ゲノム配列を配列番号４に示し、推定
される翻訳産物のアミノ酸配列を配列番号５に示す。エキソンの位置および対応
する翻訳産物の配列を示す部分的ゲノム配列を図９に示し、図１０においてBras
sica napus遺伝子からの推定される翻訳産物の配列を、Arabidopsis thalianaＦ
ＬＦからの対応する産物と比較する。推定されるＦＬＦタンパク質配列において
７９％同一性および８３％類似性を有する、高度保存域が存在する（ユニバーシ
ティー・オブ・ウィスコンシン、ジェネティクス・コンピューター・グループの
ソフトウェアパッケージバージョン９.１により測定された、デフォルトパラメ
ーターを使用）。

【０１２４】ｃＤＮＡライブラリーをBrassica napusから生産し、ArabidopsisからのＦＬ
ＦｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを用いて１０のｃＤＮＡクローンを単
離した。出発ＲＮＡをBrassica napus、Colombus品種の葉から単離した。ｍＲＮ
Ａ精製キット（アマーシャム・ファーマシア・バイオテク）を用いてポリ（Ａ）
＋ｍＲＮＡを単離した。ＥｃｏＲＩアームを伴うラムダ‐ジプロックスベクター
（ギブコＢＲＬ）においてスーパースクリプト・チョイス・システムｃＤＮＡ合
成キット（ギブコＢＲＬ）を用いることにより、ｃＤＮＡライブラリーを構築し
た。ライブラリーの１次力価は約５０００００pfuであった。コーディング領域
の最初の２エキソンを伴わないArabidopsis ＦＬＦｃＤＮＡを用いて、１次ラ
イブラリーからの約２０００００プラークをスクリーニングした。スクリーニン
グは、高ストリンジェンシーで行なわれた。第１ラウンドで１３のプラークを採
取し、これらのうち、第２ラウンドの高ストリンジェンシーでのスクリーニング
により１０が陽性として確認された。これらのプラークを精製し、ｃＤＮＡを含
むプラスミドを各クローンから切除した。各クローンの完全ヌクレオチド配列を
測定し、これから各クローンによりコード化されるアミノ酸配列を推定した。多
重配列アラインメントを用いることにより、クローン間の関係を測定した。アミ
ノ酸およびヌクレオチド配列の両データからクローンが５種の異なる遺伝子から
の転写物を代表するという結論に達した。

【０１２５】ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列は、配列番号６〜１５および配列番号１
６〜２３にそれぞれ示されている。これらの配列は恐らく次のようにグループ分
けされる５遺伝子を表すと思われる：１２.１／１６.１１５.１／１６.２／１８.２１１.２１４.１／１８.１／２０.１１１.３図９における部分的ゲノム配列および翻訳は、ｃＤＮＡ１２.１／１６.１に対応
する。

【０１２６】実施例２０ＦＬＦタンパク質の発現および免疫検出ＦＬＦタンパク質は、細菌発現タンパク質に対して産生された抗体を用いるウ
ェスタンブロットで検出され得る。最初の８０Ｎ−末端アミノ酸残基を欠き、枠内Ｎ−末端ヒスチジン標識を有す
る先端切除ＦＬＦタンパク質は、ｐＥＴ２２ｂ＋発現ベクター（ノヴァゲン）
を用いてＥ.ｃｏｌｉ株ＢＬ２１［ＤＥ３］で過剰発現された。１mlの一夜細菌
培養物を、５０μg／mlアンピシリン含有ＬＢブロス１００mlに加え、培養物を
３７℃で０.６のＯＤ_600nmに成長させた。次いで、１００μlの１モルＩＰＴＧ
を加え、培養物をさらに４時間成長させた後、タンパク質単離用に採取した。ヒ
スチジン標識タンパク質を、テイロン金属親和樹脂（クロンテク）を用いて精製
した。抗体を産生させるため精製タンパク質をウサギに注射した（Harlowおよび
Lane、１９８８）。

【０１２７】１２日齢Arabidopsis植物を、液体窒素中で粉砕し、抽出緩衝液（０.１モルＮ
ａＰＯ_４、ｐＨ７.２、１ミリモルＥＤＴＡ）中でホモジナイズした。２分間１
６０００ｇでの遠心分離により不溶性物質を沈澱させた。即座に、３分の１体積
の６×ＳＤＳ試料緩衝液（０.５モルのトリス、ｐＨ６.８、１０％ＳＤＳ、０.
６モルＤＴＴ、０.０１２％ブロモフェノールブルー）中で５分間上清を煮沸し
た。２×ＳＤＳ試料緩衝液（０.１６７モルのトリス、ｐＨ６.８、３.３％ＳＤ
Ｓ、０.２モルのＤＴＴ、０.００４％ブロモフェノールブルー）中でホモジナイ
ズし、５分間煮沸することにより、不溶性タンパク質を抽出した。タンパク質抽
出物（１レーンにつき５０μg）を変性１２％ポリアクリルアミドゲルで分離し
た後、プロトランニトロセルロース膜（シュライヒェルおよびシュエル）にブロ
ッティングした。ブロットを、１：１０００希釈の免疫前血清または１：３００
０希釈のＦＬＦポリクローナル抗血清とインキュベーションした。１：２０００
に希釈した第２抗体によりＥＣＬウエスタン・ブロッティング分析システム（ア
マーシャム）を用いて、免疫反応性タンパク質を可視化した。ブロットを２〜１
０分間Ｘ線フィルム（フジＲＸ）に暴露した。

【０１２８】ＦＬＦタンパク質の量は、Ｃ２４およびPitztalエコタイプおよびｆｌｆ突然
変異体において３５日の低温処理後劇的に減少した。ｆｌｆ突然変異体における
減少は、２種のエコタイプの場合ほど大きくはなく、この発見は、開花期および
ＦＬＦＲＮＡ転写の両方に関するわれわれの結果と一致していた。Landsberg e
rectaエコタイプまたはｅｆＳＬ４機能喪失突然変異型におけるＦＬＦタンパク
質は非常に少なく、これもまたＲＮＡデータと一致していた。これらの結果は、
タンパク質発現がＲＮＡ発現と平行していること、およびＲＮＡ転写物レベルに
見られる差異がタンパク質レベルに反映されていることを示す。

【０１２９】これらの結果はまた、ＦＬＦタンパク質に対して指向した抗体を用いるイムノ
アッセイを用いることにより、このタンパク質の低または高レベル発現性を有す
る植物が同定され、所望の特性を有する株が選択され得ることを立証している。
また、かかるイムノアッセイを用いることにより、細菌または他の宿主における
タンパク質の組換え発現がモニターされ得る。

【０１３０】実施例２１ Brassica napusにおける開花期に対するＦＬＦによる形質転換の効果カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの制御下Arab
idopsis ＦＬＦｃＤＮＡを含むカセットを、ベクターｐＷＢＶｅｃ８中に挿入
した。このベクターは、同じくＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子の制御下、ＨＰＴ遺伝子
を含み、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する。Agrobacterium tu
mefaciens株ＡＧＬ１において、このプラスミドを用いることにより、Brassica
napus品種ＢＬＮ１２３９胚軸外植体を形質転換し、植物を再生させた。ハイグ
ロマイシン耐性Ｔ_０植物を土壌に移した。形質転換実験開始の約４ヶ月後、植物
を噴霧台に置いた小さな植木鉢に移し、約４週間後、植物を大きな鉢に植え替え
、温室内に置いた。

【０１３１】植物を２１の独立カルスから再生させた。各カルスから再生された植物を全て
ここではファミリーと称し、各ファミリーは１またはそれ以上の独立形質転換事
象を示す。

【０１３２】植物の形態をモニターし、結果を表３に要約する。

【０１３３】

【表４】

【表５】

【０１３４】これらの植物は一連の開花期を呈し、組織培養で開花したり噴霧台に置かれて
いる間に開花する植物もあれば、２ヶ月より長くかかる植物もあった。ＣａＭＶ
３５Ｓ：：ＦＬＦ導入遺伝子に特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）分析を遂行することにより、どの推定トランスジェニック植物が導
入遺伝子を含むかを測定した。また、抗体試験（ウェスタン分析）を実施するこ
とにより、どの植物がArabidopsis ＦＬＦタンパク質を含むかを測定した。抗体
は、使用された条件下ではどのBrassicaタンパク質とも交差反応しない。ＰＣＲ
および抗体試験は単独実験であったが、２試験間には明確な相関関係がある。

【０１３５】表４はこれらの結果を要約している。

【０１３６】

【表６】

【０１３７】大型鉢へ植え付けた日を第１日と称する。花植物は、つぼみまたは開花を有す
るものである。

【０１３８】実験の組織培養段階であるため、野生型開花期制御は実験には全く含まれ得な
いが、早生開花植物は、試験では導入遺伝子および Arabidopsis ＦＬＦタンパ
ク質の存在について陰性であったため、野生型植物の開花期前後に開花したもの
と仮定するのは当然である。すなわち、トランスジェニック系の中には、最も早
生の開花系の少なくとも６週間後に開花したものもある。また、開花までの時間
の遅延は、花蕾が現れる前の植物成長による葉数の増加により証明された。

【０１３９】この実施例は、ＦＬＦによる形質転換を用いることにより、開花期が修正され
得ることを立証している。当業界における専門家であれば、これらの発見を他の
種の植物にも適用できるはずである。

【０１４０】実施例２２ Arabidopsis thalianaからのＦＬＦ様分子 Arabidopsisゲノム配列データベースの検索により、ＦＬＦタンパク質と高度
の相同性を有する５種の推定ＭＡＤＳボックスコード化遺伝子が明らかにされた
。ＦＬＦ−ＬＩＫＥ１と命名されたこれらの遺伝子の１つは、染色体１ＢＡＣ
Ｆ２２Ｋ２０（ＡＣ００２２９１）で見出され、それぞれＦＬＦ−ＬＩＫＥ２、
３、４および５と命名された他の４種は、２つの隣接する染色体５Ｐ１クロー
ンＭＸＫ３およびＭＱＮ２３（ＡＢ０１９２３６およびＡＢ０１３３９５）にお
いてクラスターで見出される。

【０１４１】ＦＬＦ−ＬＩＫＥタンパク質のアミノ酸配列が後記に示されており、アミノ酸
は太字で記載したＦＬＦタンパク質の対応するアミノ酸と同一である。

【０１４２】

【化５】

【０１４３】完全長ＦＬＦタンパク質配列とＦＬＦ−ＬＩＫＥタンパク質の完全長推定アミ
ノ酸配列のアラインメントは、ＦＬＦ−ＬＩＫＥ１について６５.３％同一性（
８６.７％類似性）、ＦＬＦ−ＬＩＫＥ２について６１.２％同一性（８４.２％
類似性）、ＦＬＦ−ＬＩＫＥ３について６０.７％同一性（８４.２％類似性）、
ＦＬＦ−ＬＩＫＥ４について６０.７％同一性（８５.２％類似性）およびＦＬＦ
−ＬＩＫＥ５について５６.１％同一性（８６．２％類似性）を示した。対照的
に、ＦＬＦと非常に類似している公表されたArabidopsis ＭＡＤＳボックスタン
パク質は、ＡＧＬ１４（Rounsleyら、１９９５）の場合４２.９％同一性（６６.
３％類似性）、ＣＡＬ（ＣＡＵＬＩＦＬＯＷＥＲ、Kempinら、１９９５）につい
て４０.３％同一性（７５.５％類似性）およびＡＰ１（ＡＰＥＴＡＬＡ１、Mand
elら、１９９２）について３８.８％同一性（７４.０％類似性）を示すに過ぎな
い（同一性および類似性の％はウィスコンシン・パッケージ・バージョン１０.
０により測定、ジェネティクス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）、マディ
ソン、ウィスコンシン、デフォルトパラメーターを使用）。

【０１４４】ＲＴＰＣＲに基く方法を用いて染色体１ＦＬＦ−様遺伝子（ＦＬＦ−ＬＩＫ
Ｅ１）からのｃＤＮＡを単離した。第１鎖ｃＤＮＡは、５μgのＣｏｌ−０全Ｒ
ＮＡから生成された。製造会社の使用説明書に従い２０μl体積でスーパースク
リプトII（ギブコＢＲＬ）を用いて反応が行なわれた。プライマー：

【化６】をもつ鋳型として１μlの第１鎖ｃＤＮＡ合成反応物を用いるＰＣＲによりＦＬ
Ｆ−ＬＩＫＥ１転写物を増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位には各
々下線が付されている。増幅反応は、２.５マイクロモルの各オリゴヌクレオチ
ドプライマー、１.０単位のアンプリタック・ポリメラーゼ（パーキン・エルマ
ー）および４種のデオキシヌクレオチド各々２５０マイクロモルを含む４０μl
の最終体積中で行なわれた。増幅条件は次の通りであった：２分間９４℃、９４
℃で１５秒変性、５５℃で１５秒間アニーリングおよび７２℃で１分間ポリマー
化から成る４０サイクル、および７２℃で４分間最終伸長後、温度を２５℃に低
下させた。キアクイック（QIAquick）ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いてＰ
ＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＢＩＩＳＫ＋
ベクター（ストラタジーン）の対応する制限部位へ連結させた。製造会社の使用
説明書に従いアプライド・バイオシステムズ・ビッグ・ダイ・ターミネーター配
列決定混合物を伴う普遍的プライマーの使用により陽性コロニーを配列決定し、
アプライド・バイオシステムズ３７７配列決定装置（パーキン・エルマー）を用
いて分析した。得られたｃＤＮＡ配列を、Arabidopsisゲノム配列（ＢＡＣＦ２
２Ｋ２０、ＡＣ００２２９１）と比較した。配列分析にはユニバーシティー・オ
ブ・ウィスコンシンＧＣＧソフトウェアパッケージを使用した。

【０１４５】ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ消化ＰＣＲ産物を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター含有Ｅ
ｃｏＲＩ／ＫｐｎＩｐＡＲＴ７ベクター（Gleave、１９９２）へクローニング
することにより、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下ＦＬＦ−ＬＩＫＥ１ｃ
ＤＮＡ含有バイナリー構築物を生成した。プライマー：

【化７】をもつ鋳型として２００pgのＦＬＦ−ＬＩＫＥ１ｃＤＮＡクローンを用いてＰ
ＣＲ産物を増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限部位にはそれぞれ下線が付
されている。増幅反応は上記と同様に行なわれた。クローン化ＰＣＲ産物を配列
決定することにより、増幅進行中に突然変異は全く導入されなかったことを確実
にした。次いで、ＮｏｔＩ（Gleave、１９９２）を用いて３５Ｓ：：ＦＬＦ−Ｌ
ＩＫＥ１カセットをｐＡＲＴ２７へサブクローニングし、Agrobacterium tumefa
ciens株ＧＶ３１０１へ電気穿孔により導入した。植物内形質転換（Bechtoldら
、１９９３）によりトランスジェニック植物が生成され、選択マーカーとしてＮ
ＰＴII遺伝子を用いることによりトランスジェニック植物を同定した。

【０１４６】３５Ｓ：：ＦＬＦ−ＬＩＫＥ１構築物を、Arabidopsis thalianaエコタイプ L
andsberg erectaおよびＣ２４へ形質転換した。個々のＴ_１系２０を各エコタイ
プについて選択し、これらのうち約半分が晩生開花表現型を示した。Landsberg
erectaバックグラウンドでは、２０のＴ_１植物中１２が発芽後３−４週間で抽だ
いし、非形質転換野生型植物の抽だい期と一致していた。他の８植物は、発芽後
約７−８週間まで抽だいしなかった。同様に、Ｃ２４形質転換系の場合、２０植
物のうち９植物が発芽後約４−５週間で抽だいし、野生型Ｃ２４植物の抽だい期
と一致しており、他の１１のＴ_１系は発芽後８−１０週間まで抽だいしなかった
。これらのデータは、われわれがＦＬＦに関して示したものと同様に、ＦＬＦ−
ＬＩＫＥ１遺伝子がArabidopsis thaliana植物での過剰発現時に開花を遅延させ
得ることを示している。さらに、報告された他のＦＬＦ−ＬＩＫＥ遺伝子の過剰
発現は、開花期に対してＦＬＦおよびＦＬＦ−ＬＩＫＥ１遺伝子の両方に見出さ
れる効果と類似した効果を有すると思われ、特にＦＬＦ−ＬＩＫＥ１はＦＬＦよ
りも他のＦＬＦ−ＬＩＫＥ遺伝子の方と高い相同性を示すと考えられる。

【０１４７】実施例２３ＦＬＦは、若干の発生プロセスにおいてジベレリン酸（ＧＡ）活性を調節するＦＬＦ転写物の過剰発現の表現型効果を、３５Ｓ：：ＦＬＦトランスジェニッ
クArabidopsis thalianaにおいて調べた。使用されたエコタイプおよび調べられ
たＴ１植物の数は下記に示されている。変更されていることが見出された表現型
特性の多くは、ＧＡにより制御または調節される成長過程と関連していることが
知られている。これらには、花粉形成、葉の拡張、葉柄角度の減少、および突起
様構造形成が含まれる。植物の中には不稔性のものもあれば、矮性表現型に特有
な抽だい高および節間長の減少、または矮性表現型に伴う変色を示すものもある
ことは特に注目に値した。

【０１４８】晩生開花ｆｌｆ突然変異体は、野生型植物よりも早生開花の誘導にかなり多く
のＧＡを必要とすることから、ＦＬＦ遺伝子産物はＧＡまたはＧＡ活性を除去す
べく作用し得ると思われる。高レベルのＦＬＦ転写物を発現するトランスジェニ
ック植物で観察される表現型異常の多くはＧＡレベルまたは活性の変化に起因し
得るため、ＦＬＦのこの機能は、開花促進に関するＧＡ活性の制御だけでなくＧ
Ａの他の役割に関するＧＡ活性の制御でもあると思われる。このため、ＦＬＦ遺
伝子は、植物成長の他局面、例えば、限定されるわけではないが、植物構造およ
び／または稔性の制御におけるＧＡ活性の調節に有用であり得る。

【０１４９】先の実施例で検討された開花期に対する効果と同様、ＦＬＦコーディング配列
の過剰発現はまた、下記で概説されている、若干の栄養成長および花の表現型を
もたらした。

【０１５０】Ｃ２４エコタイプ（２４Ｔ１植物）一早生開花植物（＃６）は、植物におけるＧＡ生産の停止ではなく低減化によ
り誘発される、ＧＡ半矮性に典型的な、半矮性（抽だい高の減少、節間長の減少
）の外観を呈していた。この植物は不稔性であった。

【０１５１】幾つかの植物（＃６、９、１０、１６、１９、２２、２３）は部分的または完
全な不稔性を呈した。これらの植物の幾つかでは、葯が裂開しなかったと思われ
、花粉が全く見られなかった。

【０１５２】 Landsberg erectaエコタイプ（２４Ｔ１植物）２植物（＃５９、６３）は、不稔性であるかまたはごく僅かしか種子を生じな
かった。これらの植物は、緑色を帯びた縮小サイズの花弁、および突起様構造（
トリコーム）（「毛茸」）を伴う異常形状の心皮を有する、明らかな花の異常を
有していた。正常なArabidopsisの心皮は突起様構造を有しない。

【０１５３】まだ開花していない植物の中には葉の大きさが縮小していたものもあり、正常
より直径の短いロゼット葉が付いていた（＃４０、４２、６２）。晩生開花植物
の多く（＃３６、３７、３８、４０、４２、６２）は通常より濃い緑色をしてい
た。ＧＡ欠失矮性植物は濃緑色である。晩生開花植物の多くは葉が隆起している
領域を呈していたことから、葉の拡張は各方向へ同等に行われているわけではな
いと思われた。多くの植物は葉柄角度の減少を呈していた、すなわち葉は平らで
あった。

【０１５４】 Landsberg erecta.−ＦＬＣ^Sf2（１７Ｔ１植物）２植物は半矮性の外観を呈していた（＃２６，２８）。これらの植物は稔性が
低下していた。一植物（＃２５）は非常に僅かの種子しか生じなかった。この植
物は、緑色を帯びた縮小サイズの花弁、および突起様構造を伴う異常形状の心皮
を伴う、明らかな花の異常を有していた。

【０１５５】まだ開花していない一植物（＃３２）は、非常に小さいロゼット葉（直径〜１
５mm）を有する。他は小さくてもそれほど極端ではない（＃１００、１０３）。
晩生開花植物の１つ（＃１０２）は、通常より濃い緑色であった。晩生開花植物
の多くは葉が隆起している領域を呈していたことから、この場合も葉の拡張は各
方向へ同等に行われているわけではないと思われた。多くの植物は葉柄角度が減
少していた。

【０１５６】 Landsberg erecta−ＦＬＩ^Sf2（３５Ｔ１植物）一植物（＃４７）は半矮性の外観を呈していた。この植物は稔性が低下してい
た。一植物（＃８９）は非常に僅かの種子しか生じなかった。この植物は、緑色
を帯びた縮小サイズの花弁、および突起様構造を伴う異常形状の心皮という、明
らかな花の異常を有していた。晩生開花植物の幾つか（＃４８、５６）は通常よ
り濃い緑色であった。まだ開花していない２植物（＃９７、９８）は、非常に小
さいロゼット葉（直径〜１５mm）を有する。他は小さくてもそれほど極端ではな
い（＃５１、５３、７８、９３、９５、９６）。

【０１５７】晩生開花植物の多くは葉が隆起している領域を呈していたことから、葉の拡張
は各方向へ同等に行われているわけではないと思われた。多くの植物は葉柄角度
が減少していた。

【０１５８】Ａｃ生成早生開花突然変異体におけるさらに別の表現型異常Ａｃをイントロン１へ挿入することにより生成された早生開花突然変異体では
、それらの葉に存する突起様構造数が低下している。

【０１５９】当業界の専門家にとって、本発明が明瞭性および理解を目的としてある程度詳
細に説明されており、この明細書に開示された発明概念の範囲から逸脱すること
無くここに記載された実施態様および方法に様々な修飾および変化が加えられ得
ることは当然のことである。

【０１６０】ここに引用されている参考文献は、後の頁に列挙されており、出典明示により
本明細書の一部とする。

【０１６１】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【０１６２】

【配列表】

配列表（１）一般的情報（ｉ）出願人：（Ａ）名称：コモンウェルスサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチオーガニゼーション（Ｂ）通り：ライムストーンアベニュー（Ｃ）都市：キャンベル（Ｄ）州：オーストラリアンキャピタルテリトリー（Ｅ）国：オーストラリア（Ｆ）郵便番号（ＧＩＰ）：２６１２（ｉｉ）発明の名称：開花の制御（ｉｉｉ）配列の数：３（ｉｖ）コンピューター読み取り可能形式: （Ａ）媒体型：フロッピー（登録商標）ディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換性（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO) （２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：７９６８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：Arabidopsis thaliana （ｘｉ）配列番号１の記載：

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：９４３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：Arabidopsis thaliana （ｘｉ）配列番号２の記載：

【表２０】（２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１９６アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の型：タンパク質（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：Arabidopsis thaliana （ｘｉ）配列番号３の記載：

【表２１】配列番号４５６ないし２５

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、野生型Ｃ２４(左)、発芽後７０日における晩生開花Ｔ−
ＤＮＡ標識されたｆｌｆ変異体(中)、および栄養抽だい(vegetative bolts)によ
ってドーム状の形状を示す、１５０日におけるｆｌｆ変異体(右)。バーは５cmである。

【図２】図２は、晩生開花表現型を有する２つのＴ−ＤＮＡ挿入の分離を
示す。Ａ．ＥｃｏＲＩで消化しＮＰＴＩＩ遺伝子で探索した、早生(Ｅ)、晩生(Ｌ)およ
び極晩生（ＶＬ）に分離するＴ_２集団から単離されたゲノムＤＮＡ。Ｂ．ＦＬＦ遺伝子座に連鎖した２つのＴ−ＤＮＡ挿入の物理的マップ。それらの
配向を示す。ＥｃｏＲＩ部位はＲＩ標識されている；ＬＢおよびＲＢは、それぞ
れＴ−ＤＮＡのレフトおよびライトボーダーを表す。三角印はＴ−ＤＮＡのライ
トの３０ｂｐの欠失の位置を表す。矢印は該遺伝子の転写の向きを表す。Ｃ．遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂ遺伝子座を含むアラビドプシス変異体ＤＮＡの２７
ｋｂの領域の表示。Ｔ−ＤＮＡ挿入の位置を示す。フランキング植物ＤＮＡから
のＤＮＡ断片（プローブ２および３）を、ｃＤＮＡクローンを単離するためにプ
ローブとして使用した。ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、ＢａｍＨＩ（Ｂ）およびＥｃｏ
ＲＩ（ＲＩ）制限酵素部位を示す。遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂの位置が示され、そ
れらの転写方向を、矢印で示す。Ｄ．Ｔ−ＤＮＡ挿入の位置にわたる、図２Ｃのプローブ１および２によって野生
型Ｃ２４のゲノムライブラリーから単離された、６．５ｋｂおよび６．８ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片。制限部位は図２Ｃの通りである。

【図３】図３は、３０日齢の野生型Ｃ２４植物（レーン１）、ヘミ接合体
（レーン２）およびホモ接合体（レーン３）ｆｌｆ変異体植物における遺伝子Ａ
および遺伝子Ｂの発現レベルを示す。

【図４】図４は、Ｃ２４における３５Ｓ：：ＦＬＦのＴ１トランスジェニ
ック植物（左）およびLandsberg erecta(右)エコタイプを示す写真である。Ｃ２
４トランスジェニックは、早生開花（後）または晩生開花（前）のいずれかであ
った。Landsberg erectaトランスジェニックは、晩生開花(左)または通常開花(
右)のいずれかであった。

【図５】図５は、ＦＬＦ遺伝子構造およびＦＬＦ転写物の発現パターンを
示す。Ａ．イントロンの位置および大きさ、並びにＭＡＤＳボックス、介在するドメイ
ン(Ｉ)、Ｋドメイン(Ｋ)およびカルボキシル末端ドメイン(Ｃ)の位置を示す、Ｆ
ＬＦ遺伝子のゲノム構造。ラインの下の数は、各エキソンにおける塩基対の数を
表す。Ｂ．Ｃ２４植物におけるＦＬＦのｍＲＮＡの発現のパターン：インビトロ育成栄
養植物からの根(Ｒ)およびロゼット葉(ＲＬ)、1および5ｃｍの間の抽だい茎(bol
t stem)を有する土壌育成植物からの芝生状の葉(cauline leaves)(ＣＬ)、抽だ
い茎 (ＢＳ)、花茎茎頂(floral apex)およびつぼみ(Ｂ)。成熟花(Ｆ)および長角
果(Ｓ)を他の植物から採集した。植物を、16時間の光周期条件で育成した。Ｂ−
ＦについてのＲＮＡゲルブロットを、線形化し、ＭＡＤＳボックス領域を除去し
たＦＬＦ(遺伝子Ｂ)ｃＤＮＡクローンから転写されたリボプローブによって探索
した。Ｂ−Ｆにおいて臭化エチジウム染色リボゾームバンドをローディングコン
トロールとして示す。Ｃ．Ｃ２４植物の大多数が抽だいしたとき(これらの成長条件下で50日)までの、
10日ごとに収穫した(数で表す)、Ｃ２４植物またはｆｌｆ変異体全植物体におけ
るＦＬＦのｍＲＮＡの発現レベル。Ｄ．21日間8時間蛍光灯光周期で育成し、その後、第21の光周期の終了時、同じ
条件(ＳＤ;レーン１、２、７、８)に保つか、または継続暗黒(ＣＤ;レーン３、
４、９、１０）にもしくは継続光(ＣＬ;レーン５、６、１１、１２)に移動した
、Ｃ２４(レーン１−６)およびｆｌｆ(レーン７−１２)植物のＦＬＦのｍＲＮＡ
の発現。植物を次の光周期が開始するであろう直前(明け方;レーン１、３、５、７、９
、１１)、または光周期の終わりの直前(日暮れ；レーン２、４、６、８、１０、
１２)に収穫した。転写レベルは、光周期の開始時にやや高かったが、このパタ
ーンは変異体においては変わらなかった。Ｅ．ジベレリン酸(ＧＡ_３)処理およびバーナリゼーションが、Ｃ２４(レーン１
−３)およびｆｌｆ変異体(レーン４−６)実生におけるＦＬＦ転写へ及ぼす影響
。ＲＮＡを、無処理(Ｃ;レーン１および４)、１０^−５ＭのＧＡ_３を含む培地で
育成または４℃３週間の前処理をした（Ｖ；レーン３および６)１２日齢の実生
から単離した。Ｆ．抽だい後すぐ収穫した、Ｃ２４および早生開花アンチセンスメチルトランス
フェラーゼ系統１０．５（Ｔ３世代)のロゼット葉におけるＦＬＦ発現。

【図６】図６について：Ａ．ＥｃｏＲＩで消化し、Ａｃの３’領域についてのプローブによって探索した
、ＥｃｏＲＩで消化したそれぞれｆｌｆ、ｅｆＳＬ３(Ｍ２)、ｅｆＳＬ４(Ｍ２)
およびＣ２４植物から単離したゲノムＤＮＡ。ｆｌｆ試料についてのＤＮＡを、
第３のＴ−ＤＮＡバンド、すなわち約８ｋｂの該バンドを含む植物から抽出した
。この第３のバンドの存在は開花期に影響がなく、無関係であった。Ｂ．プローブがプローブ４である他は、Ａと同様である(図２Ｃ参照)。ｅｆＳＬ
３(Ｍ２)およびｅｆＳＬ４(Ｍ２)試料についてのＤＮＡを、ネオ晩生および早生
開花変異体を含む大量のＭ２植物から抽出した。いくつかの２．７ｋｂバンドが
、これらのＤＮＡ抽出物中に存在する。それぞれの早生開花植物から単離された
他のＤＮＡは、２．７ｋｂのバンドを含まない。Ｃ．イントロンＩにおけるＡｃ挿入の位置。該ヌクレオチドの位置を、後記でＡ
ＴＧのＡをヌクレオチド１として、後記に記載する。Ｄ．Ｃ２４(レーン１)、ｆｌｆ(レーン２)、ｅｆＳＬ３(レーン３)、ｅｆＳＬ４
(レーン４)の１５日齢のロゼット葉におけるＦＬＦ遺伝子の発現レベル。Ｍ２早
生開花変異体はまさに抽だいを始めようとしており、一方、他の植物は栄養成長
のままであった。臭化エチジウム染色リボゾームバンドはローディングコントロ
ールとして示す。

【図７】図７は、ネオ晩生植物からのゲルブロットを示す。Ａ．ゲノムＤＮＡを６つのネオ晩生変異体植物からおよびｅｆＳＬ３(Ｍ２)、ｅ
ｆＳＬ４(Ｍ２)、ｆｌｆおよびＣ２４植物から単離し、ＥｃｏＲＩで消化した。
ＤＮＡゲルブロットをＡｃの３’領域によって探索した。Ｂ．全ＲＮＡを、６つのネオ晩生植物、ｆｌｆおよびＣ２４からのロゼットおよ
び芝生状の葉(cauline leaves)の混合物から単離した。ＲＮＡゲルブロットを図
５のように探索した。臭化エチジウム染色リボゾームバンドをローディングコン
トロールとして示す。

【図８】図８は、エコタイプおよび晩生開花変異体におけるＦＬＦ遺伝子
の発現を示す。全ＲＮＡを１２日齢実生から単離し、ＲＮＡゲルブロットを図５におけるよう
に探索する。臭化エチジウムリボゾームバンドをＡ−Ｃにおいてローディングコ
ントロールとして示す。Ａ．いくつかの様々なアラビドプシスエコタイプにおける発現。Ｂ．Landsberg erecta(L.er)およびＥＲＩ(L.er.-FRI^Sf2)またはＦＬＣ(L.er.-F
LC^Sf2,L.er.-FLC^Col)遺伝子座のいずれかにおいて晩生対立遺伝子を含むLandsbe
rg erecta系統における発現。Ｃ．L.er.エコタイプ(ｆｃａ、ｆｖｅ、ｆｐａ、ｇｉ、ｃｏ、ｆｈａ、ｆｗａ、
ｆｄ、ｆｅ、ｆｔ)またはＷｓ(Ｉｄ)のいずれかにおける晩生開花変異体におけ
る発現。変異体ｖｒｎ１およびｖｒｎ２は、ｆｃａバックグラウンドにおいて単
離され、ｖｒｎ１のみが、ｆｃａ変異体遺伝子座から分離された。

【図９】図９は、Brassica napusからのＦＬＦ様配列のゲノム配列の一部
を示す。エキソンおよび翻訳産物の推測される配列を示している。

【図１０】図１０は、Brassica napusのＦＬＦ様配列の推測された翻訳産
物(トップライン)、およびArabidopsis thalianaからの推測されたＦＬＦ翻訳産
物の比較を示す。同一なアミノ酸(|)、高度に保存されたアミノ酸(:)および保存
されたアミノ酸(.)を示している。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年８月９日（２０００．８．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項２２】植物が天然に存在する集団の構成員である、請求項２０に
記載の方法。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１０月２５日（２００１．１０．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６０

【補正方法】変更

【補正内容】

【化１】（上からそれぞれ配列番号３１および３２）であった。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６３

【補正方法】変更

【補正内容】

【化２】（上からそれぞれ配列番号３３および３４）のプライマー(ここで制限部位を太字で示し、遺伝子ＢのｃＤＮＡにハイブリダ
イズする配列にアンダーラインを付する)と共に、実施例５に記載の方法と類似
の方法を使用して増幅した]をＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含むＸｈｏＩ／Ｓ
ｐｅＩ消化ｐＡＲＴ７(Gleaves, 1992)にクローニングすることによって作成し
た。そして、３５Ｓ：：遺伝子ＢカセットをＮｏｔＩを使用してｐＡＲＴ２７(G
leaves, 1992)にサブクローン化し、A. tumefaciens系統ＧＶ３１０１(Koncz an
d Schell, 1986)に前記のように導入した。トランスジェニック植物をインプラ
ンタ形質転換(Bechthold et al, 1993)によって作出した。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６４

【補正方法】変更

【補正内容】

【化３】（上からそれぞれ配列番号３５および３６）のプライマーと共に野生型ゲノムクローンを増幅することによって作成した。これは、ＭＡＤＳボックスを欠いた、プローブ２配列の５７０ｂｐのサブセッ
トをもたらし、クロスハイブリダイゼーションを除いた。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８０

【補正方法】変更

【補正内容】

【化４】（上からそれぞれ配列番号３７および３８）により増幅されたＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ消化ＰＣＲ産物のクローニングにより生
成された。これによりＭＡＤＳボックスの下流領域が増幅されたため、アンチセ
ンス構築物はＭＡＤＳボックス領域を欠いている。ＰＣＲ産物をｐＡＲＴ７およ
びｐＢＡＲＴ２７（ｐＡＲＴ２７の誘導体である）にクローン化し、トランスジ
ェニック植物を上記要領で生成させたが、ただしＢａｒ遺伝子を選択マーカーと
して使用した。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１２５】ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列は、配列番号６〜１５および配列番号１
６〜２５にそれぞれ示されている。これらの配列は恐らく次のようにグループ分
けされる５遺伝子を表すと思われる：１２.１／１６.１１５.１／１６.２／１８.２１１.２１４.１／１８.１／２０.１１１.３図９における部分的ゲノム配列および翻訳は、ｃＤＮＡ１２.１／１６.１に対応
する。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４４

【補正方法】変更

【補正内容】

【化６】（上からそれぞれ配列番号３９および４０）をもつ鋳型として１μlの第１鎖ｃＤＮＡ合成反応物を用いるＰＣＲによりＦＬ
Ｆ−ＬＩＫＥ１転写物を増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位には各
々下線が付されている。増幅反応は、２.５マイクロモルの各オリゴヌクレオチ
ドプライマー、１.０単位のアンプリタック・ポリメラーゼ（パーキン・エルマ
ー）および４種のデオキシヌクレオチド各々２５０マイクロモルを含む４０μl
の最終体積中で行なわれた。増幅条件は次の通りであった：２分間９４℃、９４
℃で１５秒変性、５５℃で１５秒間アニーリングおよび７２℃で１分間ポリマー
化から成る４０サイクル、および７２℃で４分間最終伸長後、温度を２５℃に低
下させた。キアクイック（QIAquick）ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いてＰ
ＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＢＩＩＳＫ＋
ベクター（ストラタジーン）の対応する制限部位へ連結させた。製造会社の使用
説明書に従いアプライド・バイオシステムズ・ビッグ・ダイ・ターミネーター配
列決定混合物を伴う普遍的プライマーの使用により陽性コロニーを配列決定し、
アプライド・バイオシステムズ３７７配列決定装置（パーキン・エルマー）を用
いて分析した。得られたｃＤＮＡ配列を、Arabidopsisゲノム配列（ＢＡＣＦ２
２Ｋ２０、ＡＣ００２２９１）と比較した。配列分析にはユニバーシティー・オ
ブ・ウィスコンシンＧＣＧソフトウェアパッケージを使用した。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４５

【補正方法】変更

【補正内容】

【化７】（上からそれぞれ配列番号４１および４２）をもつ鋳型として２００pgのＦＬＦ−ＬＩＫＥ１ｃＤＮＡクローンを用いてＰ
ＣＲ産物を増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限部位にはそれぞれ下線が付
されている。増幅反応は上記と同様に行なわれた。クローン化ＰＣＲ産物を配列
決定することにより、増幅進行中に突然変異は全く導入されなかったことを確実
にした。次いで、ＮｏｔＩ（Gleave、１９９２）を用いて３５Ｓ：：ＦＬＦ−Ｌ
ＩＫＥ１カセットをｐＡＲＴ２７へサブクローニングし、Agrobacterium tumefa
ciens株ＧＶ３１０１へ電気穿孔により導入した。植物内形質転換（Bechtoldら
、１９９３）によりトランスジェニック植物が生成され、選択マーカーとしてＮ
ＰＴII遺伝子を用いることによりトランスジェニック植物を同定した。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１２月１１日（２００１．１２．１１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１６２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization <120> Control of Flowering <130> FP14527 <140> JP 2000-585411 <141> 2001-06-01 <150> PCT/AU99/01079 <151> 1999-12-02 <160> 42 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 7968 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 ggatccaaga aataatttca tatggggcac agttaaaaaa aaaacaataa aatgataata 60 gtaaggcttg aacttgggtt gatgtgaggc actattaagt aaaaagccat tgtactactt 120 acattttaac tacataatgt taacttatat aatatttatt gaattcagta tagggcacat 180 gccctatcca tgactaacgt gagtccgccc tgatagcgag taagaaacga gcaaaggaat 240 gcaaattatg tgaatactat acaccaacag tgtagacatg tagctacaat gcggcaatgt 300 taaaaataaa ctcaaattgg tttggaggga acaacctaat gcttataagt acacttttgt 360 ggtaaataca atccaattga aagtctttgt aggtttggtt tggtccaatg aaattgtatg 420 cgagttgagt aaaataacct tagttcaaaa cattagatat gtaatggtct agatacgatg 480 gtagccaaag atttgggtta aatttagaat aaagatcaaa gaacaaatga ctgacttcct 540 tatgtgtgtt tgtttatgta aagtcttaac tcgtgtcttg ccaaattaat aaaaaggtgc 600 attatacaat gaactagagc ttgttctcat caaaattttt aacattaaaa taagttatta 660 aaattttgtt gattatatat gatttcaata ttaaattata ttttttgctt atagcatcaa 720 aacttcttgg cacagctccg agtgttactg aaatgtttgt gtggctccaa tagaaaagtt 780 aataccaatc atgaatcatc aatatcgtta caaaatcagt aatcagtttc acccactccg 840 agtgttagtg aaatgtttgt gtggctccat taaaaaagtt aataccaatc accaatatcg 900 ttacaaaatt tgtaatcagt ttcacccact tcttttcgtc ttgttactcg atatagcctc 960 acctttcaag tgtctaatat aacacttttt aacaaaatat tacaaaacaa gaaaaattat 1020 agtaattaga ttaatcatat gtaatctatt acatatagta atttgtatta gtatcgttta 1080 ttgtgttacc attcaaacgg tataatctat ataattatta gcaaaacaaa atatagtttt 1140 agtaattaat aaaattaata taatgatagt gatattcaga atgtggtatc taatcatgta 1200 aaaatatata ataataaaat tagataaaga agaaattggt aaaaaataat taatgagata 1260 taaaaggaaa acaagctgat acaagcattt cacccaaaaa aaaacaagct gatacaagca 1320 aaaaagaatt agtaactttg agctattgcc atatgtgtgg acatttaaga tttcttgtat 1380 tttagaaatc ttatatattt ccacaatata tttactactt tcctttatta tttgtgttaa 1440 tctcccgaac attattattt caatactatc tgaaaaacac attttttttt ataaaatttg 1500 atgacgtagg cgagtggttc tttgttttta ctatgtaggc acgactttgg taacacctac 1560 taattaactg ccaaatttta agttttgaga agtcggaaga gttcaaacca gttttaggtt 1620 tcgatatgtc tacatagttc aaagatgatg tagagtggag gttctttctg caatagttca 1680 atccgtatcg taggggagga aagatagttt tcatttagca aagaaagtga aaactaaggc 1740 aatgcaaaag tagcaaagac gctcgtcatg cggtacacgt ggcaatcttg tcttcaaaac 1800 gcaacgtttt tattcacata tttggttttt ttgcatcact ctcgtttacc cccaaaaaaa 1860 aaaaatatct ggcccgacga agaaaaagta gataggcaca aaaaatagaa agaaataaag 1920 cgagaaaagg aaaaaaaaaa atagaaagag aaaacgctta gtatctccgg cgacttgaac 1980 ccaaacctga ggatcaaatt agggcacaaa gccctctcgg agagaagcca tgggaagaaa 2040 aaaactagaa atcaagcgaa ttgagaacaa aagtagccga caagtcacct tctccaaacg 2100 tcgcaacggt ctcatcgaga aagctcgtca gctttctgtt ctctgtgacg catccgtcgc 2160 tcttctcgtc gtctccgcct ccggcaagct ctacagcttc tcctccggcg ataagtacgc 2220 cttttcctta cctgggtttt catttattcc cccttttatc ttctgttttg tgctctttta 2280 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Lys Asn Lys Val Leu 145 150 155 160 Ala Ser Glu Val Gly Lys Leu Lys Lys Ile Leu Glu Thr Gly Asp Glu 165 170 175 Arg Ala Val Met Ser Pro Glu Asn Ser Ser Gly His Ser Pro Pro Glu 180 185 190 Thr Leu Pro Leu Leu Lys 195 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 31 aagccgcgga caatggaagc tgtaagatgc 30 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 32 gagaggctgg ttaaccggag 20 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 33 ccgctcgagc ttagtatctc cggcg 25 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 34 ggactagtcg cccttatcag cgga 24 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 35 gtatagggca catgccc 17 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 36 cactcggagc tgtgcc 16 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA antisense primer <400> 37 cggaattctc acacgaataa ggtac 25 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA antisense primer <400> 38 ggactagtgg tcaagatcct tgatc 25 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 39 attgaattcg ggcataaccc ttatcggaga tttg 34 <210> 40 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 40 aacggatccg ttgatgatgg tggctaattg agcag 35 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 41 attgaattcg ggcataaccc ttatcggaga tttg 34 <210> 42 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthesised DNA primer <400> 42 ctagtggtac cgttgatgat ggtggctaat tgagc 35

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ４Ｈ０４５Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人パスカル・ペレＰａｓｃｕａｌＰＥＲＥＺフランス、エフ−63107オビエール、アヴニュ・ドゥ・ランデ24番、カンプ・ウニヴェルシテール・デ・セゾー、ラボラトワール・ドゥ・ビオロジー・セリュレール・エ・モレキュレール (72)発明者ジョアン・エリザベス・バーンオーストラリア2602オーストラリアン・キャピタル・テリトリー、ワトソン、エイ・ベケット・ストリート84番 (72)発明者ウィリアム・ジェイムズ・ピーコックオーストラリア2600オーストラリアン・キャピタル・テリトリー、ディーキン、ブラッシー・ストリート16番 (72)発明者エリザベス・ソールズベリ・デニスオーストラリア2600オーストラリアン・キャピタル・テリトリー、ディーキン、ホープトゥーン・サーキット100番 (72)発明者キャンディス・クレア・シェルドンオーストラリア2620ニュー・サウス・ウェールズ州サットン、クォーツ・ストリート１番 (72)発明者パスカル・ペレフランス、エフ−63107オビエール、アヴニュ・ドゥ・ランデ24番、カンプ・ウニヴェルシテール・デ・セゾー、ラボラトワール・ドゥ・ビオロジー・セリュレール・エ・モレキュレール (72)発明者クリストファー・アンドリュー・ヘリウェルオーストラリア2617オーストラリアン・キャピタル・テリトリー、カリーン、ビンガム・サーキット25エイ番 (72)発明者ディーン・トーマス・ラウズオーストラリア2615オーストラリアン・キャピタル・テリトリー、マグレガー、オズバーン・ドライブ131番Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AB04 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 2G045 AA31 AA40 CB20 DA12 DA13 DA14 DA36 FB01 FB02 FB03 4B024 AA08 BA47 BA79 CA01 DA01 GA11 GA17 HA20 4B063 QA20 QQ04 QQ53 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR55 QS33 QS34 QX01 4B065 AA88X AA89Y AB01 AC20 BA01 CA24 CA25 CA53 4H045 AA11 AA50 CA30 DA30 EA05 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物の開花期を変化させることができる、ＭＡＤＳボックス
を含む単離された核酸分子。
【請求項２】プロモーター配列の制御の下でセンス配向である、植物にお
ける核酸分子の発現が、植物の開花を遅延させることのできる、請求項１に記載
の単離された核酸分子。
【請求項３】植物の開花を早めることができる、請求項１に記載の単離さ
れた核酸分子。
【請求項４】プロモーター配列の制御の下でアンチセンス配向である、植
物における核酸分子の発現が、植物の開花を早めることのできる、請求項３に記
載の単離された核酸分子。
【請求項５】 FLOWERING LOCUS F(FLF)遺伝子に対応するヌクレオチド配列
を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子、またはそれらに由来するＰＣＲ
プライマーもしくは生物学的に活性のある断片。
【請求項６】 (a)配列番号１、２、４、および６ないし１５のいずれかに
示すヌクレオチド配列； (b)少なくとも低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でそれらとハ
イブリダイズすることができる核酸分子；または (c)(a)に示した配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸分子を含む請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】核酸分子が、 (a) 高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、配列番号１、２、４
、および６ないし１５のいずれかに示すヌクレオチド配列と、ハイブリダイズす
ることができ；または (b)請求項６(a)に示した配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】請求項１ないし７のいずれかに記載の核酸分子を含むベクタ
ー。
【請求項９】請求項１ないし７のいずれかに記載の核酸で形質転換された
植物細胞。
【請求項１０】請求項１ないし７のいずれかに記載の核酸分子で形質転換
された植物。
【請求項１１】請求項１ないし７のいずれかに記載の核酸分子、またはそ
れらの機能部分を、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反
応(ＰＣＲ)プライマーとして使用し、要すればハイブリダイゼーションを検出す
る段階を含む、標的植物の開花期を変化させることができる核酸分子を単離する
方法。
【請求項１２】核酸分子が、少なくとも低ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件で、配列番号１、２、４、および６ないし１５のいずれかに示
すヌクレオチド配列とハイブリダイズすることのできる、請求項１１に記載の方
法。
【請求項１３】植物の細胞に請求項１ないし７のいずれかに記載の核酸分
子を導入し(要すれば、核酸分子のそのような発現は、誘導可能なプロモーター
の制御下にある)、そして該核酸分子を過剰発現させる段階を含む、植物の開花
を遅延させる方法。
【請求項１４】植物において、請求項１ないし７のいずれかに記載の核酸
分子の発現の程度を減少させる段階を含む、植物の早期開花を誘導する方法。
【請求項１５】ＦＬＦ遺伝子の発現のレベルを増大させ、それによって植
物におけるジベレリンの生産または活性のレベルを変更する段階を含む、植物の
栄養的なおよび／または花の表現型を変更する方法。
【請求項１６】ＦＬＦ遺伝子の発現のレベルを増大させまたは減少させる
段階を含む、植物のバーナリゼーションに対する応答を変更する方法。
【請求項１７】ＦＬＦ遺伝子が、請求項１ないし７のいずれかに記載の核
酸分子を含む、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】請求項１ないし７のいずれかに記載の核酸分子によってコ
ードされているポリペプチド。
【請求項１９】配列番号３、５、および１６ないし３０のいずれかに示す
アミノ酸配列を含み、またはそれらと少なくとも７０％の配列同一性を有する、
ＦＬＦポリペプチド。
【請求項２０】請求項１８または請求項１９に記載のポリペプチドに対す
る抗体。
【請求項２１】請求項２０に記載の抗体を使用する段階を含む、ＦＬＦポ
リペプチドの発現のレベルを検定する方法。
【請求項２２】植物におけるＦＬＦｍＲＮＡまたはＦＬＦポリペプチド
のレベルを測定する段階を含む、ＦＬＦの低または高レベルの発現によって植物
を選抜する方法。
【請求項２３】植物が天然に存在する集団の構成員である、請求項２１に
記載の方法。