KR101013866B1 - 목이버섯으로부터 항혈전 기능의 식품성분을 추출하는 방법 및 항혈전성 추출물 - Google Patents
목이버섯으로부터 항혈전 기능의 식품성분을 추출하는 방법 및 항혈전성 추출물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 여러 단계를 포함하는, 목이버섯으로부터 항혈전 기능의 식품성분을 추출하는 방법 및 그 추출 방법에 의해 추출된 항혈전성 추출물에 관한 것으로, 본 방법에 의해 추출된 물질들은 생체 내에서 출혈을 일으키지 않고, 독성이 없으면서도, 항혈전 효과가 우수하다.
목이버섯, 추출물, 항혈전
Description
본 발명은 목이버섯으로부터 항혈전 기능의 식품성분을 추출하는 방법 및 그 항혈전성 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담자균류의 목이과에 속하는 목이버섯으로부터 내인성 혈액응고시스템에 의한 혈액응고 및 혈소판응집에 의한 혈액응고를 저해함으로서 혈관 내에서의 혈전생성을 방지하는 항혈전 기능의 식품성분을 추출하는 방법, 및 그 방법에 의하여 추출된 항혈전성 추출물에 관한 것이다
혈액은 정상적인 혈관안에서는 액체 상태로 있어야 하고, 혈관의 상처부위에서는 빨리 응고하여 손상된 혈관으로부터의 혈액손실을 중단케하여 항상성을 유지해야 합니다. 정상 상태에서는 혈관내 혈전(thrombus)이 생기면 혈전 용해작용이 활성화되어 유동성을 회복하게 됩니다. 그러나, 혈전이 생기는 것과 혈전이 생기는 것을 막는 기전의 균형이 여러 요인으로 인해 깨어지게 되면, 혈액이 생체의 심혈관계내에서 응고된 덩어리인 혈전이 혈관에 침착되어 혈관의 단면적을 감소시키거나 혈관을 막아 혈액의 순환을 방해하고, 그 결과 혈액이 세포 및 조직으로 영양 분과 산소를 제대로 공급하지 못하고, 노폐물을 배출하지 못하여 독성이 쌓이는 등의 문제점이 발생하게 된다.
혈전이 혈관을 막아서 발생하는 병을 통틀어 혈전증이라 하며, 이러한 혈전증은 혈전에 의해 막히는 혈관의 부위에 따라 다양한 질병을 유발하게 된다. 그중에서도 특히 뇌혈관이나 심장혈관이 막히게 되는 경우에는 뇌졸중, 뇌출혈, 뇌경색, 심부전증, 심근경색, 심장마비 등 심각한 성인병이 발생할 수 있어 반신불수가 되거나 심한 경우 사망하게 된다.
현재 혈전증을 해결하기 위한 대부분의 연구는 혈전의 생성을 억제하는 항혈전제와 생성된 혈전을 용해시키는 혈전용해제의 개발에 초점이 맞추어지고 있다.
혈전의 생성을 사전에 차단하기 위한 항혈전제 또는 혈전형성예방제로는 손상된 혈관벽에 혈소판이 부착하는 것을 저해함으로써 혈액의 응고를 저해하는 아스피린(aspirin)과, 체내의 내인성 혈액응고 경로를 차단하는 헤파린(heparin), 쿠마린(coumarin) 제재들이 현재 임상에서 사용되고 있다. 또한 최근에는 에이코사펜탄산(Eicosapentanoic acid, ESA), PG12 유도체 제제들이 상품화되었다.
그러나, 상기의 약제들은 특이성이 없어 사용 후 체내에서 혈액과 함께 순환하거나 체내에 잔존하면서 출혈을 일으키는 부작용이 있다. 그외에 히루딘(hirudin), 합성항트롬빈(synthetic antithrombin), 티클로피딘(ticlopidine) 등의 항혈전 활성도 보고되고 있으나, 아직 실용화되지는 못하고 있다.
혈관 내에 생성된 혈전을 용해시키기 위한 치료법으로는 스트렙토키나아제(streptokinase)나 유로키나아제(urokinase)와 같은 플라스미노겐액티베이 터(plasminogen activator)를 혈전이 생성된 환자에서 정맥주사하여 체내의 혈전용해계(fibrinolytic system)를 활성화하는 치료법이 보편적으로 사용되고 있다.
스트렙토키나아제나 유로키나아제가 혈전을 용해시키는 효과는 이미 수많은 임상예에서 입증되었으나, 스트렙토키나아제나 유로키나아제는 혈전에 대한 특이성이 없어 혈전을 치료하는 동안에 전신출혈(systemic haemorrhage) 등의 부작용이 있다.
또한 조직형 플라스미노겐액티베이터(tissue?type plasminogen activator, tPA)는 혈전에 대한 선택성이 높아 가장 이상적인 혈전용해제로 인식되었으나, 실제 임상치료에 적용한 결과, 정도의 차이는 있으나 여전히 스트렙토키나아제나 유로키나아제를 투여한 경우에서와 마찬가지로 전신출혈 등의 부작용이 있었다.
또한 혈액 내에서의 반감기가 수분 정도로 매우 짧아 약효의 지속시간이 짧기 때문에 체내에서 약효를 유지하기 위해서는 투여량이 많아야 하므로 치료비용이 종래의 혈전용해제에 비해 훨씬 비싸다는 문제점이 있다.
이러한 의약품들이 혈전의 생성을 예방하거나 혈전을 제거하는데 있어서 현저한 효과를 나타내지 못하거나 심각한 부작용을 유발하기 때문에, 최근에는 의약품에 의한 치료보다는 식생활을 통하여 병을 예방하고 체질을 조절 또는 활성화시키는 기능을 가진 성분 또는 식품성분에 대한 연구가 여러 분야에서 활발히 추진되고 있다.
이와 관련하여, 연구자들은 버섯이 면역계를 자극하여 비 특이적인 작용으로 항종양세포를 파괴하는 다당체의 항암작용, 각종 효소의 혈압강하, 빈혈억제 및 항 균작용, 무기질 중 다량을 차지하는 칼륨에 의한 고혈압의 예방효과 뿐만 아니라 항혈전 활성이 있음을 보고하고 있다.
그러나, 버섯과 같은 식품으로부터 유효성분을 추출하는 경우, 추출 방법에 따라 추출 수율 및 추출되는 성분들의 종류에서 차이가 날 수 있어, 그 유효성분의 기대되는 효과가 달라질 수 있다.
이에 본 발명자들은 우수한 항혈전 효과를 가진 목이버섯의 추출 방법에 대해 장기간 연구하였기에 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 목이버섯으로부터 항혈전 효과가 우수하면서도 종래에 사용하던 약제들과는 달리 체내에서 출혈과 같은 부작용을 일으키지 않는 항혈전성 성분을 추출하는 방법, 및 그 추출법에 의해 추출된 항혈전성 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은:
목이버섯을 세밀하게 분쇄하여 추출용매로 물을 사용하여 성분들을 추출하는 단계(S1),
상기 추출된 용액을 원심분리를 통해 미분쇄물을 침전시킨 다음, 상등액을 여과하는 단계(S2),
상기 여과된 상등액에 용해된 성분을 건조하여 얻은 건조추출물에 에탄올을 넣고 12시간 동안 5℃에서 정치한 후, 이를 여과시켜 에탄올 불용성 성분을 획득하는 단계(S3),
상기 에탄올 불용성 성분을 물에 용해시켜서 원심분리를 통해 물에 불용성 성분을 제거하는 단계(S4), 및
상기 불용성 성분이 제거된 용액으로부터 100,000분자량 및 500,000분자량 크기의 한외여과기를 순차적으로 이용하여 분자량 크기별로 추출성분을 분리하는 단계(S5)를 포함하는 목이버섯으로부터 식품소재로 활용 가능한 항혈전성 성분을 추출하는 방법, 및 종래의 부작용을 일으키는 약제들과는 달리 생체 내에서 출혈을 일으키지 않고 독성이 없으면서도 항혈전 효과가 우수한 목이버섯의 항혈전성 추출물에 관한 것이다.
목이버섯을 세밀하게 분쇄하여 추출용매로 물을 사용하여 성분들을 추출하는 단계(S1),
상기 추출된 용액을 원심분리를 통해 미분쇄물을 침전시킨 다음, 상등액을 여과하는 단계(S2),
상기 여과된 상등액에 용해된 성분을 건조하여 얻은 건조추출물에 에탄올을 넣고 12시간 동안 5℃에서 정치한 후, 이를 여과시켜 에탄올 불용성 성분을 획득하는 단계(S3),
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본 발명의 추출 방법에 의해 고수율로 목이버섯으로부터 항혈전 효과가 탁월한 물질을 다량 추출할 수 있다. 또한, 그 추출물은 혈액응고체계에서의 내인성 경로에 관여하는 많은 효소와 최종단계인 피브린을 형성하는 트롬빈의 활성을 저해하고, 혈소판의 활성화를 방지하여 혈소판 자체의 응집방지 및 혈소판 활성화에 따른 혈액응고체계의 가속화를 방지함으로써 혈전의 생성을 억제하는 우수한 항혈전 효과가 있어, 뇌출혈, 뇌경색, 심근경색, 동맥경화 및 관상동맥증과 같은 심혈관계 질환을 미리 예방할 수 있다. 또한, 목이버섯은 식품이므로 종래에 사용하던 약제들과는 달리 체내에서 출혈을 일으키는 등의 부작용이 없어 안전하다는 장점이 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
건조시킨 목이버섯 시료를 분쇄기로 세밀하게 분쇄한다. 추출 수율을 높이기 위해서는 분쇄된 입자의 크기를 균질화기로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 최대한의 미세 분쇄 입자를 획득하기 위해서는 미세 분쇄기능의 균질기(homognizer)로 3,000rpm 이상으로 처리하는 것이 바람직한데, 그 이상의 경우 10,000rpm 정도로의 처리가 더 추출 수율을 높일 수 있다.
미분쇄물은 추출용매를 사용하여 환류 추출한다. 이때 추출용매로는 산, 염기 또는 물을 모두 사용할 수 있으나, 식품 원료로서의 안전성과 중화단계의 과정을 거치지 않는 편리성을 위하여 물을 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.
추출되는 성분들의 수율을 높이고 성분들을 골고루 추출하기 위해서는 상기의 환류 추출 과정을 수회 반복하여 행하는 것이 바람직하다.
환류 추출된 추출액은 원심분리기를 사용하여 미분쇄물을 침전시킨 후 상등액을 여과한다. 이는 여과시 여과지의 막힘 현상을 방지하고 여과막의 기능을 원활히 하여 여과 과정의 시간을 단축할 수 있는 효율적인 과정이다.
상기의 과정을 거친 여액을 건조하여 미분획 추출물을 얻는다. 얻어진 미분획 추출물에 에탄올을 넣고 12시간 동안 5℃에서 정치한 후 에탄올에 용해된 에탄올 용해성 성분을 분리하여 제거한다. 상기 에탄올 용해성 물질의 제거는 상기 미분획 추출물에 12시간 동안 5℃에서 정치한 후, 여과장치로 에탄올 불용성 물질을 제거하여 수행된다. 이렇게 에탄올 용해성 분획을 분리한 후, 남은 부분인 에탄올 불용성 성분은 충분한 양의 물에 용해시키고, 물에 용해되지 않는 불용성 성분은 원심분리 장치를 사용하여 제거한다.
그 다음, 물 용해성 성분을 충분한 물에 희석한 후 한외여과기(ultra filter)를 사용하여 목적 분자량별로 분획을 실시한다. 100,000분자량 및 500,000분자량 크기의 한외여과막을 사용하는 것이 바람직하다. 상기의 물용해성 성분 추출액을 1차로 100,000분자량 기준의 여과막을 사용하여 100,000분자량 크기 이하 분획과 100,000분자량 크기 이상의 분획으로 제조하고. 100,000분자량 크기 이상의 분획을 2차로 500,000분자량의 여과막을 사용하여 500,000분자량 크기 이하의 분획과 500,000분자량 이상의 분획으로 분리한다.
2차 한외여과로 획득한 500,000분자량 이하의 분획, 즉 100,000분자량 ~ 500,000분자량 크기의 분획으로부터 항혈전 효과가 우수한 목이버섯의 항혈전성 추출물을 제조한다. 항혈전성 추출물은 그대로 사용하거나 필요에 따라 건조시켜 사용할 수 있다.
상기 목이버섯의 항혈전성 추출물은 시험관내 실험(in vitro) 및 동물모델실험(in vivo)에서 탁월한 항혈전 효과를 나타낸다. 특히 상기의 추출물은 물을 이용한 추출물로써 안전한 식품성분이므로 생체 내에서 부작용없이 우수한 항혈전 효과를 나타낸다.
상기 추출물에 대하여 내인성 혈액응고 시스템에 대한 항응고활성을 측정하는 방법들인 APTT(activated partial thromboplastim time) 항응고활성 및 TT(thrombin time) 항응고활성, PT(prothrombin time) 항응고활성과, 혈소판 활성 및 부착시스템에 대한 항응고활성을 측정하는 방법인 항혈소판활성(collagen-induced platelet aggregation test)에 의하여 항혈전 활성을 측정한 결과, 매우 우수한 항혈전효과를 나타낸다.
건조시킨 목이버섯 시료를 분쇄기로 세밀하게 분쇄한다. 추출 수율을 높이기 위해서는 분쇄된 입자의 크기를 균질화기로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 최대한의 미세 분쇄 입자를 획득하기 위해서는 미세 분쇄기능의 균질기(homognizer)로 3,000rpm 이상으로 처리하는 것이 바람직한데, 그 이상의 경우 10,000rpm 정도로의 처리가 더 추출 수율을 높일 수 있다.
미분쇄물은 추출용매를 사용하여 환류 추출한다. 이때 추출용매로는 산, 염기 또는 물을 모두 사용할 수 있으나, 식품 원료로서의 안전성과 중화단계의 과정을 거치지 않는 편리성을 위하여 물을 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.
추출되는 성분들의 수율을 높이고 성분들을 골고루 추출하기 위해서는 상기의 환류 추출 과정을 수회 반복하여 행하는 것이 바람직하다.
환류 추출된 추출액은 원심분리기를 사용하여 미분쇄물을 침전시킨 후 상등액을 여과한다. 이는 여과시 여과지의 막힘 현상을 방지하고 여과막의 기능을 원활히 하여 여과 과정의 시간을 단축할 수 있는 효율적인 과정이다.
상기의 과정을 거친 여액을 건조하여 미분획 추출물을 얻는다. 얻어진 미분획 추출물에 에탄올을 넣고 12시간 동안 5℃에서 정치한 후 에탄올에 용해된 에탄올 용해성 성분을 분리하여 제거한다. 상기 에탄올 용해성 물질의 제거는 상기 미분획 추출물에 12시간 동안 5℃에서 정치한 후, 여과장치로 에탄올 불용성 물질을 제거하여 수행된다. 이렇게 에탄올 용해성 분획을 분리한 후, 남은 부분인 에탄올 불용성 성분은 충분한 양의 물에 용해시키고, 물에 용해되지 않는 불용성 성분은 원심분리 장치를 사용하여 제거한다.
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2차 한외여과로 획득한 500,000분자량 이하의 분획, 즉 100,000분자량 ~ 500,000분자량 크기의 분획으로부터 항혈전 효과가 우수한 목이버섯의 항혈전성 추출물을 제조한다. 항혈전성 추출물은 그대로 사용하거나 필요에 따라 건조시켜 사용할 수 있다.
상기 목이버섯의 항혈전성 추출물은 시험관내 실험(in vitro) 및 동물모델실험(in vivo)에서 탁월한 항혈전 효과를 나타낸다. 특히 상기의 추출물은 물을 이용한 추출물로써 안전한 식품성분이므로 생체 내에서 부작용없이 우수한 항혈전 효과를 나타낸다.
상기 추출물에 대하여 내인성 혈액응고 시스템에 대한 항응고활성을 측정하는 방법들인 APTT(activated partial thromboplastim time) 항응고활성 및 TT(thrombin time) 항응고활성, PT(prothrombin time) 항응고활성과, 혈소판 활성 및 부착시스템에 대한 항응고활성을 측정하는 방법인 항혈소판활성(collagen-induced platelet aggregation test)에 의하여 항혈전 활성을 측정한 결과, 매우 우수한 항혈전효과를 나타낸다.
또한 쥐에 대한 동물실험을 한 결과에서도 매우 우수한 항혈전 효과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하고자 한다.
그러나 다음의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아닙니다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하고자 한다.
그러나 다음의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아닙니다.
실시예
1.
분자량 분획별 항응고활성을 비교하기 위하여 목이버섯 물 용해성 성분을 한외여과기를 사용하여 100,000분자량 및 500,000분자량 크기 여과막을 기준으로 100,000분자랑 이하 분획, 100,000~500,000분자량 분획, 500,000분자량 이상 분획물을 제조하였다.
각 시료를 혈소판이 거의 없는 혈장인 PPP(Platelet poor plasma)에 1㎎/㎖의 농도로 용해시켜 PPP시료를 제조하였다. 이때 혈소판 응집에 의한 혈액응고효과를 배제하기 위하여 혈소판이 거의 없는 PPP를 사용하였다.
각 PPP시료를 100㎕씩 취하여 37℃에서 3분간 정치한 후 2mM 염화칼슘(CaCl2) 수용액100㎕를 넣고, 염화칼슘을 넣은 시점부터 피브린이 형성되어 응고가 일어나는 시간인 PRT를 측정하였다.
또한 각 PPP시료를 100㎕씩 취하여 데이드액틴(Dade actin) 100㎕을 넣고, 37℃에서 3분간 정치한 후 2mM 염화칼슘수용액 100㎕를 넣고 염화칼슘을 넣은 시점부터 피브린이 형성되어 응고가 일어나는 시간인 APTT를 측정하였다.
또한 각 PPP시료를 100㎕씩 취하여 37℃에서 3분간 정치한 후 트롬빈시약(thrombin reagent) 10㎕을 넣고, 트롬빈시약을 넣은 시점부터 피브린이 형성되어 응고가 일어나는 시간인 TT를 측정하였다.
이때 대조를 위하여 PPP에 물을 넣은 PPP대조군에 대하여 동일한 방법으로 PRT, APTT, TT를 측정하였다.
측정된 각 PPP시료 및 PPP대조군의 PRT, APTT, TT를 하기 수학식1 에 따라 계산하여 백분율형태의 항응고활성(%)을 계산하였으며 그 결과를 하기 표1에 나타내었다.
수학식1
| 분자량 별 분획물 | PRT% | APTT% | TT% |
| 100,000분자량 이하 | 7 | 18.24 | 35.36 |
| 100,000~500,000분자 | 21 | 92.45 | 128.56 |
| 500,000분자량 이상 | 17 | 73.72 | 94.56 |
상기 표1의 결과에서, 세가지 분획물 모두가 항혈전 활성을 나타냄을 알 수 있다. 그러나 100,000~500,000분자량 분획물이 다른 두개의 분획물보다 훨씬 높은 항응고활성을 나타내었다.
APTT 항응고활성을 측정한 결과로부터 목이버섯의 항혈전성 추출물은 내인성경로에 관여하는 인자들을 불활성화하여 피브린 형성을 방해함으로써 응고를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있으며, TT 항응고 활성을 측정한 결과로부터 트롬빈의 활성을 억제하여 응고를 억제하는 효과도 있음을 알 수 있다.
또한 PRT 항응고활성을 측정한 결과로부터 프로트롬빈을 트롬빈으로 바꾸는데 관여하는 여러 인자들의 활성을 억제함으로서 트롬빈 생성을 지연시켜 응고를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있으며, 전혈(Whole blood)을 이용하여 항혈소판활성을 측정한 결과로부터 혈소판들의 응집을 억제함으로써 응고를 억제하는 효과도 있음을 알 수 있다.
실시예
2.
분획물의 농도와 항응고활성과의 관계를 확인하기 위하여 100,000~500,000분자량 분획물을 PPP에 각각 0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1.0㎎/㎖의 농도로 용해시킨 후 실시예 1에서와 동일한 방법으로 APTT와 TT를 측정하였다. 측정한 APTT 와 TT를 이용하여 상기 수학식 1에 따라 APTT 항응고활성과 TT항응고활성을 계산하였고, 그 결과를 하기 표2에 나타내었다.
| 시료의 농도 | APTT% | TT% |
| 0.1 mg/ml | 2.83 | 18.61 |
| 0.5 mg/ml | 45.86 | 43.32 |
| 1.0 mg/ml | 93.56 | 125.86 |
상기 표2에서 알 수 있듯이, 항응고활성은 농도를 증가시킴에 따라 점차 증가하였다.
실시예
3.
또한 100,000~500,000분자량 분획물의 농도와 항혈소판 활성과의 관계를 알아보기 위하여 전혈에 10㎍/ml, 50㎍/ml, 80㎍/ml, 100㎍/ml의 농도로 용해시켜 저항값을 측정하였고, 그 저항값을 이용하여 상기 수학식2에 따라 항혈소판활성을 계산하였다. 계산한 항혈소판활성을 하기 표3에 나타내었다.
수학식 2
| 시료의 농도 | 항혈소판활성(%) |
| 10 ug/ml | 3.8 |
| 50 ug/ml | 12.5 |
| 80 ug/ml | 25.45 |
| 100 ug/ml | 35.86 |
상기 표3의 결과에서, 항혈소판활성도 농도의존적으로 증가함을 알 수 있었다.
실시예
4.
목이버섯의 항혈전효과를 갖는 추출물이 실제로 생체내에서도 항혈소판활성을 나타내는지를 알아보기 위하여 동물실험을 하였다.
체중이 200~250g인 수컷 쥐(rat) 15마리를 3그룹으로 나눈 다음 졸레틸(zoletil) 복강내(intraperitoneal, I.P) 마취하에 개복하지 않고 26G 바늘을 이용하여 심장에서 2㎖씩 채혈하였다. 채혈한 혈액 중 전혈 450㎕를 사용하여 각 개체의 초기 항혈소판활성치를 측정하였다. 초기 항혈소판 활성치를 측정한 후 마취에서 깨어난 쥐들 중 제1그룹의 쥐들에게는 아무것도 투여하지 않고 방치하였다. 제2그룹은 비교를 위하여 아스피린을 매일100mg/kg씩 경구투여 하였고, 제3그룹은 100,000~500,000분자량 분획물을 매일300mg/kg씩 경구투여 하였다. 6일 동안 투여한 후 쥐들을 졸레틸 복강내 마취하에 개복하여 심장구멍(heart puncture)을 통해 혈액을 채취하여 항혈소판활성을 측정하였으며, 측정결과를 평균하여 하기 표4에 나타내었다.
| 항혈소판활성(%) | |
| 정상군 | 0 |
| 아스피린(100mg/kg) | 38.56 |
| 100,000~500,000 분자량 분획물 | 32.33 |
상기 표4에 나타난 바와 같이, 100,000~500,000분자량 분획물을 투여한 쥐는 아무것도 먹이지 않은 대조군의 쥐보다 높은 항혈소판활성을 나타내었으며, 현재 혈소판응집억제제로 널리 사용되고 있는 아스피린을 투여한 쥐와 비슷한 정도의 항혈소판활성을 나타내었다.
실시예
5.
분획별 추출물의 구성성분의 분석
시료 10㎎을 테플론선이 그려진 나사뚜껑(Teflon-lined screw cap)이 있는 실험병(vial)에 넣고 질소가스를 불어 넣어 주면서 72%(w/w) 황산125㎕를 넣어주었다. 황산을 넣은 후 뚜껑을 닫고 상온에 45분 방치하였다. 다시 질소가스를 불어넣어 주면서 3차물 1.35㎖를 넣고 뚜껑을 닫은 후 100℃에서 3시간 동안 가수분해시켰다.
가수분해시킨 시료를 상온까지 냉각시킨 후 15M 암모니아용액 0.32㎖를 넣고 20㎎/㎖농도의 미오-이노시톨(myo-inositol) 50㎕를 넣어 중화하여 최종용액을 제조하였다. 별도로 무수디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide anhydride) 100㎖에 붕화수소나트륨(sodium borohydride) 2g을 넣고 100℃로 가열하여 붕화수소나트륨 용액을 만들었다. 최종 용액 0.1㎖에 붕화수소나트륨용액 1 ㎖를 넣고 40℃에서 90분 방치하여 환원시키고, 환원 후 잔존하는 과량의 붕화수소나트륨은 18M 아세트산0.1㎖를 넣어 분해하였다. 분해 후 메틸이미다졸(methylimidazole) 0.2㎖, 무수아세트산(acetic anhydride) 2㎖를 넣어 섞어준 후 상온에서 10분간 방치하여 아세틸레이션시키고, 3차물 5㎖를 넣어 과량의 무수아세트산을 분해시킨 후 상온으로 냉각하였다.
냉각 후 디클로로메탄(dichloromethane) 1㎖를 넣어 격렬하게 혼합하여 균질화한 후 층분리가 되면 아래층인 디클로로메탄을 취하여 -20℃에 보관했다가 분석에 사용하였다. 상기와 같이 전처리된 시료에 대하여 GC-MS 및 GC분석을 하기 위하여 JW 과학사의 DB-225 모세칼럼을 사용하였다. 이때 오븐은 195℃에서 3분간 유지한 후 2℃/min의 속도로 200℃까지 올려 10분간 유지하고 다시 5℃/min의 속도로 210℃까지 올려 30분간 유지하였다. 시료주입구 및 검출기의 온도는 220℃로 하였다.
상기의 전처리된 시료5㎕를 전용주사기로 취하여 주입한 후 가스크로마토그래피-질량분광측정기(gas chromatography-mass spectrometry, 이하"GC-MS"라함)를 이용하여 각 당에 해당하는 피크를 동정하고, 가스크로마토그래피(gas chromatography, 이하 "GC"라 함)를 이용하여 정량하였다.
이때 단당류 표준시약으로는 아라비노즈(arabinose), 퓨코즈(fucose), 갈락토즈(galactose), 관루코즈(glucose), 만노즈(mannose), 람노즈(rhamnose), 리보즈(ribose), 자일로즈(xylose)의 혼합시료인 표준단당을 사용하였고, 내부표준물질(internal standard)로는 미오이노시톨을 사용하였다.
건조추출물의 경우, 19.975분에 자일로즈, 32.168분에 만노즈, 37.551분에 글루코즈, 40.363분에 내부표준물질의 피크가 검출되었고, 단당의 구성비는 자일로즈 20.8%, 만노즈 45.4%, 글루코즈 34.7%이였다.
에탄올불용성분획의 경우, 13.756분에 퓨코즈, 19.962분에 자일로즈, 32.154분에 만노즈, 34.526분에 갈락토즈, 37.535분에 글루코즈, 40.329분에 내부표준물질의피크가 검출되었다. 상기 피크의 면적을 토대로 에탄올불용성분획의 단당구성비는 퓨코즈 0.3%, 자일로즈 23.1%, 만노즈 42.2%, 갈락토즈 5.1%, 글루코즈 32.3%임을 알 수 있었다.
에탄올용해성분획의 경우 19.929분에 자일로즈, 32.130 분에 만노즈, 37.499분에 글루코즈, 40.333분에 내부표준물질의피크가 검출되었다. 상기 피크의 면적을 토대로 에탄올용해성분획의 단당구성비는 자일로즈 17.1%, 만노즈 11.6%, 글루코즈 65.1%임을 알 수 있었다.
100,000~500,000분자량 분획의 경우, 13.564분에 퓨코즈, 19.910분에 자일로즈, 32.080 분에 만노즈, 34.533분에 갈락토즈, 37.311분에 글루코즈, 40.123분에 내부표준물질의피크가 검출되었다. 상기 피크의 면적을 토대로 100,000~500,000분자량 분획의 단당구성비는 퓨코즈 0.4%, 자일로즈 24.8%, 만노즈 39.3%, 갈락토즈 5.9%, 글루코즈 34.8%임을 알 수 있었다.
상기 네가지 분획에 대한 구성당의 비율 및 보유시간을 하기 표5에 나타내었다.
| 분획 | 단당류 성분(%) | ||||
| 퓨코즈 | 갈락토즈 | 글루코즈 | 만노즈 | 자일로즈 | |
| 건조 추출물 | 34.7 | 45.4 | 20.8 | ||
| 에탄올 불용성 분획 | 0.3 | 5.1 | 32.3 | 42.2 | 23.1 |
| 에탄올 용해성 분획 | 65.1 | 11.6 | 17.1 | ||
| 분자량 분획 | 0.4 | 5.9 | 34.8 | 39.3 | 24.8 |
Claims (6)
- 목이버섯을 세밀하게 분쇄하여 추출용매로 물을 사용하여 성분들을 추출하는 단계(S1),상기 추출된 용액을 원심분리를 통해 미분쇄물을 침전시킨 다음, 상등액을 여과하는 단계(S2),상기 여과된 상등액에 용해된 성분을 건조하여 얻은 건조추출물에 에탄올을 넣고 12시간 동안 5℃에서 정치한 후, 이를 여과시켜 에탄올 불용성 성분을 획득하는 단계(S3),상기 에탄올 불용성 성분을 물에 용해시켜서 원심분리를 통해 물에 불용성 성분을 제거하는 단계(S4), 및상기 불용성 성분이 제거된 용액으로부터 100,000분자량 및 500,000분자량 크기의 한외여과기를 순차적으로 이용하여 분자량 크기별로 추출성분을 분리하는 단계(S5)를 포함하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 목이버섯을 세밀하게 분쇄하여 추출용매로 물을 사용하여 성분들을 추출하는 단계(S1)에서 환류추출하는 단계(S1')를 반복함으로써 추출수율을 높이는 것을 특징으로 하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항 또는 제 2 항의 추출 방법에 의해 추출된 식품소재로 활용 가능한 항혈전성 추출물.
- 제 5 항의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항혈전성 건강보조식품.
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| KR1020080077265A KR101013866B1 (ko) | 2008-08-07 | 2008-08-07 | 목이버섯으로부터 항혈전 기능의 식품성분을 추출하는 방법 및 항혈전성 추출물 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| KR20000047578A (ko) * | 1998-12-14 | 2000-07-25 | 변유량 | 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법 및 그항혈전성 추출물 |
| KR100558618B1 (ko) | 2003-06-20 | 2006-03-13 | (주)바이오벤 | 목이버섯으로부터 유래한 식품첨가물 및 그의 제조방법 |
| KR100780664B1 (ko) | 2007-01-26 | 2007-11-30 | 대구대학교 산학협력단 | 저지혈증 효과를 갖는 목이버섯 자실체 유래의 다당체 및그 제조 방법 |
-
2008
- 2008-08-07 KR KR1020080077265A patent/KR101013866B1/ko not_active IP Right Cessation
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