KR101065001B1

KR101065001B1 - 클로렐라 소로키니아나 추출물

Info

Publication number: KR101065001B1
Application number: KR1020080104654A
Authority: KR
Inventors: 싱-팡 시에; 추-안 수; 유-성 차오; 유-청 초우; -테 왕
Original assignee: 인터내셔널 클로렐라 코., 엘티디.
Priority date: 2007-10-25
Filing date: 2008-10-24
Publication date: 2011-09-16
Also published as: MY149112A; KR20090042181A; TW200918083A; TWI356705B; CN101444542A; HK1129326A1; US20090111876A1; US8048426B2; SG152154A1; CN101444542B

Abstract

본 발명은 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 및 스테아르산을 포함하는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)의 추출물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 추출물을 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)의 치료에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.

클로렐라 소로키니아나, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, PPAR

Description

클로렐라 소로키니아나 추출물{Extracts from chlorella sorokiniana}

PPARs(Peroxisome proliferator-activated receptors)는 여러 세포 및 대사 프로세스를 조절하는 핵 수용체(nuclear receptors) 패밀리에 속한다. 3 개의 포유류 PPARs, 즉 PPARα, PPARβ, PPARγ가 확인되었다. Endocrinology 2003, 144: 2201-7, Lee C.H. 등을 참고할 수 있다. 활성화에 있어서, PPARs는 변화된 지질 및 글루코스 대사를 이끄는 전사 사건의 캐스케이드를 유발한다. 예를 들어 J Med Chem 2000, 43, 527-50, Willson T.M. 등; 및 Pharmacol Ther. 2006, 110, 371-85 Moraes L.A. 등을 참고할 수 있다.

지질 및 글루코스 대사에서 주어진 이들의 역할 때문에 PPARs는 II 형 당뇨병, 비만, C형 간염, 이상지질혈증(dyslipidemia), 관상동맥질환, 염증성 질병, 및 암과 같은 질병의 유망한 치료학적 표적이다. 예를 들어, 글리타존(Glitazone), PPARγ 작용제(agonist)가 II 형 당뇨병 치료에 사용되어 왔다. 다른 예로서, 피브레이트(fibrate), PPARα 작용제는 혈액의 중성지방(triglyceride) 수준을 낮추는데 효과적인 약이다. 그러나, 대부분의 PPAR 치료제는 제한된 효능 또는 중대한 부작용을 갖는다.

PPAR 활성 조절을 통한 지질 및 글루코스 대사 제어에 더욱 효과적인 의약의 개발이 요구된다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 추출물의 건조 중량을 기준으로, 0.1% 내지 5% 미리스트산, 10% 내지 60% 팔미트산, 2% 내지 15% 팔미톨레산, 2% 내지 15%, 올레산, 2% 내지 15%,리놀레산, 0.8% 내지 6% 리놀렌산, 및 0.5% 내지 5%의 스테아르산을 포함하는 클로렐라 소로키니아나 추출물이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 추출물의 유효량을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증을 포함하는 질병의 치료 방법이 제공된다.

본 발명에 의하면, 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 및 스테아르산을 포함하는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)의 추출물이 제공되며, 상기 추출물은 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)의 치료에 사용될 수있다.

본 발명은 호열성 단일-세포 녹조류인 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 추출물이 효과적으로 PPARα 및 PPARγ을 활성화시키는 것을 발견한 것에 기초한다. 따라서, 본 발명의 일 견지에 의하면 본 발명은 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 및 스테아르산을 포함하며, 이들이 각각 추출물 건조 중량의 0.1% 내지 5%, 10% 내지 60%, 2% 내지 15%, 2% 내지 15%, 2% 내지 15%, 0.8% 내지 6%, 및 0.5% 내지 5%를 구성하는 추출물에 관한 것이다. 바람직하게 상기 미리스트산, 상기 팔미트산, 상기 팔미톨레산, 상기 올레산, 상기 리놀레산, 상기 리놀렌산, 및 상기 스테아르산은 각각 추출물 건조 중량의 0.5% 내지 4%, 15% 내지 50%, 3.5% 내지 12%, 3.5% 내지 12%, 3% 내지 12%, 1.2% 내지 5%, 및 0.8% 내지 4%를 구성한다. 더욱 바람직하게, 상기 추출물은 7개의 성분을 포함하며, 상술한 순서로 각각 추출물 건조 중량의 0.7% 내지 1.7%, 19.2% 내지 43.6%, 4.4% 내지 10.1%, 4.4% 내지 10.0, 3.9% 내지 8.8%, 1.8% 내지 4.0%, 및 1.1% 내지 2.6%를 구성한다.

상기 추출물은 헥사데카디에노산(hexadecadienoic acid), 헥사데케노 산(hexadecenoic acid), 및 옥타데케노산(octadecenoic acid)을 추가로 포함하며, 이들은 각각 상기 추출물 건조 중량의 0.8% 내지 6%, 1.2% 내지 8%, 및 1.2% 내지 8%를 구성한다. 일 구현으로, 상기 헥사데카디에노산, 상기 헥사데케노산, 및 상기 옥타데케노산은 각각 상기 추출물 건조 중량의 1.2% 내지 5%, 2% 내지 7%, 및 2% 내지 7%를 구성한다. 예를 들어, 상기 추출물은 또한 헥사데카디에노산, 헥사데케노산, 및 옥타데케노산을 각각 상기 추출물 건조 중량의 1.9% 내지 4.3%, 2.6% 내지 6.0, 및 2.6% 내지 5.9%로 포함한다.

다른 구현으로, 본 발명은 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidemia)의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상술한 추출물의 유효량을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명의 범위에는 상술한 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물, 당뇨명, 비만 및 이상지질혈증 치료를 위한 이러한 조성물의 용도, 및 이러한 질병 치료용 의약 제조를 위한 상기 조성물의 용도가 포함된다.

본 발명의 몇몇 구현이 하기에 설명되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점을 하기의 기재 및 청구항의 기재로부터 확인할 수 있다.

본 발명의 추출물은 아세테이트를 이용하여 클로렐라 소로키니아 나(Chlorella sorokiniana)를 추출함으로써 제조될 수 있다. 이렇게 획득된 상기 추출물은 박막크로마토그래피, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 또는 어떠한 다른 적절한 방법에 의해 더욱 정제될 수 있다. 하기에 일 예가 제공된다.

상기 추출물은 PPARα/γ을 효과적으로 활성화시켜, 지질 및 글루코스 대사의 변화를 야기한다. 따라서 상기 추출물은 당뇨병, 비만, 또는 이상지질혈증의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 추출물의 유효량을 필요로하는 개체에 투여하여 상기 질병 중 하나를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "유효량(effective amount)"은 개체(subject)에서 상술한 치료 효과를 수여하기 위해 요구되는 추출물의 양을 나타낸다. 유효량은 당해 기술 분야의 숙련자에게 알려진 바와 같이 투여 경로, 부형제의 사용, 및 다른 제제와의 공동 사용(co-usage) 가능성에 따라 다양할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "치료(treating)"는 표적 질병, 표적 질병의 증상, 또는 표적 질병에 대한 소인의 치료, 치유, 경감, 완화, 변화, 개선, 향상, 또는 영향을 줄 목적으로 상기 추출물을 당뇨병, 비만, 또는 이상지질혈증을 갖고 있거나 상기 질병 중 하나에 대한 소인(predisposition)을 갖는 개체에 투여하는 것을 나타낸다.

상술한 방법 중 하나를 실행하기 위해, 경구, 직장, 비경구로 흡입 스프레이 또는 삽입된 저장고(reservoir)를 통해 상술한 추출물 또는 상기 추출물과 약학적 으로 허용되는 담체가 혼합된 조성물을 필요로 하는 개체에 투여한다. 본 명세서에서 사용된 "비경구"는 피하, 피내(intracutaneous), 정맥, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내(intrasynovial), 흉골내, 경막내(intrathecal), 병변내(intralesional) 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함하는 것으로서 사용되었다.

경구 조성물은 정제, 캡슐, 에멀젼 및 수성 서스펜션, 분산(dispension) 및 용액을 포함하는 경구로 허용되는 어떠한 제형일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 통상적으로 사용되는 정제용 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제도 전형적으로 정제에 첨가될 수 있다. 캡슐 형태로 경구 투여하기 위해 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 서스펜션 또는 에멀젼을 경구 투여하는 경우, 활성 성분은 에멀션화제 또는 현탁화제와 함께 유성상(oily phase)에 부유하거나 용해될 수 있다. 바람직한 경우, 특정한 감미료, 착향료, 또는 착색제가 첨가될 수 있다.

멸균 주사 조성물(예컨데 수성 또는 유성 서스펜션)은 당해 기술 분야에 알려진 기술에 따라 적절한 분산제 또는 습윤제(예를 들어 Tween 80과 같은) 및 서스펜딩제를 사용하여 배합될 수 있다. 상기 멸균 주사 조제는 또한, 예를 들어 1,3-부탄디올 내의 용액과 같이, 비경구적으로 허용되는 비-독성 희석제 또는 용매 내의 멸균 주사 용액 또는 서스펜션일 수 있다. 사용가능한 상기 허용되는 비히클(vehicle) 및 용매는 만니톨, 물, 링거(Ringer's) 용액 및 등장의 염화나트륨 용 액 등이다. 나아가 멸균 고정 오일이 용매 또는 서스펜딩 매질(에컨데 합성 모노- 또는 디-글리세리드)로서 통상적으로 사용된다.

흡입 조성물은 제제설계(pharmaceutical formulation)의 기술 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조될 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 벤질 알콜 또는 다른 적절한 보존제, 생물학적 이용가능성의 향상을 위한 흡수 촉진제, 플루오르화 탄소, 및/또는 다른 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수 내 용액으로써 제조될 수 있다.

국부(topical) 조성물은 오일, 크림, 로션, 연고 등으로 제조될 수 있다. 상기 조성물에 대한 적절한 담체는 식물성 오일 혹은 광유, 백색 바셀린(백색 연질 파라핀), 분지쇄 지방 혹은 오일, 동물성 지방 및 고분자량 알콜(C12 초과)을 포함한다. 담체는 활성 성분이 용해될 수 있는 것이 바람직하다. 유화제, 안정제, 습윤제(humectant) 및 항산화제가 또한 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 필요한 경우 색 또는 향을 부가하는 제제도 포함될 수 있다. 나아가, 피부 투과 증진제(transdermal penetration enhancer)가 이러한 국부적인 배합물에 사용될 수 있다. 이러한 증진제의 예는 미국 특허 3,989,816 및 4,444,762에서 찾아볼 수 있다. 크림은 광유, 자가유화(self emulsifying) 밀납 및 물의 혼합으로부터 제조되는 것이 바람직하며, 상기 혼합물에는 활성성분이 소량의 아몬드 오일과 같은 오일에 용해되어 혼합되어 있다. 이러한 크림의 예는 약 40 중량부의 물, 약 20 중량부의 밀 납, 약 40 중량부의 광유 및 약 1 중량부의 아몬드 오일을 포함한다. 연고는 활성 성분의 용액을 아몬드 오일과 같은 식물성 오일에 따뜻한 연질 파라핀과 함께 혼합한 후 식혀서 제조할 수 있다. 이러한 연고의 예는 약 30 중량%의 아몬드 및 약 70 중량%의 백색 연질 파라핀을 포함한다.

약학적 조성물 내의 담체는 배합물의 활성 성분과 융화성(compatible)의 관점에서 "허용(acceptable)"되어야 하며(그리고 바람직하게는 이를 안정화할 수 있어야 하고), 치료받을 개체에 해롭지 않아야 한다. 예를 들어, 시클로덱스트린(이는 특히 추출물의 하나 이상의 활성 성분과 함께 더욱 가용성인 합성물을 형성)과 같은 가용화제가 활성 화합물의 운반을 위한 약학적 부형제로 사용될 수 있다. 다른 담체의 예는 콜로이달 실리콘 디옥사이드, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로스, 소듐 로릴 술페이트, 및 D&C Yellow #10을 포함한다.

적절한 실험실 내(in vitro) 분석을 사용하여 PPARα/γ 활성화에 대한 본 발명의 추출물 효능의 예비적인 평가를 할 수 있다. 하기에 설명된 실시예를 참고할 수 있다. 상기 추출물은 당뇨, 비만, 또는 이상지질혈증에서의 효능에 대해 추가로 시험될 수 있다. 예를 들어 질병을 앓는 동물(예컨데 마우스 모델)에 상기 추출물을 투여하고 그 치료학적 효능을 획득할 수 있다. 상기 결과에 기초하여 적절한 투여량(dosage) 범위 및 투여 경로 또한 결정될 수 있다.

상술한 설명에 의해 추가의 시행착오 없이 적절하게 본 발명을 실시할 수 있을 것이다. 따라서, 하기의 특정한 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 언급된 문헌, 특허 등은 본 명세서에 참고 문헌으로 편입된다.

실시예 1: 클로렐라 소로키니아나( Chlorella sorokiniana ) 추출물의 제조

조질의 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 수용액(W87-10)이 International Chlorella Co. Ltd., Chang-Hua Country, Taiwan, R.O.C.로부터 제공되었다. 이는 하기와 같이 제조되었다:

영양 배지를 포함하는 배양 용기에 크립토몬아델라스(Cryptomonadales)를 접종한다. 상기 영양 배지에 계속하여 공기를 제공하면서, 상기 용기를 진탕기에서 교반한다. 크립토몬아델라스를 약 1.5 개월 배양한다.

크립토몬아델라스 조류를 ALFA-LAVEL 원심분리기에 의해 수집한 후 스프레이 건조기로 건조하여 분말을 형성한다. 70kg의 물을 30 kg의 크립토몬아델라스 분말에 첨가한다. 상기 혼합물은 100℃에서 30분간 끓인다. 용해되지 않은 잔여물을 원심분리에 의해 제거하고 상층액을 수집한다. 진공 건조기를 사용하여 약 95%의 물을 상기 상층액으로부터 제거한다. 상기 남은 상층액을 여과하고 표백하여 조질의 클로렐라 소로키니아나 용액을 제조한다.

조질의 용액 100mL를 물을 이용하여 원부피의 두 배로 희석하고 EtOAc(200mL×4)로 추출한다. 유기층을 감압 하에서 농축한다. 상기 잔여물을 실리카겔 컬럼 상에 장입하고 아세톤-n-헥산 구배(30%-100%)로 용리하여 8 분획을 제공한다(CE1: 7.0mg, CE2: 17.9mg, CE3: 59.0mg, CE4: 60.9mg, CE5: 68.4mg, CE6: 115.7mg, CE7: 33.4mg, CE8: 170.2mg).

예비(preparative) TLC를 사용하여 CE3분획을 더욱 정제하고 n-헥산 내 33%의 EtOAc로 전개하여 여섯 개의 부(sub)-분획을 획득하였다(CE3-1: 5.3mg, CE3-2: 1.3mg, CE3-3: 25.6mg, CE3-4: 3.5mg, CE3-5: 15.5mg, CE3-6: 5.6mg).

8.2 mg의 CE3-3을 디클로로메탄(0.6mL)에 용해하고 메탄올(4 mL) 내 20%의 보론 트리플루라이드 에테레이트와 질소 기체 하에서 혼합하였다. 그 후 상기 용액을 봉입하고 100℃에서 5.0분간 교반하였다. 식힌 후, 상기 용액에 포화 소듐 클로라이드 수용액(10 mL)를 첨가하여 중화하고 그 후 n-헥산(2mL)으로 추출한다. 유기층을 MgSO₄로 건조하고 감압 하에서 농축하여 메틸 에스테르 생성물을 황색 오일(CE3-3M)로서 제조하였다. HP 5973 질량선택검출기, HP 7673 자동 리퀴드 샘플러, 및 Agilent DB-5MS 컬럼(30 cm ×250 ㎛; 막 두께, 0.25 ㎛)과 결합된 Hewlett-Packard 6890 기체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 CE3-3M 조성물을 분 석하였다. 유속 1mL/분의 헬륨을 운반 기체로 사용하였다. 상기 입구 온도는 250℃로 유지하였다. 시료 (1μL)를 1:50의 분할비(spilt ratio)로 주입하였다. 초기 오븐 온도는 3분 동안 120 ℃도 유지하고 10℃/분의 속도로 180℃까지 승온하고(1 분간 유지) 그 후 2℃/분의 속도로 210℃까지 승온하여(5분간 유지) 총 30분간 실행하였다. 70eV 이온화 에너지 및 230℃ MS 공급원 온도에서 질량 스펙트라(mass spectra)가 50-550 amu 범위에 걸쳐 기록되었다. 자료 수집 및 적분은 HP Chem Station 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 각 성분의 양은 커런트(current) 스펙트로그램 총 이온 피크 영역을 적분하고 퍼센트로 변경하여 결정하였다. 상기 성분은 이들의 체류시간과 상업 표준 화합물 및 National Institude of Standards And Technology MS Search 프로그램을 비교하여 결정하였다.

10 개의 지방산이 GC 크로마토그램으로부터 관찰되었으며 그 중 7 개가 GC-MS 라이브러리 서치에 의해 확인되었다. 이러한 모든 지방산의 상대적인 퍼센트 및 체류 시간을 하기 표에 나타내었다:

번호	화합물 이름		체류 시간(분)	상대 %
1	미리스트산 [테트라데카노산]	C14:0	11.9	1.7
2	헥사데카디에노산	C16:2	15.6	4.3
3	헥사데케노산	C16:1	15.9	6.0
4	팔미톨레산[(Z)-9-헥사데케노산]	C16:1	15.9	10.1
5	팔미트산[헥사데카노산]	C16:0	16.6	43.6
6	리놀레산[(Z),(Z)-9-12-옥타데카디에노산]	C18:2	21.5	8.8
7	리놀렌산 [(Z),(Z),(Z)-9-,12-,15-옥타데카디에노산]	C18:3	21.7	4.0
8	올레산[(Z)-9-옥타데케노산]	C18:1	21.8	10.0
9	옥타데케노산	C18:1	22.0	5.9
10	스테아르산[옥타데카노산]	C18:0	22.7	2.6

실시예 2: 생물학적 분석(Bioasay)

하기의 분석에서 PPARα/γ 활성에 대한 CE3 및 CE3-3의 효능을 연구하였다.

PPARγ 리간드 결합 분석

글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질로서 hPPARγ의 리간드 결합 도메인을 대장균(E. coli)에서 발현하였다. 글루타티온-세파로스(Amersham Biosciences, NJ)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 상기 재조합 단백질을 친화도 정제(affinity purification)에 의해 분리하였다. 최종 농도 약 5nM에서 상기 재조합 GST-hPPARγ^LBD표본을 사용하였다. 염소 항-GST 항체(카탈로그 번호 27-4577-01, Amersham Biosciences, NJ)를 1:2000의 희석에서 사용하였다. 단백질 A-이트륨 실리케이트 섬광근접접촉법(SPA; scintillation proximity assay) 비드(bead)(카탈로그 번호 RPN143, Amersham Biosciences, NJ)를 10mM Tris-Cl, pH 7.2, 1mM EDTA, 10%(w/v) 글리세롤, 10mM 소듐 몰리브데이트 1mM 디티오트레이톨, 0.5mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 2㎍/mL 벤즈아미딘, 및 0.01% 소듐 아지드를 포함하는 50mL의 분석 완충제에 현탁하였다.

시료 추출물을 DMSO에 용해하여 최종 농도 5㎍/mL를 획득하였다. 방사선 표지된 PPAR 리간드 [³H] 로지글리타존(60 Ci/mmol)(American Radiolabeled Chemicals, MO)을 에탄올에 425-배 희석하여 최종 농도 7.8 nM에서 사용하였다.

96-웰 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)(카탈로그 번호 6005290, Packard Instrument, CT)에 순차적으로 GST-PPARγ^LBD, 염소 항-GST 항체, 현탁된 단백질 A-이트륨 실리케이트 섬광근접접촉법 비드, 상기 시료 추출물, 및 상기 희석된 [³H] 로지글리타존 용액(각각 20μL)을 첨가하였다. 상기 플레이트를 부드럽게 교반하면서 4℃에서 인큐베이션하였다. 24시간 후 Topcount^® Microplate Scintillation & Luminescence Counter(Packard Instrument Co., Inc, USA)를 사용하여 방사능 수준을 정량화하였다.

그 결과 CE3 및 CE3-3 모두 강력한 결합 활성을 갖는 것으로 나타났다: CE3이 PPARγ^LBD에 결합한 [³H] 로지글리타존의 >95% 의 이동을 나타낸 반면, CE3-3은 99.8% 의 [³H] 로지글리타존 이동을 나타냈다. 3회를 한 세트로 하는 8 개의 데이타 포인트를 갖는 용량반응곡선을 사용하여 PPARγ^LBD 에 대한 IC₅₀ 값을 결정하였다. CE3 및 CE3-3의 상기 IC₅₀ 값은 각각 2.7㎍/mL 및 1.6㎍/mL였다.

PPARα 차콜(Charcoal) 결합 분석

J Med Chem 2005, 48:8194-208, Mahindroo, 등., J Med Chem 2006, 49:1212- 6, Mahindroo N., 등.; J Med Chem 2006, 49:6421-6424, Mahindroo N., 등.; J Med Chem 2006, 49:2703-12, Lu, I.L. 등에 설명된 것과 유사한 방식으로 차콜 결합 분석을 수행하였다.

TEGM 완충제(10mM Tris, pH 7.2, 1mM EDTA, 10% 글리세롤, 7 μL/100mL의 β-머캅토에탄올, 10mM 소듐 몰리브데이트, 1mM 디티오트레이톨, 2μL/mL 벤즈아미드, 및 0.5mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드) 및 2.5 nM[³M]L-783,483(79μ Ci/mmol, Division of Biotechnology and Pharmaceutical research, National Health Research Institutes, Taiwan에 의해 합성 됨)를 포함하는 분석 용액을, 시료 추출물을 포함하여 혹은 포함하지 않고, 제조하였다. 최종 부피 300 μL에서 상기 분석 용액을 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 비결합 리간드를 얼음에서 200μL의 덱스트란/젤라틴-코팅된 차콜과 함께 10분간 인큐베이션 하여 제거하였다. 4℃, 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액의 방사능을 TRI-CARB 2100TR^® 액체 신틸레이션 분석기에서 계산하였다.

PPARα^LBD 에 대한 [³H]L-783,483 결합의 이동에 대한 IC₅₀ 값은 3회를 한 세트로 하는 6 개의 데이타 포인트를 갖는 용량반응곡선을 사용하여 결정하였다. CE3 및 CE3-3의 상기 IC₅₀ 값은 각각 5.0㎍/mL 및 2.3㎍/mL였다.

PPAR 전사 활성 분석

인간 간세포암(hepatoma) Huh7 세포주를 37℃의 가습된 5% CO₂ 분위기에서 10% FBS(fatal bovine serum), 100 units/mL 페니실린 G, 100 mg/mL 스트렙토마이신 술페이트, 및 0.25 ㎍/mL 암포테리신 B를 포함하는 고 글루코스 Dulbeco's 개질된 Eagle's 배지(DMEM) 내 24-웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다(5×10⁴ 세포/웰). 24 시간 후 제조사의 지시에 따라 Fugene 6^® 트랜스펙션 시약(Roche, Germany)을 사용하여 프랜스펙션(transfection)을 수행하였다. 특히, 트랜스펙션 혼합물은 각 웰에 대한 트랜스펙션 내부 대조군으로서 0.5 μl의 Fugene 6, 0.05 ㎍의 pGAL4-PPARγ^LBD 플라스미드, 0.14 ㎍의 pG5-TK-Luc 리포터, 및 0.25ng의 pRL-SV40 Renilla 루시퍼라제 플라스미드를 첨가하여 제조하였다. Huh 7세포를 하룻 밤 동안 상기 트랜스펙션 혼합물 내에서 5% CO₂ 하의 37℃에서 인큐베이션히였다. 그 후 상기 세포를 다양한 농도의 시료 추출물 DMSO 용액의 존재 하에서 24시간 동안 새로운 고-글루코스 DMEM 에서 인큐베이션하였다. 대조군 세포를 DMSO에서 인큐베이션하였다.

24시간 후, 상기 세포를 수집하고 제조사의 지시에 따라 Passive^® Lysis Buffer(Promega, WI)을 사용하여 상기 세포 용해물을 제조하였다. Dual-Luciferase^® Reporter Assay kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 세포 추출물 내의 루시퍼라제 활성을 결정하고 SIRIUS-0 루미노미터(Berthold detection systems, Pforzheim, Germany)에서 계산하였다. 즉, 50 μL의 Luciferase Assay Reagent II(LAR II)를 5μL의 세포 용해물을 포함하는 바이알에 첨가하고 상기 혼합물의 Firefly Luciferase 활성을 측정한다. 50 μL의 Stop&Glo^® Reagent를 상기 바이알에 첨가하고 그 후 상기 혼합물의 Renilla Luciferase 활성을 측정하였다. 상기 분석에서 사용된 가장 높은 DMSO 농도는 0.1%였으며, 이는 전이활성(transactivation)에 영향이 없는 것으로 나타났다. 이러한 모든 결과에서, PPAR 리간드 로시글리타존(2μM)에 의한 활성화를 양성 대조군으로 사용하였다. 상기 전이활성 결과를 Renilla Luciferase 신호에 대한 Firefly Luciferase 신호의 비율로 나타내었다.

CE3는 양성 대조군의 55.6%의 최대 PPARγ 활성화를 획득하였고 CE3-3은 양성 대조군의 63.4%의 최대 PPARγ 활성화를 획득하였다.

지방전구세포(preadipocyte) 분화 분석

컨플루언트(confluent) 지방전구세포 3T3-L1 세포를 10% FCS(fetal calf serum), 100 units/mL 페니실린G, 10 μg/mL 스트렙토마이신 술페이트, 및 150 nM 인슐린을 포함하는 DMEM에서, 시험 분획의 부존재 또는 존재 하에서, 3일간 37℃의 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 상기 세포는 지방세포(adipocyte)가 발현할 때까지 이러한 조건에 두었으며(약 9일), 배지는 이틀마다 교체하였다. 지방세포로 분화된 세포는 Toxicol Appl Pharmacol 2000, 168, 25-35, Trouba K.J. 등.,에 설명된 바와 같이 Oil Red-O(Sigma)로 염색하였다. 즉, 세포를 10%의 포르말린에 최소 1 시간동안 고정하고 Oil Red-O에 2 시간동안 담근 후 물로 완전히 헹군다. 그 후 시료를 32℃에서 인큐베이션하여 건조한다.

CE3 및 CE3-3는 3T3-L1 지방전구세포의 보통의(moderate) 지방세포 분화 활성을 나타냈다.

다른 구현들

본 발명의 여러 구현들이 설명되었으나, 본 발명의 사상 및 견지를 벗어나지 않는 다양한 변형이 이루어질 수 있다.

본 발명의 하나 또는 그 이상의 구현이 첨부된 도면 및 설명에 나타나있다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 본 명세서의 설명 및 도면 그리고 청구항으로부터 명백할 것이다.

Claims

추출물의 건조 중량을 기준으로, 0.1% 내지 5% 미리스트산, 10% 내지 60% 팔미트산, 2% 내지 15% 팔미톨레산, 2% 내지 15%, 올레산, 2% 내지 15%,리놀레산, 0.8% 내지 6% 리놀렌산, 및 0.5% 내지 5%의 스테아르산을 포함하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나(Chlorella sorokinana) 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 미리스트산, 상기 팔미트산, 상기 팔미톨레산, 상기 올레산, 상기 리놀레산, 상기 리놀렌산, 및 상기 스테아르산은 각각 추출물 건조 중량의 0.5% 내지 4%, 15% 내지 50%, 3.5% 내지 12%, 3.5% 내지 12%, 3% 내지 12%, 1.2% 내지 5%, 및 0.8% 내지 4%를 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 2항에 있어서, 상기 미리스트산, 상기 팔미트산, 상기 팔미톨레산, 상기 올레산, 상기 리놀레산, 상기 리놀렌산, 및 상기 스테아르산은 각각 추출물 건조 중량의 0.7% 내지 1.7%, 19.2% 내지 43.6%, 4.4% 내지 10.1%, 4.4% 내지 10.0, 3.9% 내지 8.8%, 1.8% 내지 4.0%, 및 1.1% 내지 2.6%를 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 1항에 있어서, 추출물 건조 중량을 기준으로, 헥사데카디에노산(hexadecadienoic acid) 0.8% 내지 6%, 헥사데케노산(hexadecenoic acid) 1.2% 내지 8%, 및 옥타데케노산(octadecenoic acid)1.2% 내지 8%을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 4항에 있어서, 상기 헥사데카디에노산, 상기 헥사데케노산, 및 상기 옥타데케노산은 각각 상기 추출물 건조 중량의 1.2% 내지 5%, 2% 내지 7%, 및 2% 내지 7%를 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키니아나 추출물.
제 5항에 있어서, 상기 헥사데카디에노산, 상기 헥사데케노산, 및 상기 옥타데케노산은 각각 상기 추출물 건조 중량의 1.9% 내지 4.3%, 2.6% 내지 6.0, 및 2.6% 내지 5.9%를 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 2항에 있어서, 추출물 건조 중량을 기준으로, 헥사데카디에노산(hexadecadienoic acid) 0.8% 내지 6%, 헥사데케노산(hexadecenoic acid) 1.2% 내지 8%, 및 옥타데케노산(octadecenoic acid) 1.2% 내지 8%을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 7항에 있어서, 상기 헥사데카디에노산, 상기 헥사데케노산, 및 상기 옥타데케노산은 각각 상기 추출물 건조 중량의 1.2% 내지 5%, 2% 내지 7%, 및 2% 내지 7%를 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 8항에 있어서, 상기 헥사데카디에노산, 상기 헥사데케노산, 및 상기 옥타데케노산은 각각 상기 추출물 건조 중량의 1.9% 내지 4.3%, 2.6% 내지 6.0, 및 2.6% 내지 5.9%를 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 3항에 있어서, 추출물 건조 중량을 기준으로, 헥사데카디에노산(hexadecadienoic acid) 0.8% 내지 6%, 헥사데케노산(hexadecenoic acid) 1.2% 내지 8%, 및 옥타데케노산(octadecenoic acid) 1.2% 내지 8%을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 10항에 있어서, 상기 헥사데카디에노산, 상기 헥사데케노산, 및 상기 옥타데케노산은 각각 상기 추출물 건조 중량의 1.2% 내지 5%, 2% 내지 7%, 및 2% 내지 7%를 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 11항에 있어서, 상기 헥사데카디에노산, 상기 헥사데케노산, 및 상기 옥타데케노산은 각각 상기 추출물 건조 중량의 1.9% 내지 4.3%, 2.6% 내지 6.0, 및 2.6% 내지 5.9%를 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 클로렐라 소로키나나 추출물.
제 1항의 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 약학 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 추출물은 추출물 건조 중량을 기준으로, 미리스트산 0.5% 내지 4%, 팔미트산 15% 내지 50%, 팔미톨레산 3.5% 내지 12%, 올레산 3.5% 내지 12%, 리놀레산 3% 내지 12%, 리놀렌산 1.2% 내지 5%, 및 스테아르산 0.8% 내지 4%을 포함하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 약학 조성물.
제 14항에 있어서, 상기 미리스트산, 상기 팔미트산, 상기 팔미톨레산, 상기 올레산, 상기 리놀레산, 상기 리놀렌산, 및 상기 스테아르산은 각각 추출물 건조 중량의 0.7% 내지 1.7%, 19.2% 내지 43.6%, 4.4% 내지 10.1%, 4.4% 내지 10.0, 3.9% 내지 8.8%, 1.8% 내지 4.0%, 및 1.1% 내지 2.6%를 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 약학 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 추출물은 추출물 건조 중량을 기준으로 헥사데카디에노산(hexadecadienoic acid) 0.8% 내지 6%, 헥사데케노산(hexadecenoic acid) 1.2% 내지 8%, 및 옥타데케노산(octadecenoic acid) 1.2% 내지 8%을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 약학 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 헥사데카디에노산, 상기 헥사데케노산, 및 상기 옥타데케노산은 상기 추출물 건조 중량의 1.2% 내지 5%, 2% 내지 7%, 및 2% 내지 7%를 각각 구성하는 것을 특징으로 하는, PPARα 및 PPARγ의 활성화에 의한 당뇨병, 비만, 및 이상지질혈증(dyslipidaemia)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병 치료용 약학 조성물.
질병 치료가 요구되는 인간을 제외한 동물에게 제 1항의 추출물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 질병은 당뇨병, 비만, 또는 이상지질혈증(dyslipidaemia)인 것을 특징으로 하는 질병의 치료 방법.
제 18항에 있어서, 상기 질병은 당뇨병인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 18항에 있어서, 상기 질병은 비만인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 18항에 있어서, 상기 질병은 이상지질혈증인 것을 특징으로 하는 치료 방법.