CN101444542B - 引藻萃取物 - Google Patents

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Abstract

本发明是有关于一种引藻萃取物，其包含肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、油酸、亚麻油酸、次亚麻油酸、及硬脂酸。本发明亦有关于此萃取物治疗糖尿病、肥胖及血脂异常的用途。

Description

引藻萃取物
技术领域
本发明是关于一种引藻(Chlorella sorokiniana)萃取物，尤其是指一种适用于治疗糖尿病、肥胖及血脂异常的引藻萃取物。
背景技术
过氧化体增生剂活化受体(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)属于核受体家族，其可控制许多细胞功能及代谢过程，其中如PPARα、PPARδ、及PPARγ等三种哺乳动物的PPARs已被鉴定确认，(参考Lee C.H.et al.，Endocrinology2003，144：2201-7)。关于活化方面，PPARs会触发一连串转录事件，导致脂质及葡萄糖的代谢改变(例如参考WillsonT.M.et al.，J Med Chem2000，43，527-50；及Moraes L.A.et al.，PharmacolTher.2006，110，371-85)。
以PPARs在脂质及葡萄糖代谢上所扮演的角色来看，如PPARs的于第二型糖尿病、肥胖、C型肝炎、血脂异常、冠状动脉心脏病、发炎性疾病及癌症等疾病的重要性，则PPARs可为以上相关疾病具发展性的治疗标的。举例而言，作为PPARγ促效剂的格列酮(glitazones)，则已经用于治疗第二型糖尿病。另外例如作为PPARα促效剂的纤维酸酯(fibrates)，其可作为有效降低血液中三酸甘油含量的药物。不过，大部分PPAR类的治疗剂，其功效有限且具有明显的副作用。
因此，仍需发展出可调控PPAR活性的药物，以更为有效地控制脂质及葡萄糖的代谢。
发明内容
本发明的目的在于提供一种引藻(单细胞嗜温性绿藻)萃取物，其能够有效的活化PPARα及PPARγ。因此本发明一方面关于一种萃取物，其包含肉豆蔻酸(myristic acid)、棕榈酸(palmitic acid)、棕榈烯酸(palmitoleic acid)、油酸(oleic acid)、亚麻油酸(linoleic acid)、次亚麻油酸(linolenic acid)、及硬脂酸(stearic acid)，其中含量分别为萃取物干重的0.1％至5％、10％至60％、2％至15％、2％至15％、2％至15％、0.8％至6％、及0.5％至5％。其中较佳而言，肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、油酸、亚麻油酸、次亚麻油酸、及硬脂酸的含量分别为萃取物干重的0.5％至4％、15％至50％、3.5％至12％、3.5％至12％、3％至12％、1.2％至5％、及0.8％至4％。然而，在萃取物中依上述次序的七种成分，其含量更佳分别为萃取物干重的0.7％至1.7％、19.2％至43.6％、4.4％至10.1％、4.4％至10.0％、3.9％至8.8％、1.8％至4.0％、及1.1％至2.6％。
该萃取物可还包含十六碳二烯酸(hexadecadienoic acid)、十六碳烯酸(hexadecenoic acid)、及十八碳烯酸(octadecenoic acid)，其含量分别为萃取物干重的0.8％至6％、1.2％至8％、及1.2％至8％。在一实施例中，十六碳二烯酸、十六碳烯酸、及十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.2％至5％、2％至7％、及2％至7％。举例而言，在萃取物中的十六碳二烯酸、十六碳烯酸、及十八碳烯酸，其含量也可分别为萃取物干重的1.9％至4.3％、2.6％至6.0％、及2.6％至5.9％。
本发明另一方面关于一种治疗糖尿病、肥胖或血脂异常的方法，此方法包含投递有效剂量的上述萃取物给所需主体。
含上述萃取物及医药上可接受的载体的医药组成物、使用这种组成物治疗糖尿病、肥胖或血脂异常的用途及使用此种组成物制出治疗这些疾病的药剂的用途，也涵盖在本发明范围内。
以下列举几个本发明实施例的详细内容，由权利要求范围及下述说明，本发明其它特征、目标及优点将更臻明确。
具体实施方式
本发明萃取物是利用醋酸乙酯萃取引藻(Chlorella sorokiniana)的方式来进行制备，以此所得的萃取物可再以薄层层析法(thin layerchromatography)、快速管柱层析法(flash column chromatography)、高效液相层析法(high performance liquid chromatography)或任何其它合适的方法进行纯化。以下将提出一个实际实施例。
该萃取物能够有效活化PPRAα/γ，造成脂质及葡萄糖代谢改变，所以可以用于治疗糖尿病、肥胖或血脂异常。因此，本发明关于一种治疗上述其中丨疾病的方法，由投递有效剂量的萃取物给所需主体。「有效剂量」一词是指能够对于该主体产生上述治疗效果的萃取物剂量。如同本领域技术人员所知，有效剂量可能会依投药的途径、赋形剂的使用、以及与其它药剂共同使用而改变。「治疗」一词是指以治愈(cure)、疗伤(heal)、减轻(alleviate)、缓和(relieve)、改变(alter)、补救(remedy)、改良(ameliorate)、改善(improve)、或影响(affect)目标疾病、目标疾病的症状、或朝目标疾病发展等为目的，投递该萃取物给具有糖尿病、肥胖或血脂异常、或具有倾向其中一疾病发展的主体。
为实现上述其中一方法，可由口服、直肠、肠外、喷雾吸入、或经由植入式贮藏器，将上述萃取物的单独组成物或该萃取物与医药上可接受载体的混合组成物投递给所需主体。于此所使用的「肠外」一词，包含皮下(subcutaneous)注射、皮内(intracutaneous)注射、静脉(intravenous)注射、肌肉(intramuscular)注射、关节内(intraarticular)注射、动脉(intraarterial)注射、滑膜内(intrasynovial)注射、胸骨内(intrasternal)注射、鞘内(intrathecal)注射、病灶内(intralesional)注射和颅内(intracranial)注射或输液技术(infusiontechniques)。
口服组成物为任何口服上可接受的药剂形式，可包含但不限于药片、胶囊、乳剂及水悬浮液、分散液及溶液。通常用于药片的载体包含乳糖及玉米淀粉，一般药片也会添加如硬脂酸镁的润滑剂。若要以胶囊形式口服投药，可使用的稀释剂包括乳糖及干玉米淀粉。当水悬浮液或乳化液以口服方式投药，则有效成分会悬浮或溶解于结合乳化剂或悬浮剂的油相中。如果需要的话，可添加一些甜味剂、香料或着色剂。
可根据本领域已知技术，使用适合的分散剂或湿润剂(例如Tween80)及悬浮剂，配制无菌可注射式的组成物(如水或油质悬浮液)。无菌可注射式的配制液，也可为肠外上可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射式溶液或悬浮液，举例如1，3-丁二醇溶液。在可接受载体及溶剂间，能使用者为甘露醇、水、林格氏液及等渗透的氯化钠溶液。此外，公知上使用无菌固定油作为溶剂或悬浮基质(如合成的单-或双-甘油酯)。
可根据医药配制领域的已知技术，制备出吸入组成物，且可添加苯甲醇或其它合适的防腐剂、加强生物可利用性的吸收促进剂、氟碳化合物、及/或其它本领域已知的稳定剂或分散剂，以制备成盐水溶液。
局部组成物可配置成油状、霜状、乳液状、油膏状及类似形式，而适用于此组成物的载体包括植物性或矿物性油、白矿脂(白色软石蜡)、支链脂肪或油脂、动物性脂肪及高分子量醇类(大于C12)，较佳的载体为有效成分可溶于其中者。如果需要的话，也可包含乳化剂、安定剂、湿润剂与抗氧化剂，以及引入颜色或香味的药剂。此外，这些局部性的配方中也可添加透皮加强剂，这类透皮加强剂的例子则记载于美国专利第3,989,816及4,444,762号。霜剂较佳配制方式，是将矿物油、自乳化性蜂蜡及水的混合物，与溶于少量的油质(如杏仁油)中的有效成分进行掺合。此类霜剂举例包含约40份水、约20份蜂蜡、约40份矿物油及约1份杏仁油。油膏剂可将植物油(如杏仁油)中的有效成分与温软石蜡混合，而后冷却混合物的方式配制。这类油膏剂举例可包含约30重量百分比杏仁油及约70重量百分比的白色软石蜡。
医药组成物的载体必须为「可接受的」，亦即可与配方中的有效成分(较佳者为可稳定有效成分)兼容，且对受治疗的主体无害。举例而言，如环糊精(其可与萃取物中一至多个活性化合物形成特定且更为稳定的错合物)的稳定剂，则可作为用来投递活性化合物的医药赋形剂。其它载体的例子包括胶状二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、月桂硫酸钠、及D&G黄色#10。
合适的体外分析可用于预先估量此发明萃取物对于PPARα/γ的效率，参见以下所述的实施例，更可检查萃取物对于治疗糖尿病、肥胖或血脂异常的效果。例如投递萃取物给具有疾病的动物(如小鼠试验模型)，而后取得其治疗效果，基于此结果，则可决定适当的剂量范围及投药途径。
不需额外详加解释，相信上述的描述已可适当的实施本发明，因此以下具体实施例仅为说明用，并非用于限制诸如此类的其余揭露范围。此所引载包含专利的所有公开物，则完整并入以供参酌。
实施例1：制备引藻萃取物
引藻(Chlorella sorokiniana)粗萃水溶液(W87-10)由中华民国台湾彰化县国际绿藻有限公司所提供。其制备方式如下：
将引藻(Cryptomonadales)接种于含营养基质的培养瓶中，持续在营养基质中通气，同时以震荡器震荡培养瓶，培养引藻约1.5个月。
以ALFA-LAVEL离心机收集引藻(Cryptomonadales algae)，并以喷雾干燥机干燥形成粉末。将70kg的水加入30kg的引藻粉末，100℃下煮沸30分钟后，以离心移去未溶解的残渣并收集上清液，使用真空干燥机自上清液移除约95％的水分，过滤剩下的上清液，脱色后得到引藻粗萃溶液。
将100mL的粗萃溶液加水稀释，直至成为原始体积的两倍，并以EtOAc进行萃取(200mL×4)，然后减压浓缩有机层，残余物装填于硅胶管柱，以丙同-正己烷梯度(30％-100％)流洗，收集CE1-CE8等8个分液，每一分液的干重经测定后分别为：CE1：7.0mg、CE2：17.9mg、CE3：59.0mg、CE4：60.9mg、CE5：68.4mg、CE6：115.7mg、CE7：33.4mg及CE8：170.2mg。
再使用制备式的TLC纯化分液CE3，利用33％EtOAc的正己烷溶液展开，可获得6个CE3-1-CE3-8等6个
次分液，每一分液的干重经测定后分别为：CE3-1：5.3mg、CE3-2：1.3mg、CE3-3：25.6mg、CE3-4：3.5mg、CE3-5：15.5mg及CE3-6：5.6mg。
于氮气下将8.2mg的CE3-3溶解在二氯甲烷(0.6mL)，并与20％三氟化硼乙醚的甲醇溶液(4mL)混合后，密封溶液且于100℃下搅伴5分钟。待冷却后，添加饱和氯化钠水溶液(10mL)以中和溶液，然后以正己烷(2mL)萃取。使用MgSO4干燥有机层，并减压浓缩有机层以得到黄色油状甲酯产物(CE3-3M)。使用气相层析系统(Hewlett-Packard 6890 gas chromatographysystem)搭配质谱选择侦测仪(HP5973mass selective detector)、自动液态样品取样器(HP7673automatic liquid sampler)及质谱管柱(Agilent DB-5MScolumn，30cm×250μm，0.25μm膜厚)分析CE3-3M组成物，载气使用流速为1mL/min的氦气。把进口温度维持在250℃，将样本(1μL)以1:50的分流比注入。温箱的起始温度维持在120℃持续3分钟，接着设定以10℃/min的速度(持续1分钟)增加至180℃，然后以2℃/min的速度(持续5分钟)增加至210℃，全部运作时间为30分钟。在70eV游离能及230℃MS离子源温度下，记录50-500amu范围的质谱，并以化学工作站软件(HP Chem Stationsoftware)收集及整合数据，透过整合全部离子流光谱图的讯号峰面积，并转成百分比来决定每一成份的含量，同时将该些成分的延迟时间与商业标准品及国家技术标准局的MS搜寻引擎(National Institute of Standards AndTechnology MS Search program)进行比较，以鉴定出各成分的身分。
由GC层析结果可观察到10种脂肪酸，且由GC-MS搜寻库中可确定其中7种。下表显示全部脂肪酸的相对比例及延迟时间：
Figure G2008101729348D00061
实施例2：生物性分析
透过以下分析，研究CE3及CE3-3对于PPARα/γ的活化效果。
PPARγ配体结合分析
在E.coli中以麸胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase，GST)融合蛋白的方式表现出hPPARγ的配体结合区域后，使用麸胱甘肽-琼脂糖胶体(Amersham Biosciences，NJ)透过亲合纯化法根据操作指南分离出重组蛋白。制备出的GST-hPPARγLBD重组蛋白，最终使用浓度约为5nM，而山羊抗-GST抗体(商品编号27-4577-01，Amersham Biosciences，NJ)则以1:2000稀释使用。将蛋白A-硅酸钇闪烁迫近分析微球(Protein A-yttrium silicatescintillation proximity assay beads)悬浮于含有10mM Tris-Cl，pH7.2、1mMEDTA、10％(w/v)甘油、10mM钼酸钠、1mM二硫苏糖醇、0.5mM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)、2μg/mL苯甲脒(benzamidine)、及0.01％迭氮化钠(sodium azide)的50mL分析缓冲液中。
样本萃取物溶于DMSO使其最终浓度为5μg/mL，并使用乙醇将放射标定的PPAR配体[3H]罗格列酮(rosiglitazone，60Ci/mmol，AmericanRadiolabeled Chemicals，MO)稀释425倍，最终使用浓度为7.8nM。
依序于96-孔微滴定盘(商品编号6005290，Packard Instrument，CT)加入GST-PPARγLBD、山羊抗-GST抗体、均匀悬浮的蛋白A-硅酸钇闪烁迫近分析微球、样本萃取物、及经稀释的[3H]罗格列酮溶液(每个20μL)后，于4℃下轻微震荡培养。待24小时后，使用微盘闪烁磷光计数器(
Figure G2008101729348D0007132432QIETU
Microplate Scintillation & Luminescence Counter，Packard Instrument Co.，Inc，USA)定出放射量。
结果显示，CE3及CE3-3两者皆具结合效力，其中显示对于结合于PPARγLBD的[3H]罗格列酮，CE3具有大于95％的置换效果，而CE3-3具有大于99.8％的置换效果。对于PPARγLBD的IC50值，则使用8个3重复数据的剂量反应曲线计算，而CE3及CE3-3的IC50值分别为2.7μg/mL及1.6μg/mL。
PPARα碳末结合分析(PPARαCharcoal Binding Assay)
碳末结合分析的方法相似于Mahindroo，et al.，J Med Chem2005，48：8194-208；Mahindroo N.et al.，J Med Chem2006，49：1212-6；Mahindroo N.et al.，J Med Chem2006，49：6421-6424；Lu，I.L et al.，J Med Chem2006，49：2703-12等所描述的方法。
配制具有或不具有样本萃取液的含TEGM缓冲液(10mM Tris，pH7.2、1mM EDTA、10％甘油、7μL/100mL的β-巯乙醇、10mM钼酸钠、1mM二硫苏糖醇、2μg/mL苯甲脒、及0.5mM苯甲基磺酰氟)及2.5nM[3H]L-783，483(79μCi/mmol，由台湾国家卫生研究院生物技术与药物研究组合成)的分析溶液，以最终体积为300μL在24℃下培养24小时后，与200μL的糊精/明胶层覆的碳末在冰上培养10分钟，以移除未结合的配体。以3000rpm于4℃下离心10分钟后，在液体闪烁计数器(TRI-CARB 
Figure G2008101729348D0008132523QIETU
liquidscintillation analyzer)中计算上清液的放射性。
取代[3H]L-783，483结合于PPARαLBD的IC50值，则6个3重复数据的剂量反应曲线计算，其中CE3及CE3-3的IC50值分别为5.0μg/mL及2.3μg/mL。
PPAR转录活性分析
在37℃且5％CO2的潮湿环境下，24孔细胞培养盘中具有含有10％胎牛血清、100单位/mL青霉素G、100mg/mL硫酸链霉素、及0.25μg/mL双性霉素B(amphotericin B)的高葡萄糖含量DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′smedium)，于其中培养人类肝癌Huh7细胞株(5×104个细胞/孔)。待24小时后，根据操作指南使用转染剂(Fugene 
Figure G2008101729348D0008132549QIETU
 transfection reagent，Roche，Germany)进行转染。具体而言，将0.5mL的转染剂、0.05μg的pGAL4-PPARγLBD质体、0.14μg的pG5-TK-Luc报导子、及0.25ng的pRL-SV40水母荧光素酶质体(Renilla luciferase plasmid)的转染混合液，作为转染的内控制组，添加至培养盘的每个孔中，并于37℃且5％CO2的环境下，将Huh7细胞在转染混合液中培养过夜。而后，在含有不同浓度样本萃取物DMSO溶液的新鲜高葡萄糖含量DMEM中，培养细胞24小时，而对照组细胞则培养在DMSO。
待24小时后收集细胞，遵照操作指南使用细胞溶解缓冲液(Lysis Buffer，Promega，WI)制出细胞溶解液，再使用双荧光素酶分析组(Dual-
Figure G2008101729348D0008132622QIETU
Reporter Assay kit，Promega，Madison，WI)评估，并以冷光仪(SIRIUS-0luminometer，Berthold detection systems，Pforzheim，Germany)计算荧光素酶的活性。简单地说，将50μL的荧光素酶分析剂(Luciferase Assay Reagent II，LARII)加入含5μL的细胞溶解产物的试瓶中，测量混合液的萤火虫荧光素酶活性，而后加入50μL的反应中止剂(Stop&
Figure G2008101729348D0008132639QIETU
 Reagent)，并测量混合液的水母荧光素酶活性。分析中使用的DMSO，最高浓度为0.1％，其对于激活作用的活性没有影响。在全部的这些结果中，由PPAR配体罗格列酮(2μM)所活化者视为正反应对照组，激活作用的结果以萤火虫荧光素酶讯号/水母荧光素酶讯号的比例表示。
CE3达到正反应对照组PPARγ最大活化的55.6％，而CE3-3达到正反应对照组PPARγ最大活化的63.4％。
前脂肪细胞分化分析(Preadipocyte Differentiation Assay)
在含有10％胎小牛血清、100单位/mL青霉素G、100mg/mL硫酸链霉素、及150nM胰岛素的DMEM中，添加或未添加测试分划，于37℃且5％CO2的潮湿环境下培养簇集脂肪细胞3T3-L1细胞3天。培养基每两天更换，持续保持细胞在此状态下，直到脂肪细胞出现为止(约9天)。如Trouba K.J.et al.，.Toxicol Appl Pharmacol2000，168，25-35所述，以油红-O(Oil Red-O，Sigma)染色分化成脂肪细胞的细胞。简单地讲，在10％福尔马林中至少固定1小时，然后浸入油红-O染色2小时，再以水彻底冲洗，于32℃下干燥样本。
CE3及CE3-3对于3T3-L1前脂肪细胞展现出中度成脂分化的活性。
其它实施例
本发明已经描述出一些实施例，不过应可了解到在不背离本发明精神及范畴的前提下，能够进行各种修改。据此，其它实施例也落入本发明的权利要求范畴中。
上述实施例仅系为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专利范围所述为准，而非仅限于上述实施例。

Claims (17)

1.一种引藻萃取物，包括：肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、油酸、亚麻油酸、次亚麻油酸、硬脂酸、十六碳二烯酸、十六碳烯酸及十八碳烯酸；其中，该肉豆蔻酸、该棕榈酸、该棕榈烯酸、该油酸、该亚麻油酸、该次亚麻油酸、该硬脂酸、该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的0.1％至5％、10％至60％、2％至15％、2％至15％、2％至15％、0.8％至6％、0.5％至5％、0.8％至6％、1.2％至8％及1.2％至8％。
2.如权利要求1所述的萃取物，其中，该肉豆蔻酸、该棕榈酸、该棕榈烯酸、该油酸、该亚麻油酸、该次亚麻油酸、及该硬脂酸的含量分别为萃取物干重的0.5％至4％、15％至50％、3.5％至12％、3.5％至12％、3％至12％、1.2％至5％、及0.8％至4％。
3.如权利要求2所述的萃取物，其中，该肉豆蔻酸、该棕榈酸、该棕榈烯酸、该油酸、该亚麻油酸、该次亚麻油酸、及该硬脂酸的含量分别为萃取物干重的0.7％至1.7％、19.2％至43.6％、4.4％至10.1％、4.4％至10.0％、3.9％至8.8％、1.8％至4.0％、及1.1％至2.6％。
4.如权利要求1所述的萃取物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸、及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.2％至5％、2％至7％、及2％至7％。
5.如权利要求1所述的萃取物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸、及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.9％至4.3％、2.6％至6.0％、及2.6％至5.9％。
6.如权利要求2所述的萃取物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸、及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.2％至5％、2％至7％、及2％至7％。
7.如权利要求6所述的萃取物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸、及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.9％至4.3％、2.6％至6.0％、及2.6％至5.9％。
8.如权利要求3所述的萃取物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸、及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.2％至5％、2％至7％、及2％至7％。
9.如权利要求8所述的萃取物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸、及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.9％至4.3％、2.6％至6.0％、及2.6％至5.9％。
10.一种医药组成物，其包括权利要求1所述的萃取物及一医药上可接受的载体。
11.如权利要求10所述的医药组成物，其中，该肉豆蔻酸、该棕榈酸、该棕榈烯酸、该油酸、该亚麻油酸、该次亚麻油酸、及该硬脂酸的含量分别为萃取物干重的0.5％至4％、15％至50％、3.5％至12％、3.5％至12％、3％至12％、1.2％至5％、及0.8％至4％。
12.如权利要求11所述的医药组成物，其中，该肉豆蔻酸、该棕榈酸、该棕榈烯酸、该油酸、该亚麻油酸、该次亚麻油酸、及该硬脂酸的含量分别为萃取物干重的0.7％至1.7％、19.2％至43.6％、4.4％至10.1％、4.4％至10.0％、3.9％至8.8％、1.8％至4.0％、及1.1％至2.6％。
13.如权利要求10所述的医药组成物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.2％至5％、2％至7％、及2％至7％。
14.如权利要求13所述的医药组成物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.9％至4.3％、2.6％至6.0％及2.6％至5.9％。
15.如权利要求11所述的医药组成物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸、及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.2％至5％、2％至7％、及2％至7％。
16.如权利要求15所述的医药组成物，其中，该十六碳二烯酸、该十六碳烯酸、及该十八碳烯酸的含量分别为萃取物干重的1.9％至4.3％、2.6％至6.0％、及2.6％至5.9％。
17.权利要求10所述的医药组成物在制备治疗糖尿病、肥胖或血脂异常药中的应用。
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