KR101024975B1 - 리케차 질환 진단항원의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리케차 질환 진단항원의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 R. conorii의 OmpA 또는 OmpB와 MBP(maltose-binding protein)를 포함하는 재조합 진단항원의 생산방법에 관한 것이다.
리케차, 재조합 OmpA, 재조합 OmpB
Description
본 발명은 리케차 질환 진단항원의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 R. conorii의 OmpA 또는 OmpB와 MBP(maltose-binding protein)를 포함하는 재조합 진단항원의 생산방법에 관한 것이다.
Rickettsiae(리케차)는 그람 음성의 짧은 막대균이며, 절대 세포 내 기생체이다(La-scola, B., et al., J. Clin. Microbiol. 35: 2715, 1997). Rickettsiae는 24개의 종으로 나누어지며, typhus group(TG, 발진열군)과 spotted fever group(SFG, 홍반열군)으로 나눈다(Fournier, P.E., et al., BMC Microbiol. 7:72, 2007; Roux, V., et al., J. Clin. Microbiol. 34: 2058, 1996). 대부분의 홍반열군 rickettsiae는 절지동물과 진드기에 의해서 사람에게 옮겨진다. 감염이 되면 열, 두통, 오한, 피부발진, 홍반 등의 증상이 나타난다(Raoult, D., et al., Clin. Microbiol. Rev. 10: 694, 1997). 홍반열군 rickettsiae는 일본, 중국, 러시아 동부 등 한국 주변을 포함하여 전세계에 분포되어 있다(Jang, W.J., et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10: 394, 2003). 국내에서도 R. conorii 감염을 포함한 홍반 열군 리케차 질환의 혈청학적, 분자생물학적 역학에 관한 연구가 보고된 바 있다(Jang, W.J., et al., J. Clin. Microbiol. 42: 2310, 2004).
Rickettsioses(리케차 질환)의 혈청학적 연구와 진단으로 indirect immunofluorescence assay(IFA)와 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)가 일반적으로 사용되고 있다(Li, Z., et al., Infect. Immun. 71: 3920, 2003). IFA는 혈청학적 진단에 표준방법으로 사용되며, ELISA는 편리하고, 결과가 확실하며 혈청학적 민감도가 높아 다양하게 이용되고 있다. 리케차 질환의 진단을 위해 다양한 방법들이 이용되고 있지만, ELISA는 짧은 시간에 진단이 가능하며 감염의 seroepidemiology 연구에 효과적이다(La-scola, B., et al., J. Clin. Microbiol. 35: 2715, 1997).
한편, outer membrane protein(Omp, 외막단백)A(OmpA)와 OmpB는 홍반열군 리케차의 주요 면역 항원들이다. DNA 백신으로서 면역한 Rickettsia rickettsii의 OmpA4999-6710, OmpB1550-2738, OmpB2459-4123 부분은 쥐에서 독성이 강한 리케차의 감염을 막아주며, R. conorii 항원에 면역된 쥐에서는 gamma-interferon의 증식과 분비가 억제된다는 보고가 있다(Diaz-Montero, C.M., et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:371, 2001).
또한, OmpA2331-3976을 발현하는 DNA 백신에 면역된 쥐는 R. conorii에 대하여 강한 면역성을 보이는 것으로 보고되었다(Crocquet-Valdes, P.A., et al., Vaccine. 20: 979, 2001). Mammalian expression vector에서 발현된 R. conorii OmpB689-744와 OmpB739-848은 면역성 anti-R. conorii CD8 T lymphocytes를 자극하는 것이 확인되어 이 유전자 부위에 CD8 T lymphocytes를 자극하는 epitope이 존재함을 알 수 있었다(Li, Z., et al., Infect. Immun. 71: 3920, 2003). Wenbin 등은 OmpA와 OmpB에는 각기 다른 29개의 epitope이 존재하고 있지만, 다른 것에 비해 발현이 늦다는 것을 보고하였다(Xu, W., et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:753, 1997). 이러한 연구 결과들을 통해, OmpA와 OmpB가 리케차 질환의 진단 마커로서 사용될 가능성이 있음을 알 수 있다.
특히, 최근 리케차 감염이 한국에도 있을 가능성이 증폭됨에 따라, 그 진단 마커에 대한 연구가 시급한 실정이다. 이에 본 발명자들은 리케차 진단항원을 개발하고자 예의 노력을 기울인 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 리케차의 OmpA와 OmpB를 이용한 리케차 진단항원의 생산방법 및 리케차 진단항원을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) R. conorii OmpA 유전자(AE008674) 또는 OmpB 유전자(AE008659)를 단편으로 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 유전자 단편을 MBP(maltose-binding protein)의 유전자가 함유된 발현벡터에 삽입하여 OmpA 유전자 단편 또는 OmpB 유전자 단편과 MBP 유전자를 포함하는 재 조합 유전자를 제조하는 단계; (c) 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하는 단계; 및 (d) 상기 대장균으로부터 OmpA 또는 OmpB의 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 리케차 진단항원의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 R. conorii OmpA 유전자(Genbank accession number AE008674) 단편은 OmpA 4048-5352인 것이 특징으로 할 수 있으며, 상기 R. conorii OmpB 유전자(AE008659) 단편은 OmpB 2401-3807 또는 OmpB 3679-4902인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 MBP(maltose-binding protein)의 유전자가 함유된 발현벡터는 플라스미드 pMAL-c2X인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 R. conorii OmpA 유전자 단편과 MBP 유전자의 재조합 유전자는 OmpA 1350-1784인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 R. conorii OmpB 유전자 단편과 MBP 유전자의 재조합 유전자는 OmpB 801-1269 또는 OmpB 1227-1634인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 생산된 리케차 진단항원을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 진단항원을 포함하는 진단키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, R. conorii의 OmpA 또는 OmpB의 특이 영역과 MBP(maltose-binding protein)를 포함하는 재조합 진단항원의 생산방법 및 그 진단항원을 제공하는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 전 세계에 분포하는 R. conorii 감염의 진단을 위한 truncated OmpA와 OmpB의 진단항원으로서의 이용가치를 연구하기 위하여, R. conorii 외막단백 OmpA와 OmpB 유전자 부위의 특이 PCR 프라이머를 제작하고, OmpA 6개 단편과 OmpB 4개의 단편을 pMAL-c2X에 넣어서, MBP와 fusion protein을 만들어 E. coli에서 발현시켰다. 또한, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 재조합 항원 중 OmpA1350-1784, OmpB801-1269, OmpB1227-1634 영역이 진단항원으로서 가능성이 있음을 확인하고, 선발한 3개의 항원을 이용하여 ELISA를 시행하였으며, 그 결과를 현재 시판중인 R. conorii ELISA kit와 비교하였다. 시료로서 열성환자와 열이 없는 정상인의 혈청을 각각 20개씩 선발하여 실험을 진행하였다. OmpA1350-1784 항원을 이용한 경우, ELISA kit에서 양성반응을 보인 20개의 시료 중 18개 시료가 양성반응을 보였으며(민감도 90%), 20개의 음성 시료는 20개 모두 음성 반응을 보였다(특이도 100%). OmpB801-1269 항원의 민감도는 90%, OmpB1227-1634 항원의 민감도는 95%를 보였으며, 특이도는 각각 100%와 95%를 보였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 리케차, 세포 배양
Vero 세포(ATCC CRL-1586; American Type Culture Collection, Manassas, VA)의 단층에 R. conorii(Malish 7 strain)를 감염시키고, Dulbecco's modified Eagle's medium(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양했다.
실시예 2: DNA 분리
상기 R. conorii의 배양액을 모으고, Chelex method를 이용하여 total genomic DNA를 분리하였다(Choi, Y.J. et al., Emerg. Infect. Dis. 11:237, 2005).
구체적으로, 200㎕ 배양액에 phosphate-buffered saline(PBS) 1㎖을 넣고 13,000rpm으로 30분간 원심분리한 다음, 펠렛을 동일량의 2×lysis buffer(100mM Tris-HCl[pH 9.0], 2mM EDTA, 2% Triton X-100, 800㎍/㎖ proteinase K)에 녹이고 60℃에서 3시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 10분간 끓이고, 1/2 부피의 15%(wt/vol) Chelex-100(BioRad, Hercules, CA, USA)을 첨가한 다음, 56℃에서 25분간 반응시켰다. 반응이 끝난 샘플을 최고 속도로 10초간 vortex하고 10분간 끓인 다음, 원심분리하여 상층액만 DNA 증폭에 사용하였다.
실시예 3: PCR 프라이머 제작 및 재조합 항원의 플라스미드 구축
R. conorii OmpA 유전자(Genbank accession number AE008674)와 OmpB 유전자(AE008659)를 maltose-binding protein(MBP)와 함께 fusion 단백질을 만들어 Escherichia coli(E. coli, 대장균)에서 발현시켰다.
OmpA 유전자는 6개의 단편(OmpA 1-1068, OmpA 586-2469, OmpA 2098-3240, OmpA 3076-4251, OmpA 4048-5352 및 OmpA 5221-5994)으로 나누고, OmpB 유전자는 4개의 단편(OmpB 40-1455, OmpB 1270-2589, OmpB 2401-3807 및 OmpB 3679-4902)으로 나눈 뒤, MBP와 fusion protein을 만들고 대장균에서 발현하였다. 상기 유전자를 PCR하기 위하여 각 단편의 특이 프라이머를 Primer3Input program (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)을 이용하여 고안하였다(표 1 참조).
| 타겟 | 위치 | PCR 예상크기(bp) |
명칭 | 프라이머 서열(5′→3′) |
단백질 예상크기(kDa) |
| OmpA | 1-1,068 | 1,068 | Rc OmpA 1 -21 | 서열번호1 | 85 |
| Rc OmpA 1068 -1049 | 서열번호2 | ||||
| 586-2,469 | 1,884 | Rc OmpA 586 -609 | 서열번호3 | 111 | |
| Rc OmpA 2469 -2449 | 서열번호4 | ||||
| 2,098-3,240 | 1,143 | Rc OmpA 2098 -2116 | 서열번호5 | 87 | |
| Rc OmpA 3240-3220 | 서열번호6 | ||||
| 3,076-4,251 | 1,176 | Rc OmpA 3076 -3094 | 서열번호7 | 89 | |
| Rc OmpA 4251 -4236 | 서열번호8 | ||||
| 4,048-5,352 | 1,305 | Rc OmpA 4048 -4067 | 서열번호9 | 86 | |
| Rc OmpA 5352 -5333 | 서열번호10 | ||||
| 5,221-5,994 | 771 | Rc OmpA 5221 -5239 | 서열번호11 | 70 | |
| Rc OmpA 5994 -5972 | 서열번호12 | ||||
| OmpB | 40-1,455 | 1,416 | Rc OmpB 40 -59 | 서열번호13 | 90 |
| Rc OmpB 1455 -1435 | 서열번호14 | ||||
| 1,270-2,589 | 1,320 | Rc OmpB 1270 -1289 | 서열번호15 | 88 | |
| Rc OmpB 2589 -2571 | 서열번호16 | ||||
| 2,401-3,807 | 1,407 | Rc OmpB 2401 -2422 | 서열번호17 | 90 | |
| Rc OmpB 3807 -3789 | 서열번호18 | ||||
| 3,679-4,902 | 1,224 | Rc OmpB 3679 -3697 | 서열번호19 | 87 | |
| Rc OmpB 4902 -4884 | 서열번호20 |
10× PCR buffer(CoreBio, Seoul, Korea), 100ng genomic DNA, 20 pmole 프라이머, 1.25 unit Top-pfu TM DNA polymerase(CoreBio), 0.2mM dTTP, dCTP, dGTP 및 dATP가 혼합된 혼합액 50㎕을 9700 Thermocycler(Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)를 이용하여 증폭하였으며, initial denaturation(94℃, 2분) 1회, denaturation(94℃, 30초), annealing(55℃, 15초) 및 elongation(72℃, 2분 30초)을 40회 반복하였고, 그리고 마지막 extension은 7분 동안 72℃에서 반응하는 조건으로 증폭하였다.
발현 plasmid pMAL-c2X(New England Biolabs, Beverly, MS, USA)에 R. conorii OmpA와 OmpB를 클로닝하여 발현시켰다. 플라스미드와 증폭된 PCR 단편은 OmpA 586-2469 , OmpA 2098-3240 및 OmpA 3076-4251 은 XmnI과 HindIII을 처리하여 cloning 하였고, OmB 40-1455 , OmpB 1270-2589 , OmpB 2401-3807 및 OmpB 3679-4902 은 XmnI과 SalI을 처리하여 cloning하였으며, OmpA1-1068 및 OmpA 4048-5352 는 XmnI 및 EcoRI 처리하였고, OmpA 5221-5994는 XmnI 처리하여 cloning 하였다.
상기와 같이, 제한효소를 처리한 PCR 단편과 expression vector pMAL-c2X를 ligation하고, HIT competent cellsTM-DH5α(Real Biotech, Toronto, Canada)에 형질전환 하였다. Plasmid construction은 PstI, DraI, HindIII, BglII로 처리하여 truncated region을 확인하였다.
도 1a 및 도 1b는 R. conorii에서 얻은 OmpA와 OmpB의 단편들을 벡터 pMAL-c2X에 클로닝하여 대장균에서 발현시켰을 때, 각 단편들의 유전자상 위치와 클로닝 여부, 재조합 단백질 발현 여부를 나타낸 것이다.
실시예 4: 단백 발현과 정제
재조합 플라스미드를 포함한 대장균을 암피실린(100㎍/㎖)이 포함된 액체 Luria-Bertani 배지에서 키웠다. 발현을 유도하기 위해서 1mM IPTG를 넣고, 37℃에서 2시간 반응시킨 다음 원심분리하여 균체를 모으고, ultra sonic liquid processor(Model XL 2020, NY, USA)를 이용하여 초음파파쇄(sonication) 하였다. 원심분리하여 조직파편(debris)을 제거한 상층액만 모아서 제조사의 방법에 따라서 amylose affinity column chromatography(New England Biolabs)를 통해 정제했다. 정제된 단백은 SDS-PAGE하여 확인했다(도 2a 및 도 2b).
SDS-PAGE 분석결과 예상되는 크기(kDa)의 MBP fusion 단백들을 다음과 같았다. 즉, OmpA1-356(85kDa), OmpA700-1080(87kDa), OmpA1026-1417(89kDa), OmpA1350-1784(86kDa), OmpA1741-1998(70kDa), OmpB14-485(90kDa), OmpB424-863(88kDa), OmpB801-1269(90kDa) 및 OmpB1227 -1634(87kDa)이다. 1ℓ의 세균을 배양하여 얻은 정제된 단백의 양은 2~10㎎이었다.
실시예 5: 혈청 시료
본 발명에 사용된 혈청은 조선대학교병원과 충남대학교병원에서 제공받아 R. conorii의 진단을 위한 특이 항원을 찾기 위해서 열이 있는 환자에서 채취한 혈청과 열이 없는 정상인에게서 채취한 혈청 중 총 136개의 혈청 시료를 사용하였다.
모든 혈청 시료는 R. conorii IFA와 R. conorii 균체에서 정제한 OmpA와 OmpB 항원을 이용해서 만든 상용 ELISA kit(Vircell, Granada, Spain)를 먼저 수행하여 그 중 20개의 양성 시료와 20개의 음성 시료를 선정하였다.
실시예 6: ELISA
96-well maxisorp microtiter plate(No. 439454; Nalge Nunc International, NY, USA)의 각 웰(well)에 50mM bicarbonate buffer(10mM Na2CO3, 30mM NaHCO3, 0.02% NaN3, pH 9.6) 100㎕에 정제된 각각의 항원을 분주하고, 4℃에서 18시간 반응시켜 항원을 흡착하였다. 플레이트(plate)를 200㎕의 PBST(PBS buffer with 0.25% Tween 20)로 씻고 200㎕의 3% 소혈청 알부민(bovin serum albumin, BSA)을 분주하여 37℃에서 120분 동안 반응시켰다. 혈청 시료는 PBST(0.1% BSA)에 1:100으로 희석하고, 각 웰에 50㎕씩 분주하였다. 시료는 각각 2개씩 중복하여 분석하였다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안 반응시키고 앞의 방법으로 씻었다. Peroxidase-conjugated anti-human IgG+IgM를 PBST로 1:5,000으로 희석하고, 각 웰에 100㎕씩 분주하여 37℃에서 60분 동안 반응시키고 앞의 방법으로 씻은 후 100㎕의 o-phenylene diamine(0.4㎎/㎖) 함유 peroxidase substrate buffer 0.2M Na2HPO4, 0.1 M citric acid)를 분주하였다. 실온에서 7분간 반응시키고 각 웰에 50㎕의 3N 황산(sulfuric acid)을 넣어 기질 반응을 멈춘 다음, 색깔 변화는 OD(optical density) 620㎚에서 측정하여 값을 얻었다.
R. conorii에 대한 항체를 검출하기 위해 상용 R. conorii ELISA IgG+IgM kit(Vircell, Granada, Spain)를 사용하였다. 이 분석은 제조사의 방법에 따라 실험하였다. 혈청 시료를 희석제(diluents)에 희석하여 각 웰에 100㎕씩 분주하고 37℃에서 45분간 반응시키고 씻었다. 즉시, 100㎕의 IgG+IgM conjugated 용액을 분주하고 플레이트를 37℃에서 30분간 반응 시킨 다음, 플레이트를 씻고, 100㎕의 기질 용액을 각 웰에 분주하였다. 실온에서 20분 동안 반응시킨 후, 기질 반응을 50㎕의 stop 용액을 분주하여 멈춘 다음, 색깔 변화는 OD 450㎚에서 측정하여 값을 얻었다.
실시예 7: ELISA에 의한 재조합 항원의 항원성 결정
재조합 항원을 검출하기 위해, Martin 등(Martin, D.A. et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9: 544, 2002)의 절차를 따라 양성/음성 비율(positive/negative(P/N) ratios)을 결정하였다. 본 발명에서 ELISA로 재조합 단백질들의 항원성을 입증하기 위해 상용 ELISA kit를 사용하여 선별된 20개의 양성 중에 임의로 뽑은 대표적인 4개의 혈청 시료들과 선별된 20개의 음성 중에 임의로 뽑은 대표적인 4개의 혈청 시료들을 대조군으로 사용하였다. 색깔 변화는 ELISA를 이용하여 OD 620㎚에서 측정하여 값을 얻었다. 각 혈청에 대한 양성값(positive values)는 환자 혈청 시료의 OD620 평균값으로 나타냈다. 각 혈청에 대한 음성값(negative values_는 대조군 시료의 OD620 평균값으로 나타냈다. 각 혈청은 P/N ratio가 3 이상 일 때 입증된 양성 시료로 분류하였다.
OmpA 및 OmpB의 쪼개진 항원은 대장균에서 MBP fusion 단백질로 발현된다. 재조합 항원은 R. conorii에 대한 감염을 검출하기 위한 진단용 항원으로써 단백질의 가능성을 측정하기 위해 ELISA를 이용하여 열성 환자 시료들에서 4개의 혈청 시료들(양성 시료들)과 건강한 정상인에서 4개의 혈청 시료들(음성 시료들)을 측정했다. 혈청 시료들은 PBST(0.1% BSA)에 1:50으로 희석하고 partial 항원 사이에서 특이적인 항원 부위를 증명하기 위해 사용되었다.
하기 표 2는 ELISA에 의해 측정된 재조합 항원의 반응성을 나타낸 것이다.
| 타겟 | 표시 | 위치 | 항원에 대한 P/N값 |
| OmpA | OmpA1 -356 | 1-1,068 | 0.1 |
| OmpA700 -1080 | 2,098-3,240 | 0.2 | |
| OmpA1026 -1417 | 3,076-4,251 | 0.025 | |
| OmpA1350 -1784 | 4,048-5,352 | 15 | |
| OmpA1741 -1998 | 5,221-5,994 | 1.2 | |
| OmpB | OmpB14 -485 | 40-1,455 | 1.4 |
| OmpB424 -863 | 1,270-2,589 | 1.75 | |
| OmpB801 -1269 | 2,401-3,807 | 26 | |
| OmpB1227 -1634 | 3,679-4,902 | 32 |
P/N 값은 양성 시료들의 평균과 음성 시료의 평균을 나누어 값을 결정하였다. 3 이상의 P/N 값을 양성으로 결정했다. ELISA의 값에 따라, OmpA1350-1784 재조합 항원, OmpB801-1269과 OmpB1227-1634 항원은 다른 항원 보다 높은 값을 나타내었다(도 3a 및 도 3b). 이를 통해, 이러한 단편 단백질들은 R. conorii에 의해 야기되는 리케차 질환을 진단에 적합한 마커들로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 8: ELISA의 cutoff values 결정
Cutoff value는 20개의 ELISA-음성 혈청 시료들로 결정하였다. ELISA에서 평균 OD620 값이 0.06이었다. Cutoff value는 평균 OD620 + 3 표준편차 (3 Stdev. = 0.12)로 결정하였다. 그러므로 ELISA에서 혈청 시료의 OD620가 0.2보다 크면 양성으로 판독하였다. 3개의 영역에 대한 cutoff values는 0.2로 모두 같았다. 또한, 그 cutoff value는 상용 ELISA kit의 결정과 상용 ELISA kit와 비교에서 동등한 가치를 부여하기 위해 사용되었다.
실시예 9: ELISA의 민감도와 특이도 결정
본 발명에서 사용된 ELISA의 민감도와 특이도는 OmpA1350-1784, OmpB801-1269, OmpB1227-1634 항원을 이용하여 40개의 혈청 시료를 분석하여 결정하였다. 그 결과는 상용 ELISA kit을 사용해 얻은 결과와 비교하였다. 도 3a 및 도 3b는 상용 kit에서 얻은 OD450 값과 본 발명에서 사용된 ELISA에서 얻은 OD620 값을 비교하여 나타낸 것이다. OmpA1350-1784를 사용한 ELISA의 경우 상용 ELISA kit에서 양성이었던 20개의 시료 중 18개 시료가 양성으로 판독되었고, 2개 시료의 값은 ELISA의 cutoff value보다 낮았다(민감도 90%)(도 4a 참조). ELISA의 특이도는 100%였다. 상용 R. conorii ELISA kit에서 음성으로 나온 20개의 시료들 모두가 본 발명에서 사용한 ELISA에서도 음성을 나타냈다(r = 0.55). OmpB801-1269을 사용한 ELISA의 민감도는 90%였다(상용 kit에서 양성으로 나타난 시료들 중에서, 18개가 본 발명에서 사용한 ELISA에서 양성이었다; r = 0.62). OmpB1227-1634를 사용한 ELISA의 민감도는 95%였다(상용 kit에서 양성으로 나타난 시료들 중, 19개가 본 발명에서 사용한 ELISA에서 양성으로 나타났다; r = 0.57). OmpB801-1269와 OmpB1227-1634을 이용한 ELISA의 검출 특이도는 유사하게 높았고, 각각 100%와 95%였다(도 4b 및 도 4c 참조).
이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1a는 R. conorii로부터 얻은 OmpA 단편들의 유전자상 위치와 클로닝 여부, 재조합 단백질 발현 여부 등의 내용을 나타낸 것이다.
도 1b는 R. conorii로부터 얻은 OmpB 단편들의 유전자상 위치와 클로닝 여부, 재조합 단백질 발현 여부 등의 내용을 나타낸 것이다.
도 2a는 재조합 OmpA 단편들의 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 것으로, lane 1은 Molecular weight protein marker(Fermentas Inc., Hanover, NH, USA)를 나타내고, lanes 2, 4, 6, 8 및 10은 유도되지 않은 재조합 E. coli를 나타내고(각각, OmpA 1-1068, OmpA 2098-3240 , OmpA 3076-4251, OmpA 4048-5352 및 OmpA 5221-5994 부분 포함), lanes 3, 5, 7, 9, 및 11은 유도되지 않은 재조합 E. coli를 나타낸다. 왼쪽의 숫자는 분자량의 크기를 kDa으로 나타낸 것이다.
도 2b는 재조합 OmpB 단편들의 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 것으로, lane 1은 Molecular weight protein marker를 나타내고, lanes 2, 4, 6 및 8은 유도되지 않은 재조합 E. coli를 나타내고(각각, OmpB 40-1455, OmpB 1270-2589 OmpB 2401-3807, 및 OmpB 3697-4902 부분 포함), lanes 3, 5, 7 및 9는 유도되지 않은 재조합 E. coli를 나타낸다. 왼쪽의 숫자는 분자량의 크기를 kDa으로 나타낸 것이다.
도 3a는 OmpA 재조합 항원을 이용하여, ELISA에 재조합 4개의 양성 혈청 시료들 (P1, P2, P3, P4)과 4개의 음성 혈청 시료들 (N1, N2, N3, N4)을 1:100으로 희석하여 ELISA로 실험한 결과이다. 오차 막대는 2번의 반복 실험으로 5개의 항원 을 SEM (standard error of mean)로 나타냈다. OmpA의 재조합 항원을 사용한 ELISA 분석 결과, 재조합 OmpA4048-5352은 다른 항원에 비해 높은 반응성을 나타낸 것을 알 수 있다.
도 3b는 OmpB 재조합 항원을 이용하여, ELISA에 재조합 4개의 양성 혈청 시료들 (P1, P2, P3, P4)과 4개의 음성 혈청 시료들 (N1, N2, N3, N4)을 1:100으로 희석하여 ELISA로 실험한 결과이다. 오차 막대는 2번의 반복 실험으로 5개의 항원을 SEM (standard error of mean)로 나타냈다. OmpB의 재조합 항원을 사용한 ELISA 분석 결과, 재조합 OmpB2401-3807과 OmpB3679-4902은 다른 항원에 비해 높은 반응성을 나타낸 것을 알 수 있다.
도 4a는 본 발명의 재조합 항원 OmpA4048-5352 항원과 상용 ELISA를 비교한 것이다. 각각의 사각형은 한 혈청의 반응을 나타냈다. Cutoff value는 음성 혈청 시료를 우리 ELISA로 검사한 경우 OD620의 평균값에, 상용 ELISA kit의 경우 OD450의 평균값에 표준편차의 3배수를 더하여 결정하였고 점선으로 나타냈다.
도 4b는 본 발명의 재조합 항원 OmpB2401-3807 항원과 상용 ELISA를 비교한 것이다. 각각의 사각형은 한 혈청의 반응을 나타냈다. Cutoff value는 음성 혈청 시료를 우리 ELISA로 검사한 경우 OD620의 평균값에, 상용 ELISA kit의 경우 OD450의 평균값에 표준편차의 3배수를 더하여 결정하였고 점선으로 나타냈다.
도 4b는 본 발명의 재조합 항원 OmpB3679-4902 항원과 상용 ELISA를 비교한 것 이다. 각각의 사각형은 한 혈청의 반응을 나타냈다. Cutoff value는 음성 혈청 시료를 우리 ELISA로 검사한 경우 OD620의 평균값에, 상용 ELISA kit의 경우 OD450의 평균값에 표준편차의 3배수를 더하여 결정하였고 점선으로 나타냈다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp.
<120> Method for Producing Antigen for Diagnosis of Rickettsia
<130> P09-E080
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Claims (8)
- (a) R. conorii OmpA 유전자(AE008674) 또는 OmpB 유전자(AE008659)를 단편으로 분리하는 단계;(b) 상기 분리된 유전자 단편을 MBP(maltose-binding protein)의 유전자가 함유된 발현벡터에 삽입하여 OmpA 유전자 단편 또는 OmpB 유전자 단편과 MBP 유전자를 포함하는 재조합 유전자를 제조하는 단계;(c) 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하는 단계; 및(d) 상기 대장균으로부터 OmpA 또는 OmpB의 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 리케차 진단항원의 생산방법.
- 제1항에 있어서,상기 R. conorii OmpA 유전자(AE008674) 단편은 OmpA 4048-5352인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 R. conorii OmpB 유전자(AE008659) 단편은 OmpB 2401-3807 또는 OmpB 3679-4902 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 MBP(maltose-binding protein)의 유전자가 함유된 발현벡터는 플라스미드 pMAL-c2X인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 R. conorii OmpA 유전자 단편과 MBP 유전자의 재조합 유전자는 OmpA 1350-1784인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 R. conorii OmpB 유전자 단편과 MBP 유전자의 재조합 유전자는 OmpB 801-1269 또는 OmpB 1227-1634인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 리케차 진단항원.
- 제7항의 진단항원을 포함하는 진단키트.
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