효소(enzyme)는 생체 내에서 화학 반응을 가속화시키는 단백질인 생물학적 촉매(biocatalyst)로서, 생체 내에서 다양한 반응에 관여한다. 효소는 제빵과 같은 식품 산업이나 맥주/포도주 등의 음료수/주류 처리 산업과 같이 전통적으로 효소가 이용되었던 산업 분야는 물론이고, 최근에는 화장품, 제약, 정밀 화합물 합성, 바이오센서(biosensor), 미생물을 사용하여 오염 물질을 분해하고 환경을 살리는 기술분야인 생물적 환경정화(bioremediation), 단백질체 분석에서의 단백질 분해(protein digestion) 및 바이오연료 전지(biofuel cell) 등에도 효소가 널리 응 용되고 있다.
이처럼, 다양한 산업분야에서 효소를 이용한 종래의 화학적 변환 공정에서는 비-특이적인 반응으로 인하여 생산 수율이 낮아질 수 있고, 상당량의 폐기물이나 순수하지 못한 산물이 얻어질 수 있으며, 효소가 매개하는 화학적 변환 공정을 위해서 요구되는 높은 온도와 압력으로 인하여 많은 양의 에너지가 소모되고 상당한 자본이 투여되어야 하므로 경제적인 면에서 바람직하지 않다. 아울러, 원하지 않았던 부산물을 처리하기가 곤란할 수 있으며, 처리를 위해서 고가의 위험한 용매를 사용하여야 하기 때문에 환경적인 면에서도 문제가 있다.
다시 말하면, 화학적 변환 공정에 응용되는 대부분의 효소는 수용액에 완전히 용해되기 때문에 반응 후, 수용액으로부터 회수하여 재사용하기 어렵고, 반응 용액의 교반으로 발생하는 전단응력과 같은 물리적인 충격에 불안정하고, 대규모 연속공정에 사용할 수 없다는 문제점을 지니고 있다.
따라서 비교적 낮은 온도 및 압력 조건에서 수행됨으로써 상대적으로 간단한 장비에서 수행되면서도 제어하기 쉽고, 값비싼 용매가 아닌 물과 같은 저렴한 용매에서 반응이 진행되며, 반응 속도가 매우 빠르면서도 특이적인 반응만을 유도할 수 있는 방안이 요구되고 있다. 아울러, 환경적인 면에서 재생 가능한(renewable) 원료 물질을 사용하거나 생분해성(biodegradable)인 공정을 도모할 필요성이 있다.
특히, 다양한 산업 분야에서 사용되는 효소는 장기간 사용하여도 안정적으로 화학적 변환 반응을 유지하는 한편, 회수 및 재사용이 가능하다면 경제적인 면에서 나 환경적인 면에서나 바람직할 것이다. 이와 같이 종래 화학적 변환 공정에서 사용되었던 통상의 효소가 갖는 문제점을 해결하기 위해서 다양한 효소 고정화 방법이 사용되고 있다.
특히 생촉매를 사용하는 산업분야에서 안정적이면서도 바람직하게는 불용성의 생촉매를 개발하기 위한 다양한 방법이 개발되고 있다. 효소를 고정화하게 되면 우선 효소를 처리하기가 편리할 뿐만 아니라, 최종적으로 얻어진 산물로부터 효소를 분리하기가 쉬워서 산물이 효소에 의하여 오염되는 것을 방지할 수 있다. 아울러, 고정화에 의하여 고가의 효소를 손쉽게 회수하여 재사용할 수 있으므로 연속적인 공정에서 작동할 수 있다. 특히, 효소는 그 활성을 위해서 필요로 하는 특유의 3차원 구조를 유지하여야 하는데, 효소의 고정화를 통하여 반복적인 사용에도 불구하고 촉매로서의 생산성을 유지하는 한편, 광범위한 pH 및 온도 범위 조건 및 다양한 유기 용매에 대한 저항성(tolerance)을 가짐으로서 안정성, 활성, 특이성(specificity) 또는 선택성(selectivity)을 향상시킬 필요가 있다.
특히, 효소 고정화 방법은 셀룰로오스와 같은 불용성 고분자 기질과 반응하는 효소에 적용할 수 없다. 또한 가격이 낮고 대량으로 사용되는 소재형(素材型) 화학제품(bulk chemical)을 생산하는 데에는 고정화 효소를 사용하기보다 제조단가가 싼 조제(粗製) 효소를 사용하는 것이 유리하기 때문에, 고정화 효소는 고가의 물질을 생산하거나 대규모 연속공정에 주로 사용된다. 효소를 고체입자에 고정하면 열, 요소, 구아니딘과 같이 단백질을 불활성화시키는 물리화학적 요인에 대해 안정 성이 증가하며 장기간 보관해도 효소의 안정성이 유지된다. 고정화 효소의 가장 큰 장점은 반응 후, 회수하여 재사용하는 것이 가능하다는 것이다. 고정화 효소의 이러한 특징은 효소반응공정의 경제성을 크게 향상시켜준다.
현재까지 개발된 효소 고정화 방법에는 효소의 결합 형태에 따라 물리적 방법과 화학적 방법이 있는데, 물리적 방법에는 포괄법과 흡착법이 있고, 화학적 방법에는 공유결합법과 화학적 가교법이 있다. 아울러, 고정화하기 위한 수단에 따라 효소를 고정화하는 방법은 ⅰ) 지지체(support) 또는 담체(carrier)에 결합시키는 방법, ⅱ) 포괄법 또는 캡슐화 방법(entrapment, encapsulation), ⅲ) 가교화 또는 교차 방법(cross-linking)으로 구분될 수 있다.
지지체를 이용한 경우에는 효소가 이 지지체에 공유 결합하게 되며, 담체를 이용하게 되면 효소가 물리적 흡착(physical adsorption) 또는 이온 결합 형태로 고정된다. 지지체 또는 담체를 이용한 효소 고정화 방법에서 지지체 또는 담체는 생촉매인 효소의 분리 및 재사용을 보조할 뿐만 아니라 효소에 의한 화학적 변환 과정을 촉진시키도록 설계된 부분을 의미하는데, 이러한 효소 고정화와 관련하여 사용되는 지지체 또는 담체로는 아크릴계 수지와 같은 합성수지나, 셀룰로오스/아가로스와 같은 비-수용성 폴리사카라이드 또는 젤라틴/알부민과 같은 단백질과 같은 생고분자(biopolymer)나, 또는 알루미나, 다공성 실리카(mesoporous silicate)나 제올라이트와 같은 무기고분자가 전통적으로 사용되었다. 최근에는 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노섬유와 같이 표면적이 큰 물질을 지지체로 사용하여 단위 부피 당 효소의 양을 증가시킴으로써 전체적으로 효소의 활성을 향상시키거나 또는 열-반응 또는 생체상용성(biocompatible) 고분자인 이른바 '스마트 고분자(smart polymer)'를 이용하여 온도, pH 등의 사소한 변환 따라 3차원 구조를 변형시킴으로써 효소를 고정화하기 위한 방안이 모색되고 있다.
즉, 지지체 또는 담체를 이용한 효소 고정화 방법과 관련해서는 주로 효소와 같은 생체 고분자를 고정화시키는 지지체에 대한 연구가 진행되고 있다. 예를 들어, 대한민국등록특허 제516824호에서는 말단에 카르복시기를 갖는 불포화 지방산과, 이중결합을 갖는 수용성 모노머인 아크릴아미드를 첨가중합 반응시켜서 형성된 고체 지지체를 이용한 효소의 고정화 방법을 제안하고 있으며, 대한민국등록특허 제509738호에서는 실리카겔 또는 복합 실리카겔 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 생성된 활성화 담체에 가교제를 반응시켜 화합물을 얻은 뒤에 이를 효소와 반응시켜 특정 효소를 고정화하는 방법을 제안하고 있다.
하지만, 지지체 또는 담체에 대한 효소의 결합은 물리적, 이온성 또는 공유결합을 이용한 것인데, 물리적 결합은 너무 약하기 때문에 반응물과 생산물의 농도가 높은 산업적인 조건에서 효소가 지지체에 지속적으로 고정되기 어려운 단점이 있다. 또한 지지체를 사용한 효소의 고정화에 있어서, 만약 효소가 비가역적으로 불활성화되면(deactivated), 효소와 고가의 지지체 모두를 사용할 수 없다. 아울러, 담체(carrier)를 사용하게 되면, 대략 90~99.9%에 이르는 비-촉매 물질 부분이 도입될 수밖에 없으므로, 효소의 활성이 '희석(dilution)'되므로 수율 및 생산성이 저하되며, 특히 많은 양의 효소를 로딩(loading)하는 경우에는 원래 효소 활성의 50% 이상의 손실이 일어나기도 하는 문제가 있다.
한편, 지지체를 사용하는 고정화 방법과 유사한 포괄법은 유기고분자 또는 금속 알콕사이드의 가수분해 중합에 의하여 형성되는 실리카 졸-겔과 같은 고분자 네트워크(gel lattice) 또는 매트릭스(matrix) 내에 효소를 포획하거나(matrix entrap) 또는 중공 섬유, 실리콘 탄성중합체 또는 마이크로캡슐과 같은 멤브레인(membrane) 장치 내에 효소를 포획하는 방법(membrane-entrap)이다. 하지만, 효소의 유출을 완전히 방지하기에는 물리적 구속이 너무 약하기 때문에 추가적인 공유 결합이 종종 요구될 뿐만 아니라, 효소의 존재하에서 이와 같은 고분자성의 네트워크 합성이 필수적으로 요구되며 효소 활성 및 안정성의 감소라든가 미세환경(micro-environment)를 제어하기 곤란하다는 단점이 있다.
이러한 종래의 효소 고정화 방법이 가지는 문제점을 해결하기 위하여, 지지체 또는 담체를 사용하지 않는(carrier-free) 효소 고정화 방법으로서의 가교화 방법이란, 효소를 화학적으로 교차결합(cross-linking)시키기 위하여 예를 들어 2개의 작용기를 갖는 가교제(bifunctional chemical cross-linker)를 사용하는 방법을 의미한다. 효소를 고정화하기 위하여 제안된 가교화 방법은 높은 안정성과 매우 향상된 효소 활성이라는 이점을 이용할 수 있고, 별도로 비활성인 지지체 또는 담체가 필요 없으므로 생산 비용도 저렴하다는 장점을 갖는다. 효소를 고정화하는 방법 으로서 가교화 방법에서 교차 결합을 위한 물질로서 용해된 효소, 결정화된 효소, 물리적으로 응집된 효소를 사용하느냐에 따라 효소교차 방법(Cross-linked enzyme, CLE), 효소교차결정체 방법(Cross-linked enzyme crystals, CLEC), 효소교차결합체 방법(Cross-linked enzyme aggregate, CLEA)으로 구분될 수 있다.
효소교차 방법은 용해된 효소를 직접 가교 결합시키는 방법으로서 효소의 열적안정성을 향상시킬 수 있지만, 가교결합제, 온도, pH 및 이온 결합의 양과 같은 다양한 인자 사이에 미묘한 균형을 맞추어야 하는 한다. 아울러, 이러한 방법을 통하여 용매화된 효소 분자의 분자간 가교결합(intermolecular cross-linking)으로 인하여 활성의 저하, 생산성 저하 및 기계적 안정성 감소와 같은 문제점이 있고, 규칙성이 없이 무작위로 가교화된 효소의 공간적 파라미터를 제어하는데 어려움이 있다.
효소교차결정체 방법(Cross-linked enzyme crystals, CLEC)을 통하여 얻어진 효소는 높은 비-활성(specific activity) 및 유기 용매에 대한 높은 저항성(tolerance)과 순수한 단백질의 특성을 결합한 것으로서, 액상 효소 또는 가교효소방법(CLE)과 비교해서 열, 유기 용매, 단백질의 가수분해로 인한 변형(denaturation)에 대하여 훨씬 안정적이면서 재사용이 가능하며 생산성이 좋다는 이점을 가지고 있어서 산업적인 화학적 변형 공정에 사용되기에 적합하다(Nancy L. St. Clair and Manuel A. Navia, Cross-linked enzyme crystals as robust biocatalysts, Journal of the American Chemical Society, 114(18), 1992, pp.7314~7316). 하지만 가교효소결정화 방법에서, 높은 순도의 효소를 얻기 위해서 가교 반응 이전에 효소를 결정화할 필요가 있는데, 효소를 결정화하는 것은 힘든 일이다.
이를 해결하기 위한 방법으로 효소교차결합체 방법(Cross-linked enzyme aggregates, CLEA)이 제안되고 있다. 효소교차결합체 방법은, 황산암모늄과 같은 염, 알코올과 같은 유기 용매 또는 PEG와 같은 비-이온성 고분자를 단백질 용액에 첨가하면 단백질의 원래 3차원 구조의 변형을 야기하지 않으면서, 단백질 분자의 물리적 응집체가 초고분자 구조(supermolecular structure)로 유도될 수 있다는 점에 근거한 것이다. 즉, 황산암모늄, 알코올, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등을 액체 상태의 생촉매와 같은 단백질에 첨가하여 수용액 중에 들어 있는 효소 단백질을 침전시키면 효소가 물리적으로 결합된(aggregated) 상태를 형성하기 때문에 단백질의 정제에 이용될 수 있다.
그런데, 이러한 단백질의 고체 결합체(aggregates) 비-공유 결합에 의하여 결합되어 있어서, 액상 매질 내에 분산될 때 응집이 쉽게 분해되고 다시 용해되는데, 이러한 효소의 물리적 결합체를 적절한 가교제와 반응시켜 물리적 결합체에 대하여 화학적 가교결합을 형성함으로써, 교차 결합된 효소 결합체를 얻는 방법이 CLEA인데, 이미 사전에 형성되었던 물리적 응집체의 초고분자 구조와 활성이 유지될 수 있다. 이 경우, 고체 상태의 효소 결합체에서 효소 분자는 규칙적인 배열을 가지고 있어서, 즉, 효소의 활성 및 안정성을 위해서 필수적인 효소의 3차원 구 조(conformation)가 견고한 초고분자 내에 고정되어 있어서 높은 안정성 및 활성을 가지고 갖는 것으로 알려져 있다(Linqiu Cao, Fred Van Rantwijk and Roger A. Sheldon, Cross-Linked Enzyme Aggregates: A simple and Effective Method for the Immobilization of Penicillin Acylase, Organic Letters, 2(10), 2000, pp.1361~1364).
도 1을 참조하여, 효소교차 결합체를 통한 효소의 고정화 방법을 설명하면 다음과 같다. 효소교차결합체 방법에서 물리적으로 결합된 효소 결합체는 효소의 간단한 침전(precipitation)에 의해서 얻어지는데, 단백질 분자를 함유하고 있는 용액에 염 또는 물과 혼합될 수 있는(miscible) 다른 유기 용매 또는 비-이온성 고분자를 첨가하여 단백질 분자의 물리적 결합체를 얻는다. 단백질 분자의 물리적 결합체는 단백질의 3차원 구조에 변형을 일으키지 않은 비-공유 결합에 의하여 결합되어 있으므로 변성이 있어나지 않는다. 이러한 물리적 결합체에 대하여 2개의 작용기를 갖는 화합물, 예를 들어 양 끝단에 알데하이드기를 갖는 글루타르알데하이드와 같은 가교제를 반응시킴으로써, 물리적 결합체로서 존재하는 효소의 아미노기와 가교제의 반응을 통하여 화학적으로 가교된 효소 결합체를 얻을 수 있는데, 사전에 이미 조직된 물리적 결합체로서의 거대 구조와 촉매 활성을 유지하면서도 불용성의 단백질이 얻어질 수 있다.
효소교차결합체 방법과 관련하여, 물리적 결합체를 얻기 위하여 용액 상태의 효소를 침전시키는 공정은 원래 단백질 정제 방법에 응용되었던 것으로서, 효소교 차결합체를 이용한 효소의 고정화 방법은 단백질 정제와 효소의 고정화를 단일한 동작으로 결합한 것으로 높은 순도의 효소가 필요 없을 뿐만 아니라, 다루기 쉽고, 저렴하여 효율적인 방법이며, 쉽게 재사용이 가능하고 안정성 생산성이 우수하며 힘든 작업인 결정화 작업 역시 필요가 없다는 이점을 가지고 있으므로, 효소를 이용한 변환 공정이 사용되는 많은 산업분야에서 최근 주목을 받고 있다.
효소교차결합체 방법을 비롯하여 효소 분자의 화학적 가교 결합을 이용한 효소의 고정화 방법은 지지체 또는 담체를 사용하는 것과 비교하여, 단백질 결합체를 형성하는 과정에서 야기되는 극성 및 소수성 상호작용과 같은 다수의 비-공유 결합력과 같은 안정화 인자(stabilization factor)로 인한 이른바 '3차원 효소 고정(three-dimensional enzyme immobilization)'효과를 가지기 때문에 높은 온도 및 다양한 유기 용매에 대해서도 높은 안정성을 보일 뿐만 아니라, 용적 활성(volumetric activity, U/g)이 훨씬 높다. 따라서 높은 생산성이 요구되는 공정이나 기존의 지지체를 사용하는 고정화 방법으로는 효율적으로 안정화될 수 없는 불안정한 효소를 사용하는 공정에서는 가교결합을 이용한 효소의 고정화 방법이 유리하다.
최근, 효소교차결합체 방법을 응용하여, 효소의 물리적 응집체를 얻기 위해서 용해된 리파아제(lipase)를 침전시키는 과정에서 크라운에테르 또는 계면활성제가 존재하는 상태에서 수행함으로써, 활성이 증가된 가교결합효소응집체를 제조하는 방법이 보고되고 있다(유럽특허(EP) 제1,360285호; P. Lopez-Serrano et al., Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity: application to lipase, Biotechnology Letters, 24, 2002, pp.1379~1383). 아울러, 셀룰로오스와 같은 미소공성(microporous) 고분자 멤브레인을 형성하고, 이 멤브레인 포어(pore)를 채우는 효소의 수용액과 가교제를 함유하는 유기 매질 사이의 용매 교환에 의하여 멤브레인의 내부에 형성된 교차효소결합체로서의 리파아제를 고정화하는 경우에, 적절한 양의 가교제를 사용하면 제조된 리파아제 응집체의 형태 및 활성을 제어할 수 있다는 결과도 있다(N. Hilal et al., immobilization of cross-linked lipase aggregates with microporous polymeric membrane, Journal of Membrane Science, 28, 2004, pp.131-141).
그렇지만, 교차효소결합체 방법을 이용하여 효소를 고정화하는 데에는 문제점도 존재한다. 예를 들어, 교차효소결합체 방법을 통한 효소의 고정화에 있어서 결합체 입자의 크기를 제어하기 위한 방법이라든가, 결합체를 형성하는 조건을 변형시켜 효소의 활성 및 선택도를 조절하는 방법을 모색할 필요가 있다.
특히, 도 1에서 알 수 있는 것처럼 물리적 결합체 상태의 효소가 글루타르알데하이드와 같은 가교제와 반응하여 화학적으로 가교화된 결합체를 형성하기 위해서는 효소 자체에 글루타르알데하이드의 작용기인 알데하이드기와 반응할 수 있는 아민기가 존재하여야 한다. 즉, 가교화된 효소 결합체를 얻기 위해서는 효소 자체에 아미노기(-NH2)를 갖는 아미노산, 즉 염기성 아미노산으로서 리신(lysine)의 함 량이 일정 수준을 넘거나 충분하여야 한다.
이에 따라, 1차 아민기에 해당하는 아미노기를 갖는 아미노산인 리신의 함량이 적은 효소의 경우에는 가교제에 존재하는 작용기와 반응을 할 수 없고, 그 결과 효소들 사이의 가교 결합이 거의 형성되지 않는다. 따라서 이와 같은 효소에 대해서 효소교차결합체 방법을 이용하여 고정화하려고 하더라도 가교화된 상태의 효소 결합체가 거의 존재하지 않기 때문에 고정화 효율이 저하하기 때문에 효소의 활성 증가라든가 재사용과 같은 효과를 기대할 수 없다.
결국, 수용성 효소 분자 및/또는 고체 상태의 물리적 결합체로 존재하는 효소로부터 화학적으로 가교화된 효소 결합체를 제조하여 효소를 고정화하는 것과 관련해서는 특히 가교제와 화학적으로 반응할 수 있는 작용기를 거의 갖지 않는 효소에는 적용할 수 없으므로, 이와 같은 효소에 대해서도 간편하면서도 재사용이 가능할 뿐만 아니라, 효소의 활성을 그대로 유지하면서도 가열이나 다양한 유기 용매와 같이 자연적으로 존재하지 않는 산업적인 조건에서도 안정적인 고정화된 효소를 얻을 수 있는 방법을 모색할 필요가 있다.
본 발명자들은 예를 들어 생촉매로서의 효소를 고정화하는 방법 중에서 가교 결합 방법, 특히 효소교차결합체 방법(CLEA)이 모든 효소에 대해서 효율적인 고정화 방법이 될 수 없다는 점에 주목하고, 이를 해결하기 위한 방법을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 기본적으로 지지체 또는 담체를 사용하지 않으면서 생물학적 촉매인 효소와 같은 단백질 분자 사이의 가교 결합에 의한 결합체를 형성하는 효소를 고정화하는 방법, 예를 들어 효소교차결합체(CLEA) 방법으로부터 생물학적 촉매를 높은 수율로 안정적으로 고정화할 수 있는 방법 및 이러한 방법을 통하여 얻어진 고정화된 효소를 산업적으로 응용하는 방법에 관한 것이다. 이와 관련하여 본 명세서 및 도면을 통해서 일부 용어의 의미를 정의한다.
본 명세서에서 '표적 단백질(target protein, TP)' 또는 '표적 효소(target enzyme)'이라는 용어는 가교 결합 방식을 이용한 종래의 효소 고정화 방법으로는 고정화가 일어나지 않거나 거의 일어나지 않은 단백질 또는 효소를 의미한다. 가교 결합 방식을 이용한 효소의 고정화 방법에서 사용되는 단백질의 작용기와 가교제가 함유하는 작용기 사이의 상호작용을 통하여 단백질 분자 사이의 가교결합이 형성되는데, 이러한 의미에서 '표적 단백질'이란 가교제가 함유하는 작용기와 상호작용할 수 있는 작용기가 상대적으로 적거나 부족한 단백질을 의미한다.
만약, 단백질의 화학적 가교 결합을 위하여 알데하이드 치환기를 갖는 화합물, 예컨대 글루타르알데하이드가 사용되는 경우에 알데하이드 치환기와 상호작용할 수 있는 1차 아민기/아미노기(primary amine group, -NH2)를 갖는 아미노산인 리신의 함량이 상대적으로 적은 단백질 또는 효소의 경우에 종래의 가교 결합 방식으로는 고정화가 실질적으로 불가능한데, 이 경우에 1차 아민기를 갖는 아미노산의 함량이 상대적으로 적은 단백질 또는 효소가 표적 단백질 또는 표적 효소로 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면 로도코커스 에리스로폴리스 유래의 아미다아제 또는 포토박테리움 유래의 리파아제와 같은 효소가 표적 단백질로 사용될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다.
한편, 본 명세서에서 '교차보조 단백질(cross-linking complement protein, CP)' 또는 '가교보조 단백질' 이란 용어는 전술한 표적 단백질과 혼합되어 가교 결합 방식을 이용한 효소의 고정화 방법에서 사용되는 가교제와 상호작용할 수 있는 작용기의 함량이 표적 단백질에 비하여 상대적으로 훨씬 많거나 충분한 단백질 또는 효소를 의미한다.
만약, 단백질의 화학적 가교 결합을 위하여 알데하이드 치환기를 갖는 화합물, 예컨대 글루타르알데하이드가 사용되는 경우에 알데하이드 치환기와 상호작용할 수 있는 아미노기(-NH2)를 갖는 아미노산인 리신의 함량이 상대적으로 많은 단백질 또는 효소가 본 발명의 교차보조 단백질로 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 교차보조 단백질로 사용되었는데, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며 소혈청알부민과 비교하여 비슷한 비율의 리신 함량을 갖는 임의의 단백질이 본 발명의 교차보조 단백질로 사용될 수 있음은 물론이다.
또한, 본 명세서에서 '공동-효소교차결합체(co-Cross-Linked Enzyme aggregates, co-CLEA)'란 전술한 표적 단백질 또는 표적 효소와, 교차보조 단백질을 혼합한 상태에서 효소교차결합체 반응을 진행하는 것으로 이해되어야 한다. 이때, 용액 중에 존재하는 용융성의 표적 단백질과 교차보조 단백질에 대해서 각각 침전제를 투입하여 물리적 결합체를 형성한 뒤 이들 각각의 물리적 결합체 상태의 단백질을 혼합한 상태에서 효소교차결합체 반응을 진행하거나, 또는 용액 중에 존재하는 용융성의 표적 단백질과 교차보조 단백질의 혼합 단백질을 침전시켜 물리적 결합체인 고체 상태의 혼합 단백질을 형성한 상태에서 효소교차결합체 반응을 진행할 수 있음은 물론이다.
전술한 것과 같이, 효소가교결합체(CLEA) 방법을 비롯하여 화학적 가교 결합을 통하여 효소를 고정화 하는 방법의 경우, 효소 분자 사이의 가교 결합을 형성하기 위하여 사용되는 가교제가 가지는 화학적 작용기와 상호작용할 수 있는 작용기의 함량이 적은 효소의 경우에는 화학적 가교 결합 방법을 통해서 고정화하더라도 수율이 극히 미비하기 때문에 산업적으로 응용되기 곤란하였다.
예를 들어 종래의 효소가교결합체 방법에서 수용액 속의 단백질을 침전시킨 뒤, 글루타르알데하이드와 같은 가교제를 사용하여 단백질을 구성하는 아미노산 중에 리신(Lysine, K)에 포함되어 있는 아미노기(-NH2) 사이에 공유 결합을 형성함으로써 가교화된 단백질 결합체를 제조하였으나, 리신 함량이 적은 단백질의 경우에는 가교제로서 글루타르알데하이드를 첨가하더라도 단백질 분자 사이의 교차결합이 형성되지 않기 때문에 이러한 단백질을 표적 단백질로 사용하게 되면 고정화과 되지 않는다는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 예를 들어 표적 단백질에 리신 함량이 상대적으로 높은 단백질(교차보조 단백질)을 혼합한 뒤에 단백질의 교차결 합체가 형성되도록 유도하는 새로운 고정화 방법(공동-효소교차결합체)을 연구하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 따라 생물학적 촉매인 효소를 포함하는 단백질의 고정화 방법은 종래의 효소교차결합체(CLEA)에 직접적으로 응용될 수 있음은 물론이지만 그 외 화학적 가교 결합 방법을 이용하여 효소를 고정화하는 방법, 예컨대 효소교차(CLE) 방법에도 응용될 수 있음은 물론이다. 본 발명에 따라 표적 단백질을 고정화하는 방법을 단계별로 살펴본다.
우선, 본 발명은 액상 매질 내에 존재하는 단백질을 침전시켜서 고체 상태 단백질의 물리적 결합체를 형성하는 단계와, 이와 같은 방법으로 얻어진 단백질의 물리적 결합체에 가교제를 반응시켜 가교화된 단백질 결합체를 얻는 단계로 구분될 수 있다.
이때, 물리적 결합체를 형성하기 위한 방법으로는 수용액 또는 유기 용매와 같은 액상 매질 내에 존재하는 용융성의 단백질 분자의 수화(hydration) 상태를 변경하거나 또는 비-변성(non-denaturing) 단백질 분리에서 광범위하게 사용되는 적절한 응집제(또는 침전제)를 첨가하여 단백질 용액의 정전 상수를 변형하는 방법을 이용할 수 있다. 특히 침전제를 사용하는 경우에 고도로 용매화된 단백질 분자는 원래의 conformation을 가지면서 불용성 결합체로서 침전할 수 있을 정도로 함께 결합될 수 있다.
본 발명에서는 자체적으로 가교화 반응이 어려운 표적 단백질과 가교화 반응을 유도할 수 있는 교차보조 단백질의 혼합 단백질을 액상 매질 내에서 용해시킨 상태에서 침전제를 투입하여 혼합 단백질의 물리적 결합체를 형성하는 방법과, 표적 단백질과 교차보조 단백질이 각각 용해되어 있는 액상 매질 내에 각각 침전제를 투입하여 표적 단백질의 물리적 결합체와 교차보조 단백질의 물리적 결합체를 각각 형성한 뒤 이들을 혼합하는 방법을 고려해 볼 수 있다. 이때, 표적 단백질과 교차보조 단백질의 혼합 단백질에서 표적 단백질과 교차보조 단백질은 1:2 ~ 2:1, 바람직하게는 1:1.5 ~ 2:1의 중량비로 혼합하면, 후술하는 가교화 반응에서 단백질의 고정화 수율을 향상시킬 수 있다.
한편, 본 발명에 따라 물리적 결합체인 고체 상태의 단백질을 유도하기 위한 침전제로는 종래 용액 상태의 단백질로부터 고체 상태의 물리적 결합체를 형성하기 위하여 사용되었던 임의의 화합물이 사용될 수 있다. 구체적으로 액상 매질 내에 용해되어 있는 생물학적 촉매인 효소를 침전시킬 수 있은 침전제로서 황산암모늄((NH4)2SO4)과 같은 염, 부틸알코올과 같은 탄소수 1~4의 알코올, 디메톡시에탄(dimethoxyethane, DME), 아세톤 등과 같은 유기 용매, 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 고분자가 사용될 수 있다.
이어서, 본 발명에서는 물리적 결합체 형태로 존재하는 표적 단백질과 교차 보조 단백질의 혼합 단백질을 적절한 가교제와 반응시켜 혼합 단백질이 화학적으로 가교화되어 있는 결합체를 형성함으로서 표적 단백질을 고정화하는 단계가 수행된다. 즉, 도 2에서 간략하게 도시되어 있는 것과 같이 일례로 가교제로서 양 끝단에 알데하이드 작용기를 갖는 글루타르알데하이드를 사용하는 경우에, 아미노기를 갖는 리신의 함량이 적은 표적 단백질만을 사용하게 되면 가교화 반응이 거의 일어나지 않기 때문에 고정화가 일어나지 않지만, 본 발명에서와 같이 표적 단백질과 리신의 함량이 상대적으로 높은 교차보조 단백질의 혼합 단백질을 사용하여 '공동효소교차결합체(co-CLEA)'를 수행하게 되면, 교차보조 단백질에 상대적으로 많이 함유되어 있는 리신의 자유 아민기와 가교제가 상호작용하는 과정에서 표적 단백질-교차보조 단백질이 가교화된 형태로 결합체를 형성함으로써, 결과적으로 표적 단백질의 고정화를 유도할 수 있다.
본 발명과 관련하여 이와 같은 교차보조 단백질과 상호작용할 수 있는 가교제는 교차보조 단백질의 리신 또는 리신에 함유되어 있는 1차 아민기와 반응하여 가교화된 단백질 결합체를 형성할 수 있는 임의의 가교제가 사용될 수 있다. 일례로, 양 끝단에 동일한 작용기를 가지고 있는 '호모이기능성(homo-bifunctional)' 가교제인 글루타르알데하이드(glutar aldehyde), 덱스트란 폴리알데하이드(dextran polyaldehyde), 디메틸아디피미데이트 디하이드로클로라이드(dimethyl adipimidate·2HCl, DMA), 디메틸 수베리미데이트 디하이드로클로라이드(dimethyl suberimidate ·2HCl, DMS), 디숙신이미딜 수버레이트 (disuccinimidyl suberate, DSS)가 사용될 수 있다.
아울러, 숙신이미딜-4(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl-4(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate, SMCC), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오-프로피오네이트) (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionate), N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸)-아미노벤조에이트(N-succinimidyl (4-iodoacetyl)-aminobenzoate, SIAB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 등의 '헤테로이기능성(hetero-bifunctional)' 가교제가 사용될 수 있다. 이들 각각의 가교제를 반응시키기 위한 용매라든가 최적 pH 등은 이미 잘 알려져 있으므로 자세한 설명은 생략한다.
계속해서, 본 발명과 관련하여 사용된 표적 단백질 및 교차보조 단백질에 대해서 설명한다. 본 발명과 관련하여 표적 단백질은 전술한 것과 같이 가교화 반응에서 사용되는 가교제의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 갖는 아미노산의 함량이 적어서 자체적으로는 가교화 반응을 통한 고정화 효율이 산업적으로 무의미한 생물학적 촉매인 효소를 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 표적 단백질은 가교제와 상호작용할 수 있는 아민기를 갖는 리신의 함량이 6% 이하, 예를 들어 0.0~6.0% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 예를 들어 0.5~5.0%, 더욱 바람직하게는 4% 이하, 예를 들어 0.5~4.0%에 불과한 단백질이다.
본 발명의 일 실시예에서 사용된 표적 단백질인 로도코커스 에리스로폴리 스(Rhodococcus erythropolis) 유래의 아미다아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, 예를 들어 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자로부터 발현될 수 있다. 본 발명에서 사용된 아미다아제는 서열번호 1로 표시되는 전체 521개 아미노산 중에서 리신의 개수가 19개로써 3.6%를 차지하고 있다. 이처럼 리신 아미노산 함량이 적기 때문에 교차결합이 충분히 형성되지 않아서, 아미다아제 단독으로 가교화 반응을 수행하는 경우에, 종래의 CLEA 제조방법으로 고정화를 수행할 수 없다. 이처럼 리신 함량이 적은 아미다아제 효소액에 리신 함량이 9.9%로서 상대적으로 높은 함량의 리신을 함유하는 소혈청알부민(BSA) 단백질을 첨가하여 공동-CLEA 제조방법을 수행함으로써 높은 고정화 수율을 얻을 수 있다.
본 발명에 따라 표적 단백질로서 선택된 로도코커스 에리스로폴리스 유래의 아미다아제는 의학적으로 중요한 중간체를 합성하는데 관여한다. 즉, 리피토르 (Lipitor)는 체내 지방함량을 낮추는 합성 의약품으로 현재 널리 사용되고 있다. 3-히드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A, HMG-CoA) 리덕타아제는 콜레스테롤 생합성과정의 초기 단계인 HMG-CoA를 메발론산염(mevalonate)으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. 한편, 아토르바스타틴(Atorvastatin)은 이러한 HMG-CoA 리덕타아제에 대해 저해제 역할을 수행함으로써 콜레스테롤의 생합성을 막아주므로, 고지혈증(hypercholesterolemia) 치료에 사용되는 키랄 의약품(chiral drug)이다.
기존의 연구에 따르면, 니트릴라제 효소가 3-히드록시글루타릴니트릴(3-hydroxyglutaryl nitrile)을 아토르바스타틴의 중간체인 (R)-4-시아노-3-히드록시 부티르산 ((R)-4-cyano-3-hydroxybutyric acid)으로의 비대칭화반응(desymmetrization)을 촉매하는 것이 보고되었다. 한편, (S)-4-염화-3-히드록시부티레이트 에틸에스테르 (ethyl-(S)-4-chloro-3-hydroxybutyrate, (S)-ECHB)가 아토르바스타틴을 생산하는 데에 중요한 키랄 중간체임이 밝혀졌다. 이러한 (S)-ECHB는 니트릴기질로부터 두 가지의 효과적인 효소 반응과 화학적 반응에 의해서 생성된다. 먼저 니트릴 수화효소(nitrile hydratase, NHase)가 4-염화-3-히드록시부티로니트릴 (4-chloro-3-hydroxybutyronitrile, CHBN)을 4-염화-3-히드록시부틸아미드 (4-chloro-3-hydroxybutyramide, CHBamide)로 전환시키고, 이후에 아미다아제가 4-염화-3-히드록시부티르산 (4-chloro-3-hydroxybutyric acid, CHBacid)으로 전환시키고, 에틸화(ethylation)에 의하여 ECHB로 전환될 수 있다. 따라서, 고지혈증 치료제로 사용되는 아토르바스타틴을 생산하는데 중요한 키랄 중간체인 (S)-ECHB를 를 생산하기 위해서는 라세미체인 CHBamide에서 (S)-CHBacid로 전환하는 입체선택적인(enantioselective) 아미다아제가 사용될 필요가 있다.
최근, 로도코커스 에리스로폴리스균이 니트릴수화효소와 아미다아제 효소를 동시에 생산하며 이들 효소에 의해서 CHBN이 CHBamide를 거쳐 CHBacid로 전환되는 것이 보고되었다. 이중에서 아미다아제 효소는 E. coli 균에서 재조합 형태로 대량생산되었으며 (R)-CHBamide에 대한 입체선택성이 높은 것으로 밝혀졌다. 그렇지만 이들 효소에 의한 화학적 변환 공정을 산업적으로 응용하기 위해서는 이들 효소를 안정적으로 고정화할 수 있어야 하는 데, 서열번호 1로 표시되는 로도코커스 에리스로폴리스 유래의 아미다아제는 가교화 반응을 통해서 고정화가 사실상 일어나지 않았다는 문제점이 있었으나, 본 발명에서는 공동-CLEA 방법을 통해서 로도코커스 에리스로폴리스 유래의 아미다아제를 화학적으로 가교화된 결합체 형태로 고정화시키고, 아미다아제가 매개하는 화학적 변환 공정에서 고정화된 효소를 사용함으로써 다양한 유기용매에 대한 안정성의 향상은 물론이고, 고지혈증 치료제의 중요한 키랄 중간체를 합성하는데 있어서도 양호한 입체선택성을 보여주는 것으로 확인되어, 본 발명의 고정화 방법이 산업적으로도 응용될 수 있음을 보여주고 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에 따라 사용된 포토박테리움(Photobacterium lipolyticum) 유래의 M37 리파아제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며, 예를 들어 서열번호 4의 염기 서열로부터 발현될 수 있다. 포토박테리움 유래의 M37 리파아제는 저온에서도 효과적으로 지질을 분해할 수 있어서(H.S. Ryu et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 70: 321-326; 2006), 세제첨가제, 계면활성제로서의 활용은 물론이고 특정 에스테르 결합을 가지는 화합물의 합성으로 제약 산업 등에 응용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
포토박테리움 유래의 M37 리파아제는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 알 수 있듯이 리신 함량이 5.5%로서 전술한 로도코커스 에리스로폴리스 유래의 아미다아제에 비하여 자체적으로도 가교화 반응을 통한 고정화가 어느 정도 가능하다. 하지만 놀랍게도, 본 발명의 실시예에 따르면, M37 리파아제와 교차보조 단백질을 대략 1:1.5의 비율로 혼합한 상태에서의 고정화 수율이 급격하게 증가할 수 있다는 점을 확인하여 본 발명의 공동-CLEA 방법을 통한 고정화 방법으로 고정화된 M37 리파아 제가 매개하는 화학적 변환 공정에 보다 안정적이면서도 반복적인 사용에도 불구하고 활성 저하가 거의 일어나지 않도록 응용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
한편, 본 발명과 관련해서 사용되는 교차보조 단백질은 사용되는 가교제와 상호작용할 수 있는 작용기를 갖는 아미노산인 리신의 함량이 상대적으로 높은 임의의 단백질이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 사용되는데, 소혈청알부민은 서열번호 6의 염기 서열로부터 발현될 수 있다.
서열번호 5에서 알 수 있듯이, 소혈청알부민은 리신의 함량이 대략 9.9%로서 가교제와 반응할 수 있기 때문에 표적 단백질로 사용된 아미다아제 및/또는 리파아제와 혼합된 상태에서 가교제를 첨가하면 혼합 단백질의 가교화된 결합체를 얻을 수 있다. 이러한 의미에서 본 발명과 관련하여 교차보조 단백질로 사용될 수 있는 단백질은 소혈청알부민만으로 한정되는 것은 결코 아니고, 소혈청알부민과 비교하여 리신 함량이 유사하거나 그보다 높은 임의의 단백질이 사용될 수 있을 것이다. 예를 들어 리신 함량이 8~15%인 단백질이 사용될 수 있다. 특히, 소혈청알부민은 ELISA와 같은 면역학적 분석 방법에 널리 사용될 뿐만 아니라, 일부 효소가 반응 튜브 또는 보관 용기로 흡착되는 것을 방지하는 한편 효소의 활성에 영향을 주지 않으므로 보관제로 사용될 뿐만 아니라 쉽게 정제될 수 있으므로 가격도 저렴하기 때문에 본 발명에 따른 교차보조 단백질로 사용하기에 바람직하다. 본 발명에 따른 표적 단백질과 교차보조 단백질은 예를 들어 1:2 ~ 2:1, 바람직하게는 1:1.5 ~ 2:1의 중량비로 혼합하여 가교화 반응을 수행하면 고정화 수율이 향상될 수 있다.
이어서, 본 발명에 따른 고정화 방법 내지는 이를 응용한 방법에 대해서 간략하게 설명한다. 우선, 본 발명에서는 리신 함량이 3.6%인 로도코커스 에리스로폴리스 아미다아제와 리신 함량이 5.5%인 포토박테리움 리파아제 효소를 대장균에서 재조합단백질로 생산하여 CLEA 제조실험을 수행하였다(도 3, 4). 각 세포추출액을 단독으로 고정화 실험을 수행한 경우와 소혈청알부민과 섞어서 고정화 실험을 수행하여 효소교차결합체(CLEA) 형성을 확인하고(도 5, 6), 고정화 수율을 조사하였다(도 7). 로도코커스 아미다아제의 경우, 세포추출액 10 ㎎을 상기방법으로 고정화한 경우에는 수율이 6%밖에 되지 않았으나, 소혈청알부민을 5, 10, 15 ㎎을 섞어서 각각 고정화를 수행한 경우에는 수율이 55, 58, 27%로 증가되었다. 포토박테리움 리파아제의 경우, 세포추출액 10 ㎎을 상기방법으로 고정화한 경우에는 수율이 47%로 되었으나, 소혈청알부민을 10, 15 ㎎을 섞어서 각각 고정화를 수행한 경우에는 수율이 55, 94%로 증가되었다.
이어서, 아미다아제CLEA 및 수용성 아미다아제에 대한 온도와 pH 및 유기용매의 영향을 조사하여 비교하였다(도 8, 도 9, 도 10, 도 11). 또한, 반복사용 시, 안정성에 대해서도 비교하였다(도 12). 이와 같은 일련의 실험을 통해서 아미다아제 CLEA는 수용성 아미다아제에 비해서 온도와 pH 안정성이 우수하며, 반복사용 시, 안정성이 뛰어나다는 점을 확인하였다.
수용성 효소는 수용액에 완전히 용해되기 때문에 반응 후, 수용액으로부터 효소를 회수하여 재사용하기 어렵고, 효소의 안정성이 약하고, 대규모 연속공정에 사용할 수 없다는 문제점이 있는 반면, 아미다아제 CLEA 및 리파아제 CLEA는 반응 후, 회수해서 재사용하는 것이 용이하다. 아미다아제 CLEA의 경우, 4회 반복사용 하였을 때 99%의 활성이 유지되었고, 리파아제 CLEA의 경우, 4회 반복사용 하였을 때 96%의 활성이 유지되었다(도 12). 이러한 특징은 효소를 이용하는 반응공정의 경제성을 매우 크게 증가시켜줄 것이다.
한편, 본 발명에 따라 사용된 로도코커스 에리스로폴리스 아미다아제는 CHBamide를 입체선택적으로 CHBacid로 전환할 수 있다. 따라서 고정화된 아미다아제CLEA를 사용하여 유용 키랄 중간체인 (S)-ECHB의 생산공정에서 반복적으로 안정하게 사용할 수 있다는 이점을 가진다. 로도코커스 에리스로폴리스의 니트릴 수화효소와 아미다아제의 작용에 의해 CHBN은 CHBacid로 전환된다. 본 발명에서는 (R)-, (S)-CHBamide를 제조하기 위하여 로도코커스 에리스로폴리스 생균체를 이용하였다. 즉, 로도코커스 에리스로폴리스의 니트릴 수화효소는 저온 (15℃)에서 높은 활성 (860 U/㎎)을 보이기 때문에 생균체를 이용하여 저온에서 (R)-, (S)-CHBamide를 제조하였다. 이후에 아미다아제를 사용하여 CHBamide를 CHBacid로 전환하였으며 그 결과를 TLC를 통해 확인하였다(도 13).
이하, 예시적인 실시예를 통해서 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 결코 아니다.
실시예 1 : 표적 단백질의 대장균에서의 생산 및 발현
(1) 로도코커스 유래의 아미다아제의 대장균에서의 생산 및 발현
로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis) No.7 아미다아제 효소(서열번호 1)를 생산하기 위해서 발현 벡터로 pET22 플라스미드를 사용하였고 E. coli BL21 (DE3)를 재조합 단백질 발현의 숙주로 사용하였다. 우선, 로도코커스 에리스로폴리스 No.7 strain 유래의 아미다아제 유전자(서열번호 2)는 PCR 과정을 통하여 증폭되었다. PCR과 관련해서 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머를 사용하였다. PCR은 Takara Taq (Takara Bio Inc, Shiga, Japan)을 사용하여, 95℃에서 60초, 43℃에서 60초, 72℃에서 90초의 과정을 30 사이클 반복하였다. 증폭된 PCR 산물(서열번호 2)은 도 3에 도시된 것처럼 NdeⅠ과 EcoRⅠ의 제한효소를 사용하여 절단한 뒤 AxyPrep DNA gel extraction kit(Axygen Scientific, Inc., Union City, USA)를 사용하여 정제되었다. 증폭된 DNA는 재조합 벡터로 사용된 pET22 플라스미드의 T7 프로모터의 downstream으로 삽입되었다.
형질전환 E. coli BL21 (DE3)는 암피실린(100㎍/mL)이 포함된 LB 배지 (10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모추출물, 5g/L 염화나트륨)에서 흡광도(0.D600nm)가 0.6으로 될 때까지 배양한 후, 아이피티지(IPTG, 1 mM)를 첨가하여 18℃에서 20 시간동안 배양하였다. 배양된 균체를 원심분리(6,000×g, 10분)를 통해 회수하였고, 인산칼륨용액(10 mM, pH 7.5)에 현탁한 뒤, 현탁된 세포를 얼음 내에서 초음파 분쇄법으로 파쇄하여 원심분리(10,000×g, 15분)를 통해 세포추출액을 얻었다. SDS-전기영동은 12%의 아크릴아미드 겔을 사용하여 수행하였다. 도 2에서 본 실시예에 따른 전기영동 분석 결과를 보여준다. M은 마커이고, Sup는 상등액이며, Ppt는 pellet을 대상으로 한 것으로, 대략 55kDa에 해당하는 아미다아제가 분리되었으며, 주로 용융성 부분(상등액) 형태로 존재한다는 것을 확인하였다.
(2) 포토박테리움 M37 리파아제의 대장균에서의 생산 및 발현
포토박테리움(Photobacterium lipolyticum) 유래의 M37 리파아제를 발현하기 위하여 종래 기술(H.S. Ryu et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 70: 321-326)에 기술되어 있는 방법에 따라, M37 리파아제를 발현, 분리하였다.
서열번호 3의 재조합 M37 리파아제를 발현시키기 위하여 우선 서열번호 4의 유전자는 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 사용하는 PCR 과정을 통하여 위에서 기술된 것과 동일한 방법에 따라 증폭하였다. 이어서, 서열번호 4의 염기 서열이 삽입되어 있는 재조합 플라스미드(pET22)를 가진 대장균(Escherichia coli BL21 (DE3))을 암피실린(100㎍/mL)이 포함된 액체배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨)에서 흡광도(O.D600㎚)가 0.6으로 될 때까지 배양한 후, 아이피티지(IPTG, 1 mM)를 첨가하여 18℃에서 20시간동안 배양하여 서열번호 3으로 표시되는 M37 리파아제를 발현시켰다.
이어서, M37 리파아제를 다음과 같이 분리하였다. 우선 대량 배양된 균체를 원심분리를 통해 회수하였다. 균체를 초음파 분쇄법으로 깬 후에 원심분리(12,000×g, 15분)하여 얻은 상층액을 효소액으로 하였다. 효소액에 70% 포화농도의 황산 암모늄을 처리하여 리파아제를 침전시켰다. 원심분리(12,000×g, 15분)하여 상층액을 제거한 후, 인산완충용액 (50 mM, pH 7.5)으로 침전된 단백질을 녹였다. 단백질 용액에서 염을 제거시키기 위해 투석막에 넣어서 인산완충용액(50mM, pH 7.5)으로 투석하였다.
실시예 2 : 다양한 농도의
소혈청알부민을
사용한
CLEA
의 제조 및 분석
(1) 공동 CLEA 제조
로도코커스 아미다아제 및 포토박테리움 리파아제 유전자를 대장균에서 발현시키고 각각의 세포추출액을 사용하여 CLEA 제조방법으로 고정화하였다.
우선, 아미다아제 세포추출물 10 ㎎을 소혈청알부민 0, 5, 10, 15 ㎎과 각각 혼합하였고, 혼합된 단백질용액에 침전제인 황산암모늄을 70% 포화되도록 가하여 단백질을 침전시켰다. 단백질 침전용액에 가교제인 글루타르알데히드(25%, 2 ㎖)를 가하고 4℃에서 20시간 반응시킨 후, 원심분리(10,000×g, 10분)를 통해 제조된 아미다아제 CLEA를 회수하였다. 인산칼륨용액 (10 mM, pH 7.5) 10 mL을 사용하여 회수된 아미다아제C LEA를 3회 세척하였고, 동일한 인산칼륨용액에 현탁한 후, 4℃에서 보관하였다. 동일한 절차에 따라 포토박테리움 유래의 M37 리파아제 CLEA를 제조하였다.
(2) 고정화 분석
아미다아제 세포추출물과 소혈청알부민을 10:5, 10:10, 10:15 비율로 섞어서 만들어진 CLEA의 구조를 주사 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다. 7,500 배율로 확대하여 관찰한 결과, 세 가지 경우 모두 구형 구조를 가지고 있음을 확인하여, 교차 반응이 제대로 일어났음을 확인하였다(도 5). 이어서, 제타 포텐셜 기기를 이용하여 구의 크기를 정량적으로 측정하였다(도 6). 소혈청알부민을 5 ㎎, 10 ㎎, 15 ㎎을 첨가한 경우, 각각 평균 1.23 ㎛, 0.91 ㎛, 1.69 ㎛ 직경의 구형 결합체 구조가 만들어진 것을 확인하였다.
계속해서, 본 실시예에 따라 얻어진 공동 CLEA의 고정화 수율을 조사하였다. 도 5는 본 실시예에 따라 10 ㎎의 아미다아제 세포추출액을 각각 0, 5, 10, 15 ㎎의 소혈청알부민과 각각 혼합하여 고정화하였을 때의 수율을 나타낸 그래프이다. 아미다아제 효소의 경우, 아미다아제 세포추출액 10 ㎎만을 사용하여 고정화를 수행하였을 때에는 수율이 6%밖에 되지 않았지만, 5 ㎎, 10 ㎎, 15 ㎎의 소혈청알부민을 첨가하였을 때에는 수율이 각각 55%, 58%, 27%로 나타났다.
한편, 리파아제 효소의 경우, 리파아제 세포추출액만을 사용하여 고정화를 수행하였을 때에는 고정화 수율이 47%로 나타났으며, 10 ㎎, 15 ㎎의 소혈청알부민을 첨가하였을 때에는 55%와 94%의 고정화 수율을 나타내었다.
실시예 3 : 로도코커스 아미다아제 및 리파아제 활성 측정
아미다아제의 가수분해 활성 측정은 Fawcett와 Scott에 의해 개발된 방법인 암모니아 측정법을 통해 수행되었다. 5 mM 농도의 기질(isobutyramide)이 포함된 인산칼륨용액 (10 mM, pH 7.5) 1 mL에 효소를 적당량 첨가하고 40℃에서 반응을 수 행하였다. 반응 시간 별로 반응 혼합액 100 ㎕를 샘플링하여 용액 A (10 g/L 페놀, 0.4 g/L sodium nitropruside) 500 ㎕와 용액 B (5 g/L 수산화나트륨, 7 ㎖/L sodium hypochloride solution) 500 ㎕와 함께 섞어 주었다. 30 분간 상온에서 방치한 후, 분광광도계로 625 nm에서의 흡광도를 측정하고, 염화암모늄 (0-0.5 mM)을 이용한 표준곡선과 비교하여 비색정량을 수행하였다. 효소활성의 1 유닛(unit)은 1분 동안 1 마이크로 몰의 암모니아를 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.
한편, 리파아제 효소의 활성 측정을 다음과 같이 수행하였다. 파라-니트로페닐 부티레이트(p-nitrophenyl butyrate, 10 mM)와 에탄올 및 트리스-염산(Tris-HCl, 50 mM, pH 8.0)완충용액을 10:40:950의 비율로 섞어 총 1 mL을 제조하였다. 이 혼합액에 적당량(5~20 ㎕)의 효소액을 넣고 35℃에서 3분간 반응시킨 후, 효소반응에 의해서 생성된 파라-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 405㎚ 파장의 흡광도로 측정하였다. 효소활성 1유닛(unit)은 1분 동안 1마이크로 몰의 파라-니트로페놀을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
실시예 4 : 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 온도에 따른 효과
본 실시예에 따라 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 최고 활성 온도와 온도 안정성을 조사하였다. 최고 활성 온도를 측정하기 위해 아미다아제CLEA 와 아미다아제 세포추출액을 10℃에서 70℃사이의 온도에서 각각 30 분간 아미다아제 활성측정 반응을 수행하고 생성된 암모니아의 양을 분석하였다. 온도 안정성을 알아보기 위해 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액을 10℃에서 70℃ 사이의 온도에서 30 분간 처리하고, 기질을 첨가하여 40℃에서 30 분간 반응하여 암모니아 정량 분석 방법으로 아미다아제 활성을 조사하였다.
도 8의 A는 본 실시예에 따라 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액을 10℃에서 70℃사이의 온도에서 각각 30 분간 반응하였을 때의 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액의 효소활성 변화를 나타낸 그래프이다. 아미다아제 CLEA의 경우 60℃에서 최적의 효소활성을 나타내었고, 아미다아제 세포추출액의 경우 50℃에서 최적의 효소활성을 나타내었다. 도 8의 B는 본 실시예에 따라 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액을 10℃에서 70℃사이의 온도에서 30분간 처리하고 기질을 첨가하여 40℃에서 30분간 반응하였을 때의 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액의 효소활성 변화를 측정한 그래프이다. 아미다아제 CLEA의 경우, 50℃까지 100% 활성을 유지하였고 아미다아제 세포추출액의 경우 81%의 효소활성을 유지하였다.
실시예 5 : 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 pH에 따른 효과
아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 최고 활성 pH와 pH 안정성을 조사하였다. 최고 활성 pH를 측정하기 위해 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액을 여러 가지 pH 용액(pH 4-12)에 넣고 40℃ 온도에서 30 분간 반응한 후, 아미다아제 활성을 암모니아 정량분석 방법으로 조사하였으며, pH 안정성을 알아보기 위해 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액을 여러 가지 pH 용액 (pH 4-12)에 넣고 4℃에서 30 분간 처리한 후, 기질을 첨가하여 40℃에서 30 분간 반응함으로써 아미다아제 잔존 활성을 조사하였다.
도 9의 A는 본 실시예에 따라 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액을 여러 가지 pH 용액 (pH 4-12)에 넣고 40℃에서 30 분간 반응하였을 때의 효소활성 변화를 측정한 그래프이다. 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액은 pH 8에서 최적의 효소활성을 나타내었다.
도 9의 B는 본 실시예에 따라 아미다아제CLEA와 아미다아제 세포추출액을 여러 가지 pH 용액 (pH 4-12)에 넣고 각각 4℃에서 30 분간 처리하였고, 기질을 첨가하여 40℃에서 30 분간 반응하였을 때의 잔존활성을 측정한 그래프이다. 아미다아제 CLEA의 경우, pH 5-12까지 효소활성이 유지되었으나 아미다아제 세포추출액의 경우, pH 7-12까지 효소활성이 유지되었다.
실시예 6 : 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 온도와 시간에 따른 안정성
본 실시예에서는 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 여러 가지 온도에서 시간에 따른 안정성을 조사하였다. 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액을 각각 50℃, 55℃, 60℃ 온도에서 2시간동안 처리하였고, 기질을 첨가하여 40℃에서 30 분간 처리하여 아미다아제 활성을 암모니아 정량 분석방법으로 조사하였다.
도 10은 본 실시예에 따라 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액을 각각 50℃, 55℃, 60℃에서 처리하였을 때 반응 시간에 따른 효소의 잔존 활성 변화 를 측정한 그래프이다. 도시된 것처럼, 50℃에서 반응한 경우, 2시간이 경과되었을 때 아미다아제CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 효소활성은 각각 52%, 48%로 유지되었고, 55℃에서 반응한 경우, 2시간이 경과되었을 때 아미다아제 CLEA의 효소활성은 33%로 나타났으나, 아미다아제 세포추출액의 효소활성은 전혀 나타나지 않았다. 60℃에서 반응한 경우, 아미다아제 세포추출액은 30분이 경과 되었을 때 효소활성이 나타나지 않았고, 아미다아제 CLEA는 2시간이 경과 되었음에도 35%의 효소활성을 유지하였다.
실시예 7 : 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 유기용매에 따른 안정성
본 실시예에서는 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 각종 유기용매에 대한 안정성을 조사하였다. 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액 용액에 유기용매를 농도별로 첨가하고 30분간 반응한 후, 아미다아제 활성을 암모니아 정량 분석방법으로 조사하였다.
도 11은 본 실시예에 따라 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액에 다양한 유기용매를 30 분간 처리한 상태에서 효소의 잔존 활성 변화를 측정한 그래프로서, A가 아미다아제 CLEA에 유기용매를 처리한 결과이고 B가 아미다아제 세포추출액에 유기용매를 처리한 결과이다. 아미다아제 CLEA의 경우, 메탄올을 10% 농도로 처리하면 효소활성이 99% 유지되었고, 40% 농도로 처리하면 효소활성이 62% 유지되었다. 반면 아미다아제 세포추출액의 경우, 메탄올을 40% 농도로 처리하면 효 소활성이 27%에 불과하였다.
에탄올을 10% 농도로 처리하면 아미다아제 CLEA의 경우 65%, 아미다아제 세포추출액의 경우 47%의 효소활성이 유지되었고, 아세톤을 10% 농도로 처리하면 아미다아제 CLEA의 경우 24%, 아미다아제 세포추출액의 경우 19%의 효소활성이 유지되었다. 반면 아세토니트릴(Acetonitrile)을 10% 농도로 처리하면 아미다아제 CLEA의 경우 19%, 아미다아제 세포추출액의 경우 29%의 효소활성이 유지되었고, 디메틸설폭사이드(DMSO)를 10% 농도로 처리한 경우에는 두 가지 모두 6%의 효소활성이 나타났다.
실시예 8 : 아미다아제 CLEA 및 로도코커스 에리스로폴리스 균체,
E. coli
균체, 아미다아제 세포추출액의 반복 안정성 조사
본 실시예에서는 아미다아제 CLEA, 로도코커스 에리스로폴리스 균체, E. coli 균체, 아미다아제 세포추출액(수용성 아미다아제)의 반복 안정성을 조사하였다. 각 생균체와 아미다아제 CLEA, 수용성 아미다아제를 기질과 40℃에서 30 분간 반응한 후, 반응액을 원심분리(10,000×g, 10분)하여 다음 반응에 사용하였다.
도 12는 본 실시예에 따라 아미다아제 CLEA, 로도코커스 에리스로폴리스 균체와 E.coli 균체, 수용성 아미다아제를 4회 반복 사용하였을 때의 활성을 나타낸 그래프이다. 로도코커스 에리스로폴리스 균체와 E. coli 균체의 경우, 2회 반복 사용하였을 때 활성이 50%로 감소하였다. 반면 아미다아제 CLEA는 4회 반복 사용함에도 불구하고 99%의 활성이 유지되었으며, 수용성 아미다아제는 반복 사용에 다른 활성이 없어졌음을 확인하였다.
실시예 9 : 아미다아제CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 기질에 따른 특이성
본 실시예에서는 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 기질에 따른 특이성을 조사하였다. 짧은 사슬 아마이드 (아세트아미드, 아크릴아미드, 프로피온아미드), 중간 사슬 아마이드 (부틸아미드, 이소부틸아미드), 방향족 아마이드 (벤즈아미드)를 기질로 사용하여 가수분해 활성을 측정하였다. 하기 표 1은 여러 가지 기질을 사용하였을 때의 상대활성을 나타낸 것이다. 아미다아제 CLEA와 아미다아제 세포추출액의 경우, 모두 이소부틸아미드, 부틸아미드, 프로피온아미드를 빠르게 가수분해하며, 아세트아미드, 아크릴아미드, 벤즈아미드를 느리게 분해하였다.
표 1. 기질에 따른 활성 분석
기질 |
화학식 |
상대 효소활성 (%) |
아미다아제 세포추출액 |
아미다아제 CLEA |
이소부틸아미드 |
(CH3)2CHCONH2 |
100 |
100 |
프로피온아미드 |
CH3CH2CONH2 |
40 |
62 |
부틸아미드 |
CH3(CH2)2CONH2 |
41 |
53 |
아세트아미드 |
CH3CONH2 |
5 |
12 |
아크릴아미드 |
CH2=CHCONH2 |
10 |
18 |
벤즈아미드 |
C6H5CONH2 |
20 |
30 |
실시예 10 :
아미다아제
CLEA
및
아미다아제
세포추출액의 입체선택성
본 실시예에서는 (R)- (S)-CHBamide를 분해하여 방출되는 암모니아의 양을 조사함으로써 아미다아제 CLEA 및 아미다아제 세포추출액의 입체선택성을 측정하였다. CHBamide를 제조하기 위하여 로도코커스 에리스로폴리스 생균체를 이용하였다.
로도코커스 에리스로폴리스의 니트릴 수화효소는 저온 (15℃)에서 높은 활성을 보이기 때문에 생균체를 이용하여 15℃에서 (R)- 및 (S)-CHBN을 (R)- (S)-CHBamide으로 전환하였다. 원심분리(10,000×g, 5분)를 통해 얻은 상층액을 기질로 사용하여 아미다아제 반응을 수행하였고, 반응시간에 따라 일정량의 반응액을 취해 암모니아 양을 측정하였다. 먼저 CHBamide에 대한 가수분해 활성을 박막크로마토그래피 방법으로 측정하였다. 효소와 CHBamide 기질을 40℃에서 반응하여 반응 시간별로 일정량의 반응물을 추출하여 실리카 유리판에 가하고, 혼합용매를 이용하여 물질을 전개하였다. 전개된 유리판에 발색시약을 적시고 가열하면서 발색반점을 관찰하였다. 도 13a는 표준물질을 사용한 것이고, 도 13b는 본 실시예에 따라 CHBacid가 만들어진 것을 보여주는 TLC 분석 결과이다.
한편, 효소의 입체선택적인 효과를 측정하기 위해서 (R)-CHBmide와 (S)-CHBmide로부터 방출된 암모니아의 양을 분석하였다. 그 결과가 도 14에 표시되어 있는데, 도 14의 A가 아미다아제 세포추출액의 입체선택성을 측정한 것이고, 도 14의 B가 본 발명의 아미다아제 CLEA의 입체선택성을 측정한 그래프이다.
아미다아제 세포추출액의 경우, (R)-CHBamide를 (S)-CHBamide에 비해 빠르게 가수분해하였다. 입체선택적 분해의 수치를 계산해보면, 전환 수율이 약 59% 일 때, e.e. 값은 67%가 산출되었다. 아미다아제 CLEA의 경우, 전환 수율이 약 60% 일 때, e.e. 값은 69%가 산출되어, 본 발명의 아미다아제 CLEA가 세포추출액보다 입체선택성이 양호하다는 점을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 기술하였으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야의 평균적 기술자라면 상술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다 할 것이다. 그러나 그러한 변형과 변경은 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 더욱 분명해질 것이다.