KR101013940B1

KR101013940B1 - 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법

Info

Publication number: KR101013940B1
Application number: KR1020100083182A
Authority: KR
Inventors: 임강현; 김정범; 김이화; 송효남; 안철현
Original assignee: 주식회사 자연인; 세명대학교 산학협력단
Priority date: 2009-11-12
Filing date: 2010-08-26
Publication date: 2011-02-14
Also published as: WO2011059170A2; WO2011059170A3

Abstract

본 발명은 방풍통성산 한방약재들로부터 방향성물질을 추출하는 방법에 관한 것으로서 감초, 길경, 대황, 박하, 백출, 천궁, 형개등을 각각 건조한 후 혼합하고 분쇄하는 제1단계와, 상기 혼합물을 초임계 추출조에 넣고 초임계 유체를 공급하는 제2단계와, 추출조 내 압력은 200~500기압, 온도는 65℃로 상승시킨 후 상기 초임계 추출조를 5~7시간 동안 일정하게 유지시키는 제3단계와, 5~7시간 경과 후 상기 초임계 추출조의 내부 압력을 감소시킨 다음 내부에 저장된 혼합물로부터 추출물을 추출하는 제4단계로 구성된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면 종래의 정유추출법과 달리 공정이 간단하며, 추출시간을 줄일 수 있고, 본 발명에 의하여 제조된 조성물은 사용자에게 안정적인 향을 제공한다. 또한 한방 약초의 향기에 의하여 인체의 건강에 도움이 되는 조성물을 제공하며 나아가 한방천연향이 인체에 들어가 식욕이 억제되는 효과를 가져와 체중감량의 효과를 발생한다.

Description

방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법{THE METHOD THAT EXTRACT AROMATIC SUBSTANCE FROM CHINESE HERB MEDICINE}

본 발명은 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법으로서 더욱 상세하게는 감초, 길경, 대황, 박하, 백출, 천궁, 형개 등의 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법에 관한 것이다.

산업전반에 걸쳐 환경에 대한 관심이 증가되는 상황에서 천연물 유효성분을 추출, 정제하는 공정이나 기존의 유기용매를 이용한 추출, 정제 공정은 환경 및 인체 독성, 목적 성분에 대한 비선택성, 고비용 등의 문제점이 발생하였으며 근래에는 새로운 공정을 도입하기 위한 다각도의 시도가 국내외에서 모색되고 있다.

즉, 정밀화학, 에너지, 환경, 신소재 등 제반 산업에는 공정 유체로 초임계 유체를 사용하는 기술이 급속도로 파급되면서 전통적인 다양한 분리기술이 초임계 유체 공정을 이용하는 신기술로 대체해가고 있는 추세이다.

일예로, 방풍통성산 유효성분들을 추출하는 기술이 있는데 이를 살펴보면, 상기 방풍통성산 유효성분들을 추출하는 기술은 에탄올 등의 용매에 상기 혼합 추출물을 넣은 후 용매가 증발되는 것을 방지하도록 냉각 콘덴서가 장착된 증류장치에서 50~95℃, 3~20시간 가열하여 추출하거나 또는 5~37℃에서 1~15일간 침적시켜 유효성분을 추출한 다음 에탄올 등의 용매를 증발 농축하여 정유를 추출하였다.

이 때, 상기 방풍통성산 유효성분들을 추출하는 기술은 천연물 추출물 각각을 추출한 다음 이를 혼합한 경우에도 같은 효과를 나타내므로 이 방법도 동일하게 적용이 가능하다. 즉, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 상기 방풍통성산 천연물 혼합추출물을 완전히 감압 농축하여 추출물을 얻는다.

그러나 상기와 같은 추출법은 고온으로 가열하거나 유기 용매를 사용하기 때문에 증발, 열분해, 산화로 인하여 자연 활성 성분이 파괴되고 효능을 나타내는 정유 등의 손실되는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 기존의 정유추출법과 달리 공정을 간단히 하면서도 추출시간을 줄일 수 있도록 한 방풍통성산 정유방법을 제공하는데 목적이 있다.

또한, 방풍통성산 정유방법을 통해 얻어진 정유를 이용하여 식욕억제 및 감퇴 등의 효과를 항진시킬 수 있는 방풍통성산 정유 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 감초, 길경, 대황, 박하, 백출, 천궁, 형개를 건조한 후 혼합하여 분쇄하는 제1단계와, 상기 제1단계를 거쳐 분쇄된 혼합물을 초임계 추출조에 넣고 초임계 유체를 공급하는 제2단계와, 상기 혼합물이 공급된 초임계 추출조 내부 압력을 200~500기압에 맞추고 온도는 65℃로 조절한 후 상기 초임계 추출조를 5~7시간동안 일정하게 유지시키는 제3단계와, 5~7시간 경과 후 상기 초임계 추출조의 내부 압력을 감소시킨 다음 내부에 저장된 혼합물로부터 추출물을 추출하는 제4단계를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.

상술된 바와 같이, 본 발명은 방풍통성산한약재로부터 방향성성분을 효율적으로 추출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 종래의 정유추출법과는 달리 공정이 간단하며, 추출시간을 줄일 수 있고, 본 발명에 의하여 제조된 다이어트용 방향제 조성물은 사용자에게 안정적인 향을 제공하고, 발산된 향이 방향제를 설치한 곳의 주위에 오랜 시간동안 향기가 유지될 수 있는 방풍통성산 정유 조성물을 제공한다.

또한 상기 추출방법을 통해 얻어진 방풍통성산 정유 조성물의 구성성분으로 한방적으로 인체를 건강하게 하는 한방 약초를 이용함으로서, 한방 약초의 향기에 의하여 인체의 건강에 도움이 되는 조성물을 제공하며 나아가 한방천연향이 인체에 들어가 식욕이 억제되는 효과를 가져와 체중감량의 효과를 발생한다.

도 1은 본 발명의 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법을 도시한 순서도.
도 2는 실험 대상군의 Leptin 양성 세포발현의 변화를 나타낸 그래프도.
도 3은 실험 대상군의 NPY 양성 세포발현의 변화를 나타낸 그래프도.
도 4는 실험 대상군의 단기 기억능력의 변화를 나타낸 그래프도.
도 5는 실험 대상군의 BDNF 단백질 발현의 변화를 나타낸 그래프도.

이하, 본 발명에 따른 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법을 첨부된 도면을 참조로 하여 설명하기로 한다.

본 발명인 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법은 감초, 길경, 대황, 박하, 백출, 천궁, 형개를 건조한 후 혼합하여 분쇄하는 제1단계(S100)와, 상기 제1단계(S100)를 거쳐 분쇄된 혼합물을 초임계 추출조에 넣고 초임계유체를 공급하는 제2단계(S200)와, 내부에 상기 혼합물이 공급된 초임계 추출조 내부 압력을 200~500기압에 맞추고 온도는 65℃로 조절한 후 상기 초임계 추출조를 5~7시간동안 일정하게 유지시키는 제3단계(S300)와 5~7시간 경과 후 상기 초임계 추출조의 내부 압력을 감소시킨 다음 내부에 저장된 혼합물로부터 추출물을 추출하는 제4단계(S400)와 상기 제4단계(S400)를 통해 추출된 추출물을 용매를 이용하여 용해시켜 왁스 성분 및 비휘발성물질을 제거하는 제5단계(S500)으로 이루어진다.

먼저 방풍통성산 한약재를 구성하는 감초, 길경, 대황, 박하, 백출, 천궁, 형개에 대해서 설명하면 다음과 같다.

상기 감초는 쓴 약을 달게 하여먹기 좋게 하는 것 뿐만 아니라 모든 약의 독성을 풀어주고 기침과 담을 삭이며 모든 약을 중화하는 효과가 있고, 동의 보감에는 감초는 5장 6부의 한열과 사기를 다스리며 눈, 코, 입, 귀 대소변의 생리를 정상으로 활동하게하고 모든 혈맥을 소통시키며 근육과 뼈를 튼튼하게 하고 영양상태를 좋게 하고 또 모든 약의 독성을 해독하고 72가지 석약과 1200가지 초약을 서로 조화하여 약효를 잘 나타나게 한다고 적혀있다. 또한 긴장을 풀어주고 항알러지 작용을 하여 위궤양, 십이지장궤양에도 효과가 크다.

그리고 길경은 도라지과 식물로 세포성 면역을 증강시키고 점막의 점액분을 증강하고 배농을 촉진시키는 등 상처치료에 효과가 있을 뿐만 아니라 길경의 사포닌 작용으로 피부에 세포부활작용을 도와 피부표면조직을 부드럽게 하고 혈행 촉진을 도와 피부로 관리해주는 효과도 있다.

다음으로 대황은 인체를 매우 차갑게 하며 몸에 깨끗하지 못한 피를 제거하는 효과가 있고 특히 본 발명자가 대황에 대한 성질에 대하여 연구한 결과 대황의 방향성에 대한 성질은 다른 향을 가라앉혀 한 곳에 응집시키는 것을 알게 되었으며, 이러한 대황을 다른 약초 방향제 조성물에 첨가할 경우에는 전체의 방향이 쉽게 발산하는 것을 방지하도록 개발하였다.

또한 박하는 머리와 눈을 밝게 하고 땀을 나게 하며, 해열작용이 있어 감기, 두통에 효과가 있고 그 향은 맵고 약간 쓴 것이 특징이며, 사용자로 하여금 청량 상쾌함을 느끼게 해준다. 이러한 '박하'의 맵고 청량 상쾌한 향은 중추신경을 자극하여 간접적으로 말초신경에 전도됨으로서, 피부 모세혈관의 확대 및 땀샘의 분비를 촉진하여 인체에 발한해열작용을 하는 것이다.

그리고 백출은 기를 보하고 비를 튼튼히 하며 설사를 낫게 하고 땀을 멈추는 효과가 있으며 백출은 국화과 삽주속 식물로서 그 뿌리와 줄기를 약으로 사용하고 있다. 구성성분으로 휘발정유를 포함하고 있으며 정유의 주요한 것 atractylon, atractylenolide Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ이 있고 비타민 A성 물질도 함유하고 있다.

다음으로 천궁은 한방적으로 인체를 따뜻하게 하고 두통을 없애며 이목구비를 통하게 하는 효과가 있고 피의 생성을 돕고 피를 맑게 하여 울혈을 풀어주는 기능을 하는 것으로 알려져 있으며 이러한 천궁의 향은 약간 맵고 쓴 것이 특징이다.

마지막으로 형개는 머리와 눈을 맑게 하고 감기로 인한 두통과 찬 기운을 발산시키는 효과가 있고 다량의 휘발성 정유가 포함되어 그 발산하는 향기는 약간 매운 향으로 박하향과 비슷하여, 땀샘의 분비를 왕성케하고, 신경의 경련을 안정시키며, 피부의 혈액순환을 왕성케 하는 작용이 있다.

이하에서는 추출방법으로 초임계 유체 추출방법에 대하여 살펴본다.

먼저 초임계유체라는 단어의 정의에 대하여 살펴보면, 모든 순수 물질은 온도, 압력의 변화에 따라 기체 및 액체 고체 등의 상태를 나타내는데 이 중 기체 및 액체의 상전이 곡선인 증기압 곡선을 살펴보면 온도가 증가함에 따라 압력도 함께 증가함을 알 수 있다. 이는 새로운 평형점에 도달하기 위한 결과로써 증기압의 증가를 가져오고 결국 액상과 기상 사이의 밀도 차이가 감소되기 때문이다. 이러한 액체와 기체의 밀도 차이가 임계점 이라는 곳에서 동일해져 구별할 수 없게 되며 임계점 이상의 영역에서는 압력을 증가시켜도 액화현상이 일어나지 않고 또한 온도를 높여도 기화현상이 일어나지 않는 특징이 있다.

이러한 임계점 이상에서 기체와 액체의 중간 성격을 갖는 유체를 초임게 유체라 정의한다. 초임계 유체는 미세한 온도 압력 변화에도 밀도가 크게 변하므로 용해력을 쉽게 조절할 수 있으며 또한 기체 및 액체와는 또 다른 고유의 특성을 갖추고 있다. 즉, 용매와 용질 분자 사이의 상호작용에 관련된 용해(dissolution), 기질(matrix)로부터 용질을 분리해 내는 능력과 밀접한 연관성을 갖는 밀도(density) 등의 측면에서는 액체의 특성을 나타내며 기질 투과성과 관련이 있는 높은 확산도(difficulty), 낮은 표면장력(surface tension)등은 기체의 성질을 나타낸다.

초임계 유체추출기술(Surpercritical Fluid Extraction Technology)은 임계 온도 및 임계 압력 이상의 유체를 사용하는 기술로 의약품, 식품가공 및 석유화학물질 정제 등의 추출, 정제관련 분야에서 기존의 공정을 대체할 수 있는 새로운 환경친화적 기술로 주목받고 있다. 특히, 근자에 이르러 에너지 자원 가격의 상승, 전통적인 분리 공정이 지니는 환경폐해, 기체나 액체 공정으로 제조가 불가능한 특수 목적 신소재 수요의 신장등의 이유로 선진 각국에서는 지난 30여년간, 전통적인 공정으로 기체나 액체를 사용하는 개념을 탈피하여 초임계 유체 기술을 공정 유체로 사용하는 신공정 유체기술의 개발에 심혈을 기울여 오고 있다. 초임계유체 추출은 초임계 상태의 유체가 갖는 여러 장점을 이용하는 기술로서 증류(distillation)와 추출(extraction) 의 원리가 같이 적용되는 복합 기술의 성격을 갖기 때문에 여러 가지 독특한 장점을 갖는다. 초임계 유체는 압력 온도의 조작에 의하여 고밀도 상태에서 저밀도 상태에 어떤 조건 설정도 가능하기 때문에 분획, 분리 등의 선택성이 뛰어나서 고순도의 제품을 얻을 수 있고, 추출용매를 손실 없이 거의 완전하게 회수할 수 있으며, 잔존 용매가 없는 정제물을 얻을 수 있다.

또한, 초임계 유체의 점도가 작아 시료에의 침투성이 좋아 추출효율이 높으며 또한 확산계수(diffusion coefficient)가 크므로 추출속도가 빠르며, 비교적 저온에서 추출함으로서 열에 의한 손상을 피할 수 있고, 시료와 초임계유체와의 밀도차이가 크고 초임계 유체의 점도가 낮으므로 추출잔류물과 용매의 분리가 용이한 장점 등 많은 장점을 가지고 있다.

본 발명에서 따른 초임계 유체 추출법은 초임계 유체로서 이산화탄소를 사용하며 추출공정은 다음과 같다.

1) 감초, 길경, 대황, 박하, 백출, 천궁, 형개를 각각 건조하고 혼합하 고 분쇄하는 단계;

2) 상기 혼합물을 초임계 추출조에 넣고 초임계 유체를 공급하는 단계;

3) 추출조의 압력을 450기압으로 유지시키며 추출조 내부의 온도를 0.5℃ /min 속도로 65℃까지 승온시키는 단계;

4) 추출조의 온도와 압력을 65℃, 200~500 기압으로 5~7시간 유지 한 후 상압으로 감압하여 다이어트용 방향제 조성물을 얻는 단계;

5)용매추출법을 적용하여 에탄올 용매로 방향제 조성물에서 왁스 성분 및 비휘발성 물질을 용해시킨 다음 분액깔때기로 제거하여 다이어트용 방향제 조성물을 얻는 단계를 포함한다.

상기와 같은 초임계 조건에서의 추출을 통해서 유효성분의 효과적인 수득뿐만 아니라 각 유효성분들이 추출 후에 각각의 유효성이 잘 발현되고 서로가 시너지 효과를 얻을 수 있게 된다.

본 발명에 따른 감초, 길경, 대황, 박하, 백출, 천궁, 형개 의 혼합 정유 추출물인 다이어트용 방향제 정유 조성물의 추출방법을 보다 상세히 살펴보면 다음과 같다.

먼저 각각의 감초, 길경, 대황, 박하, 백출, 천궁, 형개를 잘 건조하고 감초 90중량부에 대하여 길경 80~100중량부, 대황 60~80중량부, 박하 40~60중량부, 백출 80~100중량부, 천궁 40~60중량부, 형개 40~60중량부, 형개 40~60중량부를 혼합하고 분쇄기를 이용하여 그 혼합물을 미세 분쇄하며, 여기서 혼합물의 혼합 비율은 다이어트용 방향제로 그 혼합물이 기능하는데 최적화되도록 실험을 통해 확인된 것이다.

다음으로 상기의 혼합물을 초임계 추출조에 투입하고 고압용 기체 펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 공급하여 압력을 높인다. 추출조의 압력이 450기압에 달하면 이산화탄소의 공급을 중단한다. 이때 추출조 내부의 온도는 섭씨 25~35도로 유지하며, 그 이유는 가압 펌프와 추출조간에 긴 관(1m)으로 연결되어 있어서 가압 펌프에 근접한 곳은 가온되나 실제로 추출조 내부의 온도는 변화가 없게 된다.

그 후에 온도 제어기를 이용하여 추출조 외부를 감싸고 있는 열선을 이용하여 추출조 내부의 온도를 0.5℃/min 속도로 섭씨 65도까지 승온시킨다. 승온으로 인한 추출조의 압력은 추출조의 출구에 부착된 압력 조절기를 이용하여 이산화탄소를 일부 배출하며 압력을 300기압으로 유지한다.

다음으로 추출조의 온도와 압력을 섭씨 65도, 450기압으로 6시간 유지한다. 고압용 기체펌프를 재가동하여 20L/min의 유량으로 이산화탄소를 추출조에 연속적으로 공급을 한다. 동시에 출구 쪽에 부착된 압력조절기를 이용하여 추출물을 방출시키며 추출조의 온도와 압력을 일정하게 유지한다.

방출된 추출물을 1기압으로 감압하여 이산화탄소를 대기로 방출시키고, 방향성 정유 추출물의 유효성분을 함께 포집기 내로 회수한다. 위의 과정을 12시간 동안 수행하여 추출물을 얻어낸 후 추출조업을 종료한다.

하기에서는 본 발명에 따라 추출된 다이어트용 방향제 정유 조성물의 기능에 대해 실험예를 통해 살펴보기로 한다.

[실험예]

1. 실험 대상

본 실험에서 사용된 동물은 5주령(25 g ± 2)의 ICR 계통의 생쥐를 국가공인 동물취급업체(Orient Bio Co, Kyung-Gi, Korea)로 부터 공급받았다. 실험동물들을 3일간의 환경적응 기간을 거치게 한 후 무작위 표본 추출에 의해 3집단으로 나누어 대조군(n = 8), 절식군(n = 8), 절식-다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입군(n = 8)으로 구분하였다. 절식 쥐는 48시간동안 물만 공급하고 사료는 공급하지 않았다. 각 집단별로 쥐들을 사육케이스(30 cm × 20 cm) 에 넣고 항온(20 ± 2 ℃), 항습(60%)이 유지되며 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 동일한 실험실 환경에서 사육하였다.

다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입은 밀폐된 플라스틱 상자 (35 × 23 × 24 cm)에 그 방향제 정유 조성물을 실험 시작 하루 전에 미리 넣어 그 향이 플라스틱 상자 안에 충분히 퍼지도록 하였다.

향 흡입은 하루 2번 오전 10시와 오후 6시에 1시간씩 정유 조성물 향 흡입군 쥐를 밀폐된 상자 안에 넣어 2일간 반복적으로 자유 흡입하도록 하였다.

2. 기억 능력 측정

기억 능력 측정장비는 step-down avoidance task(NeuroLab, Korea)를 사용하였으며, 실험동물들에게 최초 7 × 25 cm 플랫폼 (높이 2.5 cm)에서 2분간 안정을 취하게 한 후 기억 능력 측정을 실시하였다. 기록은 플랫폼 위에 놓인 쥐들이 평행하게 놓인 1 cm 간격의 스테인레스 강철막대기 (42 × 25 cm)에 네 발이 모두 닿았을 때 측정하였다. 플랫폼에서 내려온 쥐들에게 0.2 mA의 전기 자극을 2초간 주어 쥐들에게 기억을 시킨 뒤 1시간 후 테스트를 실시하였다. 기록측정은 동일한 절차로 하였으며, 전기 자극은 부여하지 않았다. 플랫폼에서 네발이 모두 닿는 시간은 최대 180초까지 기록하였다.

3. 조직처리

실험이 끝난 동물은 Zoletile 50^®(Vibac, Carros, France)을 실험동물 복강에 10 mg/kg로 주사하여 마취시킨 후 흉강을 열고 좌심실을 통해 50mM 인산염 완충식염수(Phosphate buffer saline, PBS)를 5분간 주입하였다. 계속해서 100mM 인산 완충액(phosphate buffer, PB)에 4% paraformaldehyde(PFA) 고정액을 10분간 관류시킨 후 뇌를 적출하고, 4℃에서 4% PFA용액에 24시간 침전시킨 후 고정하였다. 고정된 뇌 조직은 30% sucrose 용액에 일주일간 침전시킨 후 freezing microtome (Leica, Nussloch, Germany)를 이용하여 40μm의 두께로 연속횡단 절편을 제작하였다.

4. 면역조직화학법

1) Leptin 면역조직화학법

뇌 절편을 선택하여 먼저 조직 내에 존재하는 내재성 peroxidase를 비활성화시키기 위해서 50mM PBS 1%로 희석된 과산화수소(H₂O₂)에 30분간 반응시킨 후, 50mM PBS로 3회 세척하고, 1% bovine serum albumin(BSA)와 10%의 goat serum으로 1시간 동안 반응시킨 후 rabbit anti-leptin 항체(1:500, DiaSorni, Stillwater, MN, USA)와, 0.05% BSA와 0.3% Triton X-100이 들어있는 일차 항체용액으로 12시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그리고 biotinylated rabbit secondary antibody(1:2000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에서 1시간 동안 반응시킨 후, avidin-biotin-peroxidase complex(Vectastain ABC^®kit, Vector Laboratories)에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 발색제로는 3,3'-diaminobenzidinetetrahydrochloride (DAB)을 0.05M Tris-HCl (pH 7.6)에 0.02% 로 희석하였으며, 0.03% H₂O₂를 첨가하여 5분 동안 발색하였다. 발색이 끝난 조직은 gelatincoated slide glass에 얹어서 2 시간 동안 실온에서 건조시킨 후 ethanol의 농도를 70%, 80%, 90%, 100%로 높여가며 탈수시키고, xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다.

2) NPY 면역조직화학법

뇌 절편을 선택하여 먼저 조직 내에 존재하는 내재성 peroxidase를 비활성화시키기 위해서 50mM PBS 1 %로 희석된 과산화수소(H₂O₂)에 30분간 반응시킨 후, 50mM PBS로 3회 세척하고, 1% bovine serum albumin(BSA)와 10%의 goat serum으로 1시간 동안 반응시킨 후 rabbit anti-NPY 항체(1:500, DiaSorni, Stillwater, MN, USA)와, 0.05 % BSA와 0.3 % Triton X-100이 들어있는 일차 항체용액으로 12시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그리고 biotinylated rabbit secondary antibody (1:2000, Vector Laboratories)에서 1시간 동안 반응시킨 후, avidin-biotin-peroxidase complex(VectastainABC®kit, Vector Laboratories)에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 발색제로는 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)을 0.05M Tris-HCl (pH 7.6)에 0.02% 로 희석하였으며, 0.03% H₂O₂를 첨가하여 5분동안 발색하였다. 발색이 끝난 조직은 gelatin-coated slide glass에 얹어서 2 시간동안 실온에서 건조시킨 후 ethanol의 농도를 70%, 80%, 90%, 100%로 높여가며 탈수시키고, xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다.

5. BDNF 단백질 발현의 측정

해마의 BDNF 단백질 발현을 분석하기 위해 조직을 PBS로 washing 후, 50mM HEPES(pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1.5mM magnesium chloride hexahydrate, 1mM ethleneglycol-bis-(β-aminoethy1 ether)-N,N'- tetraacetic acid(EGTA), 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), 2μg/ml leupeptin, 1μg/ml pepstatin, 1mM sodium ortho vanadate와 100mM sodium floride를 포함하고 있는 lysis buffer로 용해시킨 후, 단백질을 추출하고 원심 분리하여 그 상층액을 취하여 단백질을 정량하였다. 이와 같이 추출된 단백질을 SDS-polyacrylamide gels로 전기영동 시킨 후, nitrocellulose membrane(Schleicher & Schuell GmbH, Dassel, Germany)으로 전사시켰다. 이렇게 전사된 membrane을 blocking한 후에, mouse actin antibody(1:1000; Santa Cruz Biotech, Santa Cru, CA, USA), rabbit BDNF antibody(1:1000; Santa Cruz Biotech)로 반응시켰다. Horseradish peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse antibody(1:2000; Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg, Germany)를 actin의 2차 antibody로 이용하였으며, anti-rabbit antibody(1:4000; Santa Cruz biotech)를 BDNF의 2차 antibody로 이용하였다. Western blotting에 의한 결과는 enhanced chemiluminescence (ECL) detection system(Amersham Pharmacia Biothech GmbH)을 통하여 확인하였다.

6. 자료처리 방법

본 실험에서 얻은 자료는 SPSS version 11.0 통계프로그램을 이용하여 각 항목에 대한 평균(mean) ± 표준오차(standard error mean; S.E.M)를 산출하였다. Leptin, NPY, Latency time, 그리고 BDNF 발현에 대한 집단 간 차이는 일원 변량 분산분석(one-way analysis of variance; ANOVA)을 이용하였고, Duncan의 방법으로 사후검정을 실시하였다. 유의 수준은 P < .05로 설정하였다.

7. 실험 결과

1) Leptin 양성 세포발현의 변화

각 군의 시상하부에서 식욕억제를 나타내는 leptin 양성세포 수는 도 2에서와 같이 대조군(A)에서 137.23 ± 10.12, 절식군(B)에서 72.17 ± 5.22, 절식-다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입군(C)에서 111 ± 8.41으로 나타났다.

본 실험 결과 절식군은 대조군에 비해 leptin 양성세포의 수가 통계적으로 유의하게 감소 하였으며 (P < .05), 반면에 절식-다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입군은 절식군에 비해 leptin 양성세포의 수가 유의하게 증가하였다 (P <. 05). 따라서, 본 실험 결과 절식에 의해서 식욕 억제를 나타내는 leptin 발현이 감소되어 식욕이 항진되었으며, 다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입에 의하여 leptin 발현이 증가되어 그 향 흡입이 절식에 의하여 증가된 식욕을 감소시키는 것을 알 수 있었다.

2) NPY 양성 세포발현의 변화

도 3을 참조로 하면, 각 군의 시상하부에서 식욕증진을 나타내는 NPY 양성세포 수는 대조군(A)에서 94.7 ± 4.12, 절식군(B)에서 116.25 ± 1.90, 절식-다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입군(C)에서 106 ± 3.15으로 나타났다.

본 실험 결과 절식군은 대조군에 비해 NPY 양성세포의 수가 통계적으로 유의하게 증가 하였으며(P < .05), 반면에 절식-다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입군은 절식군에 비해 NPY 양성세포의 수가 유의하게 감소하였다(P < .05). 따라서, 본 실험 결과 절식에 의해서 식욕증진을 나타내는 NPY 발현이 증가되어 식욕이 항진되었으며, 다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입에 의하여 NPY 발현이 감소되어 그 향 흡입이 절식에 의하여 증가된 식욕을 감소시키는 것을 알 수 있다.

3) 다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입이 단기 기억능력에 미치는 영향

본 실험에서는 다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입이 단기 기억능력에 미치는 영향을 평가하기 위해서 passive avoidance 검사를 실시하였다. 본 실험 결과 latency time은 도 4에서와 같이 대조군(A)이 84.0 ± 8.4, 절식군(B)이 32.0 ± 4.2, 절식-다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입군(C)에서 60.9 ± 3.2으로 나타났다.

본 실험 결과, 절식군은 대조군에 비해 단기 기억능력이 유의하게 감소하는 것을 볼 수 있으며(P < .05), 반면에 절식-다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입군은 절식군에 비해 단기 기억능력이 유의하게 증가하는 것을 볼 수 있었다(P < .05). 따라서, 본 실험 결과 절식에 의하여 단기 기억능력이 감소되었으며, 다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입이 절식으로 감소된 단기 기억 능력을 개선시킨다는 것을 알 수 있었다.

4) BDNF 단백질 발현의 변화

해마부위에서 신경성장인자 BDNF 단백질 발현을 Western blotting으로 정량화하였다. 도 5를 참조로 하면, 대조군(A)에서의 BDNF의 발현을 1.00으로 하였을 때, 절식군(B) 0.71 ± 0.02, 절식-다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입군(B) 0.85 ± 0.02으로 나타났다.

본 실험 결과, 절식군은 대조군에 비해 BDNF 단백질 발현이 유의하게 감소하는 것을 알 수 있었다(P < .05). 반면, 절식-다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입군은 절식군에 비해 BDNF 단백질 발현이 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(P < .05). 따라서, 본 실험 결과 절식에 의하여 신경성장 인자인 BDNF 단백질 발현이 감소되어 절식은 신경의 생성을 억제함을 알 수 있었고, 다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입이 절식에 의하여 감소된 BDNF 단백질 발현을 증가시켜 다이어트용 방향제 정유 조성물 향 흡입이 신경성장을 다시 항진 시킴을 알 수 있다.

이하에서는 실시예 및 비교예를 통해 본 발명의 효과에 대해 보다 상세히 살펴보기로 한다.

[실시예] 방풍통성산 다이어트 정유 추출물 제조

감초 90g, 길경 90g, 대황 68g, 박하 54g, 백출 90g, 천궁 54g, 형개 54g를 건조하여 혼합 및 분쇄한 혼합물 500g을 초임계 추출조에 투입한 다음 고압용 기체펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 공급하여 압력이 450기압에 달하면 이산화탄소의 공급을 중단하였다. 온도 제어기를 이용하여 추출조 외부를 감싸고 있는 열선을 통해 추출조 내부의 온도를 0.5℃/min 속도로 섭씨 65도까지 승온하였다. 추출조의 출구에 부착된 압력 조절기를 이용하여 이산화탄소를 일부 배출하면서 추출조의 온도와 압력을 섭씨 65도, 450기압으로 6시간 유지하였다. 그런 다음 고압용 기체펌프를 재가동하여 20L/min의 유량으로 이산화탄소를 추출조에 연속적으로 공급을 하였다. 동시에 출구쪽에 부착된 압력조절기를 이용하여 추출물을 방출시키며 추출조의 온도와 압력을 65℃, 450기압으로 6시간 유지한다. 고압용 기체펌프를 재가동하여 20L/min의 유량으로 이산화탄소를 추출조에 연속적으로 공급을 한다. 동시에 출구 쪽에 부착된 압력조절기를 이용하여 추출물을 방출시키며 추출조의 온도와 압력을 일정하게 유지한다.

방출된 추출물을 상압으로 감압하여 이산화탄소를 대기로 방출시키고, 다이어트용 방향제 조성물의 유효성분을 함께 포집기 내로 회수한다. 위의 과정을 12시간 동안 수행하여 추출물을 얻어낸 후 추출조업을 종료하여 천연 정유 51.3g을 얻었으며, 이 정유를 용매추출법을 적용하여 에탄올 70g에 천연 정유 30g을 용해시킨 다음 왁스 성분 및 비휘발성 물질을 분액깔대기로 제거하여 방풍통성산 다이어트 정유 추출물 89g을 얻었다.

1회	2회	3회	4회	5회	평균
89g	92g	90g	91g	93g	91g

동일한 양의 방풍통성산 한약재와 동일한 방법으로 수회 추출해 본 결과 다음과 같은 방풍통성산 다이어트 정유 추출물을 얻었다.

[비교예] 일반추출법에 의한 방풍통성산 다이어트 정유 추출물 제조

감초 90g, 길경 90g, 대황 68g, 박하 54g, 백출 90g, 천궁 54g, 형개 54g을 혼합하여 분쇄한 혼합물 500g을 에탄올 1,500g에 혼합하여 10시간동안 교반한 후 냉각 콘덴서가 장착된 증류장치에서 95℃에서 5시간 동안 가열하여 추출물 1,530g 을 얻었다. 이 추출물을 회전 휘발 농축장치를 이용하여 65g의 일반 추출법에 의한 방풍통성산 다이어트 정유 추출물을 얻었다.

1회	2회	3회	4회	5회	평균
65g	68g	66g	64g	62g	65g

상기의 실시예 및 비교예의 표 1 및 표 2에서와 같이 본 발명에 따른 추출방법을 통해 보다 많은 방풍통성산 다이어트 정유 추출물의 추출이 가능함을 확인할 수 있다.

Claims

삭제
감초, 길경, 대황, 박하, 백출, 천궁, 형개를 건조한 후 혼합하여 분쇄하는 제1단계,
상기 제1단계를 거쳐 분쇄된 혼합물을 초임계 추출조에 넣고 초임계 유체를 공급하는 제2단계,
상기 혼합물이 공급된 초임계 추출조 내부 압력을 200~500기압에 맞추고 온도는 65℃로 조절한 후 상기 초임계 추출조를 5~7시간동안 일정하게 유지시키는 제3단계,
5~7시간 경과 후 상기 초임계 추출조의 내부 압력을 감소시킨 다음 내부에 저장된 혼합물로부터 추출물을 추출하는 제4단계,
상기 제4단계를 거쳐 추출된 추출물에 함유된 왁스성분 및 비휘발성 물질을용매로 용해시켜 제거하는 제5단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법.
청구항 2에 있어서,
상기 혼합물은 감초 90중량부에 대하여, 길경 80~100중량부, 대황 60~80중량부, 박하 40~60중량부, 백출 80~100중량부, 천궁 40~60중량부, 형개 40~60중량부를 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법 .
청구항 2에 있어서,
상기 초임계 유체는 이산화탄소(CO₂)인 것을 특징으로 하는 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법 .
청구항 2에 있어서,
상기 제5단계에 사용되는 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 방풍통성산 한약재로부터 방향성 물질을 추출하는 방법.