KR100999858B1 - 갈색거저리 유충의 체액으로부터 펩티도글리칸 인식단백질을 분리하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 하나 이상의 합성 펩티도글리칸이 결합된 수지로 컬럼을 충진하여 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계; (b) 갈색거저리 유충의 체액을 단계 (a)에서 얻어진 컬럼에 적용하는 단계; (c) 이동상 용매를 상기 컬럼에 제공하여 펩티도글리칸-인식 단백질을 컬럼으로부터 용리시켜 용리액을 얻는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 얻어진 용리액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 갈색거저리 유충의 체액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

갈색거저리 유충의 체액으로부터 펩티도글리칸 인식 단백질을 분리하는 방법{A METHOD OF SEPARATING A PEPTIDOGLYCAN RECOGNITION PROTEIN FROM A HEMOLYMPH OF TENEBRIO MOLITOR LARVAE}

본 발명은 합성 펩티도글리칸을 이용하여 갈색거저리 유충의 체액에 존재하는 펩티도글리칸-인식 단백질을 분리하는 방법, 상기 방법에 의해 분리된 펩티도글리칸-인식 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다.

대부분의 생물체들은 병원균이나 기생충 등과 같은 외부 유해 환경에 항상 노출되어 있지만, 그 생명을 유지하면서 살아갈 수 있는 것은 자신을 방어할 수 있는 면역체계를 가지고 있기 때문이다. 이러한 면역체계는 외부 이물질을 인식하는 방법에 따라 선천성(innate)과 후천성(adaptive) 면역계로 구분되어지며, 무척추 동물의 경우 선천성 면역계만을 가지고 있으나 사람과 같은 척추동물은 선천성 면역계와 후천성 면역계를 모두 가지고 있다. 척추동물에서만 관찰되는 후천성 면역계는 체내에 침입한 유해 이물질 각각에 대한 개별적인 구조를 인식하여 특정 항원에 대한 선택적인 항체를 생성하여 지속적인 면역작용을 가지는 기억 면역계인 반면, 무척추동물에서 관찰되는 선천성 면역계는 병원성 미생물에 공통적으로 존재하 는 특징물질인 pattern을 인식하여 즉각적이면서도 신속하게 대응하는 비기억 면역계이다. 불과 몇 년 전만 하더라도 선천성 면역계는 외부 이물질의 침입시 후천성 면역계에 의한 항체 생성이 이루어질 때까지의 1차적인 방어 작용을 하는, 후천성 면역계보다 비특이적이고 덜 발달된 형태의 면역계인 것으로 여겨져 왔다.

그러나, 최근 수년간의 분자수준에서의 활발한 연구결과 선천성 면역계는 후천성 면역계의 유도에도 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀지면서 그 중요성이 대두되고 있다(Carroll, M. C. et al, Curr. Opin. Immunol. 10, 36-48(1998); Ruslan, M. et al, Cell 91, 295-298(1997)).

이러한 사실들로 부터 선천성 면역계의 조절이 후천성 면역계에 변화를 가져올 수 있다는 점에서 질병 치료 및 신약개발 측면에 있어서 새로운 개념의 접근이 가능하므로, 최근의 많은 국내외 연구진들에 의해 선천성 면역계에 대한 분자 수준에서의 연구가 활발히 진행되고 있다(Medzhitov, R. et al, Nature 388, 394-397(1997)).

선천성 면역계를 연구하기 위해서는 선천성 면역계를 가지는 무척추동물이 주된 연구재료로 사용되어지고 있으며, 그 중에서 곤충을 대상으로 한 연구가 많이 이루어지고 있다. 최근 분자 수준에서의 연구 결과, 곤충의 선천성 면역계와 척추동물의 선천성 면역계 사이에 존재하는 유사성이 밝혀짐으로써 각종 곤충을 이용한 선천성 면역계에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. (Medzhitov, R. et al,(1997) Nature 388, 394-397(1997); Hultmark, D. (1994), Nature 367, 116-117(1994); Wasserman, S. A. Mol. Biol. Cell. 4, 767-771(1993)).

곤충의 면역계는 세포성 면역반응(cellular immune response)과 체액성 면역반응(humoral immune response)으로 나누어 설명할 수 있다. 그중 체액성 면역 반응은 외부에서 침입한 이물질에 대응하여 곤충의 체액으로 유리되는 항세균성 단백질, 침입한 이물질에 대하여 특정 당을 인식하는 렉틴의 유도, 멜라닌 생성에 관련되는 것으로 알려져 있는 프로-페놀옥시다제(이하, pro-PO) 활성화 반응 등이 있다.

곤충을 대상으로 한 pro-PO 활성화 시스템에 대한 연구 결과에 의하면 세린 프로테인아제 저해제에 의해 페놀옥시다제(이하, PO) 활성이 억제된다는 사실이 밝혀졌고(Ashida, M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 113, 562-568(1983)), pro-PO는 세린 프로테인아제 성질을 가지는 pro-PO 활성화 인자(이하, PPAF)가 관여하는 캐스캐이드 반응을 통하여 활성화된다는 사실이 보고되었다(Aspan, A et al, Insect Biochem., 21, 363-373(1991)). 이 반응은 곰팡이의 세포벽 성분인 베타-1,3-글루칸(Kwon, T. H. et al, Mol. Cells. 7, 90-97(1997); Saul, S. et al, Archs. Insect Biochem. Physiol. 7, 91-103(1988); Ashida, M., Bombyxi mori, Insect Biochem. 11, 57-65(1981)), 또는 박테리아의 세포벽 성분인 리포폴리사카리아드(LPS)나 펩티도글리칸(PGN)(Saul, S. et al, Archs. Insect Biochem. Physiol. 7, 91-103(1988); Ashida, M., Bombyxi mori, Insect Biochem. 11, 57-65(1981); Pye, A. E., Nature 251, 610-613(1974)) 등의 패턴이라고 불리는 물질에 의해 개시된다는 사실도 알려졌다.

일반적으로 PO는 불활성 상태의 proenzyme(zymogen)으로서 발현되며, 활성화 되면 디페놀이 퀴논체로 산화되어 최종적으로 멜라닌을 생성한다. PO는 분자 내에 구리를 포함하는 것으로 알려져 있으며, 특히 곤충에 있어서는 곤충 각피의 갈변화와 경화, 상처복구를 통한 체액 유실 및 병원균 침입 방지 등 생체 방어 작용과 관련하여 상당히 중요한 역할을 할 것으로 추정된다.

곤충의 생체방어 기전과 관련된 곤충의 pro-PO의 연구는 지난 수 십 년간 여러 연구진에 의해 활발히 연구가 수행되었음에도 불구하고 1995년도에 와서야 비로소 초파리(Drosophila melanogaster), 누에(Bombyx mori), 박각시나방의 유충(tobacco hornworm, Manduca sexta)의 3종류의 곤충으로부터 pro-PO가 분리, 정제되어 전체 아미노산 서열이 규명되었다(Saul S. et al, Archs. Insect Biochem. Physiol., 5, 1-11(1987); Fujimoto K. et al,, PNAS, 92, 7769-7773; Kawabata T. et al,, PNAS, 92, 7774-7778(1995)).

곤충의 선천성 면역반응계에서의 천연의 pattern 인식 단백질을 규명하고 pro-PO cascade 반응에서 생물학적 역할을 부분적으로 규명하여 세계적으로 연구가 활발히 진행되어졌다 (Girardin SE, et al.. J Biol Chem. 278: 803283(2003); Hugot JP et al, Curr Opin Immunol. 15: 593597(2003).). 또한 딱정벌레목에 속하는 갈색거저리 유충의 체액을 소재로 β-1,3-글루칸 인식 단백질에 대한 규명과 pro-PO 캐스케이드 반응에서의 상관관계를 보고하였으며, 한국산 참검정 풍뎅이 (Holotrichia diomphalia)의 유충의 체액으로부터 β-1,3-글루칸 인식 단백질에 대한 규명과 생물학적 기능에 대하여 보고하였다 (Lee MH, et al, J Biol Chem. 279(5):3218-27(2000); Zhang R et al, J Biol Chem. 278(43):42072-9.(2003)).

그런데 최근 이렇게 밝혀진 pattern 인식 단백질들 중 Holotrichia diomphalia larvae의 체액에서 분리 정제된 PGRPs는 PGN을 특이적으로 인식하는 반응이 아닌, 진균의 pattern인 β-1,3-glucan을 특이적으로 인식하여 pro-PO cascade를 활성화 시킨다는 새로운 내용의 연구결과가 보고되었다 (Lee MH, et al, J Biol Chem. 279(5):3218-27(2000)). 이러한 결과는 아직까지 천연의 pattern 인식 단백질의 분자 수준에서의 반응기전과 pro-PO cascade의 활성화 기전과의 관계가 아직 명확하게 규명되지 않고 있는 점을 보여주었다.

갈색거저리의 유충의 체액은 진균의 pattern인 β-1,3-glucan에 의해 pro-PO cascade 반응을 활성화 시킬 수 있다는 사실의 선행의 연구결과를 얻을 수 있었다. 그리고 체액에는 β-1,3-glucan과 특이적으로 인식 하는 단백질이 존재한다는 사실을 발견하였다. 이러한 결과들은 진균 진단 시약에 개발 할 수 있는 가능성을 제시하였다(Zhang R et al, J Biol Chem. 278(43):42072-9.(2003).

일련의 캐스케이드 단계로 이루어지는 PO 활성화 반응 시스템은 외부에서 침입한 병원균이나 이물질, 혹은 자신의 혈구 세포의 탈과립화 반응에 의해 유도되는 내부 인자 등에 의하여 쉽게 활성화되어 페놀옥시다아제로 변화되어 카테콜아민류를 이용하여 멜라닌을 형성해 버리므로, 이 반응 시스템을 구성하는 인자인 펩티도글리칸 또는 β-1,3-글루칸을 특이적으로 인식하는 패턴 인식 단백질 등을 생체 외로 분리하는 것이 어려움이 있다.

기술적 과제

이에 본 발명자들은 펩티도글리칸-인식 단백질에는 결합할 수 있으나 그 하위 단계의 캐스케이드는 활성화시키지 못하는 합성 펩티도글리칸을 이용하여 갈색거저리 유충의 체액으로부터 PO 활성화 반응 시스템을 구성하는 펩티도글리칸-인식 단백질을 분리함으로써 본 발명을 완성하였다.

기술적 해결방법

본 발명은 특정 합성 펩티도글리칸을 사용하여 펩티도글리칸-인식 단백질을 갈색거저리(Tenebrio molitor) 유충의 체액으로부터 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 패턴 인식 단백질 분획을 갈색거저리 유충의 체액으로부터 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 펩티도글리칸-인식 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 펩티도글리칸-인식 단백질을 포함하는 펩티도글리칸 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 특징 및 유리한 점은 하기 첨부도면을 참조하여 본 발명의 예시적이고 비제한적인 구현예를 상세히 서술함으로써, 더욱 명확해질 것이다.

도 1은 페놀옥시다제 활성화 시스템을 개략적으로 도시한 것이다.

도 2는 PO 활성을 측정하기 위한 파이의 분광 광도법의 원리를 나타낸 것이다.

도 3은 PO 활성과 관련하여 천연 펩티도글리칸, 베타-1,3-글루칸 및 합성 펩 티도글리칸의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 천연 펩티도글리칸에 의존적인 PO 활성화가 합성 PGN에 의한 저해 정도를 나타내는 그래프이다.

도 5 및 6 각각은 합성 PGN의 농도에 따라 천연 펩티도글리칸에 의존적인 PO 활성 및 아미다제 활성의 저해 정도를 나타내는 그래프이다.

도 7은 투석하기 이전 및 이후의 갈색 거저리 유충의 체액, 그리고 합성 PGN이 결합된 컬럼 및 대조군 컬럼으로부터 나온 용리액을 가지고 SAS-PAGE을 수행한 결과이다.

도 8의 (A) 및 (B)는 합성 PGN-컬럼으로부터 분리된 20kDa의 단백질을 에드만 분해를 수행하여 N-말단 및 3개의 부분적인 아미노산 서열을 분석한 결과이다.

도 9은 토요펄 HW55S 컬럼 크로마토그래피상에서 갈색 거저리 유충의펩티도글리칸-인식 단백질의 용리액 프로필을 나타내는 그래프이다.

도 10는 하이드록시에퍼타이트 크로마토그래피상에서 갈색 거저리 유충의펩티도글리칸-인식 단백질의 용리액 프로필을 나타내는 그래프이다.

도 11은 Mono-Q-FPLC 컬럼 크로마토그래피상에서 갈색 거저리 유충의펩티도글리칸-인식 단백질의 용리액 프로필을 나타내는 그래프이다.

도 12은 20kDa의 펩티도글리칸-인식 단백질을 코딩하는 cDNA의 염기 서열과 이로부터 발현되는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

발명의 실시를 위한 형태

상기 본 발명의 일 태양에 따라, (a) 하기 화학식 1 내지 4의 화합물로 이루 어진 군으로부터 하나 이상 선택된 합성 펩티도글리칸이 결합된 수지로 컬럼을 충진하여 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계; (b) 갈색거저리 유충의 체액을 단계 (a)에서 얻어진 컬럼에 적용하는 단계; (c) 이동상 용매를 상기 컬럼에 제공하여 펩티도글리칸-인식 단백질을 컬럼으로부터 용리시켜 용리액을 얻는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 얻어진 용리액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 갈색거저리 유충의 체액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 분리하는 방법이 제공된다:

＜화학식 1＞

＜화학식 2＞

＜화학식 3＞

＜화학식 4＞

식 중, Pr은 프로필을 의미한다.

본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 상기 화학식 1 내지 4의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 합성 펩티도글리칸이 결합된 수지로 컬럼을 충진하여 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계; (b) 갈색거저리 유충의 체액을 단계 (a)에서 얻어진 컬럼에 적용하는 단계; (c) 세척액을 상기 컬럼에 제공하여 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 물질을 컬럼으로부터 용리시켜 용리액을 얻는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 얻어진 용리액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 물질을 정제하는 단계를 포함하는, 갈색거저리 유충의 체액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 패턴 인식 단백질 분획을 분리하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 방법에 의해 분리된 펩티도글리칸-인식 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 방법에 의해 분리된 펩티도글리칸-인식 단백질을 포함하는 펩티도글리칸 검출용 키트가 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 갈색거저리 유충의 체액으로부터 펩티도도글리칸-인식 단백질을 분리하는 방법에 있어서, 합성 펩티도글리칸은 하기 화학식 1 내지 4의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되며, 화학식 3의 화합물이 더욱 바람직하다:

화학식 1

화학식 2

화학식 3

화학식 4

식 중, Pr은 프로필을 의미한다.

상기 합성 펩티도글리칸은 그람양성균의 천연 펩티도글리칸과 그 구조가 유사하다. 이러한 합성 펩티도글리칸은 천연의 펩티도글리칸과 함께 펩티도글리칸-인식 단백질에 경쟁적으로 결합한다. 즉, 합성 펩티도글리칸은 펩티도글리칸-인식 단백질에 결합할 수는 있으나, PO를 활성화시키는 그 하위 단계를 활성화시키지 못하므로, 합성 펩티도글리칸은 천연의 펩티도글리칸에 대해 경쟁적인 억제자로서 작용한다.

본 발명에 따른 펩티도글리칸-인식 단백질의 분리 방법은 상기 화학식 1 내지 4의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 합성 펩티도글리칸이 결 합된 수지로 컬럼을 충진하여 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계를 포함한다. 상기 수지 화합물의 예로는 세파로즈 수지, 세파덱스 수지 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세파로즈 수지를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 펩티도글리칸-인식 단백질의 분리 방법은 갈색거저리 유충의 체액을 상기에서 준비된 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계를 포함한다. 상기 단계를 수행하면, 갈색거저리 유충의 체액중의 펩티도글리칸-인식 단백질은 컬럼내의 합성 펩티도글리칸에 결합되게 된다.

본 발명에 따른 펩티도글리칸-인식 단백질의 분리 방법은 이동상 용매를 컬럼에 제공하여 펩티도글리칸-인식 단백질을 컬럼으로부터 용리시켜 용리액을 얻는 단계를 포함한다. 이때 펩티도글리칸-인식 단백질을 분리하기 위한 이동상 용액으로는 EDTA 및 NaCl을 포함하는 Tris-HCl 용액 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 1M NaCl 및 3mM EDTA를 포함하는 50mM Tris-HCl 용액(pH 7.5)을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 펩티도글리칸-인식 단백질의 분리 방법은 상기에서 얻어진 용리액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 컬럼으로부터 배출된 용리액을 SDS-PAGE 등을 이용하여 단백질 구성을 분석하고, 그 결과 펩티도글리칸-인식 단백질이 포함되어 있는 것으로 판단되는 분획을 정제한다.

본 발명에 있어서, 펩티도글리칸-인식 단백질을 정제하기 위해 당업계에 공지된 다양한 정제 방법, 예를 들어 크기-배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 이온 농도 구배 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 이용할 수 있다. 더욱 효율적인 단백질의 분리를 위해 정제 단계 이전에 상기 용리액을 농축하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 펩티도글리칸-인식 단백질의 정제 단계는 상기 용리액의 크기-배제(size-exclusion) 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계; 이온 농도 구배 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 포함한다. 이때, 상기 크기-배제 컬럼의 예로는 토요펄 Hw55S 컬럼 등이, 상기 이온 농도 구배 컬럼의 예로는 하이드록시애퍼타이트 컬럼 등이, 상기 이온 교환 컬럼은 모노-Q FPLC 컬럼 등이 있다.

본 발명은 또한, 갈색거저리 유충의 체액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 패턴 인식 단백질 분획을 분리하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 (a) 상기 화학식 1 내지 4의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 합성 펩티도글리칸이 결합된 수지로 컬럼을 충진하여 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계; (b) 갈색거저리 유충의 체액을 단계 (a)에서 얻어진 컬럼에 적용하는 단계; (c) 세척액을 상기 컬럼에 제공하여 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 물질을 컬럼으로부터 용리시켜 용리액을 얻는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 얻어진 용리액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 패턴 인식 단백질 분획을 분리하는 단계를 포함한다.

상기 단계 (a), (b) 및 (d)는 상기 펩티도글리칸-인식 단백질의 분리방법의 각 단계와 유사하게 수행될 수 있다. 한편, 상기 단계 (c)에서 사용되는 세척액으로는 EDTA를 포함하는 Tris 완충액(pH6.0) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 3mM EDTA이 포함된 50mM Tris 완충액(pH 6.0)을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 펩티도글리칸-인식 단백질의 분리방법에 의해 분리된 펩티도글리칸-인식 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 일구체예에서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명은 또한 상기 펩티도글리칸-인식 단백질의 분리방법에 의해 분리된 펩티도글리칸-인식 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 일구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는다.

본 발명은 또한 갈색거저리 유충의 체액으로부터 유래하는 펩티도글리칸-인식 단백질을 이용하여 시료내 펩티도글리칸 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료내 펩티도글리칸은 박테리아의 세포벽으로부터 유래한 것일 수 있다. 따라서, 상기 키트를 사용하게 되면 보다 신속하게 편리하게 시료중의 박테리아의 존재를 확인할 수 있게 된다. 본 발명의 다른 일구체예에서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 갈색 거저리의 유충의 체액 채취

갈색 거저리의 유충을 서울대공원 곤충 사육실에서 분양받아 직접 사육하였다. 25℃ 정도의 실내 온도에서 밀기울과 배추를 사료로 사육하여 크기가 약 2 cm를 넘는 유충을 실험에 사용하였다.

유충 (평균무게, 0.1 g/마리)을 얼음 위에서 저온 마취시킨 다음, 25 G 주사 바늘이 연결된 5 ㎖ 멸균 주사기에 탈응집 완충액(NaCl 15 mM, 트리소듐 시트레이트 83 mM, 시트르산 26 mM 및 EDTA 20 mM; pH 5.0)을 채웠다.

그런 다음, 멸균된 에펜도르프 튜브에도 탈응집 완충액 1.4 ㎖을 채운 뒤, 유충의 앞머리 첫째 마디를 찔러 표면 쪽으로 유출되는 체액을 튜브속에 담그는 방식으로 하나의 튜브당 15마리의 유충의 체액을 모았다.

실시예 2: 천연 PGN 또는 β-1,3-글루칸의 준비

S. aureus PGN 및 M.lnteus PGN은 Fluka사로부터, β-1,3-글루칸(커드란)은 와코 퓨어 케미칼(Wako Pure Chemicals, 일본)으로부터 구입하였다.

S. aureus PGN 및 M.luteus PGN을 초음파 파쇄하여 얻어진 수용성 PGN은 20 mM Tris (pH 8.0)을 사용해 10％의 PGN 용액으로 제조하여 사용하였고 반응액에는 최종농도 1㎍이 되게 사용하였다.

실시예 3: 합성 PGN의 제조

(1) 알릴 6- O -벤질-4-(3- O -벤질-4,6- O -벤질이덴-2-데옥시-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카보닐아미노)-β-D-글루코시라노실)-3- O -(( R )-1-(에톡시카보닐)에틸)-2-데옥시-글로코피라노시드 (4)의 제조

-15℃에서 무수 이염화메탄중에 N-Troc-글루코사미닐 트리클로로아네시이미데이트 공여체(2)(26.0g, 38mmol) 및 N-무라밀 수용체(3)(17.0g, 30mmol) 및 MS4A의 혼합물에 TMSOTf(340㎕, 3.0mmol)을 첨가하였다.

표 1

동일한 온도에서 10분 동안 교반한 후에, 반응을 냉각된 NaHCO₃ 포화 수용액(30mL)으로 c칭하고, 그 혼합물은 CHCl₃(250mL)로 추출하였다. 유기층을 NaHCO₃(60mL) 및 브린(60mL)으로 세척하고, Na₂SO₄하에서 건조시키고, 진공하에서 농축하였다. 잔사를 실리카-겔 크로마토그래피(600g, 톨루엔-EtOAc=10:1)로 정제하여 담황색 고체로서 표제 화합물(29.0mg, 88％)을 제조하였다.

ESI-TOF-MS (positive) m/z 1119.2 [M + Na]⁺;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 7.45-7.29 (15H, m, (C ₆ H ₅ )-CH₂-), 5.85-5.78 (1H, m, -CH₂-CH=CH₂), 5.57 (1H, s, Ph-CH=), 5.28-5.13 (3H, m, H-1, -CH₂- CH=CH ₂), 4.89-4.59 (10H, m, CCl₃-CH₂-OCO-, CH₃-CH₂-OCO-, Ph-CH ₂-), 4.43-4.39 (1H, m, H-6'), 4.26-4.04 (5H, m, Lac-αH, Ph-CH ₂-, H-1'. -CH ₂-CH=CH₂), 3.98-3,93 (2H, m, -CH₂-CH=CH ₂, H-3), 3.77-3.56 (6H, m, H-2, H-4, H-4', H-6, H-6'), 3.43-3.41 (2H, m, H-2', H-5), 3.25-3.21 (2H, m, H-3, H-5'), 1.34-1.25 (6H, m, Lac-CH ₃, CH ₃-CH₂-OCO). Found: C, 51.42; H, 4.90; N, 2.60. Calcd for C₄₇H₅₄Cl₆N₂O₁₅: C, 51.33; H, 4,95; N, 2.55％.

(2) 디사카라이드 1- O -트리클로로아세토이미데이트 (12) 제조

무수 THF(6mL)중에 화합물 4(3.0g, 2.7mmol)의 가스를 제거한 용액에 H₂로 활성화된 [Ir(cod)(MePh₂P)₂]PF₆(23mg, 0.027mmol)를 첨가하였다. 질소대기 하에서, 실온에서 1시간 동안 교반한 후, H₂로 활성화된 무수 THF(3mL)중의 [Ir(cod)(MePh₂P)₂]PF₆(23mg, 0.027mmol)를 첨가하였다. 질소대기 하에서, 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 요오드(690mg, 2.7mmol) 및 물(10mL)을 첨가하고, 그 반응 혼합물을 다시 10분 동안 교반하였다. 그 반응 혼합물에 Na₂SO₃(5％, 100mL) 수용액을 급히 첨가하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 EtOAc(50mL)로 추출하였다. 그 유기층을 수성 Na₂S₂O₂(5％, 50mLx2), NaHCO₃(100mLx2) 포화 수용액, 브린(50mL)으로 세척하고, Na₂SO₄하에서 건조시키고, 진공하에서 농축하였다. 잔사를 실리카-겔 크로 마토그래피(180g, 톨루엔-EtOAc=4:1)로 정제하여 담황색 고체로서 표제 화합물(2.72mg, 93％)을 제조하였다.

[α]_D ²³ = +8.4 (c 1.00, CHCl₃);

ESI-MS (positive) m/z = 1079.0[M + Na]⁺; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ= 7.54.7.27 (m, 15H, (C ₆ H ₅ )-CH₂-), 5.60 (br.s, 1H, H-1), 5.57 (s, 1H, Ph-CH=), 4.89-4.60 (m, 8H, CCl₃-CH ₂-OCO-, CH₃-CH ₂-OCO-, Ph-CH ₂-), 4.43-4.39 (m, 1H, H-6"'), 4.31-3.91 (m, 4H, Ph-CH₂-, H-1', Lac-αH), 3.95-3.91 (m, 1H, H-3), 3.82-3.63 (m, 6H, H-2, H-4, H-6, H-4', H-6'), 3.43-3.41 (m, 2H, H-2', H-5), 3.22-3.21 (m, 2H, H-3', H-5'), 1.35.1.27 (m, 6H, Lac-Me, CH ₃-CH₂-OCO). Found: C, 51.68; H, 5.33; N, 2.35. Calcd for C₄₄H₅₀C₁₆N₂O₁₅: C, 51.24; H, 5.12; N, 2.54％.

(3) 4'- O -다사카라이드 (13) 제조

0℃에서, 무수 CH₃CN(13mL)중에 화합물 4(1.5g, 1.36mmol)의 트리에틸아멘-보란(150mg, 2.05mmol) 용액에 보란 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트(960mg, 6.80mmol)를 적가로 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 30분동안 교반하였다. 그런 다음, 얼음 및 NaHCO₃(100mL) 포화 수용액으로 c칭하고, 그 혼합물을 EtOAc(100mLx2)로 추출하였다. 그 유기층을 10％ 시트르산 수용액(15mLx4), NaHCO₃(150mL) 포화 수용액 및 브린(100mL)으로 세척하고, Na₂SO₄하에서 건조시키고, 진공하에서 농축하였다. 잔사를 실리카-겔 크로마토그래피(180g, 톨루엔-AcOEt=4:1)로 정제하여 무색 고체로서 표제 화합물(1.13g, 73％)을 제조하였다.

[α]_D ²³ = +25.6 (c 1.00, CHCl3); ESI-TOF-MS (positive) m/z = 1121.6 [M + Na]⁺; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ= 7.43-7.27 (15H,m,(C ₆ H ₅ )-CH₂-), 5.85-5.79 (1H, m, -CH₂-CH=CH₂), 5.26-5.13 (3H, m, -CH₂-CH=CH ₂, H-1), 4.86-4.50 (9H, m, CCl₃-CH ₂-OCO-, CH₃-CH ₂-OCO-, Ph-CH ₂-), 4.33-4.04 (5H, m, Ph-CH ₂-, Lac-αH, H-1', -CH ₂-CH=CH₂), 3.97-3.57 (10H, m, -CH ₂-CH=CH₂, H-3, H-4, H-6, H-3', H-4', H-6'), 3.46-3.36 (2H, m, H-2', H-5), 3.27-3.23 (1H, m, H-5'), 1.29-1,20 (6H, m, Lac-CH ₃, CH ₃-CH₂-OCO). Found: C, 51.68; H, 5.33; N, 2.35. Calcd for C₄₇H₅₆Cl₆N₂O₁₅: C, 51.24; H, 5.12; N, 2.54％.

(4) 완전히 보호된 테트라사카리아드 (14) 제조

-15℃에서, 무수 이염화메탄(75mL)중에 화합물 12(2.7g, 38mmol), 화합물 13(1.65g, 30mmol), 및 MS4A의 혼합물에 TMSOTf(18㎕, 0.15mmol)를 첨가하였다. 동일한 온도에서 10분 동안 교반한 후에, 반응을 얼음으로 냉각시킨 NaHCO₃ 포화 수용액(100mL)으로 c칭하고, 그 혼합물을 CHCl₃(100mL)로 추출하였다. 유기층을 NaHCO₃(60mLx2) 및 브린(60mL)으로 세척하고, Na₂SO₄하에서 건조시키고, 진공하에서 농축하였다. 잔사를 실리카-겔 크로마토그래피(300g, 톨루엔-EtOAc=10:1)로 정제하여 담황색 고체로서 표제 화합물(2.33g, 79％)을 제조하였다.

[α]_D ²³ = -1.7 (c 1.00, CHCl₃); ESI-TOF-MS (positive) m/z = 2159.0 [M + Na]⁺; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 7.51-7.27 (30H, m, (C ₆ H ₅ )-CH₂-), 5.86-5.76 (1H, m, -CH₂-CH=CH₂), 5.56 (1H, s, Ph-CH=), 5.25-4.98 (4H, m, -CH₂ -CH=CH₂, Ph-CH ₂-, H-1), 4.88-4.33 (17H, m, CCl₃-CH ₂-OCO-, CH₃-CH ₂-OCO-, Ph-CH ₂-), 4.32-3.90 (12H, m, Ph-CH ₂-, Lac-αH, H-1", H-1", H-1"', H-6"', -CH ₂-CH=CH₂), 3.87-3.01 (24H, m, Ph-CH2-, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-2', H-3', H-4', H-5', H-6', H-2", H-3", H-4", H-5", H-6", H-2"', H-3"', H-4"', H-5"', H-6"'), 1.32-1,27 (12H, m, Lac-CH ₃,CH ₃-CH₂-OCO).

(5) 2-N-아세틸-테트라사카라이드 (21)의 제조

AcOH중의 화합물 14(1.05g, 0.46mmol)의 용액에 Zn-Cu(1g의 Zn으로부터 제조됨)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용해되지 않은 물질을 여과에 의해 제거하고, 그 여과액을 진공에서 농축하였다. 그 잔사 용매를 톨루엔(5mLx3)으로 공증발(coevaporation)시킴으로써 제거하였다. 조질 생성물을 피리딘(7mL) 및 아세트산 무수물(7mL)에 녹이고, 실온에서 30분동안 교반하였다. 그 런 다음, 진공에서 농축시킴으로써 용액을 제거하였다. 잔사 용매를 톨루엔(5mLx3)으로 공증발시킴으로써 제거하였다. 잔사를 실리카-겔 크로마토그래피(80g, CH₃Cl:아세톤=3:1)로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물(750mg, quant.)을 제조하였다.

[α]_D ²³ = -7.4(c 1.00, CH₃Cl); ESI-TOF-MS(positive) m/z=1609.2[M+H⁺], 1631.6[M+Na]⁺.

(6) 유리된 카복실산을 갖는 테트라사카라이드 (23)의 제조

디옥산-THF-H₂O(2:4:1, 1.2mL)중의 화합물 21(180mg, 0.11mmol)의 용액에 LiOH(28mg, 0.66mmol)을 첨가하고 1시간동안 실온에서 교반하였다. 그 용액을 다우엑스 H⁺(Dowex 50W-x8 200-400 메쉬 H 형태, 다우케미칼)로 중화하고 나서, HP-20 컬럼(2cm x 40cm)에 적용하였다. 유기 및 무기 염을 H₂O(300mL)로 용리하여 제거하고 난 후, 메탄올로 용리하여 백색 고체로서 상기 표제 화합물(170mg, quant.)을 제조하였다.

ESI-TOF-MS(positive) m/z=1575.1[M+Na]⁺.

(7) 보호된 테트라사카라이드 디펩티드 (25)의 제조

0℃에서, 이염화메탄(14mL)중의 화합물 23(122mg, 0.078mmol) 및 HOBt(33.5mg, 0.25mmol)의 용액에 WSCI·HCl(37mg, 0.25mmol) 및 트리에틸아민(48㎕, 0.47mmol)을 첨가하고 밤새도록 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 AcOEt로 희석하고 녹지 않은 물질을 여과하여 제거하였다. 여과액을 농축하고, 그 잔사를 CHCl₃에 녹였다. 상기 CHCl₃ 용액을 시트르산(1M, 20mL), H2O(20mL), 포화 수성 NaHCO₃(20mL) 및 브린(20mL)로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 진공하에서 농축하였다. 잔사를 실리카-겔 크로마토그래피(20g, CHCl₃-메탄올=20:1)로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물(143mg, 86％)을 제조하였다.

ESI-TOF-MS (positive) m/z =2153.52[M + Na]⁺; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ =7.52-7.15 (40H, m), 5.58 (1H, m), 5.57 (1H, s), 5.56-5.07 (6H, m), 4.86 (1H, d, J =12.3 Hz), 4.83 (1H, d, J =3.7Hz), 4.74(1H.dd, J =12.1 Hz), 4.66-4.57 (4H, m), 4.35-4.24 (8H, m), 4.09-3.92 (6H, m), 3.83-3.59 (12H, m), 3.53-3.43 (10H, m), 3.39-3.35 (1H, m), 3.34-3.20 (1H, m), 2.56-2.41 (4H, m), 2.17-2.03 (7H, m), 1.93 (3H, s), 1.88 (3H, s), 1.73 (3H, s), 1.57-1.53 (3H, m), 1.43 (1H, d, J =6.9 Hz), 1.37-1.33 (3H, m), 1.26 (1H, m). Found: C, 62.03; H, 6.63; N, 6.38. Calcd for C₁₁₃H₁₃₈N₁₀O₃₁·3H₂0: C, 62.08; H, 6.64; N, 6.41％.

(8) 테트라펩티드 (27)의 제조

상기 표제 화합물은 화합물 25의 제조방법과 유사하게 제조되었다.

ESI-TOF-MS(positive) m/z=1400.53[(M+2H)²⁺].

(9) 테트라사카라이드 디펩티드 (32, 화학식 1의 화합물)의 제조

무수 THF(6mL)중의 화합물 25(300mg, 0.071mmol)의 가스를 제거한 용액에 무 수 THF(3mL)중의 H₂로 활성화된 [Ir(cod)(MePh₂P)₂]PF₆(23mg, 0.027mmol)를 첨가하였다. 질소대기 하에서, 실온에서 1시간 동안 교반한 후, H₂로 활성화된 무수 THF(3mL)중의 [Ir(cod)(MePh₂P)₂]PF₆(23mg, 0.027mmol)를 첨가하였다. 질소대기 하에서, 실온에서 1시간 동안 교반하고, 요오드(35mg, 0.142mmol) 및 물(0.5mL)을 첨가하고, 그 반응 혼합물을 다시 10분 동안 교반하였다. 그 반응 혼합물에 수성 Na₂SO₃(5％, 100mL)을 첨가하여 c칭하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 EtOAc(50mL)로 추출하였다. 그 유기층을 수성 Na₂S₂O₂(5％, 10mLx2), NaHCO₃ 포화 수용액(100mLx2) 및 브린(50mL)으로 세척하고, Na₂SO₄하에서 건조시키고, 진공하에서 농축하였다. 잔사를 실리카-겔 크로마토그래피(20g, 톨루엔-EtOAc=5:1)로 정제하여 담황색 고체로서 1-유리된 테트라사카라이드 화합물(260mg, 88％)을 제조하였다. ESI-TOF-MS(positive) m/z=2113.6[M+Na]⁺.

아세트산(3mL)중의 상기 1-유리된 테트라사카라이드 화합물(86mg, 0.04mmol)의 용액에 아세트산 중의 탄소상의 팔라듐 수산화물(100mg)을 첨가하고, 그 반응 혼합물을 하루동안 H₂(20atm)하에서 교반하였다. Pd 촉매를 여과에 의해 제거하고 그 여과액을 농축하고, H₂O로부터 동결건조하여 백색 고체로서 상기 표제 화합물(39mg, 70％)을 수득하였다.

ESI-TOF-MS (positive) m/z = 685.3 [M-2H]^2-; HRMS-ESI FT-ICR(negative): (M) calcd for C₅₄H₈₈N₁₀O₃₁, 1372.561; found, 1372.555; ¹H NMR ((600 MHz, D₂O): d = 5.16-5.15 (d, J = 3.0 Hz, 1H, H-1), 4.46-4.42 (m, 3H), 4.36-4.32 (m, 2H), 4.30-4.27 (m, 2H, iGln--CH), 4.26-4.19 (m, 2H), 3.86-3.30 (m, 24H), 2.31 (m, 4H, iGln-γ-CH ₂), 2.12-2.03 (m, 4H, iGln-β-CH ₂), 1.96-1.95 (s, 12H, NHC(O)CH ₃ X 4), 1.37-1.35 (m, 6H, Ala-β-CH ₃), 1.31-1.28 (m, 6H, Lac-β-CH ₃).

(10) 테트라사카라이드 트리펩티드 (33, 화학식 2의 화합물)의 제조

아세트산(3mL)중의 화합물 27(95mg, 0.036mmol)의 용액에 아세트산중의 팔라듐 수산화물(100mg)를 첨가하고, H₂(20atm) 하에서, 하루동안 교반하였다. TLC 분석으로 반응을 모니터하였고, 수소화분해는 탈보호화가 끝날때까지 계속되었다. 세라이트에 의해 Pd 촉매를 여과하여 제거하고, 그 여과액을 농축하였다. 그 잔사를 아세토니트릴-H₂O로부터 동결건조하여 백색 분말로서 상기 표제 화합물(39mg, 50％)을 수득하였다.

ESI-TOF-MS (negative) m/z = 834.5 [M-2H]^2-; HRMS-ESI FT-ICR (negative): (M) calcd for C₆₉H₁₁₈N₁₄O₃₃, 1670.798; found, 1670.817; ¹H NMR (500 MHz, D₂O): δ= 4.86-4.80 (m, 1H, H-1) 4.46-4.40 (m, 3H), 4.36-4.05 (m, 8H, Lac-α-CH, Ala-α-CH, iGln-α-CH, Lys-α-CH), 3.86-3.30 (m, 26H), 3.00-2.90 (t, J = 11.4, 4H, Lys-ε-CH ₂), 2.37-2.31 (t, J = 9.5, 4H, iGln-γ-CH ₂), 2.09-2.0 (m, 4H, iGln-β-CH ₂), 2.02-1.81 (m, 18H, NHC(O)CH ₃ X 4, Lys-β-CH X 2, Lys-δ-CH X 2), 1.78-1.69 (m, 2H, Lys-δ-CH X 2), 1.58-1.70 (m, 4H, Lys-γ-CH ₂ X 2), 1.61-1.4 (m, 2H, Propyl CH₃-CH ₂), 1.40-1.35 (m, 6H, Ala-β-CH ₃), 1.31-1.28 (m, 6H, Lac-β-CH ₃), 0.85-0.80 (t, J = 9.3, 3H, Propyl CH ₃).

(11) 테트라사카라이드 테트라펩티드 (35, 화학식 3의 화합물)의 제조

상기 표제 화합물은 화합물 27로부터 화합물 33의 제조방법과 유사하게 제조되었다.

ESI-TOF-MS (negative) m/z = 905.1 [M-2H]^2-; HRMS-ESI FT-ICR (negative): (M) calcd for C₇₅H₁₂₈N₁₆O₃₅, 1812.873; found, 1812.896; ¹H NMR (500 MHz, D₂O): δ= 4.86-4.80 (m, 1H, H-1), 4.46-4.40 (m, 3H), 4.36-3.95 (m, 10H, Lac-α-CH, Ala-α-CH, D-iGln-α-CH, Lys-α-CH), 3.86-3.30 (m, 26H), 3.00-2.90 (t, J = 7.5, 4H, Lys-ε-CH ₂), 2.40-2.31 (t, 4H, iGln-γ-CH ₂), 2.09-1.82 (m, 22H, iGln-β-CH ₂ X 2, NHC(O)CH ₃ X 4, Lys-β-CH ₂ X 2, Lys-δ-CH X 2), 1.78-1.4 (m, 8H, Lys-δ-CH X 2, Lys-γ-CH ₂ X 2, Propyl CH₃-CH ₂), 1.40-1.22 (m, 12H, Ala-β-CH ₃ X 4, Lac-β-CH ₃ X 2), 0.85-0.80 (m, 3H, Propyl CH ₃).

(12) 테트라사카라이드 펜타펩티드 (37, 화학식 4의 화합물)의 제조

상기 표제 화합물은 화합물 27로부터 화합물 33의 제조방법과 유사하게 제조 되었다.

ESI-TOF-MS (negative) m/z = 976.64 [M-2H]^2-;;HRMSESI FT-ICR (negative): (M) calcd for C₈₁H₁₃₈N₁₈O₃₇, 1954.947; found 1954.939; ¹H NMR(500 MHz, D₂O): δ= 4.86-4.80 (m, 1H, H-1), 4.46-4.40 (m, 3H), 4.36-4.0 (m, 12H, Lac-α-CH, Ala-α-CH, iGln-α-CH, Lys-α-CH), 3.86-3.30 (m, 26H), 2.95-2.91 (t, J = 7.5, 4H, Lys-ε-CH ₂), 2.40-2.31 (t, J = 7.0, 4H, iGln-γ-CH ₂), 2.09-1.82 (m, 22H, iGln-β-CH ₂ X 2, NHC(O)CH ₃ X 4, Lys-β-CH ₂ X 2, Lys-δ-CH X 2), 1.78-1.4 (m, 8H, Lys-δ-CH X 2, Lys-γ-CH ₂ X 2, Propyl CH₃-CH ₂), 1.40-1.22 (m, 12H, Ala-β-CH ₃ X 6, Lac-β-CH ₃ X 2), 0.85-0.80 (m, 3H, Propyl CH ₃).

실시예 4: 천연 또는 합성 PGN에 의한 PO 활성 유도 확인

본 실시예에서는 천연 또는 합성 PGB이 갈색 거저리 유충의 체액내의 PO를 활성화시키는 지 확인하였다.

PO 활성은, 기질로서 4-메틸카테콜과 4-하이드록시프롤린 에틸 에스테르 HCl를 사용하는 Pye의 분광 광도 측정법에 따라 분석되었다. 4-메틸카테콜은 PO에 의해 산화되어 퀴논 형태로 바뀌며, 이 퀴논은 비효소적 반응에 의해 4-하이드록시프롤린 에틸 에스테르 HCl와 반응하여 520 nm에서 최대의 흡광도를 가지는 안정한 화합물인 4-(4'-하이드록실-2'-카르베톡시-1'-피롤린)-5-메틸-o-벤조퀴논을 생성하였다(도 2 참조)

10％ β-1,3-글루칸 용액 10 ㎕(1㎍), 10％ S. aureus PGN 용액 10 ㎕(1㎍), 10％ M. luteus PGN 용액 10 ㎕(10ng), 10％ 합성 PGN(화학식 1 내지 4의 화합물 각각) 용액 10 ㎕(1㎍) 각각을 갈색 거저리 유충의 체액 30 ㎕ (단백질 350㎍)을 30℃에서 5분간 반응시켰다. 그런 다음, 4-메틸카테콜(250 mM) 4 ㎕, 4-하이드록시프롤린 에틸 에스테르 HCl(62.5mM) 16 ㎕을 가하고, 1M CaCl₂(10mM) 5 ㎕를 가한 후 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 500 ㎕가 되도록 가하여 30℃에서 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 3 참조).

그 결과, β-1,3-글루칸, S. aureus PGN, M.luteus PGN 용액은 갈색 거저리 유충의 체액과 반응하여 PGN 의존적인 pro-PO 캐스케이드 반응계를 활성화시켰으나, 상대적으로 단순한 구조의 합성 PGN은 PGN에 의존적인 pro-PO 캐스케이드 반응계를 활성화 시키지 못하는 것을 확인하였다 (도 3 참조).

한편, PO 활성 측정에 첨가한 S.aureus PGN이 1 ㎍ 존재시에 동일한 양인 1 ㎍의 합성 PGN을 첨가한 조건에서 PO 활성을 측정한 결과, 합성 PGN들 사이에 정도의 차이가 있으나 PGN을 특이적으로 인식하여 활성화되어 나타나는 PO 활성에 대해 저해작용을 나타내었다(도 4 참조). 특히, N-아세틸무람산에 4개의 아미노산이 연결된 구조인 화학식 3의 화합물이 가장 강하게 천연 PGN에 의존적인 PO 활성을 경쟁적으로 저해함을 보였다. 즉, 갈색거저리 유충의 체액에 존재하는 PGN-인식 단백질은 화학식 3의 합성 PGN에 최적의 인식반응을 할 수 있는 것으로 판단되었다.

한편, S.aureus PGN이 1 ㎍ 존재시, 화학식 3의 합성 PGN을 0.2, 0.4, 0.8 및 1.5 ㎍을 각각 첨가한 경우의 천연 PGN에 대한 의존적인 PO 활성을 측정한 결과, 합성 PGN의 양의 증가에 따라 천연 PGN에 대한 PO 활성이 농도의존적인 양상으로 저해되는 것을 확인하였다(도 5 참조).

실시예 5: 천연 또는 합성 PGN에 의한 아미다제 활성 유도 확인

그람 양성균인 10％의 S.aureus PGN 용액(최종 농도: 1㎍) 및 10％의 화학식 3의 합성 PGN 용액을 각각 10㎕를 첨가하였다. 40 μM의 트립신 MCA(t-butyloxycarbonyl-benzyl-L-phenylalanyl-L-seryl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide; Boc-Phe-Ser-Arg-MCA)을 기질로 하여, 30℃에서 반응시킨 후, 각각 380nm(여기 파장) 및 460 nm(방사 파장)에서 형광분광광도계(UV-160A 모델, Shimatsu사)를 사용하여 형광광도를 측정하였다.

그 결과, 아미다제 활성에 대해서도 PO 활성의 측정결과와 동일한 양상의 결과를 보였다(도 6 참조). 이 결과로부터 합성 PGN는 PGN 인식 반응에만 제한적으로 관여한다는 점을 확인하였다.

실시예 6: 갈색 거저리의 PGN 인식 단백질의 정제

(1) 합성 PGN가 연결된 컬럼의 제조

먼저, CNBr 세파로즈 4B 수지를 1mM HCl로 활성화시켰다. 그런 다음, 결합 완충액(0.1 M NaHCO₃, 0.5 M NaCl) (pH 8.3)에 녹인 화학식 3의 합성 PGN 20mg을 CNBr 세파로즈 4B 수지에 가하여 실온에서 1시간 반응 후 블로킹 완충액(0.1 M Tris 용액, pH 8.0)으로 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 0.1 M 아세테이트 완충 액(pH 4.0, 0.5 M NaCl 포함)와 0.1 M Tris-HCl 완충액(pH 8.0, 0.5 M NaCl이 포함)로 각각 3회 세척하여 PGN이 결합된 세파로즈 4B 수지를 제조하였다.

합성 PGN이 CNBr 세파로즈 수지에 결합되었는지 확인하기 위해 합성 PGN이 녹아있는 결합 완충액과 반응 후의 용액을 218 nm에서 흡광도를 측정해 비교한 결과, 결합 전과 후의 흡광도 감소율을 계산하면 89％의 수율로써 결합 반응이 유도되었고 32㎖의 PGN이 결합된 컬럼이 제조되었다.

한편, 대조군 컬럼은 합성 PGN을 첨가하지 않은 조건을 제외하고는 상기와 동일한 방법을 수행하여 제조하였다.

(2) 20 kDa의 PGN-인식 단백질의 분리 정제

가. 합성 PGN 결합 컬럼으로부터 정제

탈응집 완충액(pH 5.0)의 조건에서 채취된 갈색 거저리 유충의 체액 160 ㎖에, 최종농도가 2mM이 되게 0.5 M DFP 용액을 첨가하여, 4℃ 조건에 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 상기 체액을 3 mM EDTA가 포함된 50 mM Tris 완충액(pH 6.0) 5℃에서 12시간 투석을 하였다.

개방 컬럼(ψ3 cm x 25 cm)에 PGN 결합 세파로즈 수지 약 30 ㎖을 충진한 후, 상기에서 투석을 한 갈색 거저리 유충의 체액 약 160 ㎖을 분당 0.6 ㎖의 유속으로 로딩하였다.

280 nm 흡광도에서 단백질이 검출되지 않을 때까지 3 mM EDTA이 포함된 50 mM Tris 완충액(pH 6.0)으로 분당 0.6 ㎖의 유속으로 세척 후, 3 mM EDTA와 1 M NaCl이 포함된 50 mM Tris 완충액(pH 6.0)을 사용하여 분당 0.4 ㎖의 유속으로 컬 럼에 결합된 단백질을 용출하였다. 그리고 분리된 용액내의 단백질 농도는 280nm 흡광도를 측정하였고 SDS-PAGE를 통해 용출된 단백질의 순도 및 양을 확인하였다.

상기 방법을 수행하여 패스-쓰루 용액과 1M NaCl 용출액을 얻었고 10,000 컷 멤브레인이 장착된 한외 여과 키트(ultrafiltration kit, Amicon사)를 사용하여 용액을 농축하였다.

그런 다음, 체액을 투석하기 이전(도 7의 레인 1) 및 이후의 체액(도 7의 레인 2), 상기 컬럼으로부터 수득된 패스-쓰루 용액(도 7의 레인 3) 및 1M NaCl 용출액(도 7의 레인 4), 및 대조군 컬럼의 1M NaCl 용출액(도 7의 레인 5)을 가지고 SDS-PAGE를 수행하였다. 젤에는 약 25㎍의 단백질이 로딩되었다.

그 결과, 대조군 컬럼과 PGN-결합 컬럼의 1M NaCl이 포함된 완충액으로 용출된 단백질들에 대한 패턴을 비교, 분석한 결과, 대조군 컬럼에서 보이지 않던 약 20 kDa의 단백질이 SDS-PAGE 수행한 결과에서 PGN-coupled column의 용출액에서만 특이적으로 존재하는 것을 확인하였다 (도 7 참조).

나. 토요펄(Toyopearl) HW55S FPLC 컬럼으로부터 정제

상기 가.에서 수득된 1M NaCl 용출액을 10,000 컷인 멤브레인을 사용하는 한외 여과 키트(Amicon사)를 사용해 농축한 시료를 준비하였다.

Toyopearl HW55S 수지를 ψ1.0 cm x 30 cm FPLC 컬럼에 충진하였고 3 mM EDTA와 0.15 M NaCl이 포함된 50 mM Tris 용액(pH 6.0)으로 분당 0.2 ㎖ 유속으로 평형화시켰다.

상기 농축 시료를 컬럼에 로딩하여 용출을 한 후, 각 피크 별로 분획하였고 전체 분획물을 프로파일의 패턴별로 회수한 후, SDS-PAGE를 수행하여 단백질 밴드의 패턴을 확인하였다.

그 결과, 전단계의 분획물보다 Tm-PGRP 이외의 단백질이 약 80％ 제거된 보다 정제된 갈색거저리 유충의 PGN-인식 단백질을 포함하는 분획임을 확인하였다. 또한 로딩후 약 55분에서부터 갈색거저리 유충의 PGN-인식 단백질이 용출되는 것을 확인하였다(도 9 참조). 따라서 본 실험에서 얻어진 보다 정제된 갈색거저리 유충의 PGN-인식 단백질을 함유한 분획물을 다음의 실험 단계에 사용하였다.

다. 하이드록시에퍼타이트 컬럼의 수행

토요펄 HW55S 컬럼을 수행하여 얻어진 단백질 용출액을, 인산기의 이온 강도에 따라 분리되는 하이드록시에퍼타이트 수지를 ψ0.5cm x 10cm FPLC 컬럼에 충진하였고 A buffer은 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5)를 사용하였고 B buffer은 300 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5)를 사용하였다. 유속은 분당 0.4 ㎖로 120분에 인산의 농도를 75 mM까지 증가시키는 gradient를 이용하여 PGN에 의존적인 PO활성을 나타내는 분획을 모아 다음의 정제과정을 수행하였다.

Toyopearl HW55S 컬럼에서 얻어진 분획물을 하이드록시에퍼타이트 컬럼을 수행한 결과의 도 10에서와 같이 나타났다.

전체 분획물을 elution profile의 pattern별로 분리, 회수 한 후 SDS-PAGE를 수행하여 단백질의 pattern을 확인한 결과, 약 24 mM phosphate 이온의 강도에서부터 Tm-PGRP가 용출되는 것을 알 수 있었다. 그리고 하이드록시에퍼타이트 컬럼을 수행함으로써 Tm-PGRP 단백질을 제외한 약 54％의 다른 단백질이 제거된 보다 정제 된 Tm-PGRP의 분획물을 얻을 수 있었고 다음의 정제과정을 수행하였다.

라. Mono-Q FPLC column 수행

음이온 교환 수지인 Mono-Q 수지의 성질을 이용하여 하이드록시에퍼타이트 컬럼에서 분리된 단백질들로부터 PGN-인식 단백질만을 순수하게 분리, 정제하기 위하여 수행하였다. 50 mM Tris (pH 6.5)를 A buffer로 하고 이것의 A buffer에 1 M NaCl 함유된 조건을 B buffer로 하여 이들의 농도 경사를 이용하여 분리하였다. B buffer의 함량을 최초 5 분까지 0％, 35 분까지 30％, 80 분까지 100％로 상승시켰다. 용출된 단백질은 280 nm에서의 UV 흡광도를 측정하여 검량하였다. SDS-PAGE를 수행하여 정제된 단백질에 대한 순도를 확인 및 정량을 하였다.

하이드록시에퍼타이트 컬럼을 수행하여 얻어진 분획물을 Mono-Q FPLC 컬럼을 수행하여 얻어진 elution profile은 도 11과 같다. 전체 분획물을 elution profile의 pattern별로 분리 회수한 후, SDS-PAGE를 수행하여 단백질의 pattern을 분석한 결과, 정제된 Tm-PGRP가 약 120 mM의 NaCl의 이온 강도에서부터 용출이 되어짐을 확인하였다.

실시예 7: 20 kDa의 PGN 인식 단백질의 N 말단 및 부분 아미노산 서열 결정

상기 실시예 6에서 순수하게 분리 정제된 단백질의 N-말단을 결정하기 위해 12％ SDS-PAGE를 실시한 후 PVDF 멤브레인에 전이시키기 위해 전이 완충액(CAPS 10 mM, 메탄올 10％) 내에서 300 mA의 일정한 전류로 1 시간동안 전기영동을 수행하였다.

젤의 단백질이 전이된 멤브레인은 CBB 염색 용액 (0.1％ CBB R-250, 50％ 메 탄올)으로 염색하고, 탈색 용액(50％ 메탄올, 10％ 아세트산)으로 탈색시킨 후 물로 수회 세척하여 감압 건조시켰다. 단백질이 전이된 멤브레인에서 대상이 되는 단백질 밴드만 잘라서 자동 아미노산 분석기(sequencer)에 주입하여 기체-상 방법으로 PVDF 멤브레인 상에서 아미노산 서열을 결정하였다.

부분 아미노산 서열의 결정은 정제된 단백질 25 ㎍을 45mM DTT에 의한 환원 및 100 mM 요오도아세토아마이드(iodoacetamide) 용액에 의한 알킬화한 후, 라이실-엔도펩티다제(lysyl-endopeptidase)를 첨가하여 37℃에서 12시간 반응을 하였으며, 절편된 펩티드를 HPLC C₁₈ 컬럼에 로딩하여 분리 정제하여 얻어진 순수한 펩티드를 자동아미노산 분석기를 이용해 아미노산 서열을 분석하였다.

그 결과, Electroelution을 수행하여 얻어진 정제된 20 kDa 단백질을 우선 PVDF 멤브레인에 블롯팅을 수행하여 에드만 분해(Edman degradation) 방법에 의해 N 말단의 아미노산 서열(서열번호 3, 도 8A 참조)와 3개의 부분적인 아미노산 서열(서열번호 4 내지 6, 도 8B 참조)을 분석하였다.

특히, 규명된 부분 아미노산 서열의 정보에서 20 kDa의 단백질이 다양한 생물에 존재하는 짧은 형태의 펩티도글리칸-인식 단백질(PGRP)과 높은 상동성을 가지는 단백질임을 NCBI blast 분석 결과에서 알 수 있었다.

실시예 8: 20 kDa의 PGN-인식 단백질의 cDNA 클로닝 및 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열 결정

본 실시예에서는 상기에서 수득된 20kDa의 PGN 인식 단백질의 부분 아미노산 서열을 정보로 하여 제작된 DNA probe를 이용한 방법을 통해 갈색 거저리의 cDNA 라이브러리에서 스크리닝하였다. 스크리닝은 1차 및 2차 스크리닝 모두 DNA 프로브를 제조하여 플라크에 혼성화시키는 방법으로 실시하였다.

(1) DNA 프로브의 합성

분리된 단백질을 라이실-엔도펩티다제로 처리하여 얻어진 부분 아미노산 서열 중 뉴클레오티드에 대한 mixture가 적은 조건과 Tm값이 적당한 범위인 55-65℃사이의 nucleotide 서열을 선택해 probe로 제작, 사용하였다.

DNA probe는 제노텍 회사가 제공하는 정제 방법에 따라 정제하였고 20 kDa의 PGN 인식 단백질의 cDNA cloning에 대해서는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 프로브를 사용하였다.

(2) 숙주 세포의 준비

LB/tetracycline plate에 XL-1-Blue stock 용액 5 ㎕를 도포하여 37℃에서 12 시간 배양한 후 생성된 single colony를 LB broth 5 ㎖, 20％ maltose 50 ㎕, 1 M MgSO₄ 50 ㎕의 혼합액에 접종하여 37℃에서 OD₆₀₀이 0.5-1이 될 때까지 진탕 배양한 다음, 500 xg에서 10 분간 원심 분리시켜 생성된 균 침전물에 10 mM MgSO₄을 가하여 OD₆₀₀이 0.5가 되도록 조정하였다.

(3) Replica의 제조

갈색거저리 유충의 증폭된 cDNA 라이브러리 용액으로부터, 플레이트 1 개당 5,000 플라크가 생성되도록 하여 12개의 플레이트로부터 리플리카를 취하였다. 5,000 플라크를 생성하는 cDNA 라이브러리 용액에 XL-1-Blue (OD₆₀₀=0.5) 200 ㎕를 가하여 37℃에서 15분간 진탕 배양한 후, 48℃로 예열된 3.5 ㎖의 top agar와 혼합하여 신속하게 수회 교반 후 신속히 NZY 플레이트에 도포시켰다. 37℃에서 13시간 배양한 후 리플리카를 취하였다.

반응의 종결을 위해 4℃에서 1시간 방치한 후 플레이트에 콜로니/플라크 스크린 멤브레인 (NEF-978)을 조심스럽게 덮고 주사침과 붉은 유성펜으로 표시를 한 다음 실온에서 5분간 방치하였다. 두 번째 멤브레인을 다시 플레이트에 조심스럽게 덮고 이번에는 검정 유성펜으로 표시를 하여 15분간 방치한 후 공기 중에서 1시간 이상 방치하여 완전히 건조시켰다. 알칼리 처리는 0.5 N NaOH로 2분간 처리하여 5분간 건조시켰고 중화는 1 M Tris/HCl (pH 7.5)로 처리한 다음 공기 중에 건조시켰다. 동일한 방법으로 알칼리, 중화처리를 다시 한번 처리하여 멤브레인이 완전히 건조되도록 실온에서 1 시간이상 방치하였다. 공기 중에 완전히 건조 시켜 스크리닝을 위한 세척조작을 시작하였다. Membrane을 washing buffer (3 X SSC /0.1％ SDS)으로 적신 후 SDS를 완전히 제거 위해 휴지로 힘껏 짰다.

(4) DNA 프로브의 kination

양성 클론의 스크리닝을 위한 DNA 프로브의 표지는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 증류수(milli-Q, autoclave) 21 ㎕, 10X kinase buffer 18 ㎕, DNA 프로브 9 ㎕ (600 pM), γ-³²P-dATP 90 ㎕ (약 0.9 mCi), T4 PNK(10unit/㎕) 12 ㎕ (40unit)를 볼텍싱한 후 스핀 다운시켰다.

그런 다음, 상기 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 방치한 후 70℃의 수욕 상에서 10분간 열처리하고 E. coli tRNA(20 ㎍/㎕) 10 ㎕을 가하여 세파로즈 G-50 컬럼으로 방사성 동위원소가 표지된 분획만 선택적으로 분취하였다.

(5) 예비 혼성화 반응

60℃로 예열시킨 예비 혼성화 반응 용액 30 ㎖을 비닐 백에 넣고 기포를 완전히 제거한 후 밀봉하고 60℃에서 5시간 방치하였다. 상기 예비 혼성화 용액은 20XSSC 용액을 22.5ml, 50 X denhart's 용액을 30ml, 5mg/ml ssssDNA을 1.5ml을 가한후 증류수를 가하여 전체 부피를 150 ml로 하여 제조되었다.

(6) 혼성화 반응

예비 혼성화 반응이 끝난 멤브레인을 비닐 백으로부터 취하여 γ- ³²P-ATP로 표지된 DNA 프로브 용액을 혼성화 용액을 30 ㎖에 1 ㎖당 5 ng 의 DNA량이 되도록 가한 후 비닐 백에 넣고 기포를 제거하고 밀봉한 후 Tm-5℃에서 항온조에서 하루 동안 혼성화시켰다. Tm값은 A와 T에 의한 결합을 2℃로, G와 C에 의한 4℃로 하여 DNA 프로브의 전 염기에 대하여 계산하는 방법인 Itakura's rule을 이용하여 Tm 값을 선정하였다.

상기 혼성화 용액은 20XSSC 용액을 30ml, 50Xdenhart's 용액을 30ml, 5mg/ml ssssDNA을 0.75ml을 가한후 증류수를 가하여 전체 부피를 150 ml로 하여 제조되었다.

혼성화 후 멤브레인을 비닐 백에 꺼내어 멤브레인을 30℃로 예열된 세척액(3 X SSC/0.1％ SDS)으로 멤브레인을 5분씩 3회 세척하고, 55℃에서 5분 동안 같은 세척액으로 1-2회 씻은 후 멤브레인에 남아있던 방사선 량은 필터당 400 cpm 정도를 유지한 상태에서 멤브레인은 왓트만사의 3MM 여지 위에 붙여 카세트에 장착하고 장착된 멤브레인 위에 X-선 필름을 고정하고 카세트를 -75℃에서, 약 12시간을 보관 뒤 실온으로 꺼내어 해동을 시킨 후 암실에서 X-선 필름을 꺼내어 현상 후 리플리카를 멤브레인에 표시한 부분과 X-선 필름에 정확히 일치시켜 표시를 한다.

(7) 양성 클론의 선택

2장의 멤브레인에 대한 autoradiography 표시 마크를 일치시켜 2장의 멤브레인에서 공통적으로 나타나는 positive signal을 선택하여 1차 양성 클론으로 판정하였다. 4℃에 보존중인 master plate에서 양성 플라크의 위치를 확인 후 될 수 있는 대로 하나의 플라크가 될 수 있도록 플라크를 선택하였다.

(8) 2차 스크리닝

1차 screening으로 선택된 양성 플라크를 LB 액체배지로 10 배씩 희석하여 3단계로 희석한 액 1 ㎕을 3 ㎕의 CHCl₃가 포함된 1 ㎖ SM 완충액에 넣은 후, NZY 플레이트 위에 도포하여 37℃에서 하루 밤을 방치시켰다. 각 플레이트당 100개 정도의 플라크가 생성된 플레이트를 마스터 플레이트로 하여 리플리카 플레이팅, DNA 고정화, 플라크 혼성화 및 양성 플라크 선택과정으로 1차 스크리닝과 동일하게 실시하였다. 2차 스크리닝 결과 1차 스크리닝에서 양성 클론으로 선택한 것이 정확하였음을 확인하였다.

(9) Phagemid의 제조

2차 스크리닝 결과로 확인된 20kDa 단백질의 양성 클론에 대하여 역가 계산을 수행하여 2 x 10⁵ 개의 플라크가 생성될 것으로 예상되는 양을 산출하였다. 이를 바탕으로 XL-1-Blue (OD₆₀₀=1.0) 200 ㎕와 2차 스크리닝 결과 확인된 양성 플라크 용액(2 x 10⁵ 파아지) 200 ㎕, ExAssist 헬퍼 파아지 hage 1 ㎕를 50 ㎖ falcon tube에 취하였다. 37℃에서 15 분간 배양한 후 3 ㎖의 LB broth를 가하고 37℃에서 3 시간 진탕 배양시킨 다음 70℃에서 다시 20 분간 열처리하였다. 열처리된 액을 1,000 xg에서 15 분간 원심 분리시켜 그 상등액을 15 ㎖ falcon에 취하여 4℃에 보관하였다.

(10) Phagemid의 배양

20 kDa의 단백질의 아미노산의 암호화 할 유전자가 삽입된 phagemid를 정제하기 위해, ampicillin resistant region을 포함하고 있지 않은 SOLR cell에 ampicillin resistant region을 포함하는 phagemid가 transformation될 경우 LB/ampicillin plate에서 자라는 현상을 이용하여, 다음 실험을 수행하였다.

SOLR cell(OD₆₀₀=1.0) 200 ㎕에 LB broth로 1,000배 희석한 phagemid를 각각 10 ㎕, 100 ㎕를 가하여 37℃에서 15 분간 진탕 배양하였다. 이들 중 50 ㎕를 취하여 LB/ampicillin plate에 도말하고 37℃에서 12 시간 배양하였다. colony가 생성된 plate로부터 single colony를 취하여 50 ㎖ falcon tube 상에 LB broth 5 ㎖과 ampicillin (50 mg/㎖) 10 ㎕를 넣고 37℃에서 12 시간 배양 하였다.

(11) Phagemid의 분리, 정제 및 확인

상기 (10)에서 제조된 배양액을, 시판되는 DNA purification kit (Quiagen사의 Miniprep kit)을 이용하여 지시된 방법대로 대상 protein의 유전자가 삽입된 plasmid를 분리 정제했다. 이어서 분리된 plasmid의 순도 확인을 위해 0.5 ㎍에 해당하는 DNA와 EcoRI 0.5 ㎕ (7.5 U), XhoI 0.5 ㎕ (6 U) 및 10 X H buffer 1 ㎕를 넣고 3 차 증류수로 10 ㎕가 되게 한 다음 37℃에서 1 시간 배양하고 6 X loading buffer 3 ㎕를 혼합하여 이중 10 ㎕로 1.5％ agarose 전기영동을 수행하였다. Ethidium bromide액 (160 ㎍/100 ㎖)에 10 분간 gel을 담근 후 물로 수회 씻어내고 UV 하에서 나타나는 band로부터 추출한 DNA의 순도 및 농도를 확인하였다.

(12) DNA sequencing을 위한 PCR 반응

상기 (11)에서 얻어진 20 kDa 단백질의 유전자가 들어있는 phagemid DNA 1 ㎍에 3 차 증류수를 가해 10 ㎕가 되게 하고, phagemid DNA의 3'-말단과 5'-말단과 결합할 수 있는 universal primer인 T3(서열번호: 8) 와 T7 primer(서열번호: 9)를 포함하는 Perkin Elmer사의 Rhodamine terminator cycle sequencing ready reaction mixture을 포함하는 DNA sequencing kit을 이용하여 DNA sequencing 용의 용액(최종 농도 3.2 pmole/㎕) 8㎕을 혼합한 후 mineral oil을 적가하고 PCR을 수행하였다. 96℃에서 30초, 50℃에서 15초, 60℃에서 4분 방치하는 과정을 24 cycle을 수행한 후, spin column으로 정제하였다. speed-vac 건조한 후(deionized formamide : blue dextran=5 : 1)용액 3 ㎕로 녹이고 95℃에서 2 분간 열처리한 후 automatic sequencer에 loading하였다.

(13) 20 kDa의 PGN을 인식 단백질의 염기 배열 결정

Sanger의 dideoxy chain termination 방법의 원리에 따랐으며, 시판되는 DNA sequencing kit (Perkin Elmer 사의 Rhodamine terminator cycle sequencing ready reaction)을 사용하였다. 완전한 DNA 염기 배열을 분석한 결과 Tenebrio PGN-인식 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 것으로 확인되었다.

(14) 20 kDa의 PGN 인식 단백질의 유전자 서열 및 아미노산 서열

1차 screening 결과 20개의 plate 모두에서 positive plaque가 생성되었다. 2차 screening 결과 15개의 positive clone을 얻을 수가 있었으며 1.5％ agarose 전기영동을 수행한 결과 3종류의 유전자가 20 kDa의 PGN 인식 단백질의 유전자를 포함하는 clone 임을 확인 하였다. 이들 clone들을 sequencing한 결과, 앞서 결정된 부분 아미노산 서열과 일치하는 아미노산을 포함하는 clone임을 알 수 있었다. 이 cDNA clone은 signal peptide로부터 stop codon까지 188개의 아미노산에 해당하는 564개의 nucleotide open reading frame이었다(도 12 참조).

Claims (14)

1. (a) 하기 화학식 1 내지 4의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 합성 펩티도글리칸이 결합된 수지로 컬럼을 충진하여 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계;

   (b) 갈색거저리 유충의 체액을 단계 (a)에서 얻어진 컬럼에 적용하는 단계;

   (c) 이동상 용매를 상기 컬럼에 제공하여 펩티도글리칸-인식 단백질을 컬럼으로부터 용리시켜 용리액을 얻는 단계; 및

   (d) 단계 (c)에서 얻어진 용리액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 정제하는 단계

   를 포함하는, 갈색거저리 유충의 체액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 분리하는 방법:

   ＜화학식 1＞

   

   ;

   ＜화학식 2＞

   

   ;

   ＜화학식 3＞

   

   ;

   ＜화학식 4＞

   

   식 중, Pr은 프로필을 의미한다.
2. 제1항에 있어서, 상기 합성 펩티도글리칸이 화학식 3의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 사용되는 상기 이동상 용매가 NaCl 및 EDTA를 포함하는 Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 (d)가 상기 용리액의 크기-배제(size-exclusion) 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계; 이온 농도 구배 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 크기-배제 컬럼에 사용되는 컬럼이 토요펄(Toyopearl) Hw55S FPLC 컬럼인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 이온 농도 구배 컬럼에 사용되는 컬럼이 하이드록시애퍼타이트 FPLC 컬럼인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 이온 교환 컬럼에 사용되는 컬럼이 모노-Q FPLC 컬럼인 것을 특징으로 하는 방법.
8. (a) 하기 화학식 1 내지 4의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 합성 펩티도글리칸이 결합된 수지로 컬럼을 충진하여 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계;

   (b) 갈색거저리 유충의 체액을 단계 (a)에서 얻어진 컬럼에 적용하는 단계;

   (c) 세척액을 상기 컬럼에 제공하여 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 물질을 컬럼으로부터 용리시켜 용리액을 얻는 단계; 및

   (d) 단계 (c)에서 얻어진 용리액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 물질을 정제하는 단계

   를 포함하는, 갈색거저리 유충의 체액으로부터 펩티도글리칸-인식 단백질을 제외한 패턴 인식 단백질 분획을 분리하는 방법:

   ＜화학식 1＞

   

   ＜화학식 2＞

   

   ＜화학식 3＞

   

   ＜화학식 4＞

   

   식 중, Pr은 프로필을 의미한다.
9. 삭제
10. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티도글리칸-인식 단백질.
11. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티도글리칸-인식 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
12. 제11항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
13. 삭제
14. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티도글리칸-인식 단백질을 포함하는 펩티도글리칸 검출용 키트.

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