KR100992290B1 - 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따른 미네랄 조성물은, 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 광물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물로서, 혈중 IgE 증가 억제, 염증과 알레르기 반응에 관련된 사이토카인, 리폭시게나제 활성 억제 및 비만세포로부터 히스타민 방출과 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출 억제에 유의적인 효과를 나타내는 바, 알레르기성 질병의 예방 또는 치료에 매우 적합하다.

Description

알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물 {Mineral Composition For Prevention or Treatment of Allergic Diseases}

본 발명은 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 광물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물에 관한 것이다.

알레르기(Allergy)란 알레르겐과 같은 비자기(non-self) 물질에 대하여, 면역학적 기전을 통해 야기되는 병적인 과민반응을 말하며, 항체 또는 세포에 의해서 매개된다.

이러한 알레르기 반응은 Th2 (T-helper type 2) 세포반응으로 대표될 수 있으며, 여기에는 IL-4, IL-5, IL-13과 종양괴사인자 (TNF)-α와 같은 사이토카인이 관여하고, RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed & secreted), eotaxin과 macrophage chemoattractant protein-3 (MCP-3)같은 케모카인이 알레르기 염증반응에 중요한 역할을 할 수 있음이 밝혀졌다(Gazzar, M. E., Mezayen, R. E., Nicolls, M. R., Marecki, J. C. and Dreskin, S. C. (2006) Downregulation of leukotriene biosynthesis by thymoquinone attenuates airway inflammation in a mouse model of allergic asthma. Biochim. Biophys. Acta., 1760, 1088-1095.).

또한, 알레르기 반응에는 자기 (self) 물질에 대해서 병적인 과민반응을 보이는 자가면역질환 (autoimmunity)도 포함될 수 있다.

이러한 과민 반응 (Hypersensitivity reaction)은 어떤 특정한 자극에 노출되면 재발 가능한 증상이나 증후가 일어나는 것으로 면역학적 또는 다른 기전에 의해 일어날 수 있는 여러 증폭된 증상 및 반응을 의미한다. 과민 반응은 Coombs and Gell에 의하여 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ와 Ⅳ로 분류할 수 있고, Janeway 등은 이 중 II형 과민 반응과 IV형 과민 반응을 세분화하여 분류하였다(Averbeck, M., Gebhardt, C., Emmrich, F., Treudler, R. and Simon, J. C. (2007) Immunologic principles of allergic disease. JDDG, 5, 1015-1028.).

이러한 과민 반응 중 I 형은 IgE(Immunoglobulin E)가 매개하며, I 형 반응은 알레르겐이 비만세포 표면의 IgE에 접촉하여 세포내 비만세포 또는 호염기구에서 여러 물질을 생산, 분비하여 일어나는 세포내 신호전달 반응이다.

전 인구의 20%는 과민 반응 Ⅰ형에 의해 일어나는 임상적 증상인 알레르기성 비염, 천식, 아토피성 피부염, 그리고 음식 알레르기와 같은 알레르기성 질병에 기인한 알레르기 질환을 겪고 있는 것으로 나타났으며, 최근에는 환경과 음식 알레르기원으로 인한 알레르기 환자의 수가 빠르게 증가하고 있는 추세이다(Yi, J. M., Kim, M. S., Seo, S. W., Lee, K. N., Yook, C. S. and Kim, H. M. (2001) Acanthopanax senticosus root inhibits mast cell-dependent anaphylaxis. Clin. Chim. Acta., 312, 163-168.).

이에, 이러한 알레르기와 같은 염증질환에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 알레르기와 같은 염증질환에 관여하는 주요 염증세포인 호염구와 비만세포들의 자극원으로는 대표적으로 난황의 지질단백질, 우유의 단백질, 땅콩 등과 같은 일부 음식물 성분이 작용하는 것으로 알려져 있다.

이와 같은 물질들은 림프구의 면역글로불린의 생성을 증가시킬 수 있으며, 식품성분인 불포화지방산을 세포 내의 leukotriene, 혈소판 활성인자, IgE의 생성을 감소시킬 수 있다고 보고되었다.

Kim 등(Kim, S. H., Jun, C. D., Suk, K. H., Choi, B. J., Lim, H. J., Park, S. J., Lee, S. H., Shin, H. Y., Kim, D. K. and Shin, T. Y. (2006) Gallic acid inhibits histamine release and pro-inflammatory cytokine production in mast cells. Toxicol. Sci., 91, 123-131.)은 Gallic acid가 화합물 48/80이나 IgE-유도 히스타민 방출을 감소시키고, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)와 더불어 칼슘 이온 투과 매개체로 작용하여 proinflammatory 사이토카인을 발현한다고 보고하였다. Nedocromil sodium은 항알레르기 약물로 비만세포에서 매개체의 방출의 기능을 갖는 염화물 통로를 차단하는 역할을 하고 있음을 밝혔다(Levi-Schaffer, R., Slovik, D., Armetti, L., Pickholt, Z. D. and Touitou, E. (2000) Activation and inhibition of mast cells degranulation affect their morphometric parameters. Life Sci ., 66, PL 283-290).

이 외에도 차에 존재하는 폴리페놀이 비만세포에서 분비되는 화학매개물질을 억제하고, 항염증활성을 가지고 있다고 보고되었다(Agarwal, R., Katiyar, S. K., Zaidi, S. I. A. and Mukhtar, H. (1992) Inhibition of skin tumor promotor-caused inhibition of epidermal ornithine decarboxylase in SENCAR mice by polyphenolic fraction isolated from green tee and its individual epicatechin derivative. Cancer. Res., 52, 3582-3588.)

Besra등은 Litchi chinensis Gaertn. 잎의 에테르 추출물이 항염증효과가 있음을 밝혔고(Besra, S. E., Sharma, R. M. and Gomes, A. (1996) Anti-inflammatory effect of petroleum ether extract of leave of Litchi chinensis Gaertn. (Sapindaceae). J. Ethnopharnaco., 54, 1-6.), 쌀 추출물과 한약제 추출물들이 알레르기 천식의 기도염증을 억제할 수 있음이 보고되었으며(Kim, J. Y., Kim, D. Y., Lee, Y. S., Lee, B. K., Lee, K. H. and Ro, J. Y. (2006) DA-9601, artemisia asiatica herbal extract, ameliorates airway inflammation of allergic asthma in mice. Mol. Cells, 22(1), 104-112.), 포도씨에 존재하는 중합체성 procyanidins는 점막 비만 세포 타입인 RBL-2H3 세포에서 히스타민 등 염증유발물질을 억제한다는 연구 결과가 알려져 있다(Kondo, K., Uchida, R., Tokutake, S. and Maitani, T. (2006) Polymeric grape-seed procyanidins, but not monomeric catechins and oligomeric procyanidis, impair degranulation and membrane ruffling in RBL-2H3 cells. Bioorganic & Med. Chem., 14, 641-649.).

또한, 유사 기전에 의해 IgE로 유도된 피부의 과민증과 TNF-α 발현을 Acanthophanax senticosus 뿌리 추출물이 억제한다는 보고가 있다(Yi, J. M., Kim, M. S., Seo, S. W., Lee, K. N., Yook, C. S. and Kim, H. M. (2001) Acanthopanax senticosus root inhibits mast cell-dependent anaphylaxis. Clin. Chim. Acta., 312, 163-168.).

한편, Corticosteroid는 일반적으로 강력한 항 염증성 스테로이드로서 천식과 같은 만성 염증 폐 질환의 치료제로 사용되고 있다. Glucocorticoids는 알레르기 염증 질환의 치료를 위한 가장 효과적인 약물 중 하나로 glucocorticoids는 염증과정에 관련된 세포에 존재하는 염증 사이토카인 수용체와 결합하여 이로 인한 염증세포에서 분비되는 염증매개물질들을 차단함으로써 항염증활성을 나타낸다. Corticosteroids나 glucocorticoids 외에도 epinephrine, histamine antagonists, leukotriene 합성저해제와 같은 몇몇의 물질들은 알레르기 염증 반응을 방해하는 것으로 알려져 있다(Schleimer, R. P., Claman, H. N. and Oponsky, A. (1989) Antiinflammatory steroid action. Basic and clinica aspect. Academic Press, San Diego.).

그러나, 이와 같은 연구 결과에도 불구하고, 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 광물을 유효성분으로 포함하는 미네랄 조성물의 알레르기성 질병의 예방 또는 치료 효과는 보고된 바 없으며, 이에 본 발명은 이하에서 설명하는 바와 같이, 소정의 광물을 유효성분으로 포함하는 신규한 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물을 통해, 우수한 알레르기성 질병 치료 효과를 발휘하는 기술을 제안 하고 있다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로, 본 발명의 목적은 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 광물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물을 통해, 혈중 IgE 증가 억제, 염증과 알레르기 반응에 관련된 사이토카인, 리폭시게나제 활성 억제 및 비만세포로부터 히스타민 방출과 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출을 억제하는 효과가 있는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물을 제공하는 것이다.

이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물은 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 광물을 유효성분으로 포함하는 것으로 구성되어 있다.

본 출원의 발명자들은 하기의 실험예를 통해 본 발명에 따른 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 광물을 유효성분으로 포함한 미네랄 조성물을 알레르기성 염증반응 을 유도한 쥐 모델에 처치한 경우, 혈중 IgE 증가 억제, 염증과 알레르기 반응에 관련된 사이토카인, 리폭시게나제 활성 억제 및 비만세포로부터 히스타민 방출과 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.

상기 IgE는 알레르기 질환을 일으키는 데 관여하는 항체로서, 인체에 들어온 외인성 항원이나 생체에서 유래한 내인성 항원은 마크로파지(macrophage)에 의해 처리되어 T세포와 B세포를 자극할 수 있다. 이 때, B세포는 헬퍼 T세포의 보조를 받아 형질세포로 분화되어 IgE 항체를 생성 및 분비하며, 생성된 IgE 항체는 모든 기관과 조직을 구성할 수 있을 뿐 아니라, 알레르기와 과민증과 같은 염증성 반응의 중요한 매개체로 작용하는 비만세포나 호염기구의 세포막 표면의 수용체에 결합하여 감작이 성립될 수 있다.

그런 다음, 다시 침입한 동일한 항원이 비만세포나 호염기구에 결합되어 있는 IgE 항체 사이에 교차결합을 형성하면 세포막이 활성화되고, 일련의 효소 반응을 거친 다음 짧은 시간 내에 탈과립되어 화학적 전달물질의 유리가 일어날 수 있다. 이러한 화학적 전달물질들에 의해 모세혈관 투과성 항진, 평활근 수축 및 분비항진 등으로 인해 조직장해가 일어날 수 있다.

이러한 작용에 대하여, 상기 미네랄 조성물은 증가된 IgE 농도를 정상 범위로 낮추는 효과를 발휘하는 바, 알레르기 염증의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

상기 사이토카인은 비만세포 또는 호염구의 특이적 IgE에 여러 항원이 결합되는 경우, 특히 IgE 수용체(FcεRI)와 강하게 결합됨으로써 생산될 수 있다. 상 기 사이토카인은 예를 들어, 에코사노이드, 프로테오글리칸, 프로테아제, 그리고 다수의 염증전(proinflammatory) 사이토카인 및 화학 주성 사이토카인일 수 있으며, 상기 화학 주성 사이토카인은 예를 들어, Th2의 세포 반응에 관여하는 사이토카인일 수 있으며, 바람직하게 IL-4 또는 TNF-α일 수 있다.

이러한 작용에 대하여, 상기 미네랄 조성물은 Th2의 세포 반응에 관여하는 사이토카인의 활성을 저해하여, 정상보다 높아진 Th2/Th1 비율을 정상화시킬 수 있을 뿐 아니라, 하기 실험예에 언급된 바와 같이 상기 사이토카인의 생성을 유전자 레벨에서 조절하는 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 비만세포는 표면에 IgE 항체의 수용체를 가지고 있고, 이 수용체는 항원에 의한 자극으로 서로 복합체를 이루게 되면, 히스타민과 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase)가 분비될 수 있다. 이들 효소의 분비가 급격히 증가하면 알레르기 반응이 발생하고, 이로 인해 칼슘 이온의 유입이 증가하는데, 이는 비만세포 자극제로 작용하여 TNF-α와 같은 염증 매개 물질 방출을 유도할 수 있다.

여기서, 상기 히스타민은 가장 많은 특성을 갖고 있는 강력한 혈관 작용 매개체로서, 즉시형 과민증에 가장 많은 영향을 줄 수 있으며, 베타-헥소사미니데이즈는 히스타민을 저장하는 비만세포의 과립에 존재하여, 비만세포가 면역학적 활성을 나타내면, 히스타민과 함께 방출될 수 있다.

이러한 작용에 대하여, 상기 미네랄 조성물은 히스타민 방출 또는 베타-헥소사미니데이즈의 방출을 억제하는 효능을 발휘할 수 있다.

상기 리폭시게나제는 류코트리엔으로 알려진 생물학적 지질 활성화에 관련된 효소로서, 염증과 알레르기성 반응에 중요한 역할을 할 수 있으며, 상기 류코트리엔은 비만세포, 호산구, 호염구에서 유리되는 화학매개체로, 알레르기 반응의 염증세포에 대한 화학주성과 활성화에 관여할 수 있다.

이러한 작용에 대하여, 상기 미네랄 조성물은 리폭시게나제의 활성을 억제하는 효능을 발휘할 수 있다.

상기 알레르기성 질병은 IgE에 의해 매개되는 질병이라면 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 알레르기성 염증으로 인한 비염, 천식 아토피성 피부염, 아나필락시스, 또는 두드러기일 수 있다.

본 발명에 따른 미네랄 조성물은 상기 정의된 바와 같이, 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 광물을 유효성분으로 포함하고 있다.

상기 연옥(nephrite, CaO₃MgO₄SiO₂)은 미세한 섬유상 결정이 얽혀 치밀질의 경괴를 이룬 투섬석 또는 투녹섬석으로, 질이 강인하여 깨지지 않고, 연마하면 순한 광택이 나는 것이 바람직하다. 굳기는 5.5 내지 6.0일 수 있고, 비중은 2.9 내지 3.0일 수 있으며, 색깔은 백색 및 암록색을 띨 수 있다.

상기 활석(talc, Mg₃Si₄O₁₀(OH)₂)은 운모와 같은 결정구조를 가지는 단사정계에 속 하는 암석으로, 굳기는 1, 비중은 2.7 내지 2.8일 수 있고, 자를 수 있으며, 색깔은 백색, 은백색 및 담녹색 등을 띨 수 있다.

상기 백운모(muscovite, K(OHF₂)₂A1₃Si₃O₁₀)는 단사정계에 속하는 광물로서, 철 과 마그네슘을 소량 함유하는 것일 수 있다. 굳기는 2 내지 2.4, 비중은 2.7 내지 3일 수 있으며, 무색, 백색, 황색, 회색, 녹색 및 갈색을 띠고, 크롬을 함유한 경우에는 선록색을 띨 수 있다.

상기 견운모(sericite, KAl₂(OH)₂(AlSi₃O₁₀))는 단사정계에 속하며, 백색 또는 회백색에 진주광택이 있다. 열수작용(熱水作用)으로 생긴 점토 모양의 미세한 백운모를 가리키며, 화학성분은 백운모와 거의 같으나, 일반적으로 칼륨(K)이 백운모보다 적고 수분(H₂O)이 다소 많을 수 있다. 상기 견운모에는 셀레늄(Se), 아연(Zn), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca) 등 인체에 필수적인 다양한 미네랄이 포함되어 있다.

상기 고령토(kaolin, Al₂Si₂O₅(OH)₄)는 고령석(카올리나이트)과 할로이사이트가 주성분으로, 바위 속에 있는 장석·정장석·소다 장석·회장석 같은 장석류가 탄산 또는 물에 의해 화학적으로 분해되는 풍화에 의해 생성되며, 순백색 또는 약간 회색일 수 있다.

상기 해부석(pumice)은 화산에서 분출된 암석이 응고하여 이루어진 구멍이 많은 광물로서, 유문암(rhyolite), 조면암(trachyte), 향암(phonolite)을 포함한 규산염 광물([SiO₂]_x)이며, 필수 미네랄인 칼슘, 철, 아연, 구리, 니켈, 크롬, 코발트, 바나듐, 셀레늄 등이 포함되어 있다.

상기 유기 게르마늄(Ge)은 미량으로 포함될 수 있으며, 이 외에도 Ca, Mg, P, K 등 필수 다량 원소(macro-element)와 Fe, Zn, Se, Mn, Cu, Mo, Co, Cr, F, Ni, V, B, Se 등 필수 미량 원소(micro-element)가 제한없이 추가로 포함될 수 있다.

상기 미네랄 조성물을 구성하는 광물들은 본 출원인의 특허출원 제2008-0025374호에도 상세하게 기재되어 있으며, 본 출원에 참조로서 합체된다.

하나의 바람직한 예에서, 상기 광물은 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄이 모두 포함된 것일 수 있다. 이러한 구성을 통해, 상기 미네랄 조성물은 유의적인 혈중 IgE 증가 억제, 염증과 알레르기 반응에 관련된 사이토카인, 리폭시게나제 활성 억제 및 비만세포로부터 히스타민 방출과 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출 억제 효과를 발휘할 수 있다.

상기 광물 성분들의 배합비는 소망하는 정도의 알레르기 염증의 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있도록 적절하게 결정할 수 있으며, 바람직하게는 광물 전체 중량을 기준으로 상기 연옥이 0 내지 15 중량%; 상기 활석은 5 내지 25 중량%; 상기 백운모는 15 내지 40 중량%; 상기 견운모는 5 내지 25 중량%; 상기 고령토는 20 내지 50 중량%; 상기 해부석은 0 내지 5 중량%; 및 상기 유기 게르마늄은 0 내지 0.5 중량%의 비율로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 의약품에 적용할 경우에는, 상기 미네랄 조성물을 유효성분으로 하고, 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제재로서는 정제, 환제, 과립제, 연·경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등을 들 수 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 용이하게 제제화할 수 있으며, 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 미네랄 조성물을 의약품에 적합하게 제제화한 경우, 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 활성성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위일 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1 내지 3 및 비교예 1]

연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄을 물로 깨끗하게 세척한 후, 100℃의 건조기에서 3시간 이상 건조시켜 수분을 제거하였다. 건조된 각각의 광물을 통상의 회전분말기에 넣고 고속분말 처리하여 입도 1~10 마이크론의 초미세 분말로 분쇄하였다. 분쇄된 초미세 분말을 롤러식 전자석 드럼과 컨베이어 벨트 각각에 강한 자력선을 투과시켜 강한 자기장을 형성함으로써, 불필 요한 철 성분을 최대한 제거하였다. 철 성분이 제거된 분말을 20배 중량의 물에 넣고 교반기를 가동시킨 후, 상층액을 버리고 침전물을 회수하였다. 이러한 과정은 교반기 가동 상태에서 부유물을 회수하고 침전물을 버릴 수도 있다. 미네랄 조성물의 각 성분들은 하기 표 1에 나타난 배합 비율에 따라 혼합하여, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1을 제조하였다.

혼합물을 도자기판에 얇은 층으로 고르게 편 다음, 전기로에 넣어 700℃의 항온에서 가열하였다. 혼합물이 붉게 가열되면 20분간 이 상태를 유지시킨 후 도자기판을 꺼내었다. 혼합물에 포함된 연옥 및 유기 게르마늄등의 조성은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.

[표 1]

하기 실험예에서 사용한 재료 및 방법은 하기와 같다.

1. 실험 재료

본 실험에 사용한 미네랄 조성물은 실시예 1의 조성으로 구성되어 있고{이하, 실시예 1: 엔티앤비티(주) (충남 홍성 소재)에서 제공받아 사용}, 실험 동물은 중앙실험 동물 사육장으로부터 공급받아 실험에 사용하였다.

2. 미네랄 조성물에 의한 혈중 IgE 저해 효과 측정

6 주령 수컷 BALB/c mouse는 중앙실험 동물 사육장으로부터 공급받아 실험에 사용하였다. 실험동물은 무작위로 8 마리씩 3 개의 그룹으로 나누었으며, 사육 조건은 온도 21~23℃, 습도 40~60%, 조명 12 시간 명암으로 유지시켰으며, 실험동물은 분양 받은 다음날 사용하였다.

BALB/c mouse에 제 0 일과 14 일에 500 ug/ml의 ovalbumin과 100 mg/ml의 aluminum hydroxide를 PBS (Phosphate buffer saline)에 넣고 섞은 후 200 ul씩 복강 주사하였다. 정상군은 PBS (Phosphate buffer saline) 200 ul을 복강 주사하였다. 21 일과 22 일, 23 일째에는 미네랄 조성물 분말 20 mg/ml을 PBS에 녹여 500 ul씩 경구 투여하였고, 30 분이 지난 후 1.5 mg/ml의 ovalbumin을 PBS에 녹인 후 100 ul씩 코에 넣어주었다. 24 일째 경추 이탈시켜 희생시킨 후 하대정맥에서 혈액을 얻었다. 혈액은 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액인 혈청만 분리하였다. 이렇게 얻은 혈청은 분주하여 -70℃에서 보관하면서 ELISA법을 사용하여 IgE 정량을 실시하였다. 1 차 항체와 0.1 M sodium carbonate, pH 9.5 용액을 1:250으로 희석하여 96 well plate에서 4℃, 16 시간 이상 코팅한 후 혈청과 assay diluent를 1:250 으로 희석하여 2 시간 동안 반응시키고 biotin이 부착된 2 차 항체를 결합시킨 후 horseradish peroxidase (HRP)와 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)를 이용하여 발색시켜 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 독립된 3 번의 실험을 통해 Mean ± SEM으로 나타내었으며, 통계는 SPSS for Windows 12.0 프로그램을 이용하였다. 두 집단간의 유의성은 대응표본 t-test인 paired t-test로 분석하고, 세 집단 이상의 유의성은 ANOVA를 사용하여 분석했으며 Duncan's multiple-range test에 따른 사후 검정을 실시하였다. 모든 실험에서 유의한 p값은 0.05 이하로 분석하였다.

3. 미네랄 조성물에 의한 기관지 세척액 내 사이토카인 저해 효과 측정

혈액 샘플을 얻은 다음, 기관지가 있는 목 부분을 조심스럽게 열고 기관지에 1 ml의 PBS로 4 번 세척하여 폐포 세척액을 수거하였다. 폐포 세척액은 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액만 얻은 다음, -70℃에서 보관해두었다. 기관지 폐포 세척액의 상등액을 이용한 Th2의 세포 반응에 관여하는 사이토카인의 일종인 IL-4 및 TNF-α의 정량은 ELISA키트 (BD Pharmingen, USA)의 사용 설명서에 따라 검사하였다. IL-4는 1 차 항체를 0.1 M sodium carbonate, pH 9.5 용액을 1:250으로 희석하여 96 well plate에서 4℃, 16 시간이상 코팅하고, TNF-α는 0.2 M sodium phosphate, pH 6.5 용액을 1:250으로 희석하여 동일한 방법으로 코팅하였다. 그 후 assay diluent로 비특이적 반응을 차단하였다. 기관지폐포 세척액 원액을 2 시간동안 반응시키고 biotin이 부착된 2 차 항체를 부착시킨 후 horseradish peroxidase (HRP)와 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)를 이용하여 발색시킨 후 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

4. 미네랄 조성물에 의한 폐 조직 내 RNA 발현 변화 측정

폐 조직에서 분리한 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 다음 primer를 사용하여 RCR 반응을 수행하였다. 정량적인 PCR을 위해 합성된 cDNA를 연속적으로 희석하여 사용하였다. 정량 분석을 위하여 대조군과 미네랄 조성물 처리군에서 internal standard로 사용된 대조군 유전자 β-actin과 동일한 양으로 증폭된 희석 조건에서 IL-4와 TNF-α 유전자의 증폭양을 비교하였다.

5. 폐 조직의 형태학적 분석

폐포 세척액을 얻은 후 왼쪽 폐 안으로 2 ml의 PBS를 관류시켰다. 폐 속에 있던 혈액을 제거하고 4% paraformaldehyde에 넣어 20 시간 이상 고정시킨 후 파라핀 포매 절편을 제작한다. 조직학적 검색을 위하여 초박절편기 (Reichert-Jung, 820-Ⅱ)를 이용하여 파라핀 포매 조직을 4 um 두께로 박절한 후 gelatine으로 피복된 유리슬라이드 위에 부착시킨 후 xylene과 알코올로 탈 파라핀과 함수과정을 거친 후 hematoxylin과 eosin Y로 염색하였다.

6. 리폭시게나제(Lipoxygenase) 효소 활성 억제 측정

미네랄 조성물의 lipoxygenase 활성 억제를 측정하기 위하여, 0.1 M borate 완충액 (pH 9.0)에 lipoxygenase (Sigma) 110 Units을 첨가하고, 미네랄 조성물 분말은 충분히 녹인 후, 상등액을 100 ul 첨가하였다. 30℃에서 10 분간 pre-incubation한 뒤 500 uM linoleic acid를 첨가하고 234 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.

7. 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 정량

Rat의 basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3 세포는 10% FBS, 100 unit/ml의 penicillin과 streptomycin을 포함하는 DMEM 배지와 37℃의 5% CO₂를 포함하는 조건에서 24 시간 배양하였다. 이 때, 세포의 수는 2 X 10⁴ cell/well로 96 well plate에서 배양한 후, 상등액을 제거한 다음 2% FBS, anti-DNP IgE (1:1,000)이 포함된 DMEM을 각 well에 100 ul씩 첨가한 후 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양 후 HEPES buffer (pH 7.4)를 각 well당 200 ul씩 첨가하여 3 회 세척하고 세포독성이 없는 조건의 미네랄 조성물 분말을 HEPES buffer (pH 7.4)로 미리 희석하여 100 ul씩 첨가하고, 37℃에서 10 분간 반응하였다. 4 ug/200 ul의 DNP-BSA를 첨가하고 37℃에서 35 분간 재차 반응시켰다. 4℃에서 반응을 종결시킨 후 상등액을 새 plate에 50 ul씩 넣은 후 1 mM p-nitrophenyl-β-acetyl-glucosamide를 50 ul씩 넣고 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 다음 200 ul의 0.2 M glycine buffer (pH 10.7)로 반응을 종결시켰다. 그리고, ELISA reader를 사용하여 407nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

8. 히스타민 정량

Rat의 basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3 세포는 10% FBS, 100 unit/ml의 penicillin과 streptomycin을 포함하는 DMEM 배지와 37℃의 5% CO₂를 포함하는 조건에서 24 시간 배양하였다. 이 때, 세포의 수는 1 X 10⁵ cell/well로 조절하고 24 well plate에서 배양한 후, 상등액을 제거한 다음 2% FBS, anti-DNP IgE (1:1,000)이 포함된 DMEM을 각 well에 1 ml씩 첨가한 후 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양 후 HEPES buffer (pH 7.4)를 각 well당 200 ul씩 첨가하여 3 회 세척하고 세포독성이 없는 조건의 미네랄 조성물 분말을 HEPES buffer (pH 7.4)로 미리 희석하여 500 ul씩 첨가하고, 37℃에서 10 분간 반응하였다. DNP-BSA (20 ug/well)를 1 ml첨가하여, 37℃에서 35 분간 재차 반응시켰다. 4℃에서 반응을 종결시킨 후 회수한 상등액 1 ml을 새 24 well plate에 옮겨서 0.2 ml의 1 N NaOH, 0.1 ml의 1% o-phthalaldehyde (OPT)를 첨가하고 실온에서 5 분간 방치하였다. 반응을 종결시키기 위해서 1 N HCl을 0.2 ml 첨가하고, fluorometer를 사용하여 360 nm의 excitation 파장과 450 nm의 emission 파장에서 흡광도를 측정하였다.

[실험예 1] 혈중 IgE 저해 효과

미네랄 조성물의 혈중 IgE 저해 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다

도 1을 참조하면, 실험쥐에 Ovalbumin으로 염증반응을 유도한 대조군 (7250.75 ± 376.32 ng/ml)의 IgE 농도는 PBS로 처리한 정상군 (1817.19 ± 296.45 ng/ml)의 IgE 농도에 비해 약 4 배 증가하였으나, 증가된 대조군의 IgE 농도는 미네랄 조성물(실시예 1)의 처리에 의해 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다(4255.77 ± 514.69 ng/ml). 미네랄 조성물은 증가된 IgE 농도를 약 59% 감소시켰다.

[실험예 2] IL-4 및 TNF-α 저해 효과

미네랄 조성물의 IL-4 및 TNF-α 저해 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2를 참조하면, Ovalbumin으로 염증반응을 유도한 대조군의 IL-4 농도는 110.7 ± 8.11 pg/ml로서 PBS 처리된 정상군 IL-4 농도 (51.9 ± 7.05 pg/ml)에 비해 2 배 증가하였고, 증가된 대조군의 IL-4 농도는 광물성 미네랄 혼합물을 처리한 실험군에서 50.38 ± 4.01 pg/ml로 감소되었음을 확인할 수 있다.

도 3을 참조하면, TNF-α는 ovalbumin으로 염증 반응을 유도한 대조군에서 129.52 ± 23.08 pg/ml로서 PBS 처리된 정상군의 75.01 ± 4.16 pg/ml에 비해 약 1.7 배 증가하였다. 증가된 대조군의 TNF-α 농도는 광물성 미네랄 혼합물을 처리한 실험군에서 58.79 ± 5.92 pg/ml로 감소되었는데, 이 수치는 p<0.05에서 통계학적으로 정상군과 차이가 없는 결과이다.

[실험예 3] IL-4 및 TNF-α의 mRNA 발현 저해 효과

알레르기성 염증반응을 유도한 쥐 모델에서 광물성 미네랄 혼합물 처리에 의한 사이토카인 발현 변화를 보고자 정상군, ovalbumin 처리된 대조군, 미네랄 혼합물 처리된 실험군의 폐 조직을 이용해 총 RNA를 분리하여 각각 cDNA를 합성하였다. 정상군 cDNA, 대조군 cDNA와 실험군 cDNA를 각각 단계적으로 희석하여 IL-4와 TNF-α 유전자를 증폭시켰다. 이 때 internal standard로 사용된 housekeeping 유전자는 β-actin 유전자였다. RT-PCR 결과 모두 동일한 양의 β-actin 유전자가 증폭되었다. 따라서, 이와 동일한 조건일 때 IL-4와 TNF-α transcript 유전자의 증폭양을 비교해 보았으며, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4를 참조하면, IL-4 mRNA의 경우 정상군과 실험군이 대조군에 비해 감소하였음을 확인할 수 있다. 도 5를 참조하면, TNF-α mRNA 역시 정상군과 실험군이 대조군에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는 RT-PCR을 통하여 알레르기성 염증반응이 유발되었을때 광물성 미네랄 혼합물 처리에 따른 IL-4와 TNF-α 유전자의 발현감소를 보여준다. 또한, 기관지폐포 세척액을 이용하여 사이토카인을 측정한 결과와 거의 일치하고 있음을 보여준다.

[실험예 4] 폐 조직의 형태학적 변화

Ovalbumin 감작 모델의 폐 조직에 미네랄 조성물을 처리한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, Ovalbumin 감작 모델의 폐 조직에서는 세기관지 내로 점액이 다량 유입되어 있고, 주위에 림프구 및 호산구를 비롯한 염증세포가 산재해있으나, 미네랄 조성물을 처리한 그룹에서는 세기관지 내의 점액이 유의하게 감소하였고, 주위의 염증 세포들도 다량 감소하였음을 확인하였다.

[실험예 5] 리폭시게나제 활성 억제

도 7에 광물성 미네랄 혼합물의 농도에 따른 리폭시게나제의 활성 억제 양상을 보여주는 결과를 나타내었으며, 도 7을 참조하면 광물성 미네랄 혼합물의 농도가 증가 할수록 리폭시게나제의 활성 억제율이 증가되는 것을 알 수 있었다.

[실험예 6] 베타-헥소사미니다제 및 히스타민의 방출 억제

Rat basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3세포는 점막 비만 세포 타입으로, IgE-매개체 탈과립 연구에 중요하며, IgE와 함께 RBL-2H3세포의 IgE수용체를 자극하면, 항원과 결합된 것 같은 효과를 나타낼 수 있다.

RBL-2H3 세포에서 anti-DNP IgE 매개 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)의 분비에 대한 미네랄 조성물의 효과는 10 분간 처리 후 관찰하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 미네랄 조성물 0.25%를 처리한 경우, β-hexosaminidase의 분비는 대조군에 비해 약 30% 감소하였고, 0.125% 처리시 분비율은 약 20% 감소하는 것으로 나타났다.

미네랄 조성물을 RBL-2H3 세포에 미네랄을 0.25%, 0.125%의 농도로 10 분간 처리한 결과를 도 9에 나타내었다. 미네랄 조성물의 농도가 증가할수록 히스타민 분비량은 감소하였다. 0.125% 미네랄 조성물의 처리에 의해 히스타민 분비는 약 50% 정도 감소되었고, 0.25% 미네랄 조성물을 처리하였을 때, 히스타민 분비는 대조군에 비해 80% 이상 감소되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물은, 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 광물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물 로서, 혈중 IgE 증가 억제, 염증과 알레르기 반응에 관련된 사이토카인, 리폭시게나제 활성 억제 및 비만세포로부터 히스타민 방출과 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출 억제에 유의적인 효과를 나타내는 바, 알레르기성 질병의 예방 또는 치료에 매우 적합하다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

도 1은 대조군과 본 발명에 따른 미네랄 조성물을 처리한 군의 혈중 IgE 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;

도 2는 대조군과 본 발명에 따른 미네랄 조성물을 처리한 군의 IL-4 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;

도 3은 대조군과 본 발명에 따른 미네랄 조성물을 처리한 군의 TNF-α 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;

도 4는 대조군과 본 발명에 따른 미네랄 조성물을 처리한 군의 IL-4 mRNA 발현 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;

도 5는 대조군과 본 발명에 따른 미네랄 조성물을 처리한 군의 TNF-α mRNA 발현 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;

도 6은 본 발명에 따른 미네랄 조성물을 처리한 폐 조직의 형태학적 변화를 나타낸 그래프이다;

도 7은 본 발명에 따른 미네랄 조성물을 처리한 리폭시게나제의 활성 억제 양상을 나타낸 그래프이다;

도 8은 대조군과 본 발명에 따른 미네랄 조성물을 처리한 군에서 베타-헥소사미니다제의 방출 억제 효과를 측정한 그래프이다;

도 9는 대조군과 본 발명에 따른 미네랄 조성물을 처리한 군에서 히스타민의 방출 억제 효과를 측정한 그래프이다.

Claims (11)

1. 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 미네랄 조성물은 혈중 IgE 농도를 감소시키는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 미네랄 조성물은 사이토카인의 활성을 저해하는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 사이토카인은 Th2(2형 T helper세포)의 세포 반응에 관여하는 사이토카인인 것을 특징으로 하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-4 또는 TNF-α인 것을 특징으로 하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 미네랄 조성물은 리폭시게나제를 억제하는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 미네랄 조성물은 히스타민 방출을 억제하는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 미네랄 조성물은 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출을 억제하는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 알레르기성 질병은 알레르기성 염증으로 인한 비염, 천식, 아토피성 피부염, 아나필락시스, 또는 두드러기인 것을 특징으로 하는 알레르기성 질병의 예방 또는 치료용 미네랄 조성물.
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