KR101058783B1 - 간암진단용 ｐｐｉａ 마커, 항체 및 이들을 이용한간암치료용 화합물의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암진단에 유용한 하기 폴리 뉴클레오티드를 함유하는 간암진단용 마커를 제공한다:

a) 서열번호 1 기재 또는 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리 뉴클레오티드, b) 서열번호 2 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드, c) 서열번호 2 기재의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드, d) 서열 번호 1 기재의 염기서열로 이루어지는 폴리 뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 혼성화하는 폴리 뉴클레오티드에 의해 코드 되며, 상기 염기서열에 의해 코드되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드.

PPIA, 간암

Description

간암진단용 ＰＰＩＡ 마커, 항체 및 이들을 이용한 간암치료용 화합물의 스크리닝 방법{PPIA Marker for diagnosis of liver cancer, antibody, and screening method of compounds useful to inhibiting liver cancer}

본 발명은 PPIA를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 변형서열 또는 이들로부터 발현되는 PPIA 단백질을 간암 진단 및 예후를 판단하기 위한 마커 등으로서 이용하는 기술에 관한 것이다.

간세포암의 진단을 위해 초음파 검사, CT검사, MRI 검사 등의 화상 진단 검사, 혈청 검사(AFP, PIVKA－II), 및 생검 재료의 병리 조직 검사가 이용되고 있다. 혈청 AFP 검사는 환자의 대략 7할 미만에서 높은 값을 나타내지만, 만성간질환 환자에 있어도 경도의 높은 값을 나타내는 것이 자주 인정되어 그 감별이 중요하다. 한편, 조기 간세포암에서는 낮은 값을 나타내는 일도 많다. 또, PIVKA－II(protein induced by ｖitamin K antagonist－II)의 양성율은 5할 미만으로 낮지만, 간세포암에의 특이성은 높고, 양자의 병용에 의해 진단 정밀도가 상승하는 것이 알려져 있다. 그렇지만, 위양성 혹은 양자 음성의 증례에 대해 보다 특이적인 종양마커의 개발이 기대되고 있다.

생검 재료의 병리 조직 검사는 간질환의 확정 진단에 있어 중요한 검사이다. 그러나, 병리학적 특징만으로 암 특히 초기의 간세포암과 비암부 조직을 식별하는 일도 때때로 곤란하다. 즉, 미소병변은 대재생 결절, 혹은 초기의 고분화형의 간세포암인 경우를 볼 수 있다. 특히 경피적 침생검에 의해 종양성 조직을 채취했을 경우에는, 채취량이 한정되는 일도 있어 보다 확실한 진단 기술이 필요하게 된다. 이러한 일로부터, 조기의 간세포암을 비암부 조직으로부터 식별할 수 있는 암특이적 항체의 개발이 바람직하다.

한편, 간세포암에 대해서는 여러 가지의 치료법이 있어 외과적 절제, 간동맥색전요법, 경피적 에탄올 주입 요법, 마이크로파 응고 요법 등이 행해지고 있다. 증례 마다의 최적의 치료법을 선택하기 보다는 오히려, 의료 시설마다 가장 자랑으로 여기는 치료법이 선택되는 일도 많아, 진단 기준 및 치료 방침의 선택에 대해서는 명확한 기준이 존재하지 않는다.

간암에 대해 이상을 초래하는 복수의 유전자군에 대해 클러스터화해 진단에 이용하는 것은 매우 유효하다. 간세포암에 관여하는 유전자 이상에 대해서는, IGF－II, c－myc, cyclin D나 VEGF 등이 알려져 있지만, 그 발생, 진전에 관여하는 유전자 이상등에 대해서는 밝혀져 있지 않은 점이 많다.

PPIA는 사이클로필린 A(CypA)라고도 하며 면역필린 패밀리에 속하며 사이클로스포린 A의 세포내 수용체로부터 동정되었다. 비록 PPIA는 초기에는 세포내에 존재하지만 염증 자극에 의해 분비된다는 보고도 있다 (B. Sherry et al, Proc Natl Acad Sci U S A 89 (1992), pp. 3511??3515). 분비된 PPIA는 주화성, 세포신호 등 다양한 기능을 지니고 있으나, 간암세포에서의 이들의 발현양상에 대한 어떠한 보고도 현재까지 발견되고 있지 않다.

본 발명은 PPIA의 간암의 진단 및 치료, 기타 암화에 관련된 PPIA 관련연구 등에 대한 유용성을 검증하고, 그 결과를 이용하여 간암의 진단을 위한 마커, 항체 및 이들을 함유하는 간암진단 장치로의 적용과, 이를 이용하여 간암의 치료에 유용한 화합물을 스크리닝 하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

상기한 과제를 달성하기 위하여 본 발명은,

(1) 하기와 같은 a) 또는 d) 기재의 폴리 뉴클레오티드를 함유하는 간암진단용 마커를 제공한다:

a) 서열번호 1 기재의 폴리 뉴클레오티드, b) 서열번호 2 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드, c) 서열번호 2 기재의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드, d) 서열 번호 1 기재의 염기서열 로 이루어지는 폴리 뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 혼성화하는 폴리 뉴클레오티드에 의해 코드 되며, 상기 염기서열에 의해 코드되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드.

(2) 본 발명은 상기 (1) 기재의 폴리 뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질의 부분 펩티드를 코드하는 폴리 뉴클레오티드를 함유하는 간암진단용 마커를 포함한다.

(3) 본 발명은 상기 (1) 기재의 폴리 뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질 또는 그 부분 펩티드를 함유하는 간암진단용 마커를 포함한다.

(4) 본 발명은 상기 (1) 또는 (3) 기재의 폴리 뉴클레오티드 또는 단백질을 항원으로 하고, 여기에 결합가능한 간암진단용 항체를 포함한다.

(5) 본 발명은 상기 (1) 또는 (3)의 단백질을 감암진단용 마커로 함유하는 간암진단 장치를 포함한다.

(6) 본 발명은 상기 (4)의 항체를 포함하는 간암진단 장치를 포함한다.

(7) 본 발명은 하기의 공정을 포함하는 상기 (1) 기재의 폴리 뉴클레오티드 또는 (3) 기재의 단백질의 발현을 제어하는 화합물을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

a) 세포에 후보 화합물을 접촉시키는 단계,

b) 상기 (1)의 폴리 뉴클레오티드 또는 (3)의 단백질의 세포에서의 발현레벨을 대조구와 비교하는 단계,

c) 유전자의 발현 레벨을 변화시키는 후보 화합물을 선택하는 단계.

(8) 본 발명은 하기의 과정을 포함하는 간암의 진단방법을 포함한다.

a) 생체시료 중의 상기 (1) 기재의 폴리 뉴클레오티드 또는 (3) 기재의 단백질의 함량을 측정하는 단계,

b) 상기 a)의 측정 결과와 대조구를 비교하여 간암을 검출하는 단계.

본 발명에 의하면, PPIA는 정상인에 비하여 간암환자에게서 그 분비량이 많은 것으로 나타나 이를 이용한다면 간암의 진단 및 치료, 그 외 암화에 관련된 PPIA 관련연구 등에 유용하게 사용할 수 있고, 간암을 진단하는 진단제 및 치료제로서 그 활용도가 크다.

상기한 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 하기와 같은 a) 또는 d) 기재의 폴리 뉴클레오티드를 함유하는 간암진단용 마커를 포함한다:

a) 서열번호 1 기재 또는 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리 뉴클레오티드, b) 서열번호 2 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드, c) 서열번호 2 기재의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드, d) 서열 번호 1 기재의 염기서열로 이루어지는 폴리 뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 혼성화하는 폴리 뉴클레오티드에 의해 코드 되며, 상기 염기서열 에 의해 코드되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드.

상기에서 서열 번호 1에 나타나는 염기서열과 「실질적으로 동일한 염기 서열」로서는, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열과 약 70%이상, 바람직하게는 약 80%이상, 한층 더 바람직하게는 약 90%이상, 특히 바람직하게는 약 95%이상, 가장 바람직하게는 약 98%이상의 상동성을 가지는 염기 서열 등으로서, 서열번호 1에서 코드하는 단백질과 동일한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 들 수 있다.

상기 본 발명에서의 폴리 뉴클레오티드는 DNA, 또는 RNA 일 수 있으며, 바람직하게는 mRNA이다.

상기에서 서열번호 2 기재의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드는 단백질의 기능을 실질적으로 저해함이 없는 유사한 화학적 특성을 가지는 아미노산의 치환, 예를 들어, 루신과 이소루신의 치환 등과, 번역후 조절과정에 의해 단백질의 양말단부가 일부 결실되는 경우 등 근본적으로 서열번호 2의 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 갖는 단백질을 들 수 있다.

상기 서열 번호 1 기재의 염기서열로 이루어지는 폴리 뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 혼성화하는 폴리 뉴클레오티드로서는 예를 들면, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 상보적인 서열과 약 50%이상, 바람직하게는 약 60%이상, 한층 더 바람직하게는 약 70%이상, 특히 바람직하게는 약 80%이상, 가장 바람직하 게는 약 90%이상의 상동성을 가지는 염기 서열을 함유 하는 폴리 뉴클레오티드 등이 이용된다. 혼성화는 자체 공지의 방법 혹은 거기에 준하는 방법, 예를 들면, 몰레큘라클로닝(Molecular Cloning) 제2판(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)에 기재된 방법 등에 따라서 행할 수 있다. 또, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 혼성화는 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다. 혼성화는 바람직하게는 스트린전트한 조건에 따라 행할 수 있다. 스트린전트한 조건이란, 예를 들면, 나트륨 농도가 약 19~40 mM, 바람직하게는 약 19~20 mM으로, 온도가 약 50~70℃, 바람직하게는 약 60~65℃의 조건을 나타낸다. 특히, 나트륨 농도가 약 19 mM로 온도가 약 65℃의 경우가 바람직하다.

또, 본 발명은 상기 언급된 폴리 뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질의 부분 펩티드를 코드하는 폴리 뉴클레오티드를 함유하는 간암진단용 마커를 포함한다. 여기서 부분 펩티드란 예를 들면, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열과 약 50%이상, 바람직하게는 약 60%이상, 한층 더 바람직하게는 약 70%이상, 특히 바람직하게는 약 80%이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 함유 하는 펩티드를 들 수 있다.

또, 본 발명은 상기 언급된 폴리 뉴클레오티드 또는 단백질을 항원으로 하고, 여기에 결합가능한 간암진단용 항체를 포함한다. 여기서 항체는 폴리클로날 항체, 단일 클론 항체의 어느 것이어도 무방하다. 이들 항체의 획득 방법 자체는 이미 공지되어 있으며, 본 발명에서는 이들 공지된 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조하면 된다.

본 발명에 따른 상기 항체 들은 간암진단 장치에 적용할 수 있다. 이와 같은 진단장치는 여러 가지 형태를 포함 할 수 있으며, 예를 들어, ELISA 키트, 또는 항체를 스트립에 부착하여 발색정도를 확인하여 진단할 수 있도록 구성된 US 5,728,587호에 예시된 바와 같은 간이 진단키트, 내지는 마이크로 어레이 등의 다양한 장치가 여기에 포함된다.

또, 본 발명은 하기의 공정을 포함하는 상기 언급된 폴리 뉴클레오티드 또는 단백질의 발현을 제어하는 화합물을 스크리닝 하는 방법을 포함한다.

a) 간암 세포에 후보 화합물을 접촉시키는 단계,

b) 상기 (1)의 폴리 뉴클레오티드 또는 (3)의 단백질의 간암세포에서의 발현레벨을 대조구와 비교하는 단계,

c) 유전자의 발현 레벨을 변화시키는 후보 화합물을 선택하는 단계.

상기 본 발명의 스크리닝 방법의 예로는 상기 본 발명의 폴리 뉴클레오티드를 프로브로서 이용하거나, 혹은 본 발명의 항체를 이용하는 것으로, PPIA의 발현량을 변화시키는 물질을 스크리닝할 수 있다. 즉, 본 발명은, 예를 들면, (i) 사람을 포함한 포유동물의 간암세포, 또는 (ii) 본 발명에 따른 폴리 뉴클레오티드를 벡터에 삽입하여 특정 숙주에 형질전환시켜 얻은 형질 전환체 등에 포함되는 PPIA의 mRNA량 또는 단백질량을 측정하는 것에 의한 PPIA의 발현량을 변화시키는 물질을 스크리닝할 수 있다.

PPIA의 mRNA량 또는 단백질량의 측정은 예를 들면, 통상의 방법에 의해 간세포로부터 mRNA를 추출하고, 예를 들면, RT－PCR등의 수법을 이용하는 것으로 정량 할 수 있거나 혹은 공지의 노던블롯의 해석에 의해 정량할 수도 있다. 한편, PPIA의 함량은 통상의 방법에 의해 간세포 등으로부터 단백질을 추출하여, 예를 들면, 웨스턴블롯 해석에 의해 정량할 수 있다.

상기의 스크리닝법에 의해, PPIA의 발현량을 증가시키는 물질을 간암촉진 물질, PPIA의 발현량을 감소시키는 물질을 간암세포 활성화 저해 물질로서 선택할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 적용될 수 있는 형질전환체는 이하에서와 같은 과정에 의해 제조될 수 있다.

상기 본 발명의 스크리닝을 위해 사용할 수 있는 형질전환체는 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리 뉴클레오티드 들 중 어느 하나를 함유하는 발현 벡터는, 예를 들면, 목적으로 하는 DNA 단편을 얻고, 당해 DNA 단편을 적당한 발현 벡터 내의 프로모터 하류에 연결하여 제조할 수 있다. 발현 벡터로서는, 대장균 유래의 핵외 유전자(예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13)；고초균 유래의 핵외 유전자(예, pUB110, pTP5, pC194)；효모 유래 핵외 유전자(예, pSH19, pSH15)；λ살균 바이러스 등의 bacteriophage；RNA 종양 바이러스, 배큐로바이러스 등의 동물 바이러스；pA1－11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등이 이용될 수 있다.

프로모터로서는 유전자의 발현에 이용되는 숙주세포에 사용가능하다고 알려져 있는 적절한 프로모터이면 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들면, 숙주 세포가 동물세포인 경우, SRα프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV(사이트메가로위르 스) 프로모터, HSV-TK프로모터 등이 이용될 수 있다. 그 중에서도, CMV 프로모터, SRα프로모터 등이 바람직하다. 숙주 세포가 에스케리치아 속균인 경우, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL프로모터, lpp 프로모터, T7프로모터 등이 이용될 수 있다. 숙주 세포가 바실러스 속균인 경우, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이 이용될 수 있다. 숙주세포가 효모인 경우, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 이용될 수 있다. 숙주 세포가 곤충 세포인 경우, P10 프로모터가 이용될 수 있다.

발현 벡터는 상기 외에 필요에 따라 인핸서, 스프라이싱 시그날, 폴리 A부가 시그널, 선택 마커, SV40 복제 오리진(SV40ori) 등을 함유 하고 있는 것을 이용할 수 있다. 선택 마커로는, 예를 들면, 디하이드로엽산환원효소 (dhfr) 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 폴리 뉴클레오티드 들 중 어느 하나를 함유하는 형질 전환체는 공지의 방법에 따라, 상기 폴리 뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 것에 의해 제조할 수 있다. 숙주 세포로는, 예를 들면, 에스케리치아 속균, 바실러스 속균, 효모, 곤충 세포, 곤충, 동물세포 등이 이용될 수 있다.

형질 전환은 숙주 세포의 종류에 따라 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다. 에스케리치아 속균은, 예를 들면, Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69권, 2110(1972)나 진(Gene), 17권, 107(1982) 등에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다. 바실러스 속균은, 예를 들면, Molecular ＆ General Genetics, 168권, 111(1979) 등에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다. 효모는, 예를 들면, Methods in Enzymology, 194권, 182－187(1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75권, 1929(1978) 등에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다. 곤충 세포 및 곤충은, 예를 들면, Bio/Technology, 6, 47-55(1988) 등에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다. 동물세포는, 예를 들면, Virology, 52권, 456(1973)에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다.

형질 전환체의 배양은 숙주 세포의 종류에 따라 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, 숙주세포가 에스케리치아 속균 또는 바실러스 속균인 형질 전환체를 배양하는 경우, 배양에 사용되는 배양배지로서는 액체 배양배지가 바람직하다. 또, 배양배지는 형질 전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 등을 함유 하는 것이 바람직하다. 여기서, 탄소원으로는, 예를 들면, 글루코오스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등；질소원으로는, 예를 들면, 암모늄 염류, 질산염류, 펩톤, 콩깻묵 등의 무기 또는 유기물질이；무기물로는, 예를 들면, 염화 칼슘, 염화 마그네슘 등이다. 또, 배양배지에는, 효모 엑기스, 비타민류, 생장 촉진 인자 등을 첨가할 수도 있다. 배양배지의 pH는 바람직하게는 약 5~8이다.

숙주세포가 에스케리치아 속균인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배양배지로는, 예를 들면, 글루코오스, 카자미노산을 포함한 M9배양배지[밀러(Miller), Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431－433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]가 바람직하다. 숙주 세포가 에스케리치아 속균인 형질 전환체의 배양은 통상 약 15~43℃로, 약 3~24시간 행해진다. 이때, 환기나 교반을 실시해도 된다. 숙주세포가 바실러스 속균인 형질 전환체의 배양은 통상 약 30~40℃로, 약 6~24시간 행해진다. 이때, 환기나 교반을 실시해도 된다. 숙주 세포가 효모인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배양배지로는, 예를 들면, 버크홀더(Burkholder) 최소 배양지 [Bostian, K. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77권, 4505(1980)] 등을 들 수 있다. 배양배지의 pH는 바람직하게는 약 5~8이다. 배양은 통상 약 20℃~35℃로, 약 24~72시간 행해진다. 필요에 따라서, 환기나 교반을 실시해도 무방하다. 숙주 세포가 곤충 세포 또는 곤충인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배양배지로는, 예를 들면 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C., 네이쳐(Nature), 195, 788(1962))에 비동화한 10% 소혈청 등의 첨가물을 적당히 더한 것 등이 이용될 수 있다. 배양배지의 pH는 바람직하게는 약 6.2~6.4이다. 배양은 통상 약 27℃로 약 3~5일간 행해진다. 필요에 따라서 환기나 교반을 실시해도 무방하다. 숙주세포가 동물세포인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배양배지로는, 예를 들면, 약 5~20%의 소태아혈청을 포함한 MEM 배양배지 [Science, 122권, 501(1952)], DMEM 배양지[Virology, 8권, 396(1959)], RPMI 1640 배양지[The Journal of the American Medical Association) 199권, 519(1967)], 199 배양지[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73권, 1(1950)]등이 이용될 수 있다. 배양배지의 pH는 바람직하게는 약 6~8이다. 배양은 통상 약 30℃~40℃로, 약 15~60시간 행해진다. 필요에 따라서 환기나 교반을 실시해도 무방하다.

상기와 같이 본 발명에 따른 폴리 뉴클레오티드, 단백질, 항체, 및 형질전환 체 등은 생체시료 중의 이들의 함량을 측정하고, 대조구와 비교함으로써 간암을 검출하는 데에 유용하게 활용할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 조직 시료 처리

cDNA 마이크로어레이 실험을 위하여, 전북대학교 병원으로부터 40명의 간암환자의 프라이머리 HCC 조직(primary HCC tissues)과 주위 비간암 조직을 얻었다. 조직시료는 액체질소에서 동결시켰다. RNeasy midi kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다.

<실험예 2> 간암조직에서의 PPIA의 발현 조사

PPIA와 간암의 진행(progression)과의 연관성을 밝히기 위해 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 40명의 간암환자의 암조직과 인접 조직을 대상으로 PPIA의 유전자발현을 조사, 비교하였다. 그 결과 간암조직에서 PPIA의 중요한 발현차이를 보였다. 특히 간암환자의 96.6% (29/30)에서 정상 간조직에 비해 PPIA의 RNA 발현이 증가하는 것을 보였다(도 1A). 간암 등급 I-IV 각각에서, 3쌍의 간암-비간암 HCC 시료쌍을 선택하여 노던 블롯을 실시하여 RNA 레벨을 조사하였다. PPIA 발현은 분화 정도에 따른 에드몬슨 등급 I/II에서도 증가하였으며, 에드몬슨 등급 III/IV에서 증가되는 정도가 더 컸다 (도 1B).

<실험예 3> PPIA 재조합 단백질 및 항체 생산

1. PP1A 재조합 단백질 제조

50㎕의 DH5a 콤피턴트 세포에 2㎕의 pGEX4T-1 PPIA DNA를 넣어 배양하였다. IPTG를 처리한 후 SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 단백질의 인덕션 여부를 확인하였다. 그 결과 IPTG에 의해 PPIA 단백질이 잘 발현되는 것을 확인한 후, 단백질의 용해도를 확인하였다. 그 결과 IPTG에 의해 발현된 PPIA 단백질이 대부분이 불용성 형태를 형성하고, 일부가 가용성 형태를 형성하는 것을 확인하였다. 이와 같이 PPIA 단백질을 대량생산하였다. 실험에서 얻은 PPIA 단백질은 GST-tag을 가지므로, 글루타치온 세파로오즈 4 레진 칼럼을 이용하여 분리하였다. SDS-PAGE 전기영동을 행하여 PPIA 단백질의 함유 여부를 확인하였다. 전기영동 후 겔을 PVDF 맴브레인으로 옮긴 후 PPIA 모노클론 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행함으로써 그 분획의 PPIA 단백질 함유 여부를 확인하였다.

2. PPIA 단백질을 이용한 폴리클노날 항체의 제조

6∼8주 사이의 BALB/C 암컷 마우스에 마리당 10㎍의 PPIA 단백질을 완전 애주번트(complete adjuvant)를 이용하여 복강에 주사하고, 2주 뒤 마리당 10㎍의 PPIA 단백질을 불완전 애주번트(incomplete adjuvant)를 이용하여 복강에 주사하였다. 3일 뒤 안와채혈(eye bleeding)을 통해 혈액을 채취하여 항체의 역가를 확인하 였다. 1:1000이상의 역가에서 490nm에서의 OD값이 1.0을 넘지 않는다면 역가가 높아질 때까지 2주 간격으로 추가 역가상승(boosting)을 해주었다.

3. 특이성 검증

GFP 표지 발현벡터를 이용하여 융합단백 재조합 유전자를 일시적으로 발현시켜 웨스턴 블롯으로 그 특이성을 관찰하였다 (도 2). PPIA는 GFP 융합단백에 일치하는 밴드를 보여 주었다.

<실험예 4> 간암세포주 상청액에서의 PPIA발현.

간암세포주에서 단백질 발현을 비교하기 위하여 다클론항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다 (도 3). 이를 위하여 간암세포주를 배양한 후 상청액를 용출용액 (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 100 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM EDTA, 1 mM 소듐 오르쏘바나데이트, 10 ㎍/ml 아프로티닌, 10 ㎍/ml 류펩틴, 1 M PMSF)에 용출시킨 후 세포 용해액을 전기영동하고 나이트로셀룰로오즈 멤브레인 (Bio-Rad, CA, USA)에 블롯팅하였다. 면역블롯팅 멤브레인을 5% 탈지분유, 0.1% Tween 20이 포함된 PBS용액에 넣고 실온에서 2시간 동안 블로킹한 후 PPIA에 대한 항체 (1:5,000)로 2시간 동안 반응시킨 후, 5,000배 희석된 HRP가 접합된 2차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 강화된 화학발광검출키트(ECL assay kit, Pierce, IL, USA)로 현상하여 분석하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Huh-7, SKHep-1, HLK 1 세포주의 상등액에서 PPIA가 많이 발현됨을 확인할 수 있다. 이로부터 PPIA는 분비 단백질임을 알 수 있었다.

<실험예 5> 면역조직화학검사에 의한 간조직에서의 PPIA 발현.

면역조직화학 분석을 통해 여러 임상병리학적 양상을 보이는 간암조직에서 PPIA 단백질 발현을 조사하였다 (도 4). 이를 위하여 파라핀 포매 HCC (공여자 블록) 중심성 조직생검 (직경 2 mm)을 취하여 탈파라핀화와 항원복구공정을 거쳐, 슬라이드는 PPIA에 대한 다클론 항체 (1:1,000)로 라벨링하였으며, 라벨링된 PPIA는 아비딘-바이오틴 복합체 (ABC)법에 의해 분석하였다. 이때 크로모겐으로 3, 3'-디아미노벤지딘 (DAB)을 사용하였다. 항체에 대한 음성대조군으로 식염수를 사용하였으며 조직영역에서 세포의 10％ 이상이 균일하게 염색되면 양성으로 간주하였다.

면역조직화학 분석을 실시한 결과 PPIA는 전이암과 담관암 조직에서 발현이 증가되었으며, PPIA의 발현증가와 간암의 발전과 관련이 있음을 암시한다.

<실험예 6> 면역도트검사법에 의한 환자 혈청 중 PPIA 단백질의 측정

다클론 항체를 이용하여 면역도트 방법을 확립하고, 혈청 중 PPIA의 분비정도를 비교하였다. 나이트로 셀룰로오즈 멤브레인에 5배, 10배 희석한 혈청시료 (각 케이스당 10개체)를 2㎕씩 도트를 찍은 후 상온에서 건조시키고, 1% BSAT로 블로킹하였다.

PPIA에 대한 다클론 항체를 반응시킨 후 2차 항체 접합 HRP를 가하고 DAB로 발색시켰다. 발색된 정도를 스캔하여 발색정도를 비교하였다. 간암의 경우 정상보다 많이 분비되는 것을 알 수 있었다 (도 5).

<실험예 7> ELISA에 의한 환자 혈 중 PPIA 단백질 농도 측정

단일클론 항체와 다클론 항체를 이용하여 ELISA 방법을 확립하였다. 래빗에서 얻은 다클론 항체를 1㎍/㎖로 코팅한 후 1％ BSAT로 블로킹 하였다.

PPIA 표준액을 가한 후 PPIA에 대한 단일클론 항체 접합 HRP를 가하고, TMB로 현상하였다. ELISA 방법에 의하여 환자 혈청 중 PPIA 단백질 농도를 측정하였다. 정상인과 간암환자의 혈청을 희석하여 OD를 측정해 본 결과 간암의 경우 정상치보다 상승된 PPIA농도를 보였다 (도 6). 이 결과는 혈청내 PPIA 농도의 상승이 간암 발생과 연관이 있음을 뜻한다.

결론적으로 간암에서 PPIA 레벨은 진단 및 예후 인자로서의 가능성과 효용성이 큼을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 간암조직에서 PPIA의 발현정도를 나타내는 사진 (상: 노던블롯에 의한 간암환자의 비간암과 간암 조직에서 PPIA 발현 비교, 하: 간암분화단계별 PPIA 발현결과)

도 2는 PPIA 다클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의한 PPIA 단백질 발현결과.

도 3은 간암세포주 배양 상청액에서 PPIA의 발현정도를 보여주는 사진.

도 4는 면역조직화학 분석에 의한 PPIA 단백질의 발현을 확인한 사진.

도 5는 면역도트 분석에 의한 PPIA 분비의 차이를 보여주는 결과그래프.

도 6은 ELISA에 의한 간암시료와 정상시료의 희석곡선.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> PPIA Marker for diagnosis of liver cancer, antibody, and screening method of compounds useful to inhibiting liver cancer <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 498 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggtcaacc ccaccgtgtt cttcgacatt gccgtcgacg gcgagccctt gggccgcgtc 60 tcctttgagc tgtttgcaga caaggtccca aagacagcag aaaattttcg tgctctgagc 120 actggagaga aaggatttgg ttataagggt tcctgctttc acagaattat tccagggttt 180 atgtgtcagg gtggtgactt cacacgccat aatggcactg gtggcaagtc catctatggg 240 gagaaatttg aagatgagaa cttcatccta aagcatacgg gtcctggcat cttgtccatg 300 gcaaatgctg gacccaacac aaatggttcc cagtttttca tctgcactgc caagactgag 360 tggttggatg gcaagcatgt ggtgtttggc aaagtgaaag aaggcatgaa tattgtggag 420 gccatggagc gctttgggtc caggaatggc aagaccagca agaagatcac cattgctgac 480 tgtggacaac tcgaataa 498 <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Asn Pro Thr Val Phe Phe Asp Ile Ala Val Asp Gly Glu Pro 1 5 10 15 Leu Gly Arg Val Ser Phe Glu Leu Phe Ala Asp Lys Val Pro Lys Thr 20 25 30 Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Ser Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr 35 40 45 Lys Gly Ser Cys Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe Met Cys Gln Gly 50 55 60 Gly Asp Phe Thr Arg His Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly 65 70 75 80 Glu Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe Ile Leu Lys His Thr Gly Pro Gly 85 90 95 Ile Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe 100 105 110 Phe Ile Cys Thr Ala Lys Thr Glu Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val 115 120 125 Phe Gly Lys Val Lys Glu Gly Met Asn Ile Val Glu Ala Met Glu Arg 130 135 140 Phe Gly Ser Arg Asn Gly Lys Thr Ser Lys Lys Ile Thr Ile Ala Asp 145 150 155 160 Cys Gly Gln Leu Glu 165

Claims (10)

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6. (a)서열번호 1 기재 또는 이와 98% 이상의 상동성을 가지는 mRNA;

   (b)서열 번호 1 기재의 염기서열로 이루어지는 mRNA와 나트륨 농도 19~20mM, 온도 60~65℃인 스트린젠트한 조건하에서 혼성화하는 mRNA에 의해 코드 되며, 상기 염기서열에 의해 코드되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 mRNA;

   (c)환자의 혈청 중에 상기 (a) 또는 (b)의 mRNA에 의해 코드되는 단백질 또는 그 부분 펩티드;를 항원으로 하고, 상기 항원에 결합가능한 간암진단용 조성물

   을 포함하는 간암진단 장치.
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