KR101016104B1 - 루테인 성분이 함유된 계란을 생산하기 위한 사료 첨가제용 미생물 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 루테인(Lutein) 함유한 계란을 생산하기 위한 사료첨가제용 미생물 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 일정한 조성의 매리골드(Mari gold) 꽃이 함유된 혼합물에 효모, lactobacillus plantarum 등의 미생물을 접종하고 다단계의 발효를 거쳐 제조되며 산란계용 사료에 일정 비율 이상 첨가시 계란 노른자 착색효과가 있으며 루테인 성분을 함유한 계란을 생산할 수 있는 사료첨가제용 미생물 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
루테인, 계란 노른자 착색 효과, 매리골드
Description
본 발명은 루테인 성분이 함유된 계란을 생산하기 사료첨가제용 미생물 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 루테인 함량이 풍부한 프랜치 매리골드(French marigold) 및 아프리칸 매리골드(African marigold) 꽃을 수확하여 분쇄한 후 효모, lactobacillus plantarum 등의 미생물로 24시간 배양시킨 후 고액 분리 및 원심 분리 방법을 통해 추출한 매리골드 추출물을 닭 사료에 첨가한 후 루테인 성분이 함유된 계란을 생산하도록 하는 사료첨가제용 미생물 조성물과 그 제조방법에 대한 기술에 대한 것이다.
매리골드(Marigold)의 학명은 Calendula officinalis이며, Triterpenes, Resins, Bitter glycosides, Volatile oil, Sterols, Flavonoids, Carotenes등이 활성물질로 알려져 있다. 매리골드는 고대부터 의학적 가치가 있음이 확인된 동유럽과 지중해 연안의 토착식물로서 고대 그리스와 인도 및 아랍지역에서 재배되어 왔다. 주로 꽃을 이용하지만, 줄기, 어린 잎, 종실 및 뿌리까지 의학적으로 활용할 수 있다. 의학적 효과로는 곰팡이류에 대한 저해효과와 바이러스 및 세균의 활성을 저해하는 효과를 나타내며, 상처의 치유에 도움을 주는 것으로 알려져 있으며, 항염증효과 항암효과 및 항산화효과 등 많은 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
매리골드에 함유되어 있는 루테인 함량은 재배 품종 및 재배 방법에 따라 다양하다. 일반적으로 매리골드에 함유된 총 카로티노이드계 색소의 70∼90%정도가 루테인의 형태로 존재한다고 알려져 있다.
매리골드에 함유되어 있는 루테인 함량은 재배 품종 및 재배 방법에 따라 다양하다. 일반적으로 매리골드에 함유된 총 카로티노이드계 색소의 70∼90%정도가 루테인의 형태로 존재한다고 알려져 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 기존의 매리골드 꽃에서 루테인을 추출하는 추출법의 한계를 극복하며, 루테인 함량이 높은 친환경적인 기능성 축산물의 생산을 목적으로 하고 있다.
최초로 매리골드에서 루테인의 정제 방법에 대한 논문을 발표한 저자는 Tyzkowski와 Hamilton이며, 이들은 1997년 최초로 매리골드에서 추출한 루테인의 정제방법을 발표했다. 하지만, 이들이 발표한 내용의 문제점은 추출하는데 시간이 많이 들며, 인체에 유해한 유기용매를 사용해야 하는 것, 또 이 유해한 용매들을 사용하고도 루테인의 추출 수율이 낮은 단점이 있었다.
그 후 매리골드에서 루테인 성분을 추출하는 여러 논문 및 특허가 발표되고 출원되었으나, 유해한 유기용매의 사용의 불가피성, 추출 후 반드시 진행해야하는 비누화 시 요구되는 고온에 의한 루테인 성분의 파괴와 변성 문제에 의한 루테인 추출 수율의 한계점이 있다.
또한, 기존의 루테인 추출방식을 산업적으로 활용할 경우 각 처리 공정별 설치 비용의 부담의 문제가 있으며, 최종산물인 고순도 루테인의 안정성 문제 또한 고민해야 할 중대한 문제점이다.
최초로 매리골드에서 루테인의 정제 방법에 대한 논문을 발표한 저자는 Tyzkowski와 Hamilton이며, 이들은 1997년 최초로 매리골드에서 추출한 루테인의 정제방법을 발표했다. 하지만, 이들이 발표한 내용의 문제점은 추출하는데 시간이 많이 들며, 인체에 유해한 유기용매를 사용해야 하는 것, 또 이 유해한 용매들을 사용하고도 루테인의 추출 수율이 낮은 단점이 있었다.
그 후 매리골드에서 루테인 성분을 추출하는 여러 논문 및 특허가 발표되고 출원되었으나, 유해한 유기용매의 사용의 불가피성, 추출 후 반드시 진행해야하는 비누화 시 요구되는 고온에 의한 루테인 성분의 파괴와 변성 문제에 의한 루테인 추출 수율의 한계점이 있다.
또한, 기존의 루테인 추출방식을 산업적으로 활용할 경우 각 처리 공정별 설치 비용의 부담의 문제가 있으며, 최종산물인 고순도 루테인의 안정성 문제 또한 고민해야 할 중대한 문제점이다.
루테인을 정제하는데에는 몇 가지 주의해야 할 문제점이 있다.
첫째로, 루테인은 열을 가하게 되면 루테인의 잔가지가 Cis형으로 이성질화된다.
둘째로, 루테인은 pH 3∼9 사이에서 가장 안정된 형태로 존재한다.
셋째로, 루테인은 빛에 의해 이성질체화 되어 활성을 잃게 된다.
본 발명에서는 매리골드 꽃에서의 루테인 성분의 추출하는데 고온을 사용하지 않고 추출하는 방법을 고안해야 했고, 또한 루테인이 가장 안정된 형태로 존재하는 약산에서 약알칼리까지의 pH를 지속적으로 유지하기 위해서 안정화과정이 필요했으며, 모든 생산 과정은 빛이 없는 암실에서 실행하여야 한다.
본 발명에서는 매리골드 꽃에서의 루테인 성분의 추출하는데 고온을 사용하지 않고 추출하는 방법을 고안해야 했고, 또한 루테인이 가장 안정된 형태로 존재하는 약산에서 약알칼리까지의 pH를 지속적으로 유지하기 위해서 김치에 많이 들어 있는 김치 유산균을 매리골드 추출물의 안정화에 활용하였다. 위의 모든 과정은 빛이 없는 암실에서 실행하였다.
매리골드 꽃에서 루테인을 추출하는데 사용되는 유기용매 대신 1) 인체에 무해한 유익 미생물인 효모를 활용하여 알코올발효를 통해 매리골드 꽃에서 루테인 성분을 추출하도록 고안하여 24시간 정도의 알코올발효 후, 2) 안정화를 위해 Latobacilus plantarum 등의 김치 유산균을 활용하여 24시간 유산발효한 후 3) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리했고 4)액상성분은 농축기를 통해 농축시켰고 5) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리한 후 남은 고체성분과 농축성분을 기타 부형제를 혼합한 후 20시간 건조시켜 완제품을 생산하였다.
본 발명으로 생산된 완제품인 사료첨가제용 미생물 조성물을 검증하기 위한 다음과 같은 일련의 실험을 건국대학교 동물생명과학대학 비반추영양학실험실에 의뢰하여 실시하였다.
실험 1. 생산된 사료첨가제용 미생물 조성물 내의 카로티노이드계열 분석 실험
실험 2. 미생물 조성물의 사료내 첨가가가 사육된 산란계의 사료섭취량 등에 미치는 영향
실험 2. 미생물 조성물의 사료내 첨가가가 사육된 산란계의 난질 및 난각질에 미치는 영향
실험 3. 미생물 조성물의 사료내 첨가가 계란 난황내 크산토필 및 루테인 함량 분석
첫째로, 루테인은 열을 가하게 되면 루테인의 잔가지가 Cis형으로 이성질화된다.
둘째로, 루테인은 pH 3∼9 사이에서 가장 안정된 형태로 존재한다.
셋째로, 루테인은 빛에 의해 이성질체화 되어 활성을 잃게 된다.
본 발명에서는 매리골드 꽃에서의 루테인 성분의 추출하는데 고온을 사용하지 않고 추출하는 방법을 고안해야 했고, 또한 루테인이 가장 안정된 형태로 존재하는 약산에서 약알칼리까지의 pH를 지속적으로 유지하기 위해서 안정화과정이 필요했으며, 모든 생산 과정은 빛이 없는 암실에서 실행하여야 한다.
본 발명에서는 매리골드 꽃에서의 루테인 성분의 추출하는데 고온을 사용하지 않고 추출하는 방법을 고안해야 했고, 또한 루테인이 가장 안정된 형태로 존재하는 약산에서 약알칼리까지의 pH를 지속적으로 유지하기 위해서 김치에 많이 들어 있는 김치 유산균을 매리골드 추출물의 안정화에 활용하였다. 위의 모든 과정은 빛이 없는 암실에서 실행하였다.
매리골드 꽃에서 루테인을 추출하는데 사용되는 유기용매 대신 1) 인체에 무해한 유익 미생물인 효모를 활용하여 알코올발효를 통해 매리골드 꽃에서 루테인 성분을 추출하도록 고안하여 24시간 정도의 알코올발효 후, 2) 안정화를 위해 Latobacilus plantarum 등의 김치 유산균을 활용하여 24시간 유산발효한 후 3) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리했고 4)액상성분은 농축기를 통해 농축시켰고 5) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리한 후 남은 고체성분과 농축성분을 기타 부형제를 혼합한 후 20시간 건조시켜 완제품을 생산하였다.
본 발명으로 생산된 완제품인 사료첨가제용 미생물 조성물을 검증하기 위한 다음과 같은 일련의 실험을 건국대학교 동물생명과학대학 비반추영양학실험실에 의뢰하여 실시하였다.
실험 1. 생산된 사료첨가제용 미생물 조성물 내의 카로티노이드계열 분석 실험
실험 2. 미생물 조성물의 사료내 첨가가가 사육된 산란계의 사료섭취량 등에 미치는 영향
실험 2. 미생물 조성물의 사료내 첨가가가 사육된 산란계의 난질 및 난각질에 미치는 영향
실험 3. 미생물 조성물의 사료내 첨가가 계란 난황내 크산토필 및 루테인 함량 분석
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 기존의 매리골드 꽃에서 루테인을 추출하는 추출법의 한계를 극복하며, 루테인 함량이 높은 친환경적인 기능성 축산물의 생산을 목적으로 하는 특허로 특히 인체에 무해한 공정을 통해 경제적으로 인체에 유익한 루테인 성분이 20ppm이상 함유된 계란을 생산하기 위한 미생물 조성물 및 그 제조방법을 제시하였다. 본 발명에 의해 생산된 루테인 성분을 다량 함유한 미생물 조성물은 사료첨가제로 루테인 성분이 함유된 계란은 기능성 축산물로 각각 활용될 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 루테인 성분이 함유된 계란을 생산하기 위한 사료첨가제용 미생물 조성물의 생산을 위한 구체 적인 내용을 설명하면 다음과 같다.
매리골드 꽃에서 루테인을 추출하는데 사용되는 유기용매 대신 1) 인체에 무해한 유익 미생물인 효모를 활용하여 알코올발효를 통해 매리골드 꽃에서 루테인 성분을 추출하도록 고안하여 24시간 정도의 알코올발효 후, 2) 안정화를 위해 Latobacilus plantarum 등의 김치 유산균을 활용하여 24시간 유산발효한 후 3) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리했고 4)액상성분은 농축기를 통해 농축시켰고 5) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리한 후 남은 고체성분과 농축성분을 기타 부형제를 혼합한 후 20시간 건조시켜 완제품을 생산하였다. 6) 루텐인 성분 검증을 위해 대학기관에 의뢰 미생물 조성물 내 루테인 함량을 분석 검증하였다 7)생산된 미생물 조성물을 산란계 사료에 0.1∼0.2 중량% 첨가하였다 8) 실험 개시 28일 경에 생산된 계란 노른자내 루테인 함량을 분석하여 제품의 효능을 검증하였다.
이하 본 발명의 구성을 아래의 실시예를 통해 설명하지만 본 발명은 아래의 실시예에 의해서만 반드시 한정되는 것은 아니다.
1. 루테인 성분이 함유된 계란을 생산하기 위한 사료첨가제용 미생물 조성물의 생산
본 발명에서는 매리골드 꽃에서의 루테인 성분의 추출하는데 고온을 사용하지 않고 추출하는 방법을 고안해야 했고, 또한 루테인이 가장 안정된 형태로 존재하는 약산에서 약알칼리까지의 pH를 지속적으로 유지하기 위해서 김치에 많이 들어 있는 김치 유산균을 매리골드 추출물의 안정화에 활용하였다. 위의 모든 과정은 빛이 없는 암실에서 실행하였다.
매리골드 꽃에서 루테인을 추출하는데 사용되는 유기용매 대신 1) 인체에 무해한 유익 미생물인 효모를 활용하여 알코올발효를 통해 매리골드 꽃에서 루테인 성분을 추출하도록 고안하여 24시간 정도의 알코올발효 후, 2) 안정화를 위해 Latobacilus plantarum 등의 김치 유산균을 활용하여 24시간 유산발효한 후 3) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리했고 4)액상성분은 농축기를 통해 농축시켰고 5) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리한 후 남은 고체성분과 농축성분을 기타 부형제를 혼합한 후 20시간 건조시켜 완제품을 생산하였다.
2. 생산된 사료첨가제용 미생물 조성물 내의 카로티노이드계열 분석 실험
본 발명에 의해 생산된 제품의 루테인 성분은 건국대학교 동물생명 과학대학 내 비반추영양학 실험실에 의뢰하였고 HPLC와 TLC를 활용하여 분석하였고, 분석결과는 [표 1]과 같다.
Marigold 품종별 발효추출물 내 카로티노이드 계열의 함량
실험 결과 아프리칸 매리골드 및 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물의 총 카로티노이드, 루테인 등과 총 카로티노이드 함량은 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 1204.2 ㎍/g, 아프리칸 매리골드 발효추출한 미생물 조성물이 538.6 ㎍/g으로 프렌치 매리골드 발효추출한 미생물 조성물이 월등히 높게 분석되었고, 루테인 함량 또한 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 872.6 ㎍/g, 아프리칸 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 379.4 ㎍/g으로 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 높게 분석되었으며, 지아잔틴 함량도 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 136.1 ㎍/g, 아프리칸 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 70.3 ㎍/g으로 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 높게 분석되었다.
카로티노이드는 yellow, orange 및 red의 색깔을 가지며, 물에 녹지 않으나 지방 또는 유기용매에 잘 녹고 구조가 서로 비슷한 무리색소이다. 실험에 사용한 아프리칸 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물의 경우 orange의 색을 띠고 있으며, 프렌치 메리골드를 발효추출한 미생물 조성물은 dark-orange의 색을 띠고 있다. 매리골드는 이 색의 차이에 따라 카로티노이드 함량에 큰 차이를 보이는 것으로 나타났다.
3. 미생물 조성물의 사료내 첨가가 사육된 산란계의 사료 섭취량 등에 미치는 영향
본 미생물 조성물은 루테인 성분을 다량 함유하고 있는 매리골드 추출물을 주원료로 하고 있으며 산란계사료에 첨가시 산란계가 생산하는 계란에 루테인 성분이 20ppm이상 함유되도록 하는데 그 목적이 있다.
본 발명으로 생산된 미생물 조성물의 효능을 검사하기 위해 건국대학교 동물생명과학부 비반추영양학 실험실에 의뢰하여 사양실험을 실시하였다. 실험에 사용된 공시동물은 55주령의 Hy-Line Brown종을 사용하였고 산란계 210수를 처리구별 산란율과 체중이 유사하도록 배치한 후 실험에 이용하였다.
사료 급이기와 음수용 니플의 숫자는 반복구별로 동일하게 배치하여 자유채식 및 자유음수 시켰고, 점등은 16L : 8D로 일정하게 유지하였으며, 기타 사양관리는 일반적으로 행해지고 있는 국내 사양관리 방법에 준하여 실시하였다. 사료는 옥수수대두박을 기초로 하여 대사에너지 2,800 kcal/kg와 16.1 중량%의 조단백질 그리고 기타 영양소의 수준은 NRC 요구량(1994)에 맞추거나 상회하도록 기초사료를 배합하여 대조구 사료로 사용하였다.
실험에 사용한 사료는 [표 2]에 나타내었고, 실험디자인은 [표 3]에 나타내었고, 본 발명으로 개발된 미생물 조성물의 비교실험을 위해 실험실에서 에탄올추출물과 열수추출로 추출한 추출액과 비교하였다. 참고로 본 발명으로 생산된 발효추출물은 0.1 중량% 사료에 첨가하였고, 실험실에서 추출한 에탄올추출물과 열수 추출 추출액은 5 중량%씩 사료에 첨가하였다.
실험 사료의 배합비와 일반성분 함량
실험디자인
매리골드 발효추출물 및 매리골드 추출물의 첨가급여가 사료섭취량 및 난 생산성에 미치는 영향을 [표 4]에 나타내었다. 본 항목은 매리골드 분말 및 추출물의 사료 내 첨가급여가 사료의 기호성과 산란율에 특이한 영향을 미치지 않는가 알아보기 위해 실시되었다.
(T1: 아프리칸 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T2: 프랜치 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T3: 아프리칸 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T4:프랜치 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T5: 아프리칸 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%, T6:프랜치 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%)
실험결과 사료섭취량, 산란율 및 난중에 있어 대조구와 비교하여 모든 처리구에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 모든 처리구의 사료섭취량이 차이가 없는 것으로 보아 매리골드 발효추출물 및 추출물의 사료 내 첨가가 사료의 기호성에는 영향이 없는 것으로 판단된다. 산란율은 T2, T3 및 T5의 산란율이 1주차에 비하여 실험이 진행 될수록 약간 감소하는 경향을 나타내었으나 유의한 차이는 없는 것으로 보아 매리골드 분말 및 추출물의 사료 내 첨가급여가 산란율에 특이한 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다. 난중은 모든 대조구 및 처리구에 있어 특이한 경향은 나타내지 않았다.
4. 미생물 조성물의 첨가가 사육된 산란계의 난질 및 난각질에 미치는 영향
실험 사료 급여 후 매주 생산된 계란 중 평균치에 해당하는 계란을 수집하여 난각 강도, 난각두께 및 Haugh unit 등 계란의 내부 난질 및 난각질 관련 항목을 측정하였다.
난각 강도는 난각 강도계(FHK 卵殼强度計, 富土乎工業株式會社)를 이용하여 계란의 둔단부를 위로하고 수직으로 고정한 후 압력을 가하여 파각되는 순간의 압력을 측정하였다. 난각 강도 측정 후 난백의 높이를 조사하여 난중을 대비한 Haugh unit 수치를 구하였다(FHK 卵白測定台, 富土乎工業株式會社).
난각 두께는 계란의 중앙부 난각 파편을 채취하여 난각 후도계(FHK Peacock, 富土乎工業株式會社)를 통해 측정한 두께의 평균치로 하였다. 실험결과는 [표 5]에 나타내었다.
(T1: 아프리칸 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T2: 프랜치 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T3: 아프리칸 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T4:프랜치 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T5: 아프리칸 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%, T6:프랜치 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%)
실험결과 난황색은 전체적으로 T1, T2, T3 및 T5 처리구가 대조구에 비하여 유의하게 높은 결과가 관찰되었으며, 프랜치 매리골드 발효추춤물 0.1 중량%를 첨가한 처리구에서 가장 난황색이 개선되는 것으로 나타났다.
5. 미생물 조성물의 산란계 사료내 첨가가 계란 난황내 크산토필 및 루테인 함량 분석
실험 종료 시에 각 처리구에서 수집한 계란에서 난백과 난황을 분리하고 난황 주위의 잔류 난백을 여과지(Whatman No.2)로 제거한 후 난황의 무게를 측정하였다. 무게 측정 후 난황은 동결건조하여 분석에 이용하였다. 난황 내 xanthophyll 함량의 분석은 AOAC(2000)의 방법을 이용하여 분석하였고, 난황내 루테인 분석은 HPLC와 TLC를 활용하여 분석하였다. 실험 결과는 에 [표 6]에 나타내었다.
(T1: 아프리칸 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T2: 프랜치 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T3: 아프리칸 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T4:프랜치 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T5: 아프리칸 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%, T6:프랜치 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%)
실험결과 난황 내 크산토필 및 루테인 함량은 T2 처리구가 유의하게 높고 T1, T4, T6, T3, T5 및 대조구의 순으로 낮았다. 발효추출물 분말을 첨가한 급여한 처리구의 크산토필 함량이 가장 높게 나왔으며, 에탄올 추출물, 증류수 추출물 순이었다. Karadas 등(2006)은 사료내 매리골드 추출물을 첨가시 난황 내 카로티노이드의 함량도 유의하게 증가하는 것을 확인하였으며, 증가한 카로티노이드 중 대부분이 루테인이었다고 보고하였다.
매리골드 꽃에서 루테인을 추출하는데 사용되는 유기용매 대신 1) 인체에 무해한 유익 미생물인 효모를 활용하여 알코올발효를 통해 매리골드 꽃에서 루테인 성분을 추출하도록 고안하여 24시간 정도의 알코올발효 후, 2) 안정화를 위해 Latobacilus plantarum 등의 김치 유산균을 활용하여 24시간 유산발효한 후 3) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리했고 4)액상성분은 농축기를 통해 농축시켰고 5) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리한 후 남은 고체성분과 농축성분을 기타 부형제를 혼합한 후 20시간 건조시켜 완제품을 생산하였다. 6) 루텐인 성분 검증을 위해 대학기관에 의뢰 미생물 조성물 내 루테인 함량을 분석 검증하였다 7)생산된 미생물 조성물을 산란계 사료에 0.1∼0.2 중량% 첨가하였다 8) 실험 개시 28일 경에 생산된 계란 노른자내 루테인 함량을 분석하여 제품의 효능을 검증하였다.
이하 본 발명의 구성을 아래의 실시예를 통해 설명하지만 본 발명은 아래의 실시예에 의해서만 반드시 한정되는 것은 아니다.
1. 루테인 성분이 함유된 계란을 생산하기 위한 사료첨가제용 미생물 조성물의 생산
본 발명에서는 매리골드 꽃에서의 루테인 성분의 추출하는데 고온을 사용하지 않고 추출하는 방법을 고안해야 했고, 또한 루테인이 가장 안정된 형태로 존재하는 약산에서 약알칼리까지의 pH를 지속적으로 유지하기 위해서 김치에 많이 들어 있는 김치 유산균을 매리골드 추출물의 안정화에 활용하였다. 위의 모든 과정은 빛이 없는 암실에서 실행하였다.
매리골드 꽃에서 루테인을 추출하는데 사용되는 유기용매 대신 1) 인체에 무해한 유익 미생물인 효모를 활용하여 알코올발효를 통해 매리골드 꽃에서 루테인 성분을 추출하도록 고안하여 24시간 정도의 알코올발효 후, 2) 안정화를 위해 Latobacilus plantarum 등의 김치 유산균을 활용하여 24시간 유산발효한 후 3) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리했고 4)액상성분은 농축기를 통해 농축시켰고 5) 고체 성분 및 액체성분 각각을 분리한 후 남은 고체성분과 농축성분을 기타 부형제를 혼합한 후 20시간 건조시켜 완제품을 생산하였다.
2. 생산된 사료첨가제용 미생물 조성물 내의 카로티노이드계열 분석 실험
본 발명에 의해 생산된 제품의 루테인 성분은 건국대학교 동물생명 과학대학 내 비반추영양학 실험실에 의뢰하였고 HPLC와 TLC를 활용하여 분석하였고, 분석결과는 [표 1]과 같다.
| 매리골드 분말 | |
| ppm | |
| 아프리칸 매리골드 발효추출물 | |
| Total carotenoid | 538.6±4.98 |
| Lutein | 379.4±6.51 |
| Zeaxanthin | 70.3±2.11 |
| 프랜치 매리골드 발효추출물 | |
| Total carotenoid | 1,204.2±3.42 |
| Lutein | 872.6±3.21 |
| Zeaxanthin | 136.1±6.13 |
실험 결과 아프리칸 매리골드 및 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물의 총 카로티노이드, 루테인 등과 총 카로티노이드 함량은 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 1204.2 ㎍/g, 아프리칸 매리골드 발효추출한 미생물 조성물이 538.6 ㎍/g으로 프렌치 매리골드 발효추출한 미생물 조성물이 월등히 높게 분석되었고, 루테인 함량 또한 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 872.6 ㎍/g, 아프리칸 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 379.4 ㎍/g으로 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 높게 분석되었으며, 지아잔틴 함량도 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 136.1 ㎍/g, 아프리칸 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 70.3 ㎍/g으로 프렌치 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물이 높게 분석되었다.
카로티노이드는 yellow, orange 및 red의 색깔을 가지며, 물에 녹지 않으나 지방 또는 유기용매에 잘 녹고 구조가 서로 비슷한 무리색소이다. 실험에 사용한 아프리칸 매리골드를 발효추출한 미생물 조성물의 경우 orange의 색을 띠고 있으며, 프렌치 메리골드를 발효추출한 미생물 조성물은 dark-orange의 색을 띠고 있다. 매리골드는 이 색의 차이에 따라 카로티노이드 함량에 큰 차이를 보이는 것으로 나타났다.
3. 미생물 조성물의 사료내 첨가가 사육된 산란계의 사료 섭취량 등에 미치는 영향
본 미생물 조성물은 루테인 성분을 다량 함유하고 있는 매리골드 추출물을 주원료로 하고 있으며 산란계사료에 첨가시 산란계가 생산하는 계란에 루테인 성분이 20ppm이상 함유되도록 하는데 그 목적이 있다.
본 발명으로 생산된 미생물 조성물의 효능을 검사하기 위해 건국대학교 동물생명과학부 비반추영양학 실험실에 의뢰하여 사양실험을 실시하였다. 실험에 사용된 공시동물은 55주령의 Hy-Line Brown종을 사용하였고 산란계 210수를 처리구별 산란율과 체중이 유사하도록 배치한 후 실험에 이용하였다.
사료 급이기와 음수용 니플의 숫자는 반복구별로 동일하게 배치하여 자유채식 및 자유음수 시켰고, 점등은 16L : 8D로 일정하게 유지하였으며, 기타 사양관리는 일반적으로 행해지고 있는 국내 사양관리 방법에 준하여 실시하였다. 사료는 옥수수대두박을 기초로 하여 대사에너지 2,800 kcal/kg와 16.1 중량%의 조단백질 그리고 기타 영양소의 수준은 NRC 요구량(1994)에 맞추거나 상회하도록 기초사료를 배합하여 대조구 사료로 사용하였다.
실험에 사용한 사료는 [표 2]에 나타내었고, 실험디자인은 [표 3]에 나타내었고, 본 발명으로 개발된 미생물 조성물의 비교실험을 위해 실험실에서 에탄올추출물과 열수추출로 추출한 추출액과 비교하였다. 참고로 본 발명으로 생산된 발효추출물은 0.1 중량% 사료에 첨가하였고, 실험실에서 추출한 에탄올추출물과 열수 추출 추출액은 5 중량%씩 사료에 첨가하였다.
| 사료원료 | 기초사료 |
| 옥수수 | 65.52 중량% |
| 루핀종실 | 4.00 중량% |
| 대두박 | 13.96 중량% |
| 채종박 | 2.00 중량% |
| 육분 | 3.00 중량% |
| 석회석 | 9.51 중량% |
| DCP(Dicalcium phosphate) | 0.55 중량% |
| 소금 | 0.25 중량% |
| 우지 | 0.80 중량% |
| 염화콜린(50%) | 0.08 중량% |
| DL-Methionine | 0.07 중량% |
| 미네랄 믹스 | 0.10 중량% |
| 비타민 믹스 | 0.10 중량% |
| Phytase | 0.06 중량% |
| 총합계 | 100.00 중량% |
| 건물량 | 88.80 중량% |
| 조단백질 | 16.10 중량% |
| 조지방 | 2.95 중량% |
| 조섬유 | 3.40 중량% |
| 조회분 | 11.97 중량% |
| 칼슘 | 3.86 중량% |
| 가용성 인 | 0.50 중량% |
| 메치오닌+시스테인 | 0.65 중량% |
| TMEn | 2,800 kcal/kg |
| 처리구 | 분말 | 에탄올 추출액 | 열수추출 추출액 | |||
| 아프리칸매리골드 추출물 | 프랜치 매리골드 추출물 | 아프리칸매 리골드 추 출물 | 프랜치 매 리골드 추 출물 | 아프리칸매 리골드 추 출물 | 프랜치 매 리골드 추 출물 | |
| 대조구 | ||||||
| T1 | 0.1 중량% | |||||
| T2 | 0.1 중량% | |||||
| T3 | 5.0 중량% | |||||
| T4 | 5.0 중량% | |||||
| T5 | 5.0 중량% | |||||
| T6 | 5.0 중량% | |||||
매리골드 발효추출물 및 매리골드 추출물의 첨가급여가 사료섭취량 및 난 생산성에 미치는 영향을 [표 4]에 나타내었다. 본 항목은 매리골드 분말 및 추출물의 사료 내 첨가급여가 사료의 기호성과 산란율에 특이한 영향을 미치지 않는가 알아보기 위해 실시되었다.
| 구분 | 대조구 | T1 | T2 | T3 | T4 | T5 | T6 |
| 사료섭취량 | 124.6±1.45 | 124.0±1.31 | 124.1±1.79 | 124.5±1.66 | 124.6±1.76 | 124.4±1.87 | 124.3±1.52 |
| 산란율 (%) | 86.00±2.58 | 86.40±2.23 | 84.25±1.39 | 81.25±2.28 | 85.45±2.35 | 80.99±2.91 | 83.20±2.69 |
| 난중(g) | 66.1±1.21 | 65.13±0.32 | 66.98±0.76 | 65.71±0.33 | 65.98±0.71 | 66.77±1.32 | 67.35±0.75 |
(T1: 아프리칸 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T2: 프랜치 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T3: 아프리칸 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T4:프랜치 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T5: 아프리칸 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%, T6:프랜치 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%)
실험결과 사료섭취량, 산란율 및 난중에 있어 대조구와 비교하여 모든 처리구에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 모든 처리구의 사료섭취량이 차이가 없는 것으로 보아 매리골드 발효추출물 및 추출물의 사료 내 첨가가 사료의 기호성에는 영향이 없는 것으로 판단된다. 산란율은 T2, T3 및 T5의 산란율이 1주차에 비하여 실험이 진행 될수록 약간 감소하는 경향을 나타내었으나 유의한 차이는 없는 것으로 보아 매리골드 분말 및 추출물의 사료 내 첨가급여가 산란율에 특이한 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다. 난중은 모든 대조구 및 처리구에 있어 특이한 경향은 나타내지 않았다.
4. 미생물 조성물의 첨가가 사육된 산란계의 난질 및 난각질에 미치는 영향
실험 사료 급여 후 매주 생산된 계란 중 평균치에 해당하는 계란을 수집하여 난각 강도, 난각두께 및 Haugh unit 등 계란의 내부 난질 및 난각질 관련 항목을 측정하였다.
난각 강도는 난각 강도계(FHK 卵殼强度計, 富土乎工業株式會社)를 이용하여 계란의 둔단부를 위로하고 수직으로 고정한 후 압력을 가하여 파각되는 순간의 압력을 측정하였다. 난각 강도 측정 후 난백의 높이를 조사하여 난중을 대비한 Haugh unit 수치를 구하였다(FHK 卵白測定台, 富土乎工業株式會社).
난각 두께는 계란의 중앙부 난각 파편을 채취하여 난각 후도계(FHK Peacock, 富土乎工業株式會社)를 통해 측정한 두께의 평균치로 하였다. 실험결과는 [표 5]에 나타내었다.
| 구분 | 대조구 | T1 | T2 | T3 | T4 | T5 | T6 |
| 난각색 | 29.96±0.44 | 28.62±0.53 | 29.86±0.45 | 29.73±0.94 | 28.74±0.68 | 30.24±0.33 | 30.11±0.49 |
| 난황색 | 6.46±0.08c | 6.75±0.06b | 7.96±0.11a | 6.77±0.07b | 6.32±0.07c | 6.93±0.05b | 6.43±0.08c |
| 난각강도 | 3.06±0.07 | 2.99±0.06 | 2.97±0.08 | 3.04±0.07 | 3.09±0.07 | 3.13±0.05 | 2.98±0.06 |
| 난각두께 | 35.30±0.31 | 34.94±0.20 | 35.41±0.24 | 36.07±0.30 | 35.70±0.25 | 35.84±0.44 | 35.14±0.40 |
| Haugh unit | 84.84±0.92 | 84.50±0.65 | 86.29±1.13 | 86.02±1.02 | 85.98±0.63 | 84.44±0.99 | 85.88±0.74 |
(T1: 아프리칸 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T2: 프랜치 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T3: 아프리칸 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T4:프랜치 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T5: 아프리칸 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%, T6:프랜치 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%)
실험결과 난황색은 전체적으로 T1, T2, T3 및 T5 처리구가 대조구에 비하여 유의하게 높은 결과가 관찰되었으며, 프랜치 매리골드 발효추춤물 0.1 중량%를 첨가한 처리구에서 가장 난황색이 개선되는 것으로 나타났다.
5. 미생물 조성물의 산란계 사료내 첨가가 계란 난황내 크산토필 및 루테인 함량 분석
실험 종료 시에 각 처리구에서 수집한 계란에서 난백과 난황을 분리하고 난황 주위의 잔류 난백을 여과지(Whatman No.2)로 제거한 후 난황의 무게를 측정하였다. 무게 측정 후 난황은 동결건조하여 분석에 이용하였다. 난황 내 xanthophyll 함량의 분석은 AOAC(2000)의 방법을 이용하여 분석하였고, 난황내 루테인 분석은 HPLC와 TLC를 활용하여 분석하였다. 실험 결과는 에 [표 6]에 나타내었다.
| 구분 | Control | T1 | T2 | T3 | T4 | T5 | T6 |
| 크산토필 | 21.7±0.96c | 27.7±0.87ab | 30.3±1.01a | 22.4±1.14c | 25.4±1.53bc | 21.8±1.66c | 24.7±1.57bc |
| 루테인 | 10.3±0.72c | 18.3±1.03b | 23.2±0.93a | 11.5±0.89c | 17.3±0.89b | 11.1±0.73c | 16.0±0.83b |
(T1: 아프리칸 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T2: 프랜치 매리골드 발효추출물 0.1 중량%, T3: 아프리칸 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T4:프랜치 매리골드 에탄올 추출물 5.0 중량%, T5: 아프리칸 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%, T6:프랜치 매리골드 열수 추출물 5.0 중량%)
실험결과 난황 내 크산토필 및 루테인 함량은 T2 처리구가 유의하게 높고 T1, T4, T6, T3, T5 및 대조구의 순으로 낮았다. 발효추출물 분말을 첨가한 급여한 처리구의 크산토필 함량이 가장 높게 나왔으며, 에탄올 추출물, 증류수 추출물 순이었다. Karadas 등(2006)은 사료내 매리골드 추출물을 첨가시 난황 내 카로티노이드의 함량도 유의하게 증가하는 것을 확인하였으며, 증가한 카로티노이드 중 대부분이 루테인이었다고 보고하였다.
Claims (12)
1) 매리골드(Mari gold)에 사카로마이시스 세르비지에(Sacchromyces cerevisiae)를 첨가하여 24시간 동안 알콜 발효시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 매리골드 알코올 발효물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacilus plantarum)을 첨가하여 24시간 동안 유산 발효시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 매리골드 유산 발효물의 고체성분 및 액체성분을 서로 분리하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 분리한 액상성분을 농축기로 농축시키는 단계; 및,
5) 상기 단계 4)에서 농축시킨 액상성분을 상기 단계 3)에서 분리한 고체성분과 혼합하는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 매리골드는 프랜치 매리골드(French marigold)인 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 1) 내지 5)의 단계는 암실에서 수행되는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 1) 내지 5)의 단계에서 매리골드 발효물은 pH 3 내지 pH 9로 유지되는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 단계 5)에서 혼합된 액상성분 및 고체성분에 부형제를 혼합하여 20시간 건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 부형제는 전체 부형제 총량에 대하여 생균제 20~25 중량%, 고춧가루 10~15 중량 %, 흑미 10~15 중량% 및 홍국 5~10 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물.
제 1항의 사료 첨가제 조성물을 0.1 중량% 포함하는 기능성 사료.
1) 매리골드(Mari gold)에 사카로마이시스 세르비지에(Sacchromyces cerevisiae)를 첨가하여 24시간 동안 알콜 발효시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 매리골드 알코올 발효물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacilus plantarum)을 첨가하여 24시간 동안 유산 발효시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 매리골드 유산 발효물의 고체성분 및 액체성분을 서로 분리하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 분리한 액상성분을 농축기로 농축시키는 단계; 및,
5) 상기 단계 4)에서 농축시킨 액상성분을 상기 단계 3)에서 분리한 고체성분과 혼합하는 단계;
6) 상기 단계 5)에서 혼합된 액상성분 및 고체성분에 부형제를 혼합하여 20시간 건조하는 단계;
7) 상기 단계 6에서 생산된 건조분말을 0.1 중량% 포함하는 사료를 제조하는 단계;
8) 산란계에 상기 단계 7)에서 제조한 사료를 1주 이상 자유급식하는 단계; 및,
9) 산란계로부터 계란을 생산하는 단계를 포함하는 루테인 함유 기능성 계란의 생산 방법.
제 8항의 방법으로 생산된 루테인 함유 기능성 계란.
제 9항에 있어서, 상기 루테인 함유 기능성 계란은 난중 루테인 함량이 11-25 ppm이상인 것을 특징으로 하는 기능성 계란.
제 9항에 있어서, 상기 루테인 함유 기능성 계란은 난중 루테인 함량이 15-23.5 ppm이상인 것을 특징으로 하는 기능성 계란.
제 9항에 있어서, 상기 루테인 함유 기능성 계란은 난중 루테인 함량이 23 ppm이상인 것을 특징으로 하는 기능성 계란.
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2008
- 2008-04-10 KR KR1020080032978A patent/KR101016104B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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