KR101048626B1 - 재조합 키티나제 유전자를 발현하는 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

재조합 키티나제 유전자를 발현하는 미생물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명자들은 바실러스 튜린겐시스 키티나제의 촉매 도메인(Bt ChCD)과 도둑나방 또는 파밤나방 키티나제의 키틴 결합 도메인(Mb ChBD 또는 Se ChBD)을 재조합시킨 재조합 키티나제 ORF cDNA를 제작하였고, 이를 대장균 또는 바실러스 튜린겐시스에 형질전환시켰다. 그 결과, 상기 형질전환체의 증식률이 대조군에 비해 현저하게 증가하였고, 세포외 키티나제의 활성도 또한 대조군에 비해 현저하게 증가하였다. 또한, 상기 형질전환체를 연두금파리 유충에 도포한 결과, 현저한 사멸 효과가 확인되었다.

Description

재조합 키티나제 유전자를 발현하는 미생물 및 이의 용도{Microorganism expressing recombinant chitinase gene and uses thereof}
본 발명은 재조합 키티나제 유전자를 발현하는 미생물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세균 또는 곰팡이 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Chitinase Catalytic Domain: ChCD) 및 곤충 또는 절지동물 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Chitin-Binding Domain: ChBD)를 재조합시킨 재조합 키티나제 유전자(ChCD/ChBD)를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 해충 방제용 미생물 제제, 상기 미생물 제제를 이용하여 해충을 방제하는 방법, 상기 숙주세포를 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 미생물 제제 및 상기 미생물 제제를 절지동물의 외피 부산물에 처리하여 외피의 키틴을 분해하는 단계를 포함하는 바이오매스의 생산 방법에 관한 것이다.
키티나제(chitinase)는 곤충 외골격의 분해 및 발생에 관여하는 효소로서 특히 탈피와 변태를 일으키는 곤충류의 배후발생에 필수적일 뿐만 아니라, 각종 세균 및 곰팡이류 등의 증식에도 관여한다. 생체를 구성하는 키틴 성분은 단당류 단위체인 글루코사민(GlcN)과 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)이 글리코시드 결합(glycosidic bond)을 형성하며, 다시 개개의 사슬들이 수소결합으로 연결되어 있기 때문에 물리적 강도가 대단히 높아 분해가 어려운 물질이다. 이러한 물리화학적 특성으로 인해 키틴은 절지동물(가축 외부 기생충류, 곤충류, 갑각류 등)의 외골격 및 조류(algae), 곰팡이(fungi), 효모(yeast) 등의 세포벽에 존재하면서 매우 효과적인 보호 작용을 수행한다. 키티나제는 상기 키틴을 일차적으로 분해하는 주요 효소로서, 키틴 중합체를 키틴-올리고당(oligosaccharide)으로 전환시켜 키틴의 구성단위인 GlcN 및 GlcNAc로의 분해를 가능하게 한다.
곤충의 키티나제를 암호화하는 유전자는 ORF (open reading frame) 내에 키티나제가 기질에 강력히 부착할 수 있는 특성을 부여하는 키틴-결합 도메인(ChBD)이 존재하며, 상기 특성이 키티나제의 활성을 결정하는데 큰 영향을 미친다. 곤충 병원성 미생물에 특정 곤충의 키틴-결합 도메인이 부가된 혼성체(hybrid) 키티나제 ORF cDNA를 형질도입시킴으로써 고성능 재조합 키티나제의 기능적 발현을 유도하고, 이를 가축 외부 기생충에 감염시키면, 정상적인 배후발생을 차단할 뿐만 아니라 외골격(cuticle)의 직접적인 파괴(degradation) 작용도 수행하므로 효과적이고 지속적인 해충구제 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명은 재조합 혼성체(hybrid) 키티나제를 이용하여 각종 해충들(진드기, 벼룩, 이 및 쇠파리 등)의 외골격 형성을 억제하거나 파괴시킬 수 있는 가축 외부 기생충 구충제의 생명공학적 제조 기술을 개발하고자 한 것이다. 본 발명에 높은 역가의 키티나제를 활용하기 위해서는 자연 상태에서 분리된 효소보다 활성이 높고 다양한 환경 조건에서 작용할 수 있는 재조합체가 필요하다. 이를 위해 우선적으로 여러 종의 곤충류로부터 키티나제를 암호화하는 cDNA를 분리한 다음, 이들을 대장균에서 발현시켜 높은 활성의 키티나제를 선발하고, 적절한 제한효소자리가 포함된 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 키틴-결합 기능에 관여하는 키틴-결합 도메인(ChBD) cDNA 절편을 확보하였다. 상기 확보된 절편을 벡터에 삽입하고 이를 다시 대장균에 도입시켜 키틴-결합 도메인을 증폭시켰다. 상기 증폭된 곤충 키틴-결합 도메인을 DNA 셔플링(shuffling) 기법을 통해 곤충 병원성 미생물의 키티나제-암호화 cDNA의 촉매 도메인(ChCD)과 혼성화한 다음, 대장균에 형질전환시켜 구조가 변경된 키티나제의 기능적 발현도를 확인하여 고성능의 혼성체 키티나제를 확보하였다. 결과적으로 높은 역가가 확인된 혼성체 키티나제 ORF cDNA를 병원성 세균인 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis, Bt)에 형질도입시키고, 이를 가축 외부기생충에 처리하면 해충의 발생이 저해되거나 사멸시킬 수 있으므로 강력한 생물학적 구충제로 이용될 수 있다. 또한 본 발명은 각종 농작물의 해충들에도 적용할 수 있으므로 시장성이 매우 크다고 할 수 있다.
화학 살충제의 사용은 생태계에서의 문제뿐만 아니라 가축 및 인류의 건강마저 위협하고 있는 상황이다. 현재 외부 기생충은 매우 광범위하게 가축에 퍼져 있으나 영구적인 제거가 어려운 실정이므로, 내성의 증가와 부작용이 우려되는 외부 기생충제제의 사용을 대체할 수 있는 친환경적 생물학적 제제의 개발이 절실하다. 본 발명의 생명공학적 기생충 제제 생산 기술은 아직 전 세계적으로도 시도된 바 없는 것으로서, 애완동물 및 축산 현장에 적용가능해 경제적으로 큰 가치가 있다.
한국공개특허 제2006-0073261호에는 파리 유충 억제용 미생물 제제가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0628416호에는 키티나제를 생산하는 바실러스 균주를 포함하는 생물학적 제제가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Bt ChCD) 및 곤충 유래 키틴-결합 도메인 유전자(ChBD)를 재조합시킨 재조합 키티나제 유전자(Bt ChCD/ChBD)로 형질전환된 숙주세포가 해충의 사멸에 효과적이라는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 세균 또는 곰팡이 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Chitinase Catalytic Domain: ChCD) 및 곤충 또는 절지동물 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Chitin-Binding Domain: ChBD)를 재조합시킨 재조합 키티나제 유전자(ChCD/ChBD)를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 활성이 증진된 키티나제를 생산하는 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 해충 방제용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 해충에 처리하여 해충을 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 절지동물의 외피 부산물에 처리하여 외피의 키틴을 분해하는 단계를 포함하는 바이오매스의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 해충 방제용 미생물 제제는 자연환경에 무해하면서 목적 해충(진드기, 벼룩, 이, 쇠파리 등)에만 선택적 독성을 나타낸다. 생물학적 특성상 즉각적인 살충효과는 기존의 화학적 살충제에 비해 다소 떨어질 수 있으나, 환경에 잔존하여 반복적이고 지속적인 살충효과를 나타낼 수 있는 점을 감안하면 장기적으로는 기존의 살충제에 비하여 훨씬 더 우수한 효과가 기대된다.
도 1은 도둑나방(Mamestra brassicae)의 표피로부터 증폭된 키티나제의 부분 도메인(570 bp)을 암호화하는 PCR 산물을 나타낸 것이다. 레인 1: 부분 도메인의 절편, M: 사이즈 마커.
도 2는 도둑나방의 표피로부터 증폭된 키티나제-암호화 cDNA의 RACE PCR 산물을 나타낸 것이다. 레인 5': pCR2.1 벡터에서 5' 말단의 삽입, 레인 3': pCR2.1 벡터에서 3' 말단의 삽입, M: 사이즈 마커.
도 3은 도둑나방의 표피로부터 증폭된 키티나제의 ORF cDNA를 나타낸 것이다. 레인 1: 전장 ORF cDNA, M: 사이즈 마커.
도 4는 파밤나방의 표피로부터 증폭된 키티나제의 ORF cDNA를 나타낸 것이다. 레인 1: 전장 ORF cDNA, M: 사이즈 마커.
도 5는 곤충류 키티나제 ORF를 포함하는 재조합 벡터 pCR2.1-Mb Chit(A) 및 pCR2.1-Se Chit(B)를 나타낸 모식도이다.
도 6은 바실러스 튜린겐시스의 게놈 DNA로부터 증폭된 키티나제의 ORF cDNA를 나타낸 것이다. 레인 1: 전장 ORF cDNA, M; 사이즈 마커.
도 7은 바실러스 튜린겐시스 키티나제 ORF를 포함하는 재조합 벡터 pCR2.1-Bt Chit를 나타낸 모식도이다.
도 8은 도둑나방의 전장 키티나제 cDNA로부터 증폭된 키틴-결합 도메인을 나타낸 것이다. 레인 1: cDNA 절편, M: 사이즈 마커.
도 9는 파밤나방의 전장 키티나제 cDNA로부터 증폭된 키틴-결합 도메인을 나타낸 것이다. 레인 1: cDNA 절편, M: 사이즈 마커.
도 10은 바실러스 튜린겐시스의 전장 키티나제 cDNA로부터 증폭된 촉매 도메인을 나타낸 것이다. 레인 1: cDNA 절편, M: 사이즈 마커.
도 11은 바실러스 튜린겐시스 키티나제 촉매 도메인 유전자(Bt ChCD) 및 도둑나방 키틴-결합 도메인 유전자(Mb ChBD)의 혼성체(hybrid) cDNA를 나타낸 것이다. 레인 1: Bt ChCD/Mb ChBD cDNA, M: 사이즈 마커.
도 12는 바실러스 튜린겐시스 키티나제 촉매 도메인 유전자(Bt ChCD) 및 파밤나방 키틴-결합 도메인 유전자(Se ChBD)의 혼성체 cDNA를 나타낸 것이다. 레인 1: Bt ChCD/Se ChBD cDNA, M: 사이즈 마커.
도 13은 Bt ChCD/Mb ChBD 및 Bt ChCD/Se ChBD cDNA를 나타낸 것이다. 레인 1: 클로닝 벡터에 Bt ChCD/Mb ChBD의 삽입, 레인 2: 클로닝 벡터에 Bt ChCD/Se ChBD의 삽입, C: 대조군 벡터, M: 사이즈 마커.
도 14는 재조합 벡터 pCR2.1-Bt ChCD/Mb ChBD(A) 및 pCR2.1-Bt ChCD/Se ChBD(B)를 나타낸 모식도이다.
도 15는 야생형(A) 및 Bt Chit(B), Mb Chit(C), Se Chit(D)로 각각 형질전환된 대장균 사이에 증식률을 비교한 것이다.
도 16은 야생형(A) 및 Bt Chit(B), Mb Chit(C), Se Chit(D)로 각각 형질전환된 대장균에서 글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 17은 야생형(A) 및 Bt Chit(B), Mb Chit(C), Se Chit(D)로 각각 형질전환된 대장균 사이에 세포내 글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 함량을 비교한 것이다.
도 18은 Bt Chit(A), Bt ChCD/Mb ChBD(B) 및 Bt ChCD/Se ChBD(C)로 각각 형질전환된 대장균 사이에 증식률을 비교한 것이다.
도 19는 Bt ChCD/Mb ChBD(A) 및 Bt ChCD/Se ChBD(B)로 형질전환된 대장균에서 글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 20은 Bt Chit(A), Bt ChCD/Mb ChBD(B) 및 Bt ChCD/Se ChBD(C)로 형질전환된 대장균에서 세포내 글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 함량을 비교한 것이다.
도 21은 Bt Chit(A) 및 Bt ChCD/Mb ChBD(B)로 형질전환된 바실러스 튜린겐시스 균주 사이에 증식률을 비교한 것이다.
도 22는 Bt Chit(A) 및 Bt ChCD/Mb ChBD(B)로 형질전환된 바실러스 튜린겐시스 균주에서 글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 23은 Bt Chit(A) 및 Bt ChCD/Mb ChBD(B)로 형질전환된 바실러스 튜린겐시스 균주 사이에 세포내 글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 함량을 비교한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세균 또는 곰팡이 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Chitinase Catalytic Domain: ChCD) 및 곤충 또는 절지동물 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Chitin-Binding Domain: ChBD)를 재조합시킨 재조합 키티나제 유전자(ChCD/ChBD)를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 키티나제 촉매 도메인 유전자(ChCD)는 세균 또는 곰팡이 유래이며, 바람직하게는 세균 유래이며, 더욱 바람직하게는 바실러스 속 유래이며, 더 더욱 바람직하게는 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Bt ChCD)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 키티나제 촉매 도메인 유전자로서, 본 발명의 실시예에서는 Bt ChCD를 이용하였으나, Bt ChCD에 한정되지 않고, 키티나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 키틴-결합 도메인 유전자(ChBD)는 곤충 또는 절지동물 유래이며, 바람직하게는 곤충 유래이며, 더욱 바람직하게는 도둑나방(Mamestra brassicae) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Mb ChBD) 또는 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Se ChBD)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 키틴-결합 도메인 유전자로서, 본 발명의 실시예에서는 Mb ChBD 또는 Se ChBD를 이용하였으나, Mb ChBD 또는 Se ChBD에 한정되지 않고, 키틴-결합 도메인을 코딩하는 유전자이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Bt ChCD)는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 도둑나방(Mamestra brassicae) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Mb ChBD)는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Se ChBD)는 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 내지 3의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 Bt ChCD, Mb ChBD 또는 Se ChBD 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
Bt ChCD, Mb ChBD 또는 Se ChBD 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환되어 활성이 증진된 키티나제를 생산하는 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 튜린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 곰팡이, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
상기 숙주세포는 바람직하게는 세균 또는 곰팡이 유래이며, 상기 세균은 바람직하게는 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 또는 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 해충 방제용 미생물 제제를 제공한다. 상기 해충은 파리목, 진드기목, 벼룩목 또는 이목 해충일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 해충은 파리목 해충일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 해충 방제용 미생물 제제를 해충에 처리하여 해충을 방제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 해충 방제용 미생물 제제는 예를 들어 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 해충 방제용 미생물 제제는 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도한 목적에 의존하는데, 모든 경우에 본 발명에 따른 미생물 제제의 분포가 가능한 한 미세하고 균일하도록 해야 한다.
본 발명의 해충 방제용 미생물 제제는 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로서 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은
세균 또는 곰팡이 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(ChCD) 및 곤충 또는 절지동물 유래 키틴-결합 도메인 유전자(ChBD)를 재조합하는 단계;
상기 제조된 재조합 키티나제 유전자(ChCD/ChBD)를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환체를 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.
상기 키티나제 촉매 도메인 유전자(ChCD)는 세균 또는 곰팡이 유래이며, 바람직하게는 세균 유래이며, 더욱 바람직하게는 바실러스 속 유래이며, 더 더욱 바람직하게는 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Bt ChCD)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 키틴-결합 도메인 유전자(ChBD)는 곤충 또는 절지동물 유래이며, 바람직하게는 곤충 유래이며, 더욱 바람직하게는 도둑나방(Mamestra brassicae) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Mb ChBD) 또는 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Se ChBD)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Bt ChCD)는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 도둑나방(Mamestra brassicae) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Mb ChBD)는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Se ChBD)는 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주세포는 바람직하게는 세균 또는 곰팡이 유래이며, 상기 세균은 바람직하게는 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 또는 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 바람직하게는 해충 방제용으로 이용될 수 있다. 상기 해충은 파리목, 진드기목, 벼룩목 또는 이목 해충일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 해충은 파리목 해충일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 절지동물의 외피 부산물에 처리하여 외피의 키틴을 분해하는 단계를 포함하는 바이오매스의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 미생물 제제를 이용하여 현재 수산업계서 폐기시키고 있는 새우, 게, 가재류 등 각종 절지동물류의 외피(integument) 부산물의 키틴 성분을 분해시킬 수 있고, 이를 통해 발생된 키틴 분해 산물에 연속적인 발효공정을 적용함으로써 포도당이나 에탄올 등의 산업자원을 생산할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
곤충 시료
완전변태 곤충인 도둑나방(Mamestra brassicae) 및 파밤나방(Spodoptera exigua)의 유충을 생장 챔버 내에서 배추를 먹이로 온도 25±1℃, 상대습도 60% 및 광주기 16:8 (L:D)에서 사육하면서, 유충 시기에 표피조직을 적출하고 100 mg 당 1 ml의 TRIzol 시약(Gibco BRL, USA)를 가하여 -70℃에서 보관하였다. TRIzol 시약 속에 있는 표피 조직을 마이크로-막자(micro-pestle)를 사용하여 파쇄한 후, TRIzol 1 ml 당 0.2 ml의 클로로포름을 가하여 15초 동안 강하게 교반한 다음, 원심분리(12,000×g, 15분)를 실시하여 상등액을 분리하였다. 상기 상등액에 이소프로판올을 가하여 진탕한 후, 다시 원심분리(12,000×g, 10분)하여 총 RNA를 확보하였다. 총 RNA 펠렛에 75% 에탄올을 가하여 볼텍싱한 후 원심분리(7,500×g, 5분)하여 상등액을 제거한 다음, 총 RNA 펠렛을 실온에서 공기 건조시켰다. 총 RNA의 농도는 DEPC-H2O로 총 RNA 펠렛을 용해한 다음 분광광도계(Spectronic Genesys 5)를 이용하여 파장 260 nm에서 측정하였다.
총 RNA 200 ㎍을 1 ㎍ 올리고(dT) 프라이머와 70℃에서 10분간 반응시킨 후, 얼음 위에서 5분간 정치한 다음, 제1가닥 5×완충액, RNasin 리보뉴클리아제 억제제 40 유닛, 피로인산 나트륨 40 mM 및 AMV 역전사 효소 30 유닛을 첨가하고 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 제1가닥 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 제1가닥 반응 산물 20 ㎕에 제2가닥 2.5×완충액, DNA 중합효소 23 유닛 및 RNase H 0.8 유닛을 첨가하고, 증류수를 이용하여 총 부피를 100 ㎕로 맞추어 14℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액을 다시 70℃에서 10분간 가열한 다음, 얼음에 정치시킨 상태에서 T4 DNA 중합효소 2 유닛을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 200 mM의 EDTA 10 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰다. cDNA의 회수를 위하여 반응액에 동량의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1)을 첨가하여 볼텍싱한 후, 원심분리(15,000×g, 2분) 하여 얻은 상등액에 0.1배 부피의 2.5 M 아세트산 나트륨(pH 5.2)과 2.5배 부피의 100% 에탄올(-20℃)을 넣어 -70℃에서 30분간 정치시켰다. 그 후, 원심분리(15,000×g, 10분)를 통해 침전시킨 cDNA 펠렛을 70% 에탄올(-20℃)로 세척한 후 최종적으로 적정 양의 증류수에 용해시켰으며, 분광광도계를 이용하여 260 nm에서 cDNA의 농도를 측정하였다.
곤충류 키티나제 -암호화 cDNA 의 분리
도둑나방 키티나제 -암호화 cDNA 의 부분 도메인 제작
키티나제의 부분 도메인을 증폭시키기 위해, 기존에 보고된 곤충류 키티나제들의 염기서열을 토대로 cDNA 주형 상에서 타겟 서열을 혼성화 하도록 유전자 특이 5' 프라이머(5'-GCCAATTTCAGGCTGATGGA-3'; 서열번호 4) 및 3' 프라이머(5'-TCCCTTGAAGTCGTCCATGT-3'; 서열번호 5)를 제작하였다. PCR은 표 1의 조건으로 PTC-100 Programmable Thermal Cycler (MJ Resaech, Inc)를 사용하여 0.25 mM dNTP, 0.2 mM MgCl2, 각 10 μM 및 20 μM의 5' 및 3' 프라이머, 및 100 ng cDNA 주형으로 이루어진 50 ㎕의 반응 부피로 실시하였으며, 상기 주형으로는 도둑나방 표피 조직에서 추출한 총 RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 전인큐베이션(preincubation)한 후, 80℃에서 0.4 ㎕ Taq 중합효소(TaKaRa Ex-Taq)를 첨가함으로써 개시하였다. 상기 증폭된 570 bp의 cDNA 절편을 아가로스 겔 상에서 전기영동을 통해 확인 및 정제한 다음(도 1), TA 클로닝 kit (Invitrogen)를 사용하여 pCR 2.1 벡터에 삽입하고, 염기서열을 분석함으로써 도둑나방 표피조직 키티나제 cDNA (Mb Chit)의 부분 도메인임을 확인하였다.
Figure 112011009798931-pat00001
도둑나방 키티나제 -암호화 cDNA 의 5′및 3′말단 제작
구조 분석을 통해 키티나제를 암호화하는 것으로 확인된 cDNA 부분 도메인의 염기서열을 토대로, ORF의 5′및 3′말단을 증폭시키기 위해 유전자-특이 RACE 프라이머를 제작하였다. 5' 말단 프라이머 (5'-TCCCTTGAAGTCGTCCATGT-3'; 서열번호 5), 3' 말단 프라이머 (5'-GCCAATTTCAGGCTGATGGA-3'; 서열번호 4).
RACE PCR은 Marathon cDNA amplification kit (Clontech)를 이용하여 만든 Ap1 어댑터(adaptor)가 부착된 cDNA를 주형으로 하여 Hot Start Taq DNA 중합효소(Takara)를 사용하여 수행하였다(표 2). 양 말단을 충족하는 충분한 길이의 PCR 산물을 전기영동을 통해 확인 및 정제하였으며(도 2), 이를 각각 pCR2.1 벡터에 삽입하고 캄피턴트 세포(competent cell)에 클로닝하여 개시코돈(ATG) 및 종결코돈(TAG)이 포함된 5' 및 3' 말단의 염기서열을 확인하였다.
Figure 112011009798931-pat00002
도둑나방 키티나제 -암호화 cDNA 의 전장 ORF cDNA 제작
RACE PCR을 통해 확인된 도둑나방 키티나제의 개시코돈(ATG) 및 종결코돈(TAG)이 포함된 5' 및 3' 말단의 염기서열을 토대로 전장 ORF cDNA를 증폭시키기 위해, 각 ORF들의 개시 및 종결 부위에 상응하는 유전자 특이 프라이머를 제작하였다. 5' 프라이머 (5'-ATGAGAGCTATACTAGCGACGTTG-3'; 서열번호 6), 3' 프라이머 (5'-CTAAGGCTCGCAGTCGGCGCGGTC-3'; 서열번호 7). 상기 프라이머를 이용하여 표 3의 조건으로 PCR을 실시하였다. 상기 증폭된 전장 ORF cDNA들의 크기를 아가로스 겔 상에서 확인하고(도 3), pCR2.1 벡터에 삽입 및 캄피턴트 세포에 클로닝하였다. 그 후, 염기서열을 분석하여 총 1,689 bp의 도둑나방 키티나제-암호화 cDNA의 전장 ORF cDNA (Mb Chit)를 제작하였다.
Figure 112011009798931-pat00003
파밤나방 키티나제 -암호화 cDNA 의 전장 ORF cDNA 제작
NCBI의 유전자은행(AY678531)을 통해 확인된 파밤나방 키티나제의 개시코돈(ATG) 및 종결코돈(TAG)이 포함된 5' 및 3' 말단의 염기서열을 토대로 전장 ORF cDNA를 증폭시키기 위해, 각 ORF의 개시 및 종결 부위에 상응하는 유전자 특이 프라이머를 제작하였다. 5' 프라이머 (5'-ATGAGAGCGATACTGGCG-3'; 서열번호 8), 3' 프라이머 (5'-CTAAGGCTCGCAGTCTTGACG-3'; 서열번호 9). 상기 프라이머를 이용하여 표 4의 조건으로 PCR을 실시하였다. 증폭된 전장 ORF cDNA들의 크기를 아가로스 겔 상에서 확인하고(도 4), pCR2.1 벡터에 삽입 및 캄피턴트 세포에 클로닝하였다. 그 후, 염기서열을 분석하여 총 1,674 bp의 파밤나방 키티나제-암호화 cDNA의 전장 ORF cDNA (Se Chit)를 제작하였다.
Figure 112011009798931-pat00004
대장균에서의 Mb Chit 및 Se Chit 의 발현
1,689 bp의 도둑나방 키티나제 전장 ORF cDNA (Mb Chit) 및 1,674 bp의 파밤나방 키티나제 전장 ORF cDNA (Se Chit)를 대량으로 클로닝한 다음, 상기 클로닝된 곤충류 키티나제 ORF를 pCR2.1 DNA의 lac-프로모터 후방에 위치하도록 각각 라이게이션(pCR2.1-Mb Chit 및 pCR2.1-Se Chit) 하였다(도 5). 상기 유전자는 대장균에서 발현되는 lac-P(프로모터)에 의하여 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside)가 포함된 배지에서 전사가 개시되며, ORF 내의 tag-T(종결코돈)에 의하여 전사가 종결되도록 유도하였다.
바실러스 튜린겐시스 ( Bacillus thuringiensis , Bt ) 키티나제 -암호화 cDNA 의 분리
게놈 cDNA 의 라이브러리 제작
바실러스 튜린겐시스(Bt)의 게놈 cDNA 라이브러리를 제작하기 위하여, Bt를 LB 액체 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 진탕 배양한 후, 5,000×g로 원심분리하여 세포를 회수하였다. 상기 수집된 세포에 멸균수 2 ml을 가하여 5분 동안 끓임으로써 세포를 파쇄하고, 세포 추출물을 -20℃에서 5분간 응집시킨 후, 10,000×g로 10분간 원심분리하여 세포 파편들을 침강시켰다. cDNA가 포함된 상등액을 대상으로 재차 원심분리(15,000×g, 10분)하여, 침전된 cDNA 펠렛을 70% 에탄올(-20℃)로 세척한 후, 회수된 펠렛을 100 ㎕의 증류수에 용해시켰으며, 총 cDNA의 농도는 분광광도계를 이용하여 260 nm에서 측정하여 산출하였다.
Bt 의 키티나제 -암호화 cDNA 의 전장 ORF cDNA 제작
NCBI의 유전자은행(AY074882)을 통해 확인된 바실러스 튜린겐시스 키티나제의 개시코돈(ATG) 및 종결코돈(TAG)이 포함된 5' 및 3' 말단의 염기서열을 토대로 전장 ORF cDNA를 증폭시키기 위해, 각 ORF의 개시 및 종결 부위에 상응하는 유전자 특이 프라이머를 제작하였다. 5' 프라이머 (5'-ATGAGGTCTCAAAAATTCACA-3'; 서열번호 10), 3' 프라이머 (5'-CTAGTTTTCGCTAATGACG-3'; 서열번호 11). 상기 프라이머를 이용하여 상기에서 제작된 게놈 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 표 5의 조건으로 PCR을 실시하였다. 증폭된 전장 ORF cDNA들의 크기를 아가로스 겔 상에서 분석하고(도 6), pCR2.1 벡터에 삽입 및 캄피턴트 세포에 클로닝하여 총 2,025 bp 길이인 바실러스 튜린겐시스의 키티나제-암호화 cDNA의 전장 ORF cDNA (Bt Chit)를 제작하였다.
Figure 112011009798931-pat00005
대장균에서 Bt Chit 의 발현 유도
2,025 bp의 바실러스 튜린겐시스 키티나제 전장 ORF cDNA (Bt Chit)를 대량으로 클로닝한 후 대장균에서 발현시키기 위하여, Bt 키티나제 ORF를 pCR2.1 DNA의 lac-프로모터 후방에 위치하도록 각각 라이게이션(pCR2.1-Bt Chit) 하였다(도 7). 상기 유전자는 대장균에서 발현되는 lac-P(프로모터)에 의하여 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)가 포함된 배지에서 전사가 개시되며, ORF 내의 tag-T(종결코돈)에 의하여 전사가 종결되도록 제작하였다.
곤충류 키틴-결합 및 Bt 촉매 도메인의 제작
도둑나방 키틴-결합 도메인 cDNA 절편의 증폭
도둑나방 키티나제 전장 ORF cDNA를 통해 분석된 염기서열을 토대로 키틴-결합 도메인 cDNA를 증폭시키기 위해, 키틴-결합 부위에 상응하는 유전자 특이 프라이머를 제작하였으며, 5' 프라이머에는 Sac I 제한효소자리를 부가하여 BT cDNA와의 혼성화를 유도하고자 하였다. 5' 프라이머 (5'-GACTCTGCAGCTCTGAAGACGAT-3'; 서열번호 12), 3' 프라이머 (5'-CTAAGGCTCGCAGTCGGCGCGGTC-3'; 서열번호 7). 상기 프라이머를 이용하여 상기에서 제작된 키티나제 전장 ORF cDNA를 주형으로 하여 표 6의 조건으로 PCR을 실시하였다. 상기 증폭된 키틴-결합 도메인 cDNA의 크기를 아가로스 겔 상에서 분석하여(도 8), 162 bp (54 아미노산)인 도둑나방의 키틴-결합 도메인 cDNA 절편(Mb ChBD)을 제작하였다.
Figure 112011009798931-pat00006
파밤나방 키틴-결합 도메인 cDNA 절편의 증폭
파밤나방 키티나제 전장-ORF cDNA를 통해 분석된 염기서열을 토대로 키틴-결합 도메인 cDNA를 증폭시키기 위해, 키틴-결합 부위에 상응하는 유전자 특이 프라이머들을 제작하였으며, 5' 프라이머에는 Sac I 제한효소자리를 부가하여 Bt cDNA와의 혼성화를 유도하고자 하였다. 5' 프라이머 (5'-GACCTCTGCAACTCTGAAGAAGAAGAT-3'; 서열번호 13), 3' 프라이머 (5'-CTAAGGCTCGCAGTCTTGACG-3'; 서열번호 9). 상기 프라이머를 이용하여 상기에서 제작된 키티나제 전장 ORF cDNA를 주형으로 하여 표 7의 조건으로 PCR을 실시하였다. 상기 증폭된 키틴-결합 도메인 cDNA의 크기를 아가로스 겔 상에서 분석하여(도 9), 162 bp (54 아미노산)인 파밤나방의 키틴-결합 도메인 cDNA 절편(Se ChBD)을 제작하였다.
Figure 112011009798931-pat00007
Bt 촉매( catalytic ) 도메인 cDNA 절편의 증폭
Bt 키티나제 전장 ORF cDNA를 통해 분석된 염기서열을 토대로 촉매 도메인 cDNA를 증폭시키기 위해, 촉매 부위를 포함하는 유전자 특이 프라이머를 제작하였으며, 3' 프라이머 에는 Sac I 제한효소자리를 부가하여 곤충 cDNA들과의 혼성화를 유도하고자 하였다. 5' 프라이머 (5'-ATGAGGTCTCAAAAATTCACA-3'; 서열번호 10), 3' 프라이머 (5'-GAGCTCTGAAAATGTAGCAGTACC-3'; 서열번호 14). 상기 프라이머를 이용하여 상기에서 제작된 Bt 키티나제 전장 ORF cDNA를 주형으로 하여 표 8의 조건으로 PCR을 실시하였다. 상기 증폭된 촉매 도메인 cDNA의 크기를 아가로스 겔 상에서 분석하여(도 10), 1,752 bp (584 아미노산)인 Bt의 촉매 도메인 cDNA 절편(Bt ChCD)을 제작하였다.
Figure 112011009798931-pat00008
혼성체( hybrid ) 키티나제 ORF cDNA 의 제작
Bt ChCD / Mb ChBD 재조합
Bt 키티나제 전장 ORF cDNA로부터 증폭한 Sac I 제한효소자리가 부착된 1,752 bp (584 아미노산)의 Bt 촉매 도메인이 포함된 cDNA 절편(Bt ChCD)을 100 ng/㎕로 농축한 다음, Sac I으로 절단하여 3' 점착성(sticky) 말단을 확보하였다. 또한 Bt ChCD에 도둑나방 키틴-결합 도메인을 결합하기 위하여, 상기 증폭된 162 bp (54 아미노산) cDNA 절편(Mb ChBD)을 동일 제한효소로 절단하여 5' 점착성 말단을 제조하였다. 그리고 Bt ChCD 2 ㎕ 및 Mb ChBD 2 ㎕, T4 ligase 4U, 10×라이게이션 완충액 1 ㎕를 혼합한 후, 최종 부피 10 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하여 15 ℃에서 6시간 동안 반응시키고, 동일 제한효소에 의해 절단된 cDNA의 상보적인 점착성 말단을 서로 연결함으로써 Bt ChCD/Mb ChBD 재조합을 수행하였다. 그 후, 전기영동을 통하여 약 1.9 kb인 혼성체 키티나제 ORF cDNA를 확인하였다(도 11).
Bt ChCD / Se ChBD 재조합
Bt 키티나제 전장 ORF cDNA로부터 증폭한 SacI 제한효소자리가 부착된 1,752 bp (584 아미노산)의 Bt 촉매 도메인이 포함된 cDNA 절편(Bt ChCD)을 100 ng/㎕로 농축한 다음, Sac I으로 절단하여 3' 점착성 말단을 확보하였다. 또한 Bt ChCD에 파밤나방 키틴-결합 도메인을 결합하기 위하여 상기 증폭된 162 bp(54 아미노산) cDNA 절편(Se ChBD)을 동일 제한효소로 절단하여 5' 점착성 말단을 제조하였다. 그리고 Bt ChCD 2 ㎕ 및 Se ChBD 2 ㎕, T4 ligase 4U, 10× 라이게이션 완충액 1 ㎕를 혼합한 후, 최종 부피 10 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하여 15℃에서 6시간 동안 반응시키고, 동일 제한효소에 의해 절단된 cDNA의 상보적인 점착성 말단을 서로 연결함으로써 Bt ChCD/Se ChBD 재조합을 수행하였다. 그 후, 전기영동을 통하여 약 1.9 kb인 혼성체 키티나제 ORF cDNA를 확인하였다(도 12).
Bt ChCD / Mb ChBD 및 Bt ChCD / Se ChBD 혼성체 의 확인
약 1.9 kb의 Bt ChCD/Mb ChBD 및 Bt ChCD/Se ChBD cDNA를 각각 클로닝 벡터에 삽입 및 캄피턴트 세포에서 증폭한 후, 염기서열을 분석하여 종결코돈을 포함하는 총 1,929 bp의 재조합 혼성체 키티나제-암호화 cDNA의 전장 ORF cDNA(Bt ChCD/Mb ChBD 및 Bt ChCD/Se ChBD)의 염기서열을 각각 확인하였다(도 13). 염기서열로부터 연역되는 아미노산의 구성은 MacVector 7.0 software suite(Oxford Molecular 사)를 사용하여 분석하였고, 다중 서열정열은 ClustalW (1.4) 알고리즘으로 수행하였다.
대장균에서 Bt ChCD / Mb ChBD 및 Bt ChCD / Se ChBD 의 발현
개시 및 종결코돈을 모두 포함하는 총 1,929 bp의 혼성체 키티나제-암호화 cDNA의 전장 ORF cDNA (Bt ChCD/Mb ChBD, Bt ChCD/Se ChBD)들을 대량으로 클로닝한 후, 대장균에서의 발현을 유도하기 위하여 Bt 및 곤충류 혼성체 키티나제 ORF를 pCR2.1 벡터 DNA의 lac-프로모터 후방에 위치하도록 각각 라이게이션(pCR2.1-Bt ChCD/Mb ChBD, pCR2.1-Bt ChCD/Se ChBD) 하였다(도 14). 상기 유전자는 대장균에서 발현되는 lac-P(프로모터)에 의하여 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)가 포함된 배지에서 전사되며, ORF 내의 tag-T(종결코돈)에 의하여 전사가 종결되도록 재조합되었다.
대장균의 형질전환
LB 플레이트에 배양한 XL1 blue 대장균 균주 중 우수한 콜로니를 선발하고, LB 액체 배지에 접종하여 37℃, 225 rpm으로 배양하면서 OD600 파장에서 흡광도가 0.2일 때의 세포를 원심분리(1,500×g, 20 분)를 이용하여 회수하였다. 상기 회수된 세포를 증류수로 세척한 다음, 0.1 M CaCl2 용액 1 ml에 세포를 현탁하였으며, 이후 20분간 1,500×g에서 원심분리하고 다시 동일 용액 0.5 ml에 현탁하였다. 상기 제조된 대장균 용액 200 ㎕에 구조변경 혼성체 키티나제 전장 ORF cDNA (pCR2.1-Bt ChCD/Mb ChBD 및 pCR2.1-Bt ChCD/Se ChBD) 10 ㎕를 가한 후, 얼음에서 30 분간 정치하였고, 그 후 즉시 42℃에서 30초 동안 열 충격을 가한 다음, 다시 얼음에서 5분간 반응시켰다. 상기 반응액에 LB 액체배지 800 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양 한 후, 원심분리(3,000×g, 1분)를 통해 세포 펠렛을 회수하였다. 상기 세포를 LB 액체배지 100 ㎕에 재현탁한 다음, LB-암피실린 배지 플레이트에 도말하여 37℃에서 1~2 일간 배양하면서 흰색 콜로니(white colony)를 선발하였다. 상기 선발된 콜로니를 대상으로 미니-프렙(mini-prep) 및 염기서열 분석을 실시하여 형질전환을 확인하였다.
Bt 의 형질전환
NB 플레이트에 배양한 Bt 균주 중 우수한 콜로니를 선발하고, LB 액체 배지에 접종하여 37℃, 225 rpm으로 배양하면서 OD600 파장에서 흡광도가 0.2일 때의 세포를 원심분리(1,500×g, 20분)를 이용하여 회수하였다. 상기 회수된 세포를 증류수로 세척한 다음, 0.1 M CaCl2 용액 1 ml에 세포를 현탁하였으며, 이후 20분간 1,500×g에서 원심분리하고 다시 동일 용액 0.5 ml에 현탁하였다. 상기 제조된 Bt 용액 200 ㎕에 강한 활성이 확인된 구조변경 혼성체 키티나제 전장 ORF cDNA (pCR2.1-Bt ChCD/Mb ChBD 및 pCR2.1-Bt ChCD/Se ChBD) 10 ㎕를 가한 후, 얼음에서 30분간 정치하였고, 그 후 즉시 42℃에서 30초 동안 열 충격을 가한 다음, 다시 얼음에서 5분간 반응시켰다. 상기 반응액에 LB 액체배지 800 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 원심분리(3,000×g, 1분)를 통해 세포 펠렛을 회수하였다. 상기 세포를 LB 액체배지 100 ㎕에 재현탁한 다음, LB-암피실린 배지 플레이트에 도말하여 37℃에서 1~2일간 배양하면서 우수한 콜로니를 선발하였다. 상기 선발된 콜로니 대상으로 미니-프렙 및 염기서열 분석을 실시하여 형질전환을 확인하였다.
형질전환 대장균에서 혼성체 키티나제의 기능적 발현 확인
형질전환 대장균의 배양 및 증식률 분석
네이티브(native) 및 혼성체 키티나제에 의해 형질전환된 대장균 세포에서 키티나제-암호화 cDNA의 유전자 발현 양상을 확인하기 위해, 탄소원인 1% 콜로이드(colloidal) 키틴, 1 mM IPTG 및 0.1 mg/ml 암피실린이 첨가된 영양 결핍 배지(10-1 DLB 액체 배지)에 각 균주별로 104 세포/ml씩을 접종하여 37℃, 225 rpm에서 24~48시간 진탕 배양하였다. 상기 각 세포 배양액 1 ml를 100배로 희석한 후, 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하여 현미경(×400) 하에서 세포 수를 계수하여 야생형(WT) 및 형질전환 대장균들의 증식률을 분석하였다.
세포외 키티나제 활성도 측정
10-1 DLB 액체 배지에 대조군 및 형질전환 대장균을 각 균주별로 104 세포/ml씩을 접종하고 37℃, 225 rpm에서 72시간 동안 배양하였다. 상기 키티나제가 포함된 배양액 0.5 ml에 10% CC-RBB (0.2 M 인산나트륨 완충액에 용해시킨 Remazol Brilliant Blue로 염색된 콜로이드 키틴, pH 7.0) 용액을 동량 첨가한 후, 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 Remazol Brilliant Blue를 유리시킨 다음, 5분간 끓여 키티나제의 활성을 정지시켰다. 원심분리(5,000×g, 5분)를 통하여 여분의 콜로이드 키틴을 침전시킨 후, 세포외 키티나제의 대사에 의해 이탈된 Remazol Brilliant Blue가 포함된 상등액을 취하여 595 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 상기 측정값을 대상으로 대조군 대비 0.01의 흡광도 상승 당 1 U의 효소활성도로 환산하여, 형질전환된 대장균들의 세포외 키티나제 활성도를 측정하였다.
세포내 아미노당류의 함량 분석
대장균의 세포내 아미노당류(글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc))의 함량 분석을 위하여, 1% 콜로이드 키틴, 1 mM IPTG 및 0.1 mg/ml 암피실린이 첨가된 영양 결핍배지(10-1 DLB 액체 배지)에 각 균주별로 104 세포/ml씩을 접종하여 37℃, 225 rpm에서 72시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리(7,000×g, 10분)하여 회수된 대장균을 1 ml의 증류수에 현탁한 다음, 초음파분쇄기를 이용하여 얼음 위에서 3분간 파쇄하였다. 최종적으로 원심분리(10,000×g, 10분)를 수행하여 세포 찌꺼기를 제거한 세포 용균액(lysate)을 세포내 아미노당류의 함량 분석을 위한 HPLC 시료로 사용하였다.
HPLC 분석은 세포 용균액 시료 50 ㎕를 HPLC (Waters system 600 controller, 486 Turnable Absorbance Detector-210 nm filter)에 주입하여 키티나제의 발현에 따른 키틴 분해대사 산물인 유리 아미노당류의 함량을 측정하였다. HPLC 분석은 C18 Brownlee lab guard 컬럼이 장착된 Ultrasphere-ODS 컬럼(5 μm, 4.6 mm×150 mm)을 사용하여, 아세토니트릴(용매 A) 및 H2O(용매 B)를 용출액으로 하여 1 ml/분의 속도에서 구배(gradient) 프로그램(0~2분 동안 100% 용매 B 및 0% 용매 A; 2~10분 동안 100% 용매 B 내지 40% 용매 A의 선형 기울기; 10~12분 동안 선형 내지 초기조건)으로 실시하였다. 정제된 D-글루코사민 및 N-아세틸-D-글루코사민(Sigma, USA)을 표준물질로 하여 표준곡선을 구축한 후, 이를 기준으로 세포내 아미노당류의 함량을 측정 및 분석하였다.
형질전환 Bt 에서 혼성체 키티나제의 기능적 발현 확인
Bt ChCD/Mb ChBD를 포함하는 키티나제 ORF cDNA가 형질전환된 Bt에서 혼성체 키티나제의 기능적 발현을 확인하기 위해, 형질전환 Bt 세포의 계수, CC-RBB 분석법에 의한 세포외 키티나제 활성도 측정 및 HPLC를 통한 세포내 아미노당류 함량 분석 등을 상기와 같은 방법으로 실시하여, 형질전환 Bt (Bt ChCD/Mb ChBD)의 세포 성장률 및 키틴 분해능을 조사하였다.
형질전환 Bt 제제의 치사 효과 확인
Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체가 도입되어 기능적 발현이 확인된 형질전환 Bt 세균제제의 치사 효과를 분석하기 위해, 대조군 및 형질전환 Bt 제제를 1×106 세포/ml, 5×106 세포/ml, 1×107 세포/ml, 5×107 세포/ml, 1×108 세포/ml 및 5×108 세포/ml로 정량화한 시료를 각각 제조한 후, 생물학적 분석(bioassay)을 실시하였다. 숙주 곤충(연두금파리 3주령 유충)에 20 ㎕/유충으로 시료를 도포한 다음, 24 및 48시간이 경과한 시점에서 대조군 및 형질전환 Bt 제제의 LD50 (반수치사량) 값을 세포량(세포/ml)을 기준으로 산출하여 형질전환 Bt 제제의 해충 치사 효과를 비교 및 분석하였다.
실시예 1: 대장균의 키티나제 유전자 도입 효과
증식률
Bt Chit, Mb Chit 및 Se Chit로 각각 형질전환된 대장균(XL1 blue 균주)의 증식률을 야생형과 비교한 결과, 10-1 DLB 배양액 내 세포의 수가 배양 24 및 48시간에서 Bt Chit는 54.8% 및 69.6%, Mb Chit는 59.2% 및 63.3% 그리고 Se Chit는 32.5% 및 47.5%가 야생형에 비해 각각 증가한 것으로 나타났다(표 9 및 도 15). 특히, Bt Chit 및 Mb Chit의 경우 48시간 동안 배양한 군에서 세포 증식률이 야생형에 비해 1.6배 이상 증가되었는데, 이는 도입된 키티나제-암호화 유전자의 발현에 따른 키틴 대사의 증가로 인한 것으로 생각된다.
Figure 112011009798931-pat00009
세포외 키티나제 활성도
Bt Chit, Mb Chit 및 Se Chit로 각각 형질전환된 대장균(XL1 blue 균주)의 세포외 키티나제 활성도를 CC-RBB 분석법을 이용하여 분석하였다. 각 실험군의 배양액에 존재하는 키티나제 활성도가 배양 72시간을 기준으로 야생형은 1.3 U, Bt Chit는 3.0 U, Mb Chit는 2.9 U, 그리고 Se Chit는 2.1 U으로 나타나, 야생형 대비 Bt Chit는 230.77%, Mb Chit는 223.08% 그리고 Se Chit는 161.54%의 활성 증가를 나타내었다(표 10). 따라서, Bt 및 곤충류로부터 유래한 키티나제-암호화 유전자들의 발현이 명확히 확인되었으며, 특히 Bt Chit 및 Mb Chit의 세포외 키티나제의 활성도(즉, 키틴 분해능)가 매우 우수한 것으로 나타났다.
Figure 112011009798931-pat00010
* 배양 72시간째에 측정하였다.
세포내 아미노당류의 함량
Bt Chit, Mb Chit 및 Se Chit로 형질전환된 대장균(XL1 Blue 균주)의 세포내 아미노당류 함량을 HPLC로 분석하였다. 세포내 키티나제 대사로 인해 키틴으로부터 파생된 세포내의 글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 수준이 배양 72시간에서 1 × 108 세포를 기준으로 야생형은 12.23 nmol 및 0.12 nmol, Bt Chit는 88.62 nmol 및 0.35 nmol, Mb Chit는 88.59 nmol 및 0.27 nmol 그리고 Se Chit는 70.78 nmol 및 0.18 nmol로 각각 나타났다(표 11). 특히 Bt Chit 및 Mb Chit의 세포내 아미노당 함량이 야생형에 비해 GlcN은 약 7.2배, GlcNAc은 약 2.3배 이상 높게 나타남으로써, 대장균에 도입된 Bt 및 도둑나방(Mb) 키티나제의 기능적 발현이 현저히 높은 것으로 확인되었다(도 16 및 17).
Figure 112011009798931-pat00011
* 배양 72시간째에 측정하였다.
대장균에서의 혼성체 키티나제 유전자 발현 효과
증식률
Bt ChCD/Mb ChBD 및 Bt ChCD/Se ChBD로 형질전환된 대장균(XL1 blue 균주)의 증식률을 Bt Chit와 비교한 결과, 10-1 DLB 배양액 내 세포의 수가 배양 24 및 48시간에서 Bt ChCD/Mb ChBD는 72.0% 및 93.3%, Bt ChCD/Se ChBD는 37.0% 및 21.3%가 Bt Chit에 비해 각각 증가하는 것으로 나타났다(표 12 및 도 18). 특히, Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체 키티나제로 형질전환시킨 대장균을 48시간 배양한 군에서 세포의 증식률이 Bt Chit에 비해 약 1.93배로 가장 많이 증가되었다.
Figure 112011009798931-pat00012
세포외 키티나제 활성도
Bt ChCD/Mb ChBD 및 Bt ChCD/Se ChBD로 형질전환된 대장균(XL1 blue 균주)의 세포외 키티나제 활성도를 분석한 결과, 각 실험군의 배양액에 존재하는 키티나제 활성도가 배양 72시간을 기준으로, Bt Chit에 비해 Bt ChCD/Mb ChBD는 196.67%, Bt ChCD/Se ChBD는 144.33%의 활성 증가를 나타내었다(표 13). 특히, Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체 키티나제의 유전자 발현도 및 효소 활성도가 현저히 높은 것으로 확인되었다.
Figure 112011009798931-pat00013
* 배양 72시간째에 측정하였다.
세포내 아미노당류 함량
Bt ChCD/Mb ChBD 및 Bt ChCD/Se ChBD로 형질전환된 대장균(XL1 Blue 균주)의 세포내 아미노당류 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다. 세포내 키티나제 대사로 인해 키틴으로부터 파생된 세포내의 글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 함량이 배양 72시간에서 1 × 108 세포를 기준으로 Bt ChCD/Mb ChBD는 160.71 nmol 및 0.56 nmol, Bt ChCD/Se ChBD는 118.15 nmol 및 0.43 nmol로 각각 나타났다(표 14). 특히, Bt ChCD/Mb ChBD는 BtChit에 비해 GlcN의 함량이 약 1.8배, GlcNAc의 함량이 약 1.6배 이상 높게 나타남으로써, 대장균으로 도입된 Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체 키티나제의 기능적 발현이 Bt Chit 보다 현저히 높으므로, 기생충 구충제로서의 적용 가능성이 확인되었다(도 19 및 20).
Figure 112011009798931-pat00014
* 배양 72시간째에 측정하였다.
Bt 에서의 혼성체 키티나제 유전자 발현 효과
증식률
Bt ChCD/Mb ChBD 및 Bt Chit로 형질전환된 바실러스 튜린겐시스(Bt-Bt ChCD/Mb ChBD 및 Bt-Bt Chit)의 증식률을 비교한 결과, 배양 24 및 48시간에서 Bt ChCD/Mb ChBD 균주가 Bt-Bt Chit 균주보다 128.6% 및 130.8%가 각각 증가하는 것으로 나타났다(표 15 및 도 21). Bt로 도입된 Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체 키티나제의 작용으로 인한 키틴 대사의 증가에 따라 세포 증식률이 현저하게 증가하는 것이 확인되었다.
Figure 112011009798931-pat00015
세포외 키티나제 활성도
Bt Chit 및 Bt ChCD/Mb ChBD로 형질전환된 바실러스 튜린겐시스(Bt-Bt Chit 및 Bt-Bt ChCD/Mb ChBD)의 세포외 키티나제 활성도를 분석한 결과, 10-1 DLB 배양액에 존재하는 키티나제 활성도가 배양 72시간에서 Bt-Bt Chit는 3.2 U, Bt-Bt ChCD/Mb ChBD는 6.1 U으로 나타났다(표 16). 배양 72시간을 기준으로 Bt-Bt ChCD/Mb ChBD가 Bt-Bt Chit 균주에 비해 190.63%의 활성 증가를 보임으로써, 대장균과 마찬가지로 Bt의 경우에도 Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체 키티나제 유전자의 기능적 발현도 및 효소활성도가 매우 높은 것으로 확인되었다.
Figure 112011009798931-pat00016
* 배양 72시간째에 측정하였다.
세포내 아미노당류 함량
Bt Chit 및 Bt ChCD/Mb ChBD로 형질전환된 바실러스 튜린겐시스(Bt-Bt Chit 및 Bt-Bt ChCD/Mb ChBD) 균주의 세포내 아미노당류 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다. 세포내 키티나제 대사로 인해 키틴으로부터 파생된 세포내 글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 함량이 배양 72시간에서 1 × 108 세포를 기준으로, Bt ChCD/Mb ChBD 균주는 169.24 nmol 및 0.89 nmol, Bt-Bt Chit 균주는 86.33 nmol 및 0.47 nmol로 각각 나타났다(표 17). Bt-Bt ChCD/Mb ChBD 균주가 GlcN은 Bt-Bt Chit 균주보다 약 1.96 배, GlcNAc은 약 1.89배 이상 높게 나타남으로써, Bt로 도입된 Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체 키티나제의 기능적 발현이 대조군 보다 현저히 높은 것으로 확인되었다(도 22 및 23).
상기 결과에 따라 Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체 키티나제 ORF cDNA가 형질도입된 Bt(Bt-Bt ChCD/Mb ChBD, 형질전환된 Bt 균주) 시스템이 구축됨으로써, 가축 외부기생충에 대한 구충제로 적용가능한 세균 제제를 확보하였다.
Figure 112011009798931-pat00017
* 배양 72시간째에 측정하였다.
형질전환 Bt 제제의 해충 치사 효과
Bt 균주에 Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체 키티나제 cDNA가 도입되어 기능적 발현이 확인된 형질전환 세균 제제(Bt-Bt ChCD/Mb ChBD, 형질전환된 Bt 균주)의 해충 치사 효과를 연두금파리 3주령 유충을 대상으로 분석한 결과, 반수치사량(LD50)은 Bt-Bt Chit의 경우 24 및 48시간에서 1.4×108 세포/ml 및 1.0×108 세포/ml, Bt-Bt ChCD/Mb ChBD 혼성체 균주는 5.0×107 세포/ml 및 7.5×106 세포/ml로 각각 나타났다. Bt ChCD/Mb ChBD로 형질전환된 Bt 세균 제제(Bt-Bt ChCD/Mb ChBD)의 해충 치사 효과가 Bt-Bt Chit 균주보다 24시간에서는 약 2.8배, 48시간의 경우에는 약 13.3배로 현저하게 증가되었다(표 18).
결과적으로 세균류인 Bt 키티나제의 키틴 촉매 도메인(Bt ChCD)과 곤충류인 Mb 키티나제의 키틴-결합 도메인(Mb ChBD)을 혼성화하여 제조된 혼성체 키티나제 ORF cDNA 형질전환 세균 제제(형질전환된 Bt 균주)는 지속적이면서 우수한 해충 치사 효과를 나타내었다.
Figure 112011009798931-pat00018
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Claims (14)

  1. 세균 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Chitinase Catalytic Domain: ChCD) 및 곤충 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Chitin-Binding Domain: ChBD)를 재조합시킨 재조합 키티나제 유전자(ChCD/ChBD)를 포함하는 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 키티나제 촉매 도메인 유전자(ChCD)는 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Bt ChCD)인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 키틴-결합 도메인 유전자(ChBD)는 도둑나방(Mamestra brassicae) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Mb ChBD) 또는 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Se ChBD)인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환되어 활성이 증진된 키티나제를 생산하는 숙주세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 숙주세포는 세균 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세균은 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 또는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
  7. 제4항의 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 해충 방제용 미생물 제제.
  8. 제7항에 따른 미생물 제제를 해충에 처리하여 해충을 방제하는 방법.
  9. 세균 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(ChCD) 및 곤충 유래 키틴-결합 도메인 유전자(ChBD)를 재조합하는 단계;
    상기 제조된 재조합 키티나제 유전자(ChCD/ChBD)를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환체를 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 키티나제 촉매 도메인 유전자(ChCD)는 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 유래 키티나제 촉매 도메인 유전자(Bt ChCD)인 것을 특징으로 하는 미생물 제제의 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 키틴-결합 도메인 유전자(ChBD)는 도둑나방(Mamestra brassicae) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Mb ChBD) 또는 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래 키틴-결합 도메인 유전자(Se ChBD)인 것을 특징으로 하는 미생물 제제의 제조 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 세균 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 미생물 제제의 제조 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 미생물 제제.
  14. 제13항의 미생물 제제를 절지동물의 외피 부산물에 처리하여 외피의 키틴을 분해하는 단계를 포함하는 바이오매스의 생산 방법.
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