KR100336848B1 - 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법 및 그항혈전성 추출물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 건조시킨 목이버섯을 분쇄하는 단계와; 추출용매를 사용하여 분쇄물에서 성분들을 추출하는 단계와; 추출물이 포함된 용액을 (중화시키는 단계와; 중화된 용액에서 염을 제거하는 단계와; 염을 제거한 용액을) 건조하여 미분획추출물을 얻는 단계와; 미분획추출물에 충분한 양의 메탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 메탄올용해성성분을 제거하는 단계와; 메탄올불용성성분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하는 단계와; 물용해성성분에 충분한 양의 에탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 에탄올용해성성분을 제거하는 단계와; 에탄올용해성성분이 제거된 에탄올불용성부분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하는 단계와; 남은 물용해성성분을 분리하는 단계를 포함하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법 및 이러한 방법에 의하여 추출되며 생체내에서 독성이 없으면서도 항혈전효과가 우수한 목이버섯의 항혈전성 추출물에 관한 것으로, 혈전의 생성을 억제하는 항혈전효과가 우수하면서도 종래에 사용하던 약제들과는 달리 체내에서 출혈을 일으키는 등의 부작용이 없어 안전한 효과가 있다.
Description
본 발명은 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법 및 그 항혈전성 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담자균류의 목이과에 속하는 목이버섯으로부터 내인성 혈액응고시스템에 의한 혈액응고 및 혈소판응집에 의한 혈액응고를 저해함으로서 혈관내에서의 불필요한 혈전생성을 방지하는 항혈전성 성분을 추출하는방법 및 그 방법에 의하여 추출된 항혈전성 추출물에 관한 것이다.
버섯은 종류에 따라 그 구성성분과 조성이 각기 다르며 생리활성도 매우 다양하게 나타나는데, 지금까지 알려진 버섯중에서 현재 식용으로 이용되고 있는 버섯은 350여종이다.
이러한 버섯은 다량의 단백질, 다당류, 각종 효소, 비타민, 무기질 등이 함유되어 있어서 영양가와 소화율이 높은 식품으로서 이용가치가 매우 높은 식품이다. 뿐만 아니라 면역계를 자극하여 비특이적인 작용으로 항종양세포를 파괴하는 다당체의 항암작용, 각종 효소의 혈압강하, 빈혈억제 및 항균작용, 무기질중 다량을 차지하는 칼륨에 의한 고혈압의 예방효과 등 많은 연구가 발표되었으며, 최근에는 버섯유래물질의 항혈전활성 또한 보고되고 있다.
생물체에서 여러 가지 원인에 의하여 혈액의 응고와 용해사이에 유지되던 평형이 깨지게 되면, 혈액속의 피브리노겐(fibrinogen)이 피브린(fibrin)으로 전환되면서 불용성의 중합체인 혈전이 형성된다.
이렇게 형성된 혈전은 혈관에 침착되어 혈관의 단면적을 감소시키거나 혈관을 막아 혈액의 순환을 방해하고, 그 결과 혈액이 세포 및 조직으로 영양분과 산소를 제대로 공급하지 못하고 세포 및 조직의 노폐물을 배출하지 못하여 독성이 쌓이는 등의 문제점이 발생하게 된다.
혈전이 혈관을 막아서 발생하는 병을 통틀어 혈전증이라 하며, 이러한 혈전증은 혈전에 의해 막히는 혈관의 부위에 따라 다양한 질병을 유발하게 된다. 그중에서도 특히 뇌혈관이나 심장혈관이 막히게 되는 경우에는 뇌졸중, 뇌출혈, 뇌경색, 심부전증, 심근경색, 심장마비 등 심각한 성인병이 발생할 수 있어 반신불수가 되거나 심한 경우 사망하게 된다.
현재 혈전증을 해결하기 위한 대부분의 연구는 혈전의 생성을 억제하는 항혈전제와 생성된 혈전을 용해시키는 혈전용해제의 개발에 초점이 맞추어지고 있다.
혈전의 생성을 사전에 차단하기 위한 항혈전제 또는 혈전형성예방제로는 손상된 혈관벽에 혈소판이 부착하는 것을 저해함으로써 혈액의 응고를 저해하는 아스피린(aspirin)과, 체내의 내인성 혈액응고경로를 차단하는 헤파린(heparin), 쿠마린(coumarin)제재들이 현재 임상에서 사용되고 있다. 또한 최근에는 에이코사펜탄산(Eicosapentanoic acid, ESA), PG12 유도체제제들이 상품화되었다.
그러나 상기의 약제들은 특이성이 없어 사용후 체내에서 혈액과 함께 순환하거나 체내에 잔존하면서 출혈을 일으키는 부작용이 있다.
그 밖에 히루딘(hirudin), 합성 항트롬빈(synthetic antithrombin), 티클로피딘(ticlopidine) 등의 항혈전활성도 보고되고 있으나 아직 실용화되지는 못하고 있다.
혈관내에 생성된 혈전을 용해시키기 위한 치료법으로는 스트렙토키나아제(streptokinase)나 유로키나아제(urokinase)와 같은 플라스미노겐 액티베이터(plasminogen activator)를 혈전이 생성된 환자에서 정맥주사하여 체내의 혈전용해계(fibrinolytic system)를 활성화하는 치료법이 보편적으로 사용되고 있다.
스트렙토키나아제나 유로키나아제가 혈전을 용해시키는 효과는 이미 수많은임상예에서 입증되었으나, 스트렙토키나아제나 유로키나아제는 혈전에 대한 특이성이 없어 혈전을 치료하는 동안에 전신출혈(systemic haemorrhage) 등의 부작용이 있다.
또한 조직형 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator, tPA)는 혈전에 대한 선택성이 높아 가장 이상적인 혈전용해제로 인식되었으나, 실제 임상치료에 적용한 결과, 정도의 차이는 있으나 여전히 스트렙토카나아제나 유로키나아제를 투여한 경우에서와 마찬가지로 전신출혈 등의 부작용이 있었다. 또한 혈액내에서의 반감기가 수분 정도로 매우 짧아 약효의 지속시간이 짧기 때문에 체내에서 약효를 유지하기 위해서는 투여량이 많아야 하므로 치료비용이 종래의 혈전용해제에 비해 훨씬 비싸다는 문제점이 있다.
이러한 의약품들이 혈전의 생성을 예방하거나 혈전을 제거하는데 있어서 현저한 효과를 나타내지 못하거나 심각한 부작용을 유발하기 때문에, 최근에는 의약품에 의한 치료보다는 식생활을 통하여 병을 예방하고 체질을 조절 또는 활성화시키는 기능을 가진 성분 또는 식품성분에 대한 연구가 여러 분야에서 활발히 추진되고 있다.
이에 본 발명자들은 버섯을 이용하여 항혈전성분을 찾기 위하여 다각적으로 연구 검토한 결과, 목이버섯의 추출물이 우수한 항혈전효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 목이버섯으로부터 항혈전효과가 우수하면서도 종래에 사용하던 약제들과는 달리 체내에서 부작용을 일으키지 않는 항혈전성 성분을 추출하는 방법 및 그 항혈전성 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 미분획추출물에 대한 GC-MS 결과를 나타낸 그래프,
도 2는 본 발명의 메탄올용해성분획에 대한 GC-MS 결과를 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명의 에탄올불용성분획에 대한 GC-MS 결과를 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명의 에탄올용해성분획에 대한 GC-MS 결과를 나타낸 그래프,
도 5는 표준물질인 황산칼륨(25ppm)의 황산기보유시간과 전도율의 관계를 나타낸 그래프,
도 6은 본 발명의 각 분획에서의 황산기의 함량을 나타낸 그래프.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 건조시킨 목이버섯을 분쇄하는 단계와; 추출용매를 사용하여 분쇄물에서 성분들을 추출하는 단계와; 추출물이 포함된 용액을 (중화시키는 단계와; 중화된 용액에서 염을 제거하는 단계와; 염을 제거한 용액을) 건조하여 미분획추출물을 얻는 단계와; 미분획추출물에 충분한 양의 메탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 메탄올용해성성분을 제거하는 단계와; 메탄올불용성성분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하는 단계와; 물용해성성분에 충분한 양의 에탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 에탄올용해성성분을 제거하는 단계와; 에탄올용해성성분이 제거된 에탄올불용성부분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하는 단계와; 남은 물용해성성분을 분리하는 단계를 포함하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법 및 이러한 방법에 의하여 추출되며 생체내에서 독성이 없으면서도 항혈전효과가 우수한 목이버섯의 항혈전성 추출물에 관한 것이다.
이하 본 발명은 상세하게 설명한다.
건조시킨 목이버섯시료를 분쇄기로 분쇄한다. 다음 단계인 추출에서 추출수율을 높이기 위해서는 분쇄시 입자의 크기는 미세하게 하는 것이 바람직하다.
추출수율을 높이기 위해서는 분쇄된 입자의 크기를 균질화하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 분쇄된 입자를 균질화하기 위해서는 스크리닝을 하는 것이 바람직하다. 스크리닝할 때에는 40메쉬 이상의 스크린을 사용하는 것이 바람직한데, 이는스크린의 메쉬크기를 크게 하여 스크리닝하는 경우에는 입자의 크기가 커져서 상대적으로 입자의 표면적이 작아지므로 다음 단계인 추출과정에서 성분들이 추출되는 수율이 낮아지기 때문이다.
미분쇄물은 추출용매를 사용하여 환류추출한다. 이때 추출용매로는 산, 염기 또는 물을 모두 사용할 수 있으나, 염기 또는 물을 사용하여 추출하는 것이 바람직하다. 이는 염기를 추출용매로 사용하는 경우 산이나 물을 추출용매로 사용한 경우에 비하여 항혈전효과가 높고, 물을 추출용매로 사용하는 경우 산이나 염기를 추출용매로 사용하는 경우와 달리 독성이 전혀 없다는 장점이 있기 때문이다.
환류추출의 추출용매인 염기로는 대부분의 염기를 사용할 수 있으나, 대표적으로는 수산화나트륨(NaOH), 수산화칼륨(KOH) 등의 염기를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 환류추출의 추출용매인 산으로는 대부분의 산을 사용할 수 있으나, 대표적으로는 염산(HCl), 황산(H2SO4) 등의 산을 사용하는 것이 바람직하다.
추출에 사용되는 산 또는 염기의 농도는 염기의 세기에 따라 달라지지만 일반적으로 0.01-0.5N의 농도를 사용하는 것이 바람직하다. 추출에 사용되는 산 또는 염기의 농도가 0.01N보다 낮은 경우에는 목이버섯으로부터 추출되는 항혈전 성분의 양이 지나치게 적어지고, 산 또는 염기의 농도가 0.5N을 초과하는 경우에는 염을 제거하는 공정이 복잡하고 염을 제거하는데 소요되는 비용이 많아지는 문제점이 있다. 보다 바람직하게는 0.05-0.2N의 농도를 사용하는데, 이 농도범위에서는 추출량이 많으면서도 독성이 거의 없다.
추출되는 성분들의 수율을 높이고 성분들을 골고루 추출하기 위해서는 상기의 환류추출과정을 수회 반복하여 행하는 것이 바람직하다.
환류추출된 추출물은 산 또는 염기로 중화시키고, 중화된 용액에 포함된 염을 제거한다. 염을 제거하기 위해서는 추출물을 중화시킨 후 원심분리하여 상등액만을 분리하고, 분리한 상등액을 여과하여 얻어진 여액을 탈수하고 감압농축한 다음 중화반응에 의하여 농축액 속에 포함된 염을 제거하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 농축액 속에 포함된 염을 제거하기 위해서는 투석법(dialysis)이나 겔여과법(Gel filtration) 등 여러 가지 방법을 사용할 수 있으나, 대량생산을 위해서는 투석법을 사용하는 것이 바람직하다. 투석시 용매로는 물을 사용하고, 투석막(dialysis membrane)은 분자량이 1,000-3,000인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 투석막의 분자량이 3,000을 넘으면 염만이 아니라 항혈전 성분도 빠져나가게 되고, 1,000 미만이면 염제거의 효율이 낮아지기 때문이다.
물을 추출용매로 사용한 경우에는 상기와 같은 중화단계 및 중화반응에 의하여 생성된 염을 제거하는 단계가 불필요하다.
상기의 과정을 거친 여액을 건조하여 미분획추출물을 얻는다. 얻어진 미분획추출물에 메탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 메탄올에 용해된 메탄올용해성성분을 분리하여 제거한다. 메탄올용해성성분을 제거한 메탄올불용성성분을 다시 물에 용해시킨 다음 물불용성성분을 제거한다.
물에 용해시킨 용액에 에탄올을 넣은 후 12-24시간동안 정치한 후 물용해성 성분 중 에탄올에 용해되는 에탄올용해성성분을 분리하여 제거한다.
에탄올용해성분획을 분리한 후 남은 부분인 에탄올불용성성분을 충분한 양의 물에 용해시키고 물에 용해되지 않는 불용성성분을 제거한다. 마지막으로 남은 물용해성성분을 분리하여 항혈전효과가 우수한 목이버섯의 항혈전성 추출물을 제조한다. 항혈전성 추출물은 그대로 사용하거나 필요에 따라 건조시켜 사용할 수 있다.
상기 목이버섯의 항혈전성 추출물은 시험관내 실험(in vitro) 및 생체실험(in vivo)에서 탁월한 항혈전효과를 나타낸다. 특히 상기의 추출물은 식품성분이므로 생체내에서 부작용없이 우수한 항혈전효과를 나타낸다.
상기 추출물에 대하여 내인성혈액응고시스템에 대한 항응고활성을 측정하는 방법들인 APTT(activated partial thromboplastim time) 항응고활성 및 TT(thrombin time) 항응고활성, PT(prothrombin time) 항응고활성과, 혈소판활성 및 부착시스템에 대한 항응고활성을 측정하는 방법인 항혈소판활성(collagen- induced platelet aggregation test)에 의하여 항혈전활성을 측정한 결과, 매우 우수한 항혈전효과를 나타낸다.
또한 쥐에 대한 동물실험을 한 결과에서도 매우 우수한 항혈전효과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1)
추출용매별 항응고활성을 비교하기 위하여 목이버섯을 각각 물, 0.1N 염산, 0.1N 수산화나트륨수용액을 추출용매로 사용하여 2시간씩 3회 반복하여 환류추출한다음 원심분리하고 상등액만을 분리하여 여과하였다. 여과후의 여액을 감암농축한 다음 동결건조하여 목이버섯의 열수추출물, 산추출물, 염기추출물을 제조하였다.
각 시료를 혈소판이 거의 없는 혈장인 PPP(Platelet poor plasma)에 1㎎/㎖의 농도로 용해시켜 PPP시료를 제조하였다. 이때 혈소판응집에 의한 혈액응고효과를 배제하기 위하여 혈소판이 거의 없는 PPP를 사용하였다.
각 PPP시료를 100㎕씩 취하여 37℃에서 3분간 정치한 후 2mM 염화칼슘(CaCl2)수용액 100㎕를 넣고, 염화칼슘을 넣은 시점부터 피브린이 형성되어 응고가 일어나는 시간인 PRT를 측정하였다.
또한 각 PPP시료를 100㎕씩 취하여 데이드 액틴(Dade actin) 100㎕을 넣고, 37℃에서 3분간 정치한 후 2mM 염화칼슘수용액 100㎕를 넣고 염화칼슘을 넣은 시점부터 피브린이 형성되어 응고가 일어나는 시간인 APTT를 측정하였다.
또한 각 PPP시료를 100㎕씩 취하여 37℃에서 3분간 정치한 후 트롬빈시약(thrombin reagent) 10㎕을 넣고, 트롬빈시약을 넣은 시점부터 피브린이 형성되어 응고가 일어나는 시간인 TT를 측정하였다.
이때 대조를 위하여 PPP에 물을 넣은 PPP대조군에 대하여 동일한 방법으로 PRT, APTT, TT를 측정하였다.
측정된 각 PPP시료 및 PPP대조군의 PRT, APTT, TT를 하기 수학식 1에 따라 계산하여 백분율형태의 항응고활성(%)을 계산하였으며 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 용매별 추출물 | PRT(%) | APTT(%) | TT(%) |
| 열수추출물 | 19.00 | 72.91 | 32.68 |
| 산추출물 | 7.00 | 18.23 | 91.05 |
| 알칼리추출물 | 17.00 | 91.14 | 123.73 |
상기 표 1의 결과에서, 세 가지 추출용매의 추출물 모두가 항혈전활성을 나타냄을 알 수 있다. 그러나 염기를 추출용매로 사용한 경우의 추출물이 물과 산을 추출용매로 사용한 추출물보다 훨씬 높은 항응고활성을 나타내었다.
(실시예 2)
추출물의 농도와 항응고활성과의 관계를 확인하기 위하여 염기를 추출용매로 사용하여 추출한 추출물을 PPP에 각각 0.3㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1.0㎎/㎖의 농도로 용해시킨 후 실시예 1에서와 동일한 방법으로 APTT와 TT를 측정하였다. 측정한 APTT와 TT를 이용하여 상기 수학식 1에 따라 APTT항응고활성과 TT항응고활성을 계산하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 시료의 농도 | APTT(%) | TT(%) |
| 0.3㎎/㎖ | 2.63 | 16.81 |
| 0.5㎎/㎖ | 42.21 | 41.81 |
| 1.0㎎/㎖ | 91.14 | 123.73 |
표 2에 나타난 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 항응고활성은 농도를 증가시킴에 따라 점차 증가하였다.
(실시예 3)
미분획추출물 및 각 분획의 항응고활성을 비교하기 위하여 염기를 추출용매로 사용하여 추출한 미분획추출물, 그의 에탄올용해성분획 및 에탄올불용성분획을 PPP에 각각 1㎎/㎖의 농도로 용해시킨 후 그 각각에 대하여 APTT, PT, TT를 측정하였다.
APTT, TT의 측정방법은 실시예 1에서와 동일하다. PT는 PPP시료를 37℃에서 3분간 정치한 후 트롬보플라스틴 100㎕를 넣고 트롬보플라스틴을 넣은 시점부터 피브린이 형성되어 응고가 일어나는 시간을 측정하였다.
측정된 APTT, PT, TT를 이용하여 상기 수학식 1에 따라 APTT항응고활성, PT항응고활성 및 TT항응고활성을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 분획 | APTT(%) | PT(%) | TT(%) |
| 미분획추출물 | 91.14 | - | 123.73 |
| 에탄올용해성분획 | - | 96.15 | 33.33 |
| 에탄올불용성분획 | 101.72 | 61.54 | 171.43 |
표 3의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 다당류성분인 에탄올불용성분획이 전체적으로 가장 높은 항응고 활성을 나타내었다.
(실시예 4)
또한 미분획추출물과 각 분획이 혈소판의 응집억제활성을 가지는지를 알아보기 위하여 상기 실시예 3에서의 시료들을 사용하여 항혈소판활성을 측정하였다.
항혈소판활성은 전혈 450㎕와 등장액(0.85% NaOH) 535㎕를 혼합한 혈액에 10㎎/㎖농도의 각 시료들을 10㎕씩 넣은 다음 37℃에서 배양(incubation)하였다. 배양한 시료에 콜라겐 5㎕를 넣어 혈소판응집을 유도하고 전극간의 저항값의 변화를 측정하였다. 대조를 위하여 시료대신 등장액 10㎕를 넣고 측정하였다.
등장액을 넣고 측정한 저항값을 기준값으로 하였을 때 각 시료의 저항값으로부터 하기 수학식 2에 따라 백분율형태의 항혈소판활성(%)을 계산하였다. 계산한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| 분획 | 항혈소판활성(%) |
| 미분획추출물 | 6.36 |
| 에탄올용해성분획 | 5.45 |
| 에탄올불용성분획 | 25.45 |
상기 표 4에서 나타난 바와 같이 미분획추출물과 각 분획은 항혈소판활성을 나타내었으며, 항혈소판활성도 다른 항응고활성과 마찬가지로 다당류성분인 에탄올용해성분획이 가장 높은 것을 알 수 있었다.
(실시예 5)
에탄올불용성분획의 농도와 항응고활성과의 관계를 알아보기 위하여 염기를 추출용매로 사용하여 추출한 추출물의 에탄올불용성분획을 제조하여 PPP에 각각 0.3㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1.0㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 각 농도에 대하여 APTT, PT, TT를 측정하였고, 측정된 결과를 사용하여 상기 수학식 1에 따라 APTT항응고활성, PT항응고활성과 TT항응고활성을 계산하였다. 계산한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
| 항응고활성(%) | 농도 | ||
| 0.3㎎/㎖ | 0.5㎎/㎖ | 1.0㎎/㎖ | |
| APTT (%) | 36.21 | 56.90 | 101.72 |
| PT (%) | 3.85 | 11.54 | 61.54 |
| TT (%) | - | 21.43 | 171.43 |
상기 표 5의 결과에서 알 수 있는 바와 같이 에탄올불용성분획도 농도를 증가시킴에 따라 항응고활성이 증가하는 것으로 나타났다.
(실시예 6)
또한 에탄올불용성분획의 농도와 항혈소판활성과의 관계를 알아보기 위하여 염기를 추출용매로 사용하여 추출한 추출물의 에탄올불용성분획을 제조한 후 전혈에 10㎍/ml, 50㎍/ml, 80㎍/ml, 100㎍/ml의 농도로 용해시켜 저항값을 측정하였고, 그 저항값을 이용하여 상기 수학식 2에 따라 항혈소판활성을 계산하였다. 계산한 항혈소판활성을 하기 표 6에 나타내었다.
| 농도 | 항혈소판활성(%) |
| 10㎍/ml | 3.6 |
| 50㎍/ml | 7.3 |
| 80㎍/ml | 10.0 |
| 100㎍/ml | 25.45 |
상기 표 6의 결과에서, 항혈소판활성도 농도의존적으로 증가함을 알 수 있었다.
(실시예 7)
목이버섯의 항혈전효과를 갖는 추출물이 실제로 생체내에서도 항혈소판활성을 나타내는지를 알아보기 위하여 동물실험을 하였다.
체중이 200-250g인 수컷 SD쥐(rat) 15마리를 3그룹으로 나눈 다음 졸레틸(zoletil) 복강내(intraperitoneal, I.P) 마취하에 개복하지 않고 26G 바늘을 이용하여 심장에서 2㎖씩 채혈하였다. 채혈한 혈액중 전혈 450㎕를 사용하여 각 개체의 초기 항혈소판활성치를 측정하였다.
초기 항혈소판활성치를 측정한 후 마취에서 깨어난 쥐들중 제1그룹의 쥐들에게는 아무 것도 투여하지 않고 방치하였다.
제2그룹은 비교를 위하여 아스피린을 매일 100mg/kg씩 경구투여하였고, 제3그룹은 에탄올용해성분획을 매일 300mg/kg씩 경구투여하였다.
6일동안 투여한 후 쥐들을 졸레틸 복강내 마취하에 개복하여 심장구멍(heart puncture)을 통해 혈액을 채취하여 항혈소판활성을 측정하였으며, 측정결과를 평균하여 하기 표 7에 나타내었다.
| 항혈소판활성(%) | |
| 정상군 | 0 |
| 아스피린 (100mg/kg) | 35.28 |
| 에탄올불용성분획(300mg/kg) | 31.98 |
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 에탄올불용성분획을 투여한 쥐는 아무 것도 먹이지 않은 대조군의 쥐보다 높은 항혈소판활성을 나타내었으며, 현재 혈소판응집억제제로 널리 사용되고 있는 아스피린을 투여한 쥐와 비슷한 정도의 항혈소판활성을 나타내었다.
(실시예 8)
분획별 추출물의 구성성분의 분석
시료 10㎎을 테플론선이 그려진 나사뚜껑(Teflon-lined screw cap)이 있는 실험병(vial)에 넣고 질소가스를 불어넣어 주면서 72%(w/w) 황산 125㎕를 넣어 주었다. 황산을 넣은 후 뚜껑을 닫고 상온에 45분 방치하였다. 다시 질소가스를 불어넣어 주면서 3차 물 1.35㎖를 넣고 뚜껑을 닫은 후 100℃에서 3시간 동안 가수분해시켰다.
가수분해시킨 시료를 상온까지 냉각시킨 후 15M 암모니아용액 0.32㎖를 넣고 20㎎/㎖ 농도의 미오-이노시톨(myo-inositol) 50㎕를 넣어 중화하여 최종용액을 제조하였다.
별도로 무수 디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide anhydride) 100㎖에 붕화수소나트륨(sodium borohydride) 2g을 넣고 100℃로 가열하여 붕화수소나트륨용액을 만들었다.
최종용액 0.1㎖에 붕화수소나트륨용액 1 ㎖를 넣고 40℃에서 90분 방치하여 환원시키고, 환원 후 잔존하는 과량의 붕화수소나트륨은 18M 아세트산 0.1㎖를 넣어 분해하였다. 분해 후 1-메틸이미다졸(methylimidazole) 0.2㎖, 무수 아세트산(acetic anhydride) 2㎖를 넣어 섞어준 후 상온에서 10분간 방치하여 아세틸레이션시키고, 3차 물 5㎖를 넣어 과량의 무수 아세트산을 분해시킨 후 상온으로 냉각하였다.
냉각 후 디클로로메탄(dichloromethane) 1㎖를 넣어 격렬하게 혼합하여 균질화한 후 층분리가 되면 아래층인 디클로로메탄을 취하여 -20℃에 보관했다가 분석에 사용하였다.
상기와 같이 전처리된 시료에 대하여 GC-MS 및 GC분석을 하기 위하여 JW 과학사의 DB-225 모세칼럼을 사용하였다. 이때 오븐은 195℃에서 3분간 유지한 후 2℃/min의 속도로 200℃까지 올려 10분간 유지하고 다시 5℃/min의 속도로 210℃까지 올려 30분간 유지하였다. 시료주입구 및 검출기의 온도는 220℃로 하였다.
상기의 전처리된 시료 5㎕를 전용주사기로 취하여 주입한 후 가스 크로마토그래피-질량 분광측정기(gas chromatography-mass spectrometry, 이하 "GC-MS"라 함)를 이용하여 각 당에 해당하는 피크를 동정하고, 가스 크로마토그래피(gas chromatography, 이하 "GC"라 함)를 이용하여 정량하였다.
이때 단당류 표준시약으로는 아라비노즈(arabinose), 퓨코즈(fucose), 갈락토즈(galactose), 글루코즈(glucose), 만노즈(mannose), 람노즈(rhamnose), 리보즈(ribose), 자일로즈(xylose)의 혼합시료인 표준단당을 사용하였고, 내부표준물질(internal standard)로는 미오이노시톨을 사용하였다.
상기와 같이 구성성분을 분석한 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다.
미분획추출물(YOOB)의 경우, 도 1에 나타난 바와 같이, 19.975분에 자일로즈, 32.168분에 만노즈, 37.551분에 글루코즈, 40.363분에 내부표준물질의 피크가 검출되었고, 단당의 구성비는 자일로즈 19.3%, 만노즈 47.4%, 글루코즈 33.3%였다.
메탄올용해성분획(YOOB-Ms)의 경우, 도 2에 나타난 바와 같이, 37.503분에 글루코즈, 40.332분에 내부표준물질의 피크가 검출되어 글루코즈만을 단당으로 함유하고 있음을 알 수 있었다.
에탄올불용성분획(YOOB-En)의 경우, 도 3에 나타난 바와 같이, 13.756분에퓨코즈, 19.962분에 자일로즈, 32.154분에 만노즈, 34.526분에 갈락토즈, 37.535분에 글루코즈, 40.329분에 내부표준물질의 피크가 검출되었다. 상기 피크의 면적을 토대로 에탄올불용성분획의 단당구성비는 퓨코즈 0.2%, 자일로즈 24.2%, 만노즈 39.9%, 갈락토즈 4.9%, 글루코즈 30.8%임을 알 수 있었다.
에탄올용해성분획(YOOB-Es)의 경우, 도 4에 나타난 바와 같이, 19.929분에 자일로즈, 32.130 분에 만노즈, 37.499분에 글루코즈, 40.333분에 내부표준물질의 피크가 검출되었다. 상기 피크의 면적을 토대로 에탄올용해성분획의 단당구성비는 자일로즈 19.1%, 만노즈 13.7%, 글루코즈 67.2%임을 알 수 있었다.
상기 네가지 분획에 대한 구성당의 비 및 보유시간을 하기 표 8에 나타내었다.
| 분획 | 단당류성분 | |||||||||
| 퓨코즈 | 갈락토즈 | 글루코즈 | 만노즈 | 자일로즈 | ||||||
| 비(%) | RT(분) | 비(%) | RT(분) | 비(%) | RT(분) | 비(%) | RT(분) | 비(%) | RT(분) | |
| YOOB | - | - | 33.3 | 37.551 | 47.4 | 32.168 | 19.3 | 19.975 | ||
| YOOB-Ms | - | - | 100 | 37.503 | - | - | ||||
| YOOB-En | 0.2 | 13.756 | 4.9 | 34.526 | 30.8 | 37.535 | 39.9 | 32.154 | 24.2 | 19.962 |
| YOOB-Es | - | - | 67.2 | 37.499 | 13.7 | 32.130 | 19.1 | 19.929 |
(실시예 9)
황산기 함량과 항응고활성과의 상관관계 분석
단당류에 함유되어 있는 황산기(sulfate)는 단당류의 생리활성과 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 연구보고 되고 있으며, 특히 황산기의 함량과 항응고활성은 직접적인 연관성이 있는 것으로 알려져 있다.
따라서 하기와 같이 크로마토그래피를 이용하여 황산기의 함량을 분석하여목이버섯의 각 분획 내의 황산기 함량을 분석함으로써 황산기 함량과 항응고활성과의 상관성을 분석하였다.
시료 3mg에 90% 포름산(formic acid), 2M 트리플로로 아세트산(trifloroacitic acid) 및 2M 과산화수소를 혼합한 가수분해용매 0.5ml를 가한 후 100℃에서 6시간동안 반응시켰다. 반응 후 가수분해용매가 담긴 시료병을 진공건조기에서 밤새 건조하여 가수분해용매를 완전히 제거하였다.
용매를 제거한 후 시료가 들어있는 실험병에 3차 물을 넣어 3mg/ml 농도의 시료용액을 제조하였다. 제조된 시료용액을 1.5ml 실험튜브(eppendorf tube)에 옮긴 다음 12,000rpm에서 5분간 원심분리하고, 다시 새로운 실험튜브로 옮겼다.
0.2㎛ 필터로 상등액을 여과한 후 AS12A 칼럼과 서프레서(suppressor, 이온중 필요한 음이온만 남겨두고 불필요한 양이온이나 중성물질은 제거함)(ASRS)가 장치된 크로마토그래피에 이동상(mobile phase)인 2.7mM 탄산나트륨/0.3mM 탄산수소나트륨의 혼합용액을 충분히 흘려주면서 상기 제조된 시료용액을 50㎕ 주입하였다. 이때 표준물질로서 황산칼륨(5-25ppm)을 크로마토그래피에 50㎕ 주입하여 실험하였다.
25ppm의 황산칼륨으로 실험한 결과를 도 5에 나타내었다. 이때 가로축은 황산기의 보유시간을 나타내고 세로축은 전도율을 나타낸다. 도 5에서 황산기에 의한 피크는 보유시간 약 15분 근처에서 나타나는 것을 알 수 있다.
표준물질인 황산칼륨을 사용하여 농도별로 황산기의 보유시간 및 전도율의 관계를 나타내는 표준곡선을 구하고, 농도별로 황산기의 함량이 크로마토그래피에서 검출되는지를 확인한 후 표준물질과 시료물질의 결과를 비교하여 시료 내의 황산기의 함량을 추정하였다.
상기의 방법에 의하여 목이버섯의 각 분획에 대한 황산기의 함량을 측정한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 에탄올 용해성 분획이 가장 많은 황산기를 함량하고 있었다. 반면 항응고 활성이 가장 높게 나온 에탄올 불용성 분획은 오히려 에탄올 용해성 분획보다 낮게 나와 황산기의 함량과 항응고 활성과의 직접적인 상관관계는 확인할 수 없었다.
APTT 항응고활성을 측정한 결과로부터 목이버섯의 항혈전성 추출물은 내인성 경로에 관여하는 인자들을 불활성화하여 피브린형성을 방해함으로써 응고를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있으며, TT 항응고활성을 측정한 결과로부터 트롬빈의 활성을 억제하여 응고를 억제하는 효과도 있음을 알 수 있다.
또한 PT 항응고활성을 측정한 결과로부터 프로트롬빈을 트롬빈으로 바꾸는데 관여하는 여러 인자들의 활성을 억제함으로서 트롬빈생성이 지연시켜 응고를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있으며, 전혈(Whole blood)을 이용하여 항혈소판활성을 측정한 결과로부터 혈소판들의 응집을 억제함으로써 응고를 억제하는 효과도 있음을 알 수 있다.
따라서 본 발명의 목이버섯의 항혈전성 추출물은 혈액응고체계에서의 내인성 경로에 관여하는 많은 효소와 최종단계인 피브린을 형성하는 트롬빈의 활성을 저해하고, 혈소판의 활성화를 방지함으로서 혈소판 자체의 응집방지 및 혈소판활성화에따른 혈액응고체계의 가속화를 방지함으로서 혈전의 생성을 억제하는 우수한 항혈전효과가 있다.
특히 목이버섯은 식품이므로 종래에 사용하던 약제들과는 달리 체내에서 출혈을 일으키는 등의 부작용이 없어 안전하다.
따라서 본 발명의 목이버섯의 항혈전성 추출물을 식품첨가제 및 약제로 이용하여 혈전의 생성을 억제함으로써 뇌출혈, 뇌경색, 심근경색, 동맥경화 및 관상동맥증과 같은 심혈관계 질환을 미리 예방할 수 있다.
Claims (11)
- 건조시킨 목이버섯을 분쇄하는 단계와;추출용매를 사용하여 분쇄물에서 성분들을 추출하는 단계와;추출물이 포함된 용액을 중화시키는 단계와;중화된 용액에서 염을 제거하는 단계와;염을 제거한 용액을 건조하여 미분획추출물을 얻는 단계와;미분획추출물에 충분한 양의 메탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 메탄올용해성성분을 제거하는 단계와;메탄올불용성성분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하는 단계와;물용해성성분에 충분한 양의 에탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 에탄올용해성성분을 제거하는 단계와;에탄올용해성성분이 제거된 에탄올불용성부분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하는 단계와;남은 물용해성성분을 분리하는 단계를 포함하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 환류추출하는 단계를 수회 반복함으로써 추출수율을 높이는 것을 특징으로 하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출용매로는 염기를 사용하는 것을 특징으로 하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 염기로는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 사용하는 것을 특징으로 하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 추출용매로 사용되는 염기의 농도를 0.01-0.5N로 하는 것을 특징으로 하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 추출용매로 사용되는 염기의 농도를 0.05-0.2N로 하는 것을 특징으로 하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 건조시킨 목이버섯을 분쇄하는 단계와;물을 추출용매로 사용하여 분쇄물에서 성분들을 추출하는 단계와;추출물이 포함된 용액을 건조하여 미분획추출물을 얻는 단계와;미분획추출물에 충분한 양의 메탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 메탄올용해성성분을 제거하는 단계와;메탄올불용성성분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하는 단계와;물용해성성분에 충분한 양의 에탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 에탄올용해성성분을 제거하는 단계와;에탄올용해성성분이 제거된 에탄올불용성부분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하는 단계와;남은 물용해성성분을 분리하는 단계를 포함하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 분쇄물을 환류추출하는 단계를 수회 반복함으로써 추출수율을 높이는 것을 특징으로 하는 목이버섯으로부터 항혈전성 성분을 추출하는 방법.
- 건조시킨 목이버섯을 분쇄하고, 염기를 추출용매로 사용하여 분쇄물에서 성분들을 추출하고, 추출물이 포함된 용액을 중화시키고, 중화된 용액에서 염을 제거하고, 염을 제거한 용액을 건조하여 미분획추출물을 얻고, 미분획추출물에 충분한 양의 메탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 메탄올용해성성분을 제거하고, 메탄올불용성성분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하고, 물용해성성분에 충분한 양의 에탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 에탄올용해성성분을 제거하고, 에탄올용해성성분이 제거된 에탄올불용성부분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하고, 남은 물용해성성분을 분리한 후 건조하여 얻어지는, 목이버섯으로부터 추출한 항혈전성 추출물.
- 건조시킨 목이버섯을 분쇄하고, 물을 추출용매로 사용하여 분쇄물에서 성분들을 추출하고, 추출물이 포함된 용액을 건조하여 미분획추출물을 얻고, 미분획추출물에 충분한 양의 메탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 메탄올용해성성분을 제거하고, 메탄올불용성성분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하고, 물용해성성분에 충분한 양의 에탄올을 넣고 12-24시간동안 정치한 후 에탄올용해성성분을 제거하고, 에탄올용해성성분이 제거된 에탄올불용성부분을 충분한 양의 물에 용해시켜서 물불용성성분을 제거하고, 남은 물용해성성분을 분리한 후 건조하여 얻어지는, 목이버섯으로부터 추출한 항혈전성 추출물.
- 제 9 항 또는 제 10 항의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항혈전성 건강보조식품.
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