KR101059332B1

KR101059332B1 - 홍화자, 숙지황 및 사인의 혼합생약 추출물을 유효성분으로함유하는 골다공증질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101059332B1
Application number: KR1020080019285A
Authority: KR
Inventors: 김미려; 강주봉; 양재하; 김동희; 김여희; 이종록; 서부일
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2008-02-29
Publication date: 2011-08-24
Also published as: KR20090093646A

Abstract

본 발명은 홍화자(Carthami Semen), 숙지황(Rehmanninae Rhizoma Preparat) 및 사인(Amomi fructus)의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 혼합생약 추출물은 조골세포주인 MG-63세포의 생존율을 증가시킬 뿐만 아니라 골다공증유발 원인인 감소된 골(질)량, 에스트라디올(estradiol) 및 오스테오칼신(osteocalcin)을 증가시켜주는 효과를 나타내므로, 골다공증질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

홍화자, 숙지황, 사인, 골다공증질환

Description

홍화자, 숙지황 및 사인의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising the mixed extract of Carthami Semen, Rehmanninae Rhizoma Preparat and Amomi Fructus for preventing and treating osteoporosis}

본 발명은 홍화자, 숙지황 및 사인의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 예방 및 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] Roodman GD et al., Advances in bone biology: the osteoclast, Endocrinol Rev. 17, 308-332, 1996

[문헌 2] Avioli LV. et al., The osteoporotic syndrome; Detection, prevention & treatment. 3rd ed. Wielis, 1993

[문헌 3] 권재희 et al., 폐경 여성의 골밀도: 자연 폐경 군과 수술적 폐경 군간의 비교, 대한산부학회지, 2000

[문헌 4] 골다공증 (골조송증),대한골대사학회, 최신의학사, p17-63, 1991

[문헌 5] 서부일 et al., 알기쉬운 본초학, 대구한의대학교 출판부, p295, 2004,

[문헌 6] 서부일 et al., 알기쉬운 본초학, 대구한의대학교 출판부, p435, 2004

[문헌 7] 서부일 et al., 알기쉬운 본초학, 대구한의대학교 출판부, p174, 2004

[문헌 8] Oh K. et al., Effect of Rehmaniae glutinosa Libosh extracts on bone metabolism, Clinica Chimaica Acta. 334, 185-195, 2003

[문헌 9] Dontas I. et al . Protective effect of plant extract from Onobrychis ebenoides on ovariectomy-induced bone loss in rats. Maturitas. 53, 234-242, 2006

[문헌 10] Suzuki N. et al ., A possible role of estrone produced in adipose tissues in modulating postmenopausal bone density, Maturitas. 22, 9-12, 1995

[문헌 11] Srivastava AK, et al., Development and application of a serum C-telopeptide and osteocalcin assay to measure bone turnover in an ovariectomized rat model, Calcif Tissue Int. 66(6), 435-442, 2000

골다공증은 뼈의 기질이 감소하여 뼈의 질량 자체가 매우 적어진 상로, 뼈에 거친 경석이나 스펀지처럼 작은 구멍이 많이 나서 무르고 쉽게 부러지게 된다. 골다공증은 크게 일차성과 이차성 골다공증으로 나누며 일차성 골다공증은 제 1형 골다공증(postmenopausal)과 제 2형 골다공증(senile osteoporosis)으로 구분된다. 제 1형 골다공증은 폐경 후 에스트로겐의 결핍이 주된 원인으로 골흡수가 증가하면서 혈중 칼슘이 높아지고 이에 따라 부갑상선 호르몬의 분비가 감소되고, 따라서 장내의 칼슘 흡수가 낮아지는 결과로 발생하는 골다공증으로 50~65세의 여성에게 주로 발생한다. 발생기전은 에스트로겐 부족에 의해 조골세포에서 IL-1(Interleukin-1), IL-6 등의 사이토카인의 생성이 증가하고, 이들이 파골세포를 활성화시킴으로서 골소실이 발생한다. 이때는 주로 소골에서 뼈의 소실이 발생하므로 척추와 손목에서 골절이 빈발한다. 제 2형 골다공증은 65세 이후 남녀 노인에게 발생하는 골다공증으로, 발생기전은 신장에서 1, 25(OH)₂D₃생성이 감소되어 장관내 칼슘 흡수가 줄고, 부갑상선 호르몬 분비가 많아져서 피질골의 손실이 증가되고 골아세포의 골형성이 감소되어 골다공증이 발생하는 것이다 (Roodman GD et al., Advances in bone biology: the osteoclast, Endocrinol Rev. 17, 308-332, 1996). 제 1형, 제 2형에 의한 정상적인 생리적 골 소실 외에도 유전적인 소인, 그릇된 생활습관 등 환경적인 요인과 호르몬의 부조화 등이 복합적으로 작용하여 초래되는 질환으로 골다공증 환자의 대부분이 여기에 속한다. 반면, 이차성 골다공증은 다른 질환 또는 약물에 의해 오는 골다공증을 의미하며, 병적인 원인으로는 각종 내분비 질환에 의해 생기는 골다공증을 말한다 (Avioli LV. et al., The osteoporotic syndrome; Detection, prevention & treatment. 3rd ed. Wielis, 1993)

골대사는 골 흡수와 골생성의 반복에 의해 구성되며 골량은 이 두 과정에 의해 결정된다. 그러나 폐경에 의해 여성호르몬의 결핍이 나타나면 이런 골의 재형성과정에 관여하는 조골세포와 파골세포에 직접, 간접적으로 영향을 미쳐 골손실을 유발한다. 골생성에 비하여 골흡수가 많아지면 골다공증의 원인이 되며, 이는 골절의 위험성을 높인다

골다공증의 원인으로 명확히 밝혀진 것은 없으나, 분만횟수의 증가, 활동량의 감소, 에스트라디올(estradiol)결핍, vitamin D 결핍, 호르몬장애, 플루오르화물(fluoride) 결핍, 반사장애(reflex dystrophy), 유전적 원인, 노인성 원인, 칼슘의 섭취 부족 또는 장에서의 흡수능력 저하 등이 있다. 이러한 요소들이 단독 또는 복합적으로 작용하여 골흡수를 강화 또는 골형성을 약화시켜 골다공증을 유발시킨다 (권재희 et al., 폐경 여성의 골밀도: 자연 폐경 군과 수술적 폐경 군간의 비교, 대한산부학회지, 2000).

골다공증에 의한 골절은 65세 이후의 노인에서 흔히 발생하며 넘어지는 정도의 가벼운 외상으로 발생하고 골절의 부위는 대퇴골의 경부나 전자부에 주로 발생하며 연령이 많을수록 전자부 골절이 많이 발생하며 다른 부위의 골절과는 달리 이환율과 사망률이 높고 치료가 어려운 골절이다. 또한 골절 후 6개월내 사망률이 높 게는 약 30%에 달하며 회복되더라도 골절 이전의 상태로 회복되기는 힘들어서 약 70%에서 기능의 장애가 온다. 보고에 의하면 60세 이전 노인에서 골절발생률은 15%정도인데, 이 중 40% 정도가 골다공증에 의한 골절인데 반해 60~70세 여성의 경우는 골절 중 60%가 골다공증에 의한 골절이며, 50세 이상의 골밀도 감소 여성의 경우, 골밀도가 정상인 여성에 비해 골절 위험이 2배까지 증가한다고 한다 (대한골대사학회, 골다공증, 최신의학사, p17-63, 1991). 또한 2000년 상반기 건강보험심사평가원 발표에 의하면 국내 입원 환자 중 70대 이상에서는 대퇴골 골절이 가장 높은 비율을 차지하는 것으로 나타났다. 그리고 골다공증으로 인한 사망 위험률이 유방암의 3배가 넘는 30%정도나 되어 우리나라 뿐만 아니라 많은 선진국에서도 중요한 보건문제로 대두되고 있다.

현재 골다공증의 일반적인 치료로는 칼슘, 비타민 D의 섭취, 운동 및 생활 습관의 변화를 요구하고 있으며, 약물치료로는 골흡수 억제제로 에스트라디올(estradiol), 칼시토닌(Calcitonin), 비스포스포네이트(Bisphosphonates)등이 있고, 골형성 촉진제로 플루오르화물(fluoride), 부갑상선 호르몬 등이 있다. 하지만, 아직까지 일부 약물을 제외하고는 획기적인 약물로 알려진 것이 없다. 따라서 일차적으로 골밀도의 손실을 억제하고 이차적으로 골흡수를 억제시켜주는 약물 치료법이 절실히 필요하다.

홍화자(Carthami Semen)는 국화과의 잇꽃(Carthamus tinctorius L.)의 꽃, 종자를 건조한 것으로, 그 효능이 홍화(紅花)와 거의 같으며, 이외에 활혈산결(活血散結) 및 활혈해독(活血解毒)하는 효능을 갖고 있어 두창과 창독불출(瘡毒不出) 에 사용된다 (서부일 et al., 알기쉬운 본초학, 대구한의대학교 출판부, p295, 2004,).

숙지황(Rehmanninae Rhizoma Preparat)은 현삼과의 여러해살이풀인 지황(Rehmannia glutinosa (Gaertner) Libosch.) 또는 회경지황(R. glutinosa Libosch. var. hueichingensis(Chao et Schih) Hsia.)의 뿌리, 줄기를 쪄서 건조한 것으로 맛은 달면서도 쓴맛이 돌고 따뜻한 성질이 있어 혈을 보(補)하고 정(精:생명이 발생하고 활동하는 데 기본이 되는 물질)을 보충해서 허리와 무릎이 시리고 아픈 증상이나 월경이상, 어지럼증 등을 치료하고 머리를 검게 하는 효능이 있다. 하지만, 숙지황은 성질이 점이(粘)하여 위장에 부담을 주어 습사(濕邪)를 정제하게 하기 쉬운데, 사인(砂仁)을 배합하면 점이성(粘性)이 줄어들어 위장장애를 피할 수 있다 (서부일 et al., 알기쉬운 본초학, 대구한의대학교 출판부, p435, 2004).

사인(Amomi Fructus)은 생강과의 여러해살이풀인 양춘사(Amomum villosum LOUR.)과 해남사(A. longiligulare T.L.WU.) 또는 축사(A. Xanthioides Wall.)의 성숙한 과실을 건조한 것으로, 여름과 가을 사이에 과실이 성숙할 때 채취하여 말리거나 또는 저온에서 건조한 것이다. 사인은 맛이 맵고 약성이 따뜻하며, 방향(芳香)을 지니고 있는데, 매운맛은 산(散)하고 따뜻한 성질은 통(通)하게 하며, 방향은 화습(化濕)하므로 중초(中焦)에 습사(濕邪)가 조체(阻滯)하거나 비위(脾胃)에 기체(氣滯)및 비위가 허한(虛寒)한 모든 증에 적용된다. 또한 사인은 화습화위(化濕和胃)하고 개위진식(開胃進食)하는 효능이 있어서 비위기체(脾胃氣滯)로 위구(胃口)가 불개(不開)하고 소화불량으로 구토, 설사하는 증상을 치료하며, 해행기파적 체(行氣破積滯)하는 효능이 있어 흉복창통(胸腹脹痛)을 치료하고, 이기안태(理氣安胎)하여 기체로 기가 유통하지 못하여 발생하는 태동불안(胎動不安), 임신오조(姙娠惡阻) 등의 증상을 치료한다(서부일 et al., 알기쉬운 본초학, 대구한의대학교 출판부, p174, 2004).

하지만, 상기 어느 문헌에서도 홍화자, 숙지황 및 사인의 혼합추출물이 골다공증질환의 예방 및 치료용 조성물로서 사용 가능하다고 교시되거나 게시된 바 없다.

이에 따라 본 발명자들은 골다공증에 효과적인 치료제를 개발하기 위한 연구를 통해, 홍화자, 숙지황 및 사인의 혼합생약 추출물이 골육종 세포인 MG-63 세포 (osteoblast-like cell)의 생존율을 증가시킬 뿐만 아니라 골다공증유발 원인인 감소된 골(질)량, 에스트라디올(estradiol) 및 오스테오칼신(osteocalcin)을 증가시켜주는 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍화자(Carthami Semen), 숙지황(Rehmanninae Rhizoma Preparat) 및 사인(Amomi Fructus)의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 홍화자(Carthamin Semen), 숙지황(Rehmanninae Rhizoma Preparat) 및 사인(Amomi Fructus)의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 혼합생약 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 혼합생약의 바람직한 중량 배합비로는 홍화자(1~10) : 숙지황(1~5) : 사인(1~5)의 중량비(w/w), 보다 바람직하게는 홍화자(1~6) : 숙지황(1~3) :사인(1~3)의 중량비(w/w)를 포함하는 것임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 골다공증질환은 제 1형 골다공증(폐경 후 골다공증), 제 2형 골다공증(노인성 골다공증), 특발성 골다공증, 내분비질환과 골다공증, 소화기계 질환과 골다공증, 악성질환과 골다공증, 음주와 골다공증, 흡연과 골다공증 및 약물과 골다공증으로 이루어진 군으로 선택된 하나 이상의 질환, 바람직하게는 제 1형 골다공증(폐경 후 골다공증)을 포함하는 것임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 혼합생약 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 혼합생약 추출물은 건조생약 재료인 분쇄시킨 홍화자, 숙지황 및 사인을 물로 세척하여 상기 생약재료 중량의 약 1 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 15배에 달하는 부피의 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물로, 0 내지 120℃ 온도, 바람직하게는 20 내지 100℃ 온도에서 약 1시간 내지 1일, 바람직하게는 2시간 내지 5시간 동안, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수추출방법으로 추출한 후, 추출액을 여과한 후 냉각하고 여과액을 동결 건조하여 본 발명의 혼 합생약 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 골다공증질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함된다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사 에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 골다공증질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 추출물은 골다공증질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시 클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 홍화자, 숙지황 및 사인의 혼합생약 추출물은 조골세포주인 MG-63세포의 생존율을 증가시킬 뿐만 아니라 골다공증유발 원인인 감소된 골(질)량, 에스트라디올(estradiol) 및 오스테오칼신(osteocalcin)을 증가시켜주는 효과를 나타내므로, 골다공증질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 홍화자, 숙지황 및 사인의 혼합추출물 제조

경동시장(http://www.kyungdongmart.com)에서 구입한 홍화자 50g, 숙지황 25g 및 사인 25g을 깨끗하게 수세하여 전기 약탕기(대웅약탕기, DWP5000M)에 넣고 증류수 1.3ℓ를 가하여 3시간 동안 100℃에서 열수 추출하였다. 추출액을 거름종이(Advantec, 71101903)로 여과한 후 여액을 회전 진공증류기(EYELA, A-1000s)로 감압 농축하고 동결건조하여 홍화자, 숙지황 및 사인의 혼합추출물 15g(수득율: 15%)를 수득하였다. (이하, 이를 ‘CRA'라 명명함)

참고예 1. 실험재료의 준비

FBS(fetal bovine serum)은 론자사(Lonza co., Ltd.) 제품을 구입하여 사용하였으며, 스트렙토마이신(streptomycin), 페니실린(penicillin) 및 DMEM 배지는 기브코사(Gibco co., Ltd.) 제품을 구입하여 사용하였다.

참고예 2. 실험동물의 준비

실험동물은 효창사이언스사에서 구입하였으며, 생후 6주령의 스프래그-돌리 (Sprague-Dawley)계 수컷 쥐(200~250g)를 사용하였고, 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21± 2℃, 상대습도는 53　±3%로 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 점등 및 소등하였다.

참고예 1. MG-63세포의 배양

한국세포주은행 (Korean cell line research foundation )로부터 구입한 사람의 조골세포양 세포(osteoblast-like cell)의 특성을 갖는 MG-63세포는 10% FBS(heat inactivated fetal bovine serum), 100ug/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin) 및 100U/㎖의 페니실린(penicillin)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO_2,100% 습도, 37℃의 조건을 갖는 배양기에서 배양하였으며, 하기 실험예 1에 사용한 MG-63세포는 지수적 성장기에 있는 세포를 사용하였다.

참고예 2. 난소절제를 통해 흰쥐의 골다공증 유발

2-1. 마취

Kg당 50mg의 펜토바르비탈 소디움(Entobal, 한림제약)을 복강주사하여 전신마취를 수행하였다.

2-1. 난소절제

난소제거군은 일반적인 수술 전 처치방법에 따라 10% 포비돈 요오드로 수술부위 및 주위를 세척 및 분리 후 하복부의 피부, 근육, 복막의 절개를 시행하여 양쪽 난소를 모두 노출시킨 후 난소를 절제하고 절제부위는 4호 실크로 결찰한 후 복막, 근육, 피부의 각 층을 3호 실크로 봉합하였다(이하 이를 ‘OR'라 명명함).

한편 허위난소제거군은 상기와 동일한 방법으로 양쪽 난소를 모두 노출시킨 후 난소를 절제하지 않고 도로 복강에 복귀시킨 다음 복막, 근육, 피부의 각 층을 3호 실크로 봉합하였다(이하, 이를 SHAM라 명명함).

상기 난소제거군과 허위난소제거군은 수술 3주 후 하기 실험예 2 내지 실험예3의 실험동물로 사용하였다.

참고예 3. 통계처리

통계적 유의성은 SPSS 프로그램(SPSS Inc., version 11.01)의 One-way & Two way ANOVA와 post-hoc LSD로 검정하여 p값이 0.05이하인 경우에 유의한 것으로 인정하였다.

실험예 1. MG-63세포의 생존율 측정

상기 실시예 1의 방법으로 제조된 CRA가 MG-63세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해서, MTT어세이([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide])을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Oh K. et al., Effect of Rehmaniae glutinosa Libosh extracts on bone metabolism, Clinica Chimaica Acta, 334, 185-195, 2003).

MTT 어세이는 살아있는 세포의 경우 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 수용성의 tetrazolium salt MTT(노란색)가 포마잔 크리스탈(formazan crystals; 보라색)로 환원되는 것이 기본 원리로서 즉, 살아있는 세포의 수가 많을수록 포마잔 크리스탈(formazan crystal) 생성이 증가하여 흡광도가 높게 측정된다.

참고예 1의 방법으로 배양한 MG-63세포를 12 웰 플레이트에 넣고 대조군인 인산완충 식염수 (PBS) 또는 인산완충 식염수 (PBS)에 녹인 CRA를 농도별(0, 0.01mg/㎖, 0.03mg/㎖, 0.1mg/㎖)로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양액에 50 ㎕의 MTT(2mg/ml, Promega, 223613)를 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후 반응액을 1000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 이후 100 ㎕의 DMSO(Dimethylsulfoxide, Sigma, C1619)를 첨가하여 5분 동안 플레이트 세이커(Shaker)에서 포마잔 크리스탈을 용해시킨 다음 마이크로프레이트 리더기(microplate reader, TECAN, I112904)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군의 평균 흡광도 값을 100으로 기준으로 하여 CRA에 의한 MG-63세포의 생존율정도를 계산하였다.

그 결과, 도 1에 나타나는 바와 같이, CRA처리군은 처리농도 모두에서 대조군보다 MG-63세포의 생존률이 증가하였으며, 특히 CRA처리군은 0.03mg/㎖ 및 0.1mg/㎖의 농도에서 유의적으로 증가였다. 이를 통해, CRA는 MG-63세포의 생존율을 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

실험예 2. 골다공증 유발 흰쥐의 골밀도 측정

상기 실시예 1의 방법으로 제조된 CRA가 상기 참고예 2의 방법으로 골다공증을 유발한 흰쥐의 골밀도에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Dontas I et al . Protective effect of plant extract from Onobrychis ebenoides on ovariectomy-induced bone loss in rats. Maturitas. 53, 234-242, 2006)

상기 참고예 2의 방법으로 수술을 시행한 3주후부터 SHAM(10마리/군)에 0.9% 생리식염수(양성대조군) 및 OR에 0.9% 생리식염수(음성대조군) 또는 CRA을 각각 매일 체중(Kg)당 100mg씩 3주 동안 경구 투여한 후 펜토바르비탈 소디움(pentobarbital sodium, Entobal, 한림제약)을 사용하여 마취시킨 다음 각 실험동물군의 척추, 대퇴골, 경골 및 비골 부위를 각각 이중에너지 방사선 흡수법(dual energy X-ray absorptiometry)을 이용한 골밀도측정장치 (PIXImus, Lunar)로 골밀도를 측정하였다.

그 결과, 도 2 내지 도 4에 나타나는 바와 같이, CRA투여군은 척추, 대퇴골, 경골 및 비골의 골밀도가 음성대조군보다 증가하였으며, 특히 CRA투여군은 대퇴골과 경골 및 비골의 골밀도가 음성대조군과 비교하여 유의적인 증가를 한 것으로 나타났다. 이를 통해, CRA가 골다공증의 유발원인인 감소된 골밀량을 증가시킴을 알 수 있었다(도 2 내지 4 참조).

실험예 3. 골다공증 유발 흰쥐의 혈청 중 호르몬 및 단백질 함량 측정

상기 실시예 1의 방법으로 제조된 CRA가 상기 참고예 2의 방법으로 골다공증을 유발한 흰쥐의 혈청 중 호르몬 함량에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다((Suzuki N. et al ., A possible role of estrone produced in adipose tissues in modulating postmenopausal bone density, Maturitas, 22, 9-12, 1995; Srivastava AK, et al., Development and application of a serum C-telopeptide and osteocalcin assay to measure bone turnover in an ovariectomized rat model, Calcif Tissue Int. 66(6), 435-442, 2000).

상기 참고예 2의 방법으로 수술을 시행한 3주후부터 SHAM(10마리/군)에 0.9% 생리식염수(양성대조군) 및 OR에 0.9% 생리식염수(음성대조군) 또는 CRA을 각각 매일 체중(Kg)당 100mg씩 3주 동안 경구 투여한 후 펜토바르비탈 소디움(pentobarbital sodium, Entobal, 한림제약)을 사용하여 마취시킨 다음 상기 실험예2의 시술 전 각 실험동물군의 쇄골하정맥으로부터 혈액을 채취하였고, 이 혈액을 3,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 중 에스트라디올(estradiol) 함량은 코타(Cota)-A-카운트(Count) 에스트라디올(estradiol) RIA 키트(DPC, TKE 21)를 사용하였으며, 오스테오칼신(osteocalcin)은 OSTEOCALCIN MYRIA RIA 키트(Techno genetics, 16099436)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 5 및 도 6에 나타나는 바와 같이, CRA투여군은 혈청 중 에스트라디올(estradiol) 및 오스테오칼신(osteocalcin)의 함량이 음성대조군과 비교하여 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이를 통해, CRA가 골다공증의 유발원인인 감소된 에스트라디올(estradiol) 및 오스테오칼신(osteocalcin)을 증가시킴을 알 수 있었다(도 5 내지 6 참조).

상기의 결과를 통해, 본 발명의 CRA는 조골세포의 생존율을 증가시키고 골다공증의 유발원인 중 하나인 감소된 골밀량을 증가시켜 골밀도의 손실을 억제시킬 뿐만 아니라, 또 다른 골다공증의 유발원인인 감소된 에스트라디올(estradiol) 및 오스테오칼신(osteocalcin)을 증가시켜 골흡수 또한 억제시킴을 알 수 있었다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1의 CRA 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 CRA 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1의 CRA 300 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1의 CRA 300 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조 한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1의 CRA 300 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

실시예 1의 CRA 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁0.13 ㎎

비타민 B₂0.15 ㎎

비타민 B₆0.5 ㎎

비타민 B₁₂0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제 조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

실시예 1의 CRA 300 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B₁ 0.25 g

비타민 B₂ 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 CRA에 의한 MG-63세포의 생존율 증가효과를 나타낸 도이며,

도 2는 CRA에 의해 골다공증유발동물에서 감소된 척추의 골밀도(spinal BMD)의 증가효과를 나타낸 도이며,

도 3은 CRA에 의해 골다공증유발동물에서 감소된 대퇴골의 골밀도 (femoral BMD)의 증가효과를 나타낸 도이며,

도 4는 CRA에 의해 골다공증유발동물에서 감소된 경골과 비골의 골밀도 (Tibial and Fibular BMD)의 증가효과를 나타낸 도이며,

도 5는 CRA에 의해 골다공증유발동물에서 감소된 혈청 중 에스트라디올(estradiol)의 농도 증가효과를 나타낸 도이며,

도 6은 CRA에 의해 골다공증유발동물에서 감소된 혈청 중 오스테오칼신(osteocalcin)의 농도 증가효과를 나타낸 도이다.

Claims

홍화자 (1∼10): 숙지황 (1∼5): 사인 (1∼5)의 중량비(w/w)의 혼합 생약 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 제 1형 골다공증의 예방 및 치료용 약학조성물.
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홍화자 (1∼10): 숙지황 (1∼5): 사인 (1∼5)의 중량비(w/w)의 혼합 생약 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 제 1형 골다공증의의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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